JPH05268990A - Ｘｉｉｉ因子の精製法、ｘｉｉｉａ因子に対するモノクローナル抗体、その製造及び使用 - Google Patents
Ｘｉｉｉ因子の精製法、ｘｉｉｉａ因子に対するモノクローナル抗体、その製造及び使用Info
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- JPH05268990A JPH05268990A JP4222336A JP22233692A JPH05268990A JP H05268990 A JPH05268990 A JP H05268990A JP 4222336 A JP4222336 A JP 4222336A JP 22233692 A JP22233692 A JP 22233692A JP H05268990 A JPH05268990 A JP H05268990A
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- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
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- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 イムノアフィニティクロマトグラフィーによ
るXIII又はXIIIＡ因子の精製法に関する。 【構成】 支持材料（アフィニティ材料）に結合されて
いるXIIIＡに対するモノクローナル抗体とXIII又はXIII
Ａ因子を含有する溶液を接触させ、アフィニティ材料と
液体とを互に分離し、そしてアフィニティ材料から生物
活性形態でXIII又はXIIIＡ因子を溶離することを特徴と
する。
るXIII又はXIIIＡ因子の精製法に関する。 【構成】 支持材料（アフィニティ材料）に結合されて
いるXIIIＡに対するモノクローナル抗体とXIII又はXIII
Ａ因子を含有する溶液を接触させ、アフィニティ材料と
液体とを互に分離し、そしてアフィニティ材料から生物
活性形態でXIII又はXIIIＡ因子を溶離することを特徴と
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はイムノアフィニティクロ
マトグラフィーによるXIII又はXIIIＡ因子の精製法、XI
IIＡ因子に対するモノクローナル抗体、並びにその製造
及びその使用に関する。
マトグラフィーによるXIII又はXIIIＡ因子の精製法、XI
IIＡ因子に対するモノクローナル抗体、並びにその製造
及びその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】XIII因子はフィブリンモノマーの間に共
有結合を形成させることによってフィブリン（これは血
液凝固の最後の相に形成される）を安定化するトランス
グルタミナーゼである。XIII因子は、なかんずく、血漿
中及び血小板中に見出される。血漿中では共有結合で結
合されていないＡ及びＢサブユニットのコンプレックス
として存在する。遊離Ａサブユニットのみが血小板中に
存在する。Ａサブユニットのみがフィブリン安定化作用
に必要である。XIIIＡ因子の欠乏（先天的又は獲得）は
重大な凝固の障害を生じ、この障害はXIIIＡ因子の置換
によって処置することができる。
有結合を形成させることによってフィブリン（これは血
液凝固の最後の相に形成される）を安定化するトランス
グルタミナーゼである。XIII因子は、なかんずく、血漿
中及び血小板中に見出される。血漿中では共有結合で結
合されていないＡ及びＢサブユニットのコンプレックス
として存在する。遊離Ａサブユニットのみが血小板中に
存在する。Ａサブユニットのみがフィブリン安定化作用
に必要である。XIIIＡ因子の欠乏（先天的又は獲得）は
重大な凝固の障害を生じ、この障害はXIIIＡ因子の置換
によって処置することができる。
【０００３】種々の出発物質からXIIIＡ因子を精製する
ためのいくつかの方法が知られているが、いくつかの不
利な点例えばXIIIＡ因子の純度が適切でないこと、精製
工程が多いこと及び収量が低いことと結びついている。
ためのいくつかの方法が知られているが、いくつかの不
利な点例えばXIIIＡ因子の純度が適切でないこと、精製
工程が多いこと及び収量が低いことと結びついている。
【０００４】治療の目的でヒトの組織又は体液からタン
白を精製する際には、純度が高いことはウイルス粒子の
伝播のリスクが低いことと結びついている。異種の生物
からの組換えタン白の精製の際には、免疫原の潜在性が
ある宿主細胞からのタン白ができるだけ除去されている
ためには高純度が必須である。従ってモノクローナル抗
体を使用するアフィニティクロマトグラフィーによるXI
II因子の精製は、ウイルスの安全性の改善（ヒトの組織
又は体液から精製の場合）をもたらすと共に組換え生成
物の所要の純度が達成されるのを容易にする方法であ
る。
白を精製する際には、純度が高いことはウイルス粒子の
伝播のリスクが低いことと結びついている。異種の生物
からの組換えタン白の精製の際には、免疫原の潜在性が
ある宿主細胞からのタン白ができるだけ除去されている
ためには高純度が必須である。従ってモノクローナル抗
体を使用するアフィニティクロマトグラフィーによるXI
II因子の精製は、ウイルスの安全性の改善（ヒトの組織
又は体液から精製の場合）をもたらすと共に組換え生成
物の所要の純度が達成されるのを容易にする方法であ
る。
【０００５】イムノアフィニティクロマトグラフィーに
よる精製が種々のタン白について記載されている。しか
し、抗原−抗体コンプレックスを解離するのに要する条
件（例えば極端なｐＨ値又はカオトロピックイオンの高
い濃度）が抗原の生物活性の不可逆の崩壊を生じること
が多いので、イムノアフィニティクロマトグラフィーを
用いて酵素その他の生物活性分子を精製する場合にどの
モノクローナル抗体も適しているということではない。
イムノアフィニティクロマトグラフィーによるXIIIＡ因
子の精製も既に記載されており（Gniewek, R.A. ら（19
85）Fed. Proc.44：1070）、Ｂサブユニットに対する抗
体が支持体上固定され、そしてXIIIＡ因子とXIIIＢ因子
のコンプレックスが血漿から吸着されることを含む。次
にXIIIＡ因子がＢサブユニットから解離され、こうして
アフィニティゲルから溶離される。ヒトの胎盤又は組換
え細胞からXIIIＡ因子を精製するのにこの方法を使用す
ることは可能ではない。それらの各々は遊離XIIIＡ因子
のみを含有している。
よる精製が種々のタン白について記載されている。しか
し、抗原−抗体コンプレックスを解離するのに要する条
件（例えば極端なｐＨ値又はカオトロピックイオンの高
い濃度）が抗原の生物活性の不可逆の崩壊を生じること
が多いので、イムノアフィニティクロマトグラフィーを
用いて酵素その他の生物活性分子を精製する場合にどの
モノクローナル抗体も適しているということではない。
イムノアフィニティクロマトグラフィーによるXIIIＡ因
子の精製も既に記載されており（Gniewek, R.A. ら（19
85）Fed. Proc.44：1070）、Ｂサブユニットに対する抗
体が支持体上固定され、そしてXIIIＡ因子とXIIIＢ因子
のコンプレックスが血漿から吸着されることを含む。次
にXIIIＡ因子がＢサブユニットから解離され、こうして
アフィニティゲルから溶離される。ヒトの胎盤又は組換
え細胞からXIIIＡ因子を精製するのにこの方法を使用す
ることは可能ではない。それらの各々は遊離XIIIＡ因子
のみを含有している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、血漿、胎盤、又はXIII因子鎖に対する遺伝情報を有
する組換え細胞の抽出物若しくは培養上清等の出発材料
から、イムノアフィニティクロマトグラフィーによるXI
II又はXIIIＡ因子の精製法を開発することである。
は、血漿、胎盤、又はXIII因子鎖に対する遺伝情報を有
する組換え細胞の抽出物若しくは培養上清等の出発材料
から、イムノアフィニティクロマトグラフィーによるXI
II又はXIIIＡ因子の精製法を開発することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、該出発
材料からXIII又はXIIIＡ因子を精製するのに適している
XIIIＡ因子に対するモノクローナル抗体が見出された。
材料からXIII又はXIIIＡ因子を精製するのに適している
XIIIＡ因子に対するモノクローナル抗体が見出された。
【０００８】即ち、本発明は、支持材料（アフィニティ
材料）に結合されているXIIIＡ因子に対するモノクロー
ナル抗体とXIII又はXIIIＡ因子を含有する溶液を接触さ
せ、アフィニティ材料と液体とを互に分離し、そしてア
フィニティ材料から生物活性形態でXIII又はXIIIＡ因子
を溶離することを特徴とするイムノアフィニティクロマ
トグラフィーを用いるXIII又はXIIIＡ因子の精製法に関
する。
材料）に結合されているXIIIＡ因子に対するモノクロー
ナル抗体とXIII又はXIIIＡ因子を含有する溶液を接触さ
せ、アフィニティ材料と液体とを互に分離し、そしてア
フィニティ材料から生物活性形態でXIII又はXIIIＡ因子
を溶離することを特徴とするイムノアフィニティクロマ
トグラフィーを用いるXIII又はXIIIＡ因子の精製法に関
する。
【０００９】本発明の目的のためのモノクローナル抗体
は、モノクローナル抗体の、それ自体は当業者に知られ
ている免疫反応性のフラグメント、例えば、抗体分子の
Ｆ(a b′)2、Ｆ(ab)若しくはＦvフラグメント又は抗原結
合性一重鎖、又はそれらの誘導体を包含する。
は、モノクローナル抗体の、それ自体は当業者に知られ
ている免疫反応性のフラグメント、例えば、抗体分子の
Ｆ(a b′)2、Ｆ(ab)若しくはＦvフラグメント又は抗原結
合性一重鎖、又はそれらの誘導体を包含する。
【００１０】文献中記載されているXIIIＡ因子に対する
モノクローナル抗体はＩｇＭクラスに属する（Lynch,
G．ら (1985) Thromb, Haemast, 54：274）。ＩｇＭ抗
体は、ＩｇＧ抗体より低い特異性及び親和性を有してい
るので、免疫化学的方法のためには一般にＩｇＧ抗体程
適していない。
モノクローナル抗体はＩｇＭクラスに属する（Lynch,
G．ら (1985) Thromb, Haemast, 54：274）。ＩｇＭ抗
体は、ＩｇＧ抗体より低い特異性及び親和性を有してい
るので、免疫化学的方法のためには一般にＩｇＧ抗体程
適していない。
【００１１】従って本発明の目的は、XIIIＡ因子に対す
るモノクローナル抗体、好ましくはＩｇＧクラスのもの
を製造することでもある。
るモノクローナル抗体、好ましくはＩｇＧクラスのもの
を製造することでもある。
【００１２】ＩｇＧクラスのXIIIＡ因子に対するモノク
ローナル抗体は、４週間の間隔で精製したXIIIＡ因子で
マウスを数回免疫することによって得られた。
ローナル抗体は、４週間の間隔で精製したXIIIＡ因子で
マウスを数回免疫することによって得られた。
【００１３】即ち、本発明は又、ＩｇＭクラスを除く好
ましくはＩｇＧクラスのXIIIＡ因子に対するモノクロー
ナル抗体にも関する。
ましくはＩｇＧクラスのXIIIＡ因子に対するモノクロー
ナル抗体にも関する。
【００１４】モノクローナル抗体はKoehler 及び Milst
ein の方法（Nature 256：285〜308）により、又は彼等
の方法の多くの変法のうちの１つ（例えば、Goding J.
W. (1980), J. Immunol. Meth. 39：285〜308）により
製造することができ、それらは方法自体は例えば次の方
式で当業者に知られている：XIII因子を含有する液体、
好ましくは Freund のアジュバント中精製したXIIIＡ因
子のエマルジョンの１〜８週間好ましくは４〜６週間の
間隔の数回の注射によって哺乳動物、好ましくはマウス
又はラットを免疫する。最終の注射の場合には、計画さ
れた融合日の３〜５日前に、好ましくは腹腔内又は静脈
内に水溶液としてXIIIＡ因子を投与する。抗体産生細胞
を得るため免疫動物を屠殺し、リンパ器官、好ましくは
脾臓を取り出し、そしてリンパ球を遊離させる。細胞培
養において永久的に生育する抗体産生細胞を得るために
は、このリンパ球を不死にしなければならない。このこ
とは種々の方式で例えば Epstein-Barr ウイルス又はレ
トロウイルスを用いる形質転換によって実施することが
できる。しかしこのリンパ球は骨髄腫細胞と融合させる
ことが好ましい。特に適当な骨髄腫細胞株は、免疫グロ
ブリンを分泌しないもの、例えば細胞株ＳＰ２／０−Ａ
ｇ１４又はＸ６３−Ａｇ８.６５３である。この細胞
は、３０〜６０％の強度の溶液の１０００〜６０００の
分子量を持つポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共に
インキュベーションすることによって融合させることが
できるが、電気的細胞融合（electrofusion）等の他の
方法も適当である。リンパ級と骨髄腫細胞とのハイブリ
ッド（ハイブリドーマ）を選択し、そして適当な栄養培
地中培養することによって生育させる。
ein の方法（Nature 256：285〜308）により、又は彼等
の方法の多くの変法のうちの１つ（例えば、Goding J.
W. (1980), J. Immunol. Meth. 39：285〜308）により
製造することができ、それらは方法自体は例えば次の方
式で当業者に知られている：XIII因子を含有する液体、
好ましくは Freund のアジュバント中精製したXIIIＡ因
子のエマルジョンの１〜８週間好ましくは４〜６週間の
間隔の数回の注射によって哺乳動物、好ましくはマウス
又はラットを免疫する。最終の注射の場合には、計画さ
れた融合日の３〜５日前に、好ましくは腹腔内又は静脈
内に水溶液としてXIIIＡ因子を投与する。抗体産生細胞
を得るため免疫動物を屠殺し、リンパ器官、好ましくは
脾臓を取り出し、そしてリンパ球を遊離させる。細胞培
養において永久的に生育する抗体産生細胞を得るために
は、このリンパ球を不死にしなければならない。このこ
とは種々の方式で例えば Epstein-Barr ウイルス又はレ
トロウイルスを用いる形質転換によって実施することが
できる。しかしこのリンパ球は骨髄腫細胞と融合させる
ことが好ましい。特に適当な骨髄腫細胞株は、免疫グロ
ブリンを分泌しないもの、例えば細胞株ＳＰ２／０−Ａ
ｇ１４又はＸ６３−Ａｇ８.６５３である。この細胞
は、３０〜６０％の強度の溶液の１０００〜６０００の
分子量を持つポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共に
インキュベーションすることによって融合させることが
できるが、電気的細胞融合（electrofusion）等の他の
方法も適当である。リンパ級と骨髄腫細胞とのハイブリ
ッド（ハイブリドーマ）を選択し、そして適当な栄養培
地中培養することによって生育させる。
【００１５】ハイブリドーマは細胞融合の１〜３週間後
特異的抗体の産生について試験される。それ自体当業者
に知られている多数の試験系をこれのために利用するこ
とができる。固体相上XIII因子が吸着されているＥＬＩ
ＳＡ試験系を使用することが好ましい。このハイブリド
ーマの細胞上清を初め固相上XIII因子と接触させて後、
マウスＩｇＧに対する酵素標識抗体とインキュベーショ
ンし、そして次に標識用酵素に対する色素産生基質を添
加することによってXIII因子特異性抗体を検出する。XI
IIＡ因子に対する特異的抗体を産生する細胞は、顕微鏡
検査下のプレートからの取出し（plating out）によ
り、又は制限希釈法によってクローン化される。クロー
ン細胞株は抗体を得るために生体外で生育させる。モノ
クローナル抗体は、細胞の消費済（spent）の培養基か
ら得られる。このために多くの方法を利用することがで
きる。固定化タン白Ａ又はXIIIＡ因子上アフィニティク
ロマトグラフィーを実施することが好ましい。
特異的抗体の産生について試験される。それ自体当業者
に知られている多数の試験系をこれのために利用するこ
とができる。固体相上XIII因子が吸着されているＥＬＩ
ＳＡ試験系を使用することが好ましい。このハイブリド
ーマの細胞上清を初め固相上XIII因子と接触させて後、
マウスＩｇＧに対する酵素標識抗体とインキュベーショ
ンし、そして次に標識用酵素に対する色素産生基質を添
加することによってXIII因子特異性抗体を検出する。XI
IIＡ因子に対する特異的抗体を産生する細胞は、顕微鏡
検査下のプレートからの取出し（plating out）によ
り、又は制限希釈法によってクローン化される。クロー
ン細胞株は抗体を得るために生体外で生育させる。モノ
クローナル抗体は、細胞の消費済（spent）の培養基か
ら得られる。このために多くの方法を利用することがで
きる。固定化タン白Ａ又はXIIIＡ因子上アフィニティク
ロマトグラフィーを実施することが好ましい。
【００１６】次にイムノアフィニティクロマトグラフィ
ーに対する適性について精製したモノクローナル抗体を
試験する。これを行なうためには、当業者に周知の方法
によって個々のモノクローナル抗体を適当な支持材料に
カップリングさせる。アフィニティクロマトグラフィー
における支持体として種々の材料、例えばアガロース、
ポリアクリルアミド又はセルロースの誘導体が使用され
る。例えば臭化シアン、カルボジイミドを用いるか、又
は過沃素酸塩を用いる隣接ヒドロキシル基の酸化による
支持体の活性化の後抗体をカップリングさせることがで
きる。多数の支持材料及びカップリング法が当業者に知
られている。原則として、カップリングされる抗体を害
さないか又はわずかにのみ害する普通の支持材料及びカ
ップリング法はどれでも適当である。
ーに対する適性について精製したモノクローナル抗体を
試験する。これを行なうためには、当業者に周知の方法
によって個々のモノクローナル抗体を適当な支持材料に
カップリングさせる。アフィニティクロマトグラフィー
における支持体として種々の材料、例えばアガロース、
ポリアクリルアミド又はセルロースの誘導体が使用され
る。例えば臭化シアン、カルボジイミドを用いるか、又
は過沃素酸塩を用いる隣接ヒドロキシル基の酸化による
支持体の活性化の後抗体をカップリングさせることがで
きる。多数の支持材料及びカップリング法が当業者に知
られている。原則として、カップリングされる抗体を害
さないか又はわずかにのみ害する普通の支持材料及びカ
ップリング法はどれでも適当である。
【００１７】次に種々のモノクローナル抗体とのアフィ
ニティゲルを、XIIIＡ因子の精製に対するその適性につ
いて試験する。これを行なうためには、XIIIＡ因子含有
溶液をアフィニティゲルに通し、そしてフロースルー中
のXIII因子活性を求める。XIIIＡ因子が吸着されている
ゲルは、XIIIＡ因子の未変形溶離の可能性について試験
する。好ましい操作においてはイムノアフィニティゲル
へのXIIIＡ因子の結合は低イオン強度の緩衝液中、５.
５〜８.５のｐＨにおいて又４℃〜３７℃の温度におい
て起こる。緩衝液は好ましくは０.０１〜０.０５モル／
リットルのトリス又は燐酸塩及び０〜０.１モル／リッ
トルのＮａＣｌを含有する。精製XIIIＡ因子を得るため
の次に抗原−抗体コンプレックスの解離は、XIIIＡ因子
の活性が不可逆的に破壊される条件を必要とすることが
多い。このことがXIII因子活性を保持したまま抗原−抗
体コンプレックスを解離することを許容する抗体が要求
される理由である。種々の温和な溶離剤、例えばいくつ
かの有機溶媒、洗剤、高イオン強度の水溶液又は種々の
溶離剤の組合せを使用することが原則として可能であ
る。XIIIＡ因子を溶離するのに好ましく使用されるの
は、５.５〜８.５のｐＨの０.０１〜０.０５モル／リッ
トルのトリス又は燐酸塩を用いる緩衝液中高濃度のアル
カリ金属又はアルカリ土類金属塩、例えば０.５〜３モ
ル／リットルのＮａＣｌである。
ニティゲルを、XIIIＡ因子の精製に対するその適性につ
いて試験する。これを行なうためには、XIIIＡ因子含有
溶液をアフィニティゲルに通し、そしてフロースルー中
のXIII因子活性を求める。XIIIＡ因子が吸着されている
ゲルは、XIIIＡ因子の未変形溶離の可能性について試験
する。好ましい操作においてはイムノアフィニティゲル
へのXIIIＡ因子の結合は低イオン強度の緩衝液中、５.
５〜８.５のｐＨにおいて又４℃〜３７℃の温度におい
て起こる。緩衝液は好ましくは０.０１〜０.０５モル／
リットルのトリス又は燐酸塩及び０〜０.１モル／リッ
トルのＮａＣｌを含有する。精製XIIIＡ因子を得るため
の次に抗原−抗体コンプレックスの解離は、XIIIＡ因子
の活性が不可逆的に破壊される条件を必要とすることが
多い。このことがXIII因子活性を保持したまま抗原−抗
体コンプレックスを解離することを許容する抗体が要求
される理由である。種々の温和な溶離剤、例えばいくつ
かの有機溶媒、洗剤、高イオン強度の水溶液又は種々の
溶離剤の組合せを使用することが原則として可能であ
る。XIIIＡ因子を溶離するのに好ましく使用されるの
は、５.５〜８.５のｐＨの０.０１〜０.０５モル／リッ
トルのトリス又は燐酸塩を用いる緩衝液中高濃度のアル
カリ金属又はアルカリ土類金属塩、例えば０.５〜３モ
ル／リットルのＮａＣｌである。
【００１８】次の実施例は本発明を例示する。
【００１９】実施例１ 免疫化用抗原（精製XIIIＡ因子）の製造 ａ） XIIIＡ因子精製用イムノアフィニティゲルの製造 アフィニティクロマトグラフィーによってXIIIＡ因子に
対する抗血清（Behringwerke）からXIIIＡ因子に対する
ポリクローナル抗体を精製した。これを行なうために抗
血清１０mlをタン白Ａ−Ｒセファロース（Pharmacia）
に通した。このゲルを０.１４モル／リットルのＮａ2Ｐ
Ｏ4、ｐＨ８.０、５００mlで洗浄した。結合抗体を０.
１モル／リットルのグリシン、ｐＨ３.０で溶離し、そ
して１モル／リットルのトリス、ｐＨ８.０でｐＨ６.５
に調整した。０.１モル／リットルのクエン酸トリナト
リウム（カップリング用緩衝液）に対して透析し、そし
て臭化シアンで活性化したＲセファロース４Ｂにカップ
リングさせた：臭化シアンで活性化したＲセファロース
４Ｂ １５ｇを１ミリモル／リットルのＨＣｌに懸濁
し、クロマトグラフィーカラム中に詰め、そしてＨＣｌ
（１ミリモル／リットル）１０００mlで洗浄した。次に
このカラムをカップリング用緩衝液５０mlを用いて平衡
化し、そして精製抗体（カップリング緩衝液中２mg／m
l）４０mlを含有する密封可能な容器中にゲルを移し、
室温において２時間振とうした。次にこのゲルをカラム
に戻し、カップリング用緩衝液１００mlで洗浄し、エタ
ノールアミン−ＨＣｌ（１モル／リットル、ｐＨ８.
０）１００mlを含有する密封可能な容器に入れ、室温に
おいて２時間振とうした。このゲルを再びカラム中に移
し、０.１モル／リットルの酢酸ナトリウム、１モル／
リットルのＮａＣｌ、ｐＨ４.０及び０.１モル／リット
ルのトリス、１モル／リットルのＮａＣｌ、ｐＨ８.０
各３００mlで交互に洗浄した。この操作を５回くり返し
た。最後に、０.０１モル／リットルのＮａ2ＨＰＯ4、
０.０１モル／リットルのＮａＨ2ＰＯ4、０.１５モル／
リットルのＮａＣｌ、ｐＨ７.２（ＰＢＳ）を用いて平
衡化し、これで使用準備ができた。
対する抗血清（Behringwerke）からXIIIＡ因子に対する
ポリクローナル抗体を精製した。これを行なうために抗
血清１０mlをタン白Ａ−Ｒセファロース（Pharmacia）
に通した。このゲルを０.１４モル／リットルのＮａ2Ｐ
Ｏ4、ｐＨ８.０、５００mlで洗浄した。結合抗体を０.
１モル／リットルのグリシン、ｐＨ３.０で溶離し、そ
して１モル／リットルのトリス、ｐＨ８.０でｐＨ６.５
に調整した。０.１モル／リットルのクエン酸トリナト
リウム（カップリング用緩衝液）に対して透析し、そし
て臭化シアンで活性化したＲセファロース４Ｂにカップ
リングさせた：臭化シアンで活性化したＲセファロース
４Ｂ １５ｇを１ミリモル／リットルのＨＣｌに懸濁
し、クロマトグラフィーカラム中に詰め、そしてＨＣｌ
（１ミリモル／リットル）１０００mlで洗浄した。次に
このカラムをカップリング用緩衝液５０mlを用いて平衡
化し、そして精製抗体（カップリング緩衝液中２mg／m
l）４０mlを含有する密封可能な容器中にゲルを移し、
室温において２時間振とうした。次にこのゲルをカラム
に戻し、カップリング用緩衝液１００mlで洗浄し、エタ
ノールアミン−ＨＣｌ（１モル／リットル、ｐＨ８.
０）１００mlを含有する密封可能な容器に入れ、室温に
おいて２時間振とうした。このゲルを再びカラム中に移
し、０.１モル／リットルの酢酸ナトリウム、１モル／
リットルのＮａＣｌ、ｐＨ４.０及び０.１モル／リット
ルのトリス、１モル／リットルのＮａＣｌ、ｐＨ８.０
各３００mlで交互に洗浄した。この操作を５回くり返し
た。最後に、０.０１モル／リットルのＮａ2ＨＰＯ4、
０.０１モル／リットルのＮａＨ2ＰＯ4、０.１５モル／
リットルのＮａＣｌ、ｐＨ７.２（ＰＢＳ）を用いて平
衡化し、これで使用準備ができた。
【００２０】ｂ） XIII因子の精製 胎盤XIII因子（RFibrogammin, Behringwerke AG）２５
００単位を蒸留水に溶解し、イムノアフィニティゲルを
通した。このゲルをＰＢＳで洗浄し、そして２８０nmの
吸収が０.０２未満になるとすぐに０.２Ｍのグリシン、
ｐＨ２.５で溶離した。溶離液はＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において単一バンドとして現われるXI
IIＡ因子を含有していた。
００単位を蒸留水に溶解し、イムノアフィニティゲルを
通した。このゲルをＰＢＳで洗浄し、そして２８０nmの
吸収が０.０２未満になるとすぐに０.２Ｍのグリシン、
ｐＨ２.５で溶離した。溶離液はＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において単一バンドとして現われるXI
IIＡ因子を含有していた。
【００２１】実施例２ XIIIＡ因子に対するモノクローナル抗体の製造 ａ） マウスの免疫 完全 Freund アジュバント中XIIIＡ因子（実施例１のと
おり製造）５０μｇのエマルジョンの皮下注射によって
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した（１日目）。不完全 F
reund アジュバント中エマルジョンにしたXIIIＡ因子３
０μｇを２８及び５６日目の各々に同様に皮下注射し
た。これに続いて９２日目に生理食塩水０.５ml中XIII
Ａ因子１００μｇを腹腔内注射した。
おり製造）５０μｇのエマルジョンの皮下注射によって
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した（１日目）。不完全 F
reund アジュバント中エマルジョンにしたXIIIＡ因子３
０μｇを２８及び５６日目の各々に同様に皮下注射し
た。これに続いて９２日目に生理食塩水０.５ml中XIII
Ａ因子１００μｇを腹腔内注射した。
【００２２】ｂ） リンパ球の骨髄腫細胞との融合 ９５日目に脾臓を取り出して後、機械的分解によってリ
ンパ球（約１×１０8細胞）が得られた。このリンパ球
を Dulbecco の修正 Eagle 培地（ＤＭＤＥ）中洗浄
し、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４、５×１０７細
胞と混合し、回転沈下（spin down）させた。上清を完
全に取り出し、次にＤＭＥＭ中ポリエチレングリコール
４０００の５０％強度の溶液０.５mlを１分間にわたっ
て１滴ずつ細胞ペレットに添加した。懸濁液を３７℃に
おいて９０秒間インキュベーションし、次にＤＭＥＭ
７.５mlを５分間にわたって添加することにより希釈し
た。室温において１０分間インキュベーションして後Ｄ
ＭＥＭで容量を４０mlとし、細胞を回転沈下させた。上
清を吸引して除き、次に２０％のウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）及び１３.６mg／mlのヒポキサンチン、０.１８mg／
mlのアミノプテリン、３.９mg／mlのチミジンを含有す
るＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）中再懸濁し、６つのマイクロ
タイタープレート（ウエルあたり２００μｌ）上インキ
ュベーションした。使用済の培地を３〜４日の間隔で新
鮮なものと置換し、１０日後ＨＡＴ培地をＨＴ培地に置
換した。
ンパ球（約１×１０8細胞）が得られた。このリンパ球
を Dulbecco の修正 Eagle 培地（ＤＭＤＥ）中洗浄
し、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４、５×１０７細
胞と混合し、回転沈下（spin down）させた。上清を完
全に取り出し、次にＤＭＥＭ中ポリエチレングリコール
４０００の５０％強度の溶液０.５mlを１分間にわたっ
て１滴ずつ細胞ペレットに添加した。懸濁液を３７℃に
おいて９０秒間インキュベーションし、次にＤＭＥＭ
７.５mlを５分間にわたって添加することにより希釈し
た。室温において１０分間インキュベーションして後Ｄ
ＭＥＭで容量を４０mlとし、細胞を回転沈下させた。上
清を吸引して除き、次に２０％のウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）及び１３.６mg／mlのヒポキサンチン、０.１８mg／
mlのアミノプテリン、３.９mg／mlのチミジンを含有す
るＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）中再懸濁し、６つのマイクロ
タイタープレート（ウエルあたり２００μｌ）上インキ
ュベーションした。使用済の培地を３〜４日の間隔で新
鮮なものと置換し、１０日後ＨＡＴ培地をＨＴ培地に置
換した。
【００２３】ｃ） XIIIＡ因子に対する抗体の検定 融合１４日後に、この融合細胞の細胞培養上清を酵素免
疫検定によってXIIIＡ因子に対する抗体について検定し
た：０.１モル／リットルのＮａＣｌ、０.１モル／リッ
トルの酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５中０.５μｇ／mlの因
子XIIIＡと共にポリスチレンマイクロタイタープレート
をインキュベーション（４℃、２４時間）した。次に細
胞培養上清を適用（３７℃、２時間）、続いてパーオキ
シダーゼを接合したマウスＩｇＧに対する抗体と共にイ
ンキュベーションした。使用した基質は０.１モル／リ
ットルのクエン酸、０.１モル／リットルのＮａ2ＨＰＯ
4、ｐＨ４.５中０.１％（重量／容量）の２,２′−アジ
ノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォ
ン酸及び０.１２％（容量／容量）のＨ2Ｏ2の溶液であ
った。３７℃において３０分間インキュベーションして
後、４０５nmの吸収を測定した。個々のインキュベーシ
ョン工程の間検定プレートのウエルをＰＢＳ／Tween で
洗浄した。
疫検定によってXIIIＡ因子に対する抗体について検定し
た：０.１モル／リットルのＮａＣｌ、０.１モル／リッ
トルの酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５中０.５μｇ／mlの因
子XIIIＡと共にポリスチレンマイクロタイタープレート
をインキュベーション（４℃、２４時間）した。次に細
胞培養上清を適用（３７℃、２時間）、続いてパーオキ
シダーゼを接合したマウスＩｇＧに対する抗体と共にイ
ンキュベーションした。使用した基質は０.１モル／リ
ットルのクエン酸、０.１モル／リットルのＮａ2ＨＰＯ
4、ｐＨ４.５中０.１％（重量／容量）の２,２′−アジ
ノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォ
ン酸及び０.１２％（容量／容量）のＨ2Ｏ2の溶液であ
った。３７℃において３０分間インキュベーションして
後、４０５nmの吸収を測定した。個々のインキュベーシ
ョン工程の間検定プレートのウエルをＰＢＳ／Tween で
洗浄した。
【００２４】ｄ） 抗体産生細胞株のクローニング 前述した酵素免疫検定において強い陽性反応（吸収＞
１.５）を上清が示した細胞を制限希釈法によってクロ
ーン化した。このためには、２０％のＦＣＳ及び５％の
ＲＨＥＣＳ（Costar）を含有するＤＭＥＭ中約６０の細
胞を細胞培養プレートの９６のウエルにわたって分配し
た。個々のクローンを顕微病下に同定し、そして抗体産
生について検定した。このクローニングを２回くり返し
た。
１.５）を上清が示した細胞を制限希釈法によってクロ
ーン化した。このためには、２０％のＦＣＳ及び５％の
ＲＨＥＣＳ（Costar）を含有するＤＭＥＭ中約６０の細
胞を細胞培養プレートの９６のウエルにわたって分配し
た。個々のクローンを顕微病下に同定し、そして抗体産
生について検定した。このクローニングを２回くり返し
た。
【００２５】ｅ） モノクローナル抗体の精製 クローン細胞株をローラーびん中に移し、そして Iscov
e の修正 Dulbecco 培地中培養して抗体を得た。細胞を
遠心分離及び低フィルターを通して濾過することによっ
て除去し、そして限外濾過によって上清を約１０分の１
に濃縮した。濃縮物をタン白Ａ−ＲセファロースＣＬ−
４Ｂ(Pharmacia）に通し、そして結合ＩｇＧを０.２モ
ル／リットルのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ３.０で溶離し
た。タン白含有画分を０.１モル／リットルのクエン酸
塩、ｐＨ６.５に対して透析し、限外濾過によって約５m
g／mlに濃縮した。
e の修正 Dulbecco 培地中培養して抗体を得た。細胞を
遠心分離及び低フィルターを通して濾過することによっ
て除去し、そして限外濾過によって上清を約１０分の１
に濃縮した。濃縮物をタン白Ａ−ＲセファロースＣＬ−
４Ｂ(Pharmacia）に通し、そして結合ＩｇＧを０.２モ
ル／リットルのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ３.０で溶離し
た。タン白含有画分を０.１モル／リットルのクエン酸
塩、ｐＨ６.５に対して透析し、限外濾過によって約５m
g／mlに濃縮した。
【００２６】実施例３ イムノアフィニティクロマトグラフィーによる未変性胎
盤XIIIＡ因子の精製 胎盤XIII因子の凍結乾燥濃縮物（RFibrogammin, Behrin
gwerke AG）を蒸留水に溶解した。この溶液１０ml（５.
２Ｕ／mgの比活性を持つXIII因子６００単位に相当）ず
つを、モノクローナル抗体を持つアフィニティゲル（実
施例２のとおり精製し、臭化シアンによって活性化され
たＲセファロース４Ｂに実施例１のとおりカップリン
グ）に通した。次に洗浄用緩衝液（０.０３モル／リッ
トルのＮａＣｌ、０.０２モル／リットルのＮａ2ＨＰＯ
4、ｐＨ７.４）１００mlを用いて未結合のタン白を洗い
出した。XIIIＡ因子は１モル／リットルのＮａＣｌを含
有する洗浄用緩衝液で溶離した。比活性は９０〜１０５
Ｕ／mgであった：このタン白は、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において７５,０００ダルトンの分子
量を持つ１つのバンドとして現われた。
盤XIIIＡ因子の精製 胎盤XIII因子の凍結乾燥濃縮物（RFibrogammin, Behrin
gwerke AG）を蒸留水に溶解した。この溶液１０ml（５.
２Ｕ／mgの比活性を持つXIII因子６００単位に相当）ず
つを、モノクローナル抗体を持つアフィニティゲル（実
施例２のとおり精製し、臭化シアンによって活性化され
たＲセファロース４Ｂに実施例１のとおりカップリン
グ）に通した。次に洗浄用緩衝液（０.０３モル／リッ
トルのＮａＣｌ、０.０２モル／リットルのＮａ2ＨＰＯ
4、ｐＨ７.４）１００mlを用いて未結合のタン白を洗い
出した。XIIIＡ因子は１モル／リットルのＮａＣｌを含
有する洗浄用緩衝液で溶離した。比活性は９０〜１０５
Ｕ／mgであった：このタン白は、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において７５,０００ダルトンの分子
量を持つ１つのバンドとして現われた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】 イムノアフィニティクロマトグラフィー
による凝固XIII又はXIIIＡ因子の精製法であって、支持
材料（アフィニティ材料）に結合されているXIIIＡに対
するモノクローナル抗体とXIII又はXIIIＡ因子を含有す
る溶液を接触させ、アフィニティ材料と液体とを互に分
離し、そしてアフィニティ材料から生物活性形態でXIII
又はXIIIＡ因子を溶離することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 モノクローナル抗体の免疫反応性フラグ
メント又は誘導体が支持材料に結合されている請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体が使
用される請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩
０.５〜３モル／リットルを含有する緩衝液が溶離のた
めに使用される請求項１〜３のうち少なくとも１項記載
の方法。 - 【請求項５】 ＩｇＭクラスを除くXIIIＡ因子に対する
モノクローナル抗体。 - 【請求項６】 ＩｇＧクラスの請求項５記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項７】 支持材料に結合されている請求項５記載
のモノクローナル抗体。 - 【請求項８】 XIIIＡ因子に対するモノクローナル抗体
又はこの型の抗体のフラグメント又は誘導体のXIII又は
XIIIＡ因子を精製するための使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4127841A DE4127841A1 (de) | 1991-08-22 | 1991-08-22 | Verfahren zur reinigung von faktor xiii, monoklonale antikoerper gegen faktor xiiia, ihre herstellung und verwendung |
| DE4127841:0 | 1991-08-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268990A true JPH05268990A (ja) | 1993-10-19 |
Family
ID=6438873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4222336A Pending JPH05268990A (ja) | 1991-08-22 | 1992-08-21 | Ｘｉｉｉ因子の精製法、ｘｉｉｉａ因子に対するモノクローナル抗体、その製造及び使用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5688919A (ja) |
| EP (1) | EP0529348B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05268990A (ja) |
| KR (1) | KR100245542B1 (ja) |
| AT (1) | ATE226595T1 (ja) |
| AU (1) | AU649868B2 (ja) |
| CA (1) | CA2076557C (ja) |
| DE (2) | DE4127841A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100389197B1 (ko) * | 2000-03-17 | 2003-06-27 | 유지현 | 실내의 매연 농도에 따라 다단식으로 자동 작동되는환풍방법 |
| US6660486B2 (en) * | 2001-05-31 | 2003-12-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | FXIII detection for verifying serum sample and sample size and for detecting dilution |
| US20070208163A1 (en) * | 2003-07-10 | 2007-09-06 | Novo Nordisk A/S | Method for treatment of protein precipitates |
| WO2018111010A1 (ko) * | 2016-12-14 | 2018-06-21 | (주) 팬젠 | 항-혈액응고 제viii인자 항체 및 그 용도 |
| US11155635B2 (en) | 2016-12-14 | 2021-10-26 | Pangen Biotech Inc. | Anti-coagulation factor VIII antibody and use thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO830570L (no) * | 1982-02-22 | 1983-08-23 | Carlton Med Prod | Antistoffer og antigener for diagnose og behandling av cancer |
| JPH01258700A (ja) * | 1988-04-05 | 1989-10-16 | Green Cross Corp:The | 血液凝固第４因子の精製方法 |
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1991
- 1991-08-22 DE DE4127841A patent/DE4127841A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-08-03 DE DE59209970T patent/DE59209970D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-03 ES ES92113176T patent/ES2183803T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-03 EP EP92113176A patent/EP0529348B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-03 AT AT92113176T patent/ATE226595T1/de active
- 1992-08-20 KR KR1019920014956A patent/KR100245542B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-08-21 AU AU21246/92A patent/AU649868B2/en not_active Ceased
- 1992-08-21 CA CA002076557A patent/CA2076557C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-21 JP JP4222336A patent/JPH05268990A/ja active Pending
-
1994
- 1994-07-15 US US08/275,656 patent/US5688919A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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| KR930004476A (ko) | 1993-03-22 |
| DE4127841A1 (de) | 1993-02-25 |
| AU649868B2 (en) | 1994-06-02 |
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| AU2124692A (en) | 1993-02-25 |
| KR100245542B1 (ko) | 2000-02-15 |
| DE59209970D1 (de) | 2002-11-28 |
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