WO2018111010A1 - 항-혈액응고 제viii인자 항체 및 그 용도 - Google Patents

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WO2018111010A1
WO2018111010A1 PCT/KR2017/014747 KR2017014747W WO2018111010A1 WO 2018111010 A1 WO2018111010 A1 WO 2018111010A1 KR 2017014747 W KR2017014747 W KR 2017014747W WO 2018111010 A1 WO2018111010 A1 WO 2018111010A1
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antibody
seq
antigen
factor viii
recombinant
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PCT/KR2017/014747
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윤재승
백광희
변태호
박정수
김지태
오한규
이종민
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(주) 팬젠
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors

Definitions

  • the present invention relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to coagulation factor VIII and uses thereof. More specifically, the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a coagulation factor VIII factor including heavy chain CDRs and light chain CDRs of a specific sequence, a recombinant coagulant to which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound.
  • Blood coagulation is stabilized by the coagulation cascade of several factors, including fibrinogen and II, III, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, and XIII factors. through the process of forming a cross-linked fibrin (the Roman numeral of the coagulation factor is not a sequence of continuous reactions). If any one of these factors is missing, bleeding occurs in the human body due to poor coagulation. Symptoms that can be clinically observed due to such blood clotting abnormalities include joint deformation due to intraarticular bleeding, edema due to intramuscular bleeding, intracranial bleeding, and the like. Excessive bleeding can cause life-threatening symptoms.
  • Hemophilia is a representative disease of these coagulopathy disorders and is an X-linked recessive disorder and rarely caused by mutations. Hemophilia is classified into hemophilia A due to deficiency of factor VIII (FVIII) and hemophilia B due to deficiency in factor IX (FIX). Hemophilia can also be classified as mild, moderate or severe, depending on the degree of deficiency of the associated coagulation factor. It is estimated that hemophilia A occurs at about 1 in every 5,000 children born, and hemophilia B occurs at about 1 in every 20,000 boys born, with at least 400,000 hemophilia patients worldwide. For the on-demand and prophylactic treatment of hemophilia, a method of externally administering a deficient clotting factor has been used. Such replacement therapy may be used to increase the life expectancy of hemophilia patients.
  • Isolation and purification of the recombinant hemagglutination factor VIII is carried out through a series of chromatographic steps as in the process of isolation and purification of common protein therapeutics.
  • Chromatography uses two immiscible phases, for example, the stationary phases of the mobile phase in which the target substance to be separated is dissolved together with various substances. It is a technique to separate the target substance by contacting it.
  • the sample mixture dissolved in the mobile phase undergoes a series of interactions with the stationary phase while the mobile phase flows through the column packed with the stationary phase. Aspects of this interaction depend on the physical or chemical properties of the sample mixture components (solutes).
  • the stationary phase described above generally consists of a support or matrix to which a ligand comprising a functional group, ie, a bonding group, is attached.
  • Chromatography can be characterized by various kinds of chromatography based on the principle of interaction of sample components in the stationary and mobile phases employed. These include ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • affinity chromatography is based on specific interactions between target biomolecules and biospecific ligands of the lock & key recognition principle.
  • targets and ligands are composed of affinity pairs such as antigens / antibodies, enzymes / substrates, ligands / receptors, and the like.
  • Protein A-based affinity chromatography which is a widely used method for protein isolation and purification, is well known as Protein A and Protein G. It is well known that Protein A chromatography provides particularly significant specificity for monoclonal antibodies, and consequently high purity monoclonal antibodies can be obtained.
  • the inventors of the present application have developed a novel antibody that specifically binds to the coagulation factor VIII factor, and applies the antibody to the purification of recombinant coagulation factor VIII factor to obtain high purity of the recombinant coagulation factor VIII factor. It was confirmed that it can be separated or purified by, to complete the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, a recombinant expression vector comprising the same, and a host cell comprising the same, and a method of preparing the antibody.
  • Still another object of the present invention is to provide a column for isolation or purification of recombinant hemagglutinin factor VIII, to which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound, and a method for purifying recombinant hemagglutinin factor VIII using the same.
  • the present invention is a heavy chain CDR selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 3; And it provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the coagulation factor VIII factor comprising a light chain CDR selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 to 6.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention also provides a host cell transformed with the recombinant expression vector.
  • the present invention also provides a method for producing an antibody comprising culturing the host cell to produce an antibody or antigen-binding fragment thereof, and recovering, isolating and purifying the produced antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a column for separation or purification of recombinant hemagglutination factor VIII to which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound.
  • the present invention also provides a method for purifying recombinant hemagglutinin factor VIII, comprising loading a sample containing recombinant hemagglutinin factor VIII factor in the column.
  • Figure 1 shows the result of confirming the isoelectric point value of the antibody by separating the purified antibody protein according to the isoelectric point.
  • Figure 2 shows the results confirming the immunological properties of the antibody protein purified through Western blot.
  • Figure 3 shows the results confirmed by the antigen, antibody reaction whether the purified anti-FVIII antibody protein specifically binds to the recombinant coagulation factor FVIII factor antigen.
  • the present invention in one aspect, heavy chain CDR selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 3; And an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a coagulation factor VIII factor comprising a light chain CDR selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4-6.
  • antibody refers to a protein molecule comprising an immunoglobulin molecule that specifically recognizes an antigen and immunologically responds to a specific antigen, and is a complete antibody that specifically binds to factor VIII In addition to forms, antigen binding fragments of such antibody molecules are also included.
  • IgA whole antibodies consist of two full-length light chains and two full-length heavy chains bound by disulfide bonds between the light and heavy chains.
  • IgA immunoglobulfide bonds between the light and heavy chains.
  • IgD immunoglobulfide bonds between the light and heavy chains.
  • IgE immunoglobulfide bonds between the light and heavy chains.
  • IgM immunoglobulfide bonds between the light and heavy chains.
  • IgG immunoglobulfide bonds between the light and heavy chains.
  • IgG immunoglobulfide bonds between the light and heavy chains.
  • antibody fragment refers to a fragment that retains at least antigen-binding performance and may include Fab, F (ab '), F (ab') 2 , and Fv.
  • Fab consists of the variable region of each of the heavy and light chains, the constant domain of the light chain, and the first constant domain of the heavy chain (CH1), with an antigen binding site.
  • F (ab ') differs from Fab in that it further comprises at least one cysteine residue at the C-terminus of the CH1 domain of the heavy chain.
  • F (ab ') 2 consists of two Fab' molecules with disulfide bonds between the cysteine residues of the hinge region.
  • the Fv (variable fragment) consisting of the variable regions of each of the heavy and light chains is the smallest antibody fragment that contains the original specificity of the parent immunoglobulin.
  • Disulfide-stabilized Fv (dsFv) is formed by binding the variable region of the heavy chain to the variable region of the light chain via disulfide bonds.
  • Single chain Fv (scFV) is an Fv covalently linked by a peptide linker at each variable region of the heavy and light chains.
  • These antibody fragments can be obtained by protease treatment of the entire antibody with a protease (e.g., papain or pepsin providing Fab or F (ab ') 2, preferably by genetic recombination techniques. have.
  • the antibody according to the invention is in Fv form (eg scFv) or is in the form of a complete antibody.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) or epsilon ( ⁇ ).
  • the light chain constant region may be of kappa ( ⁇ ) or lambda ( ⁇ ) type.
  • Heavy chain refers to both the variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and the full length heavy chain and fragments thereof comprising three constant region domains CH1, CH2 and CH3
  • the term “light chain” refers to a full-length light chain and fragment thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. Means all.
  • immunoglobulins have a basic structural unit consisting of two heavy chains and two light chains. Each heavy chain consists of one variable region and three constant domains, while each light chain consists of one variable region and one constant domain.
  • the variable region of each of the heavy and light chains comprises three complementarity-determining regions (hereinafter referred to as "CDRs") and four framework regions. CDRs function to bind to the epitope of the antibody.
  • the CDRs on each chain are arranged in sequence from CDR1 to CDR1, CDR2 and CDR3. These are distinguished by the chain in which they are located.
  • the antibody according to the present invention includes, for example, a heavy chain variable region comprising a CDR1 of SEQ ID NO: 1, a CDR2 of SEQ ID NO: 2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 3; And a light chain variable region comprising CDR1 of SEQ ID NO: 4, CDR2 of SEQ ID NO: 5, and CDR3 of SEQ ID NO: 6.
  • the antibody according to the present invention comprises a heavy chain variable region framework region (FR) of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-10; And a light chain variable region framework region (FR) of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11-14.
  • FR heavy chain variable region framework region
  • FR light chain variable region framework region
  • the antibody according to the present invention may include a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region of SEQ ID NO: 16, and may include a heavy chain of SEQ ID NO: 17 and a light chain of SEQ ID NO: 18.
  • Antibodies according to the invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, whole antibodies and antibody fragments.
  • chimeric antibodies eg, humanized murine antibodies
  • bivalent or bispecific molecules eg, bispecific antibodies
  • monoclonal antibody refers to an antibody molecule having a uniform molecular composition, obtained from substantially the same population of antibodies and showing binding specificity and affinity for a single epitope.
  • Non-human (eg murine) antibodies in the “humanized” form are chimeric antibodies that contain minimal sequences derived from non-human immunoglobulins.
  • humanized antibodies are non-human species (donor antibodies) that retain the desired specificity, affinity, and capacity for residues from the hypervariable region of the recipient, for example mice, rats, rabbits, or non-humans.
  • donor antibodies non-human species
  • Human immunoglobulins (receptor antibodies) replaced with residues from the hypervariable regions of primates.
  • a "human antibody” is a molecule composed entirely of amino acid sequences of all components of human immunoglobulins, including CDRs, framework sites, and the like. Human antibodies have at least three potential advantages in the treatment of human disease. First, human antibodies interact more preferably with the human immune system, effectively leading to complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Mediates the disappearance of target cells. Second, another benefit is that the human immune system does not recognize human antibodies as exogenic molecules, so that the adverse effects of immunocomplex formation that can occur in the case of chimeric or humanized antibodies upon human administration ) Can be minimized.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCC antibody dependent cell-mediated cytotoxicity
  • the formation of such immunocomplexes may cause short half-lives of chimeric antibodies or humanized antibody preparations administered in humans, while the half-life of human antibodies may be reduced in the human immune system even when administered in smaller or less frequent doses. Similar to naturally occurring antibodies.
  • the antibody of the invention comprises a constant domain, it can be derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM or a combination or hybrid thereof.
  • dimer or multimers can be formed from two or more constant domains selected from the group consisting of constant domains of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.
  • hybrid means that a sequence encoding two or more heavy chain constant domains of different origin is present in the single chain immunoglobulin heavy chain constant domain.
  • a domain hybrid may consist of one to four domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM. Combinations of hybrids can also be generated from the heavy chain constant domains of IgG isotypes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Combinations of hybrids are as defined above.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention includes not only the sequences of the anticoagulant VIII factor antibodies of the present invention described herein, but also biological equivalents thereof, so long as they specifically recognize the coagulation Factor VIII factor. can do.
  • further changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • Such modifications include, for example, deletions, insertions and / or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • Such amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged basic residues; Alanine, glycine and serine are similar small in size amino acids; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine are classified as amino acids having an aromatic side chain. Thus, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically equivalent functions.
  • each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in conferring the interactive biological function of proteins. It is known that substitution with amino acids having similar hydrophobicity indexes can retain similar biological activity. When introducing mutations with reference to the hydrophobicity index, substitutions are made between amino acids which exhibit a hydrophobicity index difference of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, even more preferably within ⁇ 0.5.
  • an antibody of the present invention or a nucleotide molecule encoding the same is interpreted to include a sequence that exhibits substantial identity with the sequence described in SEQ ID NO.
  • the above substantial identity is at least 61% when the sequence of the present invention is aligned as closely as possible with any other sequence, and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • a sequence that shows homology more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • BLAST The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is accessible from NBCI and the like and can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx on the Internet.
  • BLSAT is accessible at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparisons using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the invention relates to a polynucleotide encoding said antibody or antigen binding fragment thereof.
  • Polynucleotides encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be isolated to recombinantly produce the antibody or antigen-binding fragment thereof. Polynucleotides are isolated and inserted into replicable vectors for further cloning (amplification of DNA) or for further expression. Based on this, the present invention relates to a vector comprising the polynucleotide in another aspect.
  • Nucleotide is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules generically, and the nucleotides that are the basic building blocks of nucleotides include not only natural nucleotides, but also analogs with modified sugar or base sites. .
  • the sequence of polynucleotides encoding heavy and light chain variable regions of the invention can be modified. Such modifications include addition, deletion, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • the invention may be a polynucleotide encoding a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 20 or a polynucleotide encoding a light chain variable region of SEQ ID NO: 21. In another embodiment, the invention may be a polynucleotide encoding the heavy chain of SEQ ID NO: 22 or a polynucleotide encoding the light chain of SEQ ID NO: 23.
  • the present invention is also construed to include nucleotide sequences that exhibit substantial identity to the nucleotide sequence.
  • Substantial identity is at least 80% homology when aligning the nucleotide sequence of the present invention with any other sequence as closely as possible and analyzing the aligned sequence using algorithms commonly used in the art.
  • a nucleotide sequence that exhibits at least 90% homology, most preferably at least 95% homology.
  • the DNA encoding the antibody is readily isolated or synthesized using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes capable of specifically binding to the DNA encoding the heavy and light chains of the antibody).
  • Many vectors are available, and vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: 1) a signal sequence, 2) the origin of replication 3 A) one or more marker genes 4) enhancer elements 5) promoters, and transcription termination sequences.
  • the term "vector” refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Cosmid vector; Viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors (AAV), and the like.
  • the polynucleotide encoding the antibody in the vector is operably linked with a promoter.
  • “Operably linked” means a functional linkage between a polynucleotide expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites) and other polynucleotide sequences, thereby The regulatory sequence will control the transcription and / or translation of the other polynucleotide sequence.
  • a polynucleotide expression control sequence eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites
  • promoters capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • ribosome binding sites for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell e.g., a metallothionine promoter, a ⁇ -actin promoter, a human heroglobin promoter and a human muscle creatine promoter
  • a mammal Promoters derived from animal viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse breast tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV
  • Promoters of Moroni virus Epsteinbar virus (EBV), promoters of Loews Sacoma virus (RSV) and EF 1 alpha promoter and variants thereof can be used, and polyadenylation sequences are generally used as transcription termination sequences.
  • the vector may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • Such vectors include antibiotic resistance genes commonly used in the art as selectable markers and include, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline. There is a resistance gene.
  • the present invention relates to a recombinant host cell transformed with the above-mentioned vector.
  • the cells used to produce the antibodies of the invention can be prokaryote, yeast or higher eukaryote cells, but are not limited thereto.
  • Bacillus strains such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g., Pseudomonas futius)
  • Prokaryotic host cells such as Pseudomonas putida
  • Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • examples of useful host cell lines are COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO / -DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2 / 0, NS-0 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of culturing the recombinant host cell to produce an antibody or antigen-binding fragment thereof; And it relates to a method for producing the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the step of recovering, separating and purifying the produced antibody.
  • the cells can be cultured in various media. It can be used as a culture medium without limitation among commercial media. All other necessary supplements known to those skilled in the art may be included at appropriate concentrations. Culture conditions, such as temperature, pH, and the like, are already in use with host cells selected for expression, which will be apparent to those skilled in the art.
  • the recovery of the antibody or antigen-binding fragment thereof can be removed by, for example, centrifugation or ultrafiltration, and the resultant can be purified using, for example, affinity chromatography or the like. Further other purification techniques such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interation chromatography, hydroxyapatite (HA) chromatography and the like can be used.
  • the present invention relates to a column for separating or purifying recombinant hemagglutinin factor VIII, to which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound.
  • Isolation and Purification is a set of methods for distinguishing certain proteins, such as coagulation factor VIII, from impurities in the complex mixture and removing other impurities to increase purity or improve quality. It means the process. According to the anti-coagulant factor VIII antibody attached to the column, the coagulation factor VIII that specifically binds to the antibody is detected from impurities mixed in the sample.
  • the impurities may be mixed with substances other than the target substance in the purification process, and may include, for example, host cell proteins, host cell residues, cell debris and proteins, DNA, endotoxins, and culture factors for cell growth. have.
  • Columns are used in chromatographic processes for the separation, detection or purification of target proteins (eg recombinant hemagglutinin factor VIII) from complex mixtures using the physico-chemical properties of the target protein.
  • a stationary phase is a device that is charged.
  • the target protein may be selectively separated from the mixture or impurities by preparing a column packed with the stationary phase depending on the degree of hydrophilicity or hydrophobicity of the target material, the potential of the molecule, or the binding force with a specific material.
  • the column may be filled with coagulation factor VIII affinity stationary material, which may be, for example, in the form of a resin or agarose bead.
  • coagulation factor VIII affinity stationary material which may be, for example, in the form of a resin or agarose bead.
  • sepharose a resin in the form of cross-linked agarose beads
  • a stationary phase in which anti-coagulant factor VIII antibody is bound as a ligand.
  • a column for separation or purification of recombinant hemagglutination factor VIII is prepared.
  • the present invention further relates to a method for purifying recombinant coagulation Factor VIII factor comprising the step of interacting a sample containing a recombinant coagulation Factor VIII factor with a ligand bound to the column stationary phase.
  • the sample loaded onto the column may be, for example, a cell culture liquid or a fermentation broth, and when such a sample is loaded onto the column and purified, the host cell protein and host cell residues other than the target protein may be removed from the sample. Cell debris and proteins, DNA, endotoxins and the like can be removed.
  • Recombinant hemagglutinin factor VIII contained in the sample binds to the anticoagulant VIII factor antibody bound to the column stationary phase through an antigen-antibody reaction. Thereafter, a separate elution process may separate the recombinant coagulation Factor VIII factor bound to the anti-blood coagulation Factor VIII antibody.
  • the composition and the elution conditions of the eluate can be set to conditions that can be commonly performed by those skilled in the art, and can be combined with a suitable buffer or liquid to provide the mobile phase.
  • substantially pure means that substantially all of the material other than the recombinant coagulation factor VIII factor has been removed, and advantageously at least about 80%, eg at least about 95%, ie 95-100 of the total amount of contaminants. It is meant that between%, for example at least about 98%, ie between 98-100%, preferably at least about 99%, ie 99-100%, can be removed. Possible purity may depend on the concentration of recombinant coagulation factor VIII in the sample applied to the column and other conditions used.
  • Recombinant coagulation Factor VIII protein for use in immunization for monoclonal antibody production against recombinant coagulation Factor VIII protein (SEQ ID NO: 19) was isolated and purified from cell culture. Balb / c mice were used as animals for immunization.
  • Recombinant blood coagulation factor VIII protein and the same amount of adjuvant were mixed well and injected intraperitoneally into mouse Balb / c. After 25 days, a further injection of the same amount of recombinant coagulation factor VIII protein and an adjuvant was added, and serum was collected from the mice and further injections were performed until a good positive response was obtained for the recombinant coagulation factor VIII protein.
  • SP2 / 0 mouse myeloma cells
  • the cells were suspended in a selective medium containing HAT (Hypoxanthine, Aminopterine, Thymidine) and transferred to 96 well plates to inhibit the growth of unfused cells.
  • HAT Hexanthine, Aminopterine, Thymidine
  • recombinant blood coagulation factor VIII protein-specific ELISA was analyzed, and the cells of the well-positive wells were transferred to a new plate and cultured.
  • monoclonal cell line selection was performed by limiting dilution. 33 clones with positive reaction were selected by ELISA method using the culture of wells with colonies.
  • the cultures of the selected clones were identified for binding to antigen using Biacore, and then two clones (3F6-2-5 and 5F4-9-1) which were considered most suitable as antibodies for purification of recombinant coagulation factor VIII protein were selected. It was. Of the two clones, 3F6-2-5, which has better binding to the antigen, was selected as an antibody producing hybridoma clone against the recombinant hemagglutinating factor VIII protein. Analysis of the isotype of the antibody produced by the 3F6-2-5 clone showed that the heavy chain was IgG1 and the light chain was an antibody belonging to the kappa group.
  • the heavy and light chain genes of antibodies against recombinant hemagglutinin factor VIII protein (FVIII) (hereinafter anti-FVIII antibody) were extracted from mouse hybridoma cells (3F6-2-5) that produce antibodies to FVIII. , RT-PCR was performed.
  • the GSP1 gene specific primer
  • GSP2 and nested primers for the 3 ′ constant region were prepared.
  • the PCR product formed was cloned into a T-vector to analyze the base sequence. Accordingly, the base sequence of the 5 ′ portion including the signal sequence was confirmed.
  • Primers were prepared according to the identified nucleotide sequences, and heavy chain genes were obtained through RT-PCR.
  • GSP1 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGT (SEQ ID NO: 24)
  • GSP2 5'-CCTTGGCCCCAGAAGTGGTAA (SEQ ID NO: 25)
  • pPGIX pangen unique expression vector
  • a heavy chain gene inserted into the T-vector after constructing a primer to include 5'- Nhe I and 3'- Xho I restriction enzyme recognition sequences was amplified.
  • pPGIX-Anti-FVIII-HC was prepared, and the nucleotide sequence of the inserted heavy chain gene was confirmed (SEQ ID NO: 22).
  • the light chain gene was extracted from 3F6-2-5 hybridoma cells, and then prepared using 11 primers for 5'-primers and 3 'constant regions (MKCIII) prepared based on known signal sequences. RT-PCR was performed.
  • RT-PCR results confirmed the 700bp band including light chain variable region and constant region in PCR product using MKV7 primer and 3′-MKCIII primer.
  • the obtained PCR product was cloned into T-vector and the nucleotide sequence was confirmed.
  • MKV1 5'-GCT AGC GCC ACC ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG (SEQ ID NO: 27)
  • MKV2 5'-GCT AGC GCC ACC ATG GAG WCA GAC ACA CTC CTG YTA TGG GTG (SEQ ID NO: 28)
  • MKV3 5'-GCT AGC GCC ACC ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GSG TTG (SEQ ID NO: 29)
  • MKV4 5'-GCT AGC GCC ACC ATG AGG RCC CCT GCT CAG WTT YTT GGM WTC (SEQ ID NO: 30)
  • MKV5 5'-GCT AGC GCC ACC ATG GAT TTW CAG GTG CAG ATT WTC AGC TTC (SEQ ID NO: 31)
  • MKV6 5'-GCT AGC GCC ACC ATG AGG TKC YYT GYT SAG YTY CTG RGG (SEQ ID NO: 32)
  • MKV7 5'-GCT AGC GCC ACC ATG GGC WTC AAG ATG GAG TCA CAK WYY CWG G (SEQ ID NO: 33)
  • MKV8 5'-GCT AGC GCC ACC ATG TGG GGA YCT KTT TYC MMT TTT TCA ATT G (SEQ ID NO: 34)
  • MKV9 5'-GCT AGC GCC ACC ATG GTR TCC WCA SCT CAG TTC CTT G (SEQ ID NO: 35)
  • MKV10 5'-GCT AGC GCC ACC ATG TAT ATA TGT TTG TTG TCT ATT TCT (SEQ ID NO: 36)
  • MKV11 5'-GCT AGC GCC ACC ATG GAA GCC CCA GCT CAG CTT CTC TTC C (SEQ ID NO: 37)
  • a primer was prepared to include 5'- Nhe I and 3'- Xho I restriction enzyme recognition sequences, and the light chain gene inserted into the T-vector was amplified by PCR.
  • the PCR product and the expression vector were treated with Nhe I and Xho I restriction enzymes, conjugated to prepare pPGIX-Anti-FVIII-LC, and the nucleotide sequence of the inserted light chain gene was confirmed (SEQ ID NO: 23).
  • the heavy and light chain genes inserted in the expression plasmids pPGIX-Anti-FVIII-HC and pPGIX-Anti-FVIII-LC were transferred to the Panzen native expression vector pPGX for transduction to develop cell lines with higher expression efficiency.
  • pPGIX-Anti-FVIII-HC and pPGIX-Anti-FVIII-LC plasmid DNAs were treated with Nhe I and Xho I restriction enzymes and then conjugated to pPGX treated with the same restriction enzymes, respectively, to pPGX-Anti-FVIII-HC and pPGX- Anti-FVIII-LC plasmid DNA was constructed.
  • Transduction of the expression plasmid into the CHO DG44 host cell line was performed on a 24-well scale, and simultaneous pPGX-Anti-FVIII-HC, pPGX-Anti-FVIII-LC, and pDCH1P (dhfr) were performed by electroporation. Transduced. After incubation in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, the cells were grown in selective medium so that only the transformed cells were grown when the cells had grown sufficiently. After about two weeks, when the cells had grown sufficiently, a portion of the culture was taken to select anti-FVIII antibody expressing cell population by ELISA assay.
  • ADBA1001, ADBA1003, ADBA1011, ADBA1013, ADBA1014 Five cell groups (ADBA1001, ADBA1003, ADBA1011, ADBA1013, ADBA1014) were selected based on the results of the ELISA assay, and single clonal selection was performed to secure a high expression efficiency and stable cell line.
  • the cells were cultured in a 96-well plate so as to be 1 cell / well in culture medium, and colonies formed after about 4 weeks were analyzed to select high-efficiency cell lines. When sufficient number of cells were secured, the expression efficiency of monoclonal cell lines was compared and analyzed by ELISA method, and 6 highly productive monoclonal cell lines (ADBA1003-22, ADBA1011-19, ADBA1013-14, ADBA1013-27, ADBA1014-11 , ADBA1014-69) were selected as candidate cell lines.
  • Antibody proteins were isolated and purified using a culture of an ADABA1013-14 cell line. Affinity chromatography was performed using a column packed with Protein A resin. The column was mounted on AKTA Pure (GE healthcare), the column was equilibrated with a 20 mM Sodium phosphate / 150 mM Sodium chloride (pH 7.4) equilibration buffer, and the culture solution was loaded. The column was then washed and only the antibody protein was eluted with a 20 mM Sodium citrate (pH 3.5) elution buffer. For virus inactivation of the eluted protein fraction, the pH of the eluate was lowered to 3.5 using 1N HCl and reacted at room temperature for 180 minutes.
  • the cells were diluted with 4 volumes of water for injection, followed by Q Sepharose column chromatography.
  • a column was installed in AKTA Pure (GE healthcare), and the sample was loaded after equilibrating the column with a 4 mM Citric acid / 10 mM Sodium phosphate equilibration buffer. Flowthrough from loading samples was collected and filtered through a 0.22 ⁇ m PES membrane, followed by nanofiltration.
  • Peptide mapping assays were used to identify N-glycosylation sites of purified antibody proteins.
  • Purified antibody protein was desalted & concentrated using TCA precipitation (Trichloroacetic acid precipitation) method.
  • the obtained samples were treated with Trypsin and Trypsin / PNGase F, respectively, and then treated with DTT and iodoacetamide for reduction and alkylation.
  • LC-MS / MS peptide sequencing analysis using the sample before and after PNGase F treatment revealed glycosylation of Asparagine in heavy chain as No. 288 It was confirmed.
  • Isoelectric point (pI) identification Isoelectric focusing
  • Purified antibody proteins were separated according to isoelectric point (pI) to determine the isoelectric point value of the antibody.
  • IEF marker pI 3-10
  • purified antibody protein 20 ⁇ g were loaded onto Novex® pH 3-7 IEF Gel and subjected to electrophoresis for 1 h, 1 h and 30 min at 100 V, 200 V and 500 V voltage respectively. It was.
  • the gel was fixed in 12% TCA (Trichloroacetic acid) for 30 minutes, washed three times with ultrapure water for 10 minutes, and treated until sufficiently stained with GelCode Blue Stain Reagent. After the staining was completed, the pI band was visually confirmed by washing with ultrapure water, and each pI value was analyzed using a Gel Doc XR + imager.
  • the molecular weight of the purified antibody protein was used to determine the one-dimensional structure of the protein.
  • the purified antibody protein diluted to 1 mg / mL was treated with a 1 M DTT solution to a final concentration of 20 mM and reacted at room temperature for 40 minutes, and then the molecular weight of the heavy / light chain was measured using LC-MS.
  • Peptides isolated from HPLC were linked to the ESI source of Q-TOF MS to determine the mass of peptide ions. Molecular weight was determined using DataAnalysis software and analyzed by deconvolution by the Maximum Entropy method.
  • the native form molecular weight of the purified antibody protein was found to be 147,859 ⁇ 148,394 Da.
  • the pattern was increased by about 3,000 Da compared to the molecular weight of the theoretical antibody protein except the sugar molecular weight, which is judged as an average of sugar molecular weights bound to two heavy chains.
  • the molecular weight of the light chain was determined to be 24,323 Da ( ⁇ 2 Da) and exactly matched the light chain molecular weight of the theoretical antibody protein.
  • the major molecular weight was detected as 49,715 Da.
  • the molecular weight of about 1,300 Da was increased compared to the molecular weight of the theoretical heavy chain, which is judged to be due to the molecular weight of sugar bound to Asn of heavy chain 288.
  • the immunological characteristics of the purified antibody protein through antigen and antibody reactions were analyzed.
  • the final volume was 10 ⁇ L by adding PBS.
  • the samples under reducing conditions were boiled at a temperature of 95 ° C. or higher for 10 minutes and then placed on ice. Samples were prepared by ice cooling for 5 minutes. After loading the prepared sample on 10% SDS-PAGE gel, electrophoresis was performed for 30 minutes at 80 V, 1 hour 30 minutes at 100 V. After completion of the running (Running) was transferred to the nitrocellulose membrane (nitrocellulose membrane), and blocked (blocking) for 1 hour with 5% skim milk (skim milk).
  • goat anti-mouse IgG, AP conjugate goat anti-mouse IgG, AP conjugate diluted 1: 1,000 was treated for 2 hours at room temperature, and then washed three times for 10 minutes with 1 ⁇ TBST. After the washing step, the membrane was treated with NBT / BCIP for color development for protein detection. After observing that the color was sufficiently developed, the reaction was stopped by washing with running water.
  • Recombinant hemagglutinin FVIII factor was diluted to 0.02 mg / mL to prepare 200 and 400 ng, and then PBS was added so that the final volume was 20 ⁇ L.
  • 5 ⁇ L of 5X reducing sample buffer was mixed, boiled at a temperature of 95 ° C. or higher for 10 minutes, and then cooled on ice for 5 minutes, and centrifuged to prepare a sample. After loading the prepared sample in 7.5% gel, electrophoresis was performed for 30 minutes at 80 V, 1 hour 30 minutes at 100 V. After completion of running (transfer) was transferred to the nitrocellulose membrane (nitrocellulose membrane), and blocked with (5% skim milk) for 1 hour.
  • the purified antibody protein (Mouse IgG) diluted 1: 1,000 was treated with overnight at 4 ° C., and then washed with 1 ⁇ TBST three times for 10 minutes.
  • the secondary antibody (secondary antibody: Goat anti-mouse IgG, AP conjugate) diluted 1: 5,000 was reacted for 2 hours at room temperature, and then washed three times with 1X TBST for 10 minutes.
  • the membrane was treated with NBT / BCIP for color development. After observing that the color was sufficiently developed, the reaction was stopped by washing in running water.
  • BIAevalution analysis software was used to analyze the kinetic affinity of the purified antibody protein and recombinant coagulant FVIII factor protein.
  • the binding force, dissociation force and dissociation constant were calculated as follows by substituting 10 concentrations of binding / dissociation data into a 1: 1 kinetic binding model (A + B ⁇ AB).
  • the KD value of the purified antibody protein against recombinant hemagglutinin FVIII factor protein was analyzed to be 5.53E- 08 M.
  • Mab gel was prepared using purified antibodies for preparation of recombinant hemagglutinating agent FVIII factor protein purification column.
  • Purified antibodies were exchanged with coupling buffer (sodium bicarbonate, sodium phosphate, pH 8.3) to couple to CNBr-activated Sepharose 4B resin.
  • coupling buffer sodium bicarbonate, sodium phosphate, pH 8.3
  • the CNBr-activated Sepharose 4B resin was swelled with 1 N HCl to make a slurry, and the antibodies exchanged with the coupling buffer were mixed and reacted at room temperature for 2 hours. After washing the resin alternately with a low pH and a high pH wash solution, Mab gel production was completed.
  • Recombinant FVIII cultures, eluates, and flow-through were quantitatively analyzed by Chromogenic assay. As a result, it was confirmed that about 85% of the recombinant FVIII protein was bound to Mab gel and then eluted.
  • the purified Mab gel prepared by using the produced antibody has been confirmed to be capable of binding to recombinant blood coagulation FVIII factor protein, and is suitable for use in the production of purified antibody resin for commercial production of recombinant blood coagulation FVIII factor protein. It was confirmed.
  • Chromogenic assays were performed using samples before and after purification to confirm the purification yield of the immunoaffinity chromatography step.
  • the recombinant hemagglutinin factor FVIII contained in 50 L culture medium was 3.95 MIU, and the purified protein was 3.25 MIU, so the purification yield was 82.3%.
  • the purified Mab gel prepared using the produced antibody was confirmed to have a binding capacity with recombinant blood coagulation FVIII protein protein on a commercial production scale, and as a purified antibody resin for commercial production of recombinant blood coagulation FVIII protein. It was confirmed that it was suitable to use.
  • Antibodies or antigen-binding fragments thereof specifically binding to the coagulation factor VIII factor according to the present invention exhibits excellent affinity and avidity for the coagulation factor VIII factor, for isolation or purification of the recombinant coagulation factor VIII factor bound thereto
  • By providing a method for purifying recombinant blood coagulation factor VIII factor through the column it is possible to purify recombinant blood coagulation factor VIII factor of high purity, and to produce recombinant blood coagulation factor VIII factor of stable and improved quality.

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Abstract

본 발명은 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제를 위한 리간드로서 컬럼 정지상에 결합되어 있는 컬럼 및 이를 이용한 재조합 혈액응고 제VIII인자의 정제방법에 관한 것이다.

Description

항-혈액응고 제VIII인자 항체 및 그 용도
본 발명은 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합된 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제(purification)용 컬럼 및 이를 이용한 재조합 혈액응고 제VIII인자의 정제방법에 관한 것이다.
혈액 응고는 혈액응고 제I인자(Fibrinogen) 및 II, III, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII인자 등 여러가지 구성 인자들의 연속적 응고반응(coagulation cascade)에 의해 안정화된 섬유소(cross-linked fibrin)를 형성하는 과정을 통하여 이루어진다 (응고인자의 로마 숫자는 연속반응의 순서가 아님). 이들 혈액응고 인자들 중 어느 한 인자라도 결핍된 경우 원활치 못한 혈액 응고로 인하여 인체 내에서 출혈 현상이 일어난다. 이러한 체내 혈액응고이상으로 인해 임상적으로 관찰될 수 있는 증상들로는 관절내 출혈로 인한 관절 변형, 근육내 출혈로 인한 부종, 두개강내 출혈 등이 있다. 출혈이 과도한 경우 생명까지도 위협하는 정도의 증상이 발생할 수 있다.
혈우병은 이러한 혈액응고이상 질환의 대표적 질환으로 X 염색체 연관 열성 (X-linked recessive disorder) 유전질환이고 드물게 돌연변이에 의해서도 발생한다. 혈우병은 혈액응고 제ⅦI인자(Factor ⅦI, FⅦI)의 결핍에 의한 A형 혈우병과 혈액응고 제IX인자(Factor IX, FIX)의 결핍으로 인한 B형 혈우병으로 구분된다. 또한 혈우병은 관련 혈액응고인자의 결핍 정도에 따라 경증, 중등증 그리고 중증으로 구분할 수 있다. A형 혈우병은 남자아이 약 5,000명 출생 당 1명, B형 혈우병은 남자아이 약 20,000명 출생 당 1명의 발생빈도로 발생하고 전세계적으로 최소한 400,000명 이상의 혈우병 환자가 있는 것으로 추정되고 있다. 이러한 혈우병의 필요시(on-demand) 치료 및 예방적(prophylactic) 치료를 위해 결핍 혈액응고인자를 외부에서 투여하는 방법이 이용되고 있다. 이와 같은 결핍 혈액응고인자 대체요법(replacement therapy)으로 혈우병 환자의 기대 수명(life expectancy)을 높일 수 있다.
과거 반세기 전부터 혈액응고 제VIII인자는 정상인의 혈장으로부터 농축, 분리 및 정제되어 A형 혈우병의 치료에 사용되어 왔으나 1980년대 초기 혈장 유래 제제의 투여시 유발되는 HIV, 간염 바이러스(B, C형) 등의 혈인성 바이러스 감염의 위험성이 대두되기 시작하였다. 이러한 이유로써 혈인성 바이러스 감염의 위험성을 배제한 유전자 재조합 혈액응고 제VIII인자(recombinant Factor VIII)의 사용이 1988년 이후 점진적으로 증가하기 시작하였다.
유전자 재조합 혈액응고 제VIII인자의 분리 및 정제는 일반적인 단백질 치료제들의 분리 및 정제 공정에서와 같이 일련의 크로마토그래피 스텝을 통해 수행되고 있다. 크로마토그래피는 2개의 서로 혼합되지 않는 상(immiscible phase)을 이용하여 예를 들면, 분리하고자 하는 목적 물질이 여러가지 물질들과 함께 용해되어 있는 이동상(mobile phase)을 다른 하나의 상인 정지상(stationary phases)에 접촉시켜 목적 물질을 분리하는 기법이다. 이동상에 용해되어 있는 샘플 혼합물은 이동상이 정지상이 충전되어 있는 컬럼을 통해 흐르는 동안 정지상과의 일련의 상호작용을 겪는다. 이 상호작용의 양상은 샘플 혼합물 구성 성분(용질, solute)들의 물리적 또는 화학적 특성에 의존한다. 각 구성 성분이 갖는 이 같은 특성상의 차이에 의해 정지상과의 상호작용 강도의 차이가 발생하고 결과적으로 정지상이 충전된 컬럼을 통해 흐르는 이동상 조성의 영향 하에 개별 용질(solute)들의 이동 속도(migration rate)의 차이가 창출된다. 이동상의 조성 및 흐름 속도(유속, flow rate)에 의해 분리된 각각의 용질은 정지상과의 상호작용 강도의 역순으로 용출된다. 정지상에 의한 지연이 가장 적은 (weakly retained) 용질이 컬럼으로부터 처음 용출되고, 가장 강하게 정지상에 보유된 (strongly retained) 용질이 마지막에 용출된다. 샘플 성분들이 컬럼으로부터 용출될 때 어느 한 성분(용질)의 용출 시간(elution time)이 다른 성분(용질)의 용출 시간과 근접하여 이들간의 분리가 원활치 않는 경우 크로마토그래피 조건(정지상 및/또는 이동상)의 변경을 통하여 각 성분 간의 용출 시간의 차이가 충분히 나게 될 때 성분간 분리(separation)가 원활히 이루어진다. 따라서 각각의 특정 성분 분리 목적을 위한 최적 조건의 정지상이 요구되고 이를 설계하기 위한 노력이 계속 이루어지고 있다. 상술한 정지상은 일반적으로 관능기, 즉 결합기를 포함하는 리간드가 부착되는 지지체 또는 매트릭스로 구성된다. 크로마토그래피는 이용하는 정지상과 이동상 내의 샘플 성분의 상호작용의 원리를 기초로 하여 여러가지 종류의 크로마토그래피로 각각 특성화할 수 있다. 이러한 것들로서 이온 교환(ion exchange) 크로마토그래피, 소수성 상호작용(hydrophobic interaction) 크로마토그래피 및 친화도(affinity) 크로마토그래피 등을 예로 들 수 있다.
이 중 친화도 크로마토그래피는 자물쇠-열쇠(lock & key) 인식 원리의 표적 생체분자와 생물특이적 리간드(biospecific ligand) 사이의 특이적 상호작용에 기반한다. 따라서, 표적물 및 리간드는 친화도 쌍(pair), 예를 들어 항원/항체, 효소/기질, 리간드/수용체 등으로 구성된다. 단백질 분리 및 정제를 위해 널리 이용되는 방법인 단백질-기반 친화도 크로마토그래피의 리간드로는 프로테인 A(Protein A) 및 프로테인 G(Protein G) 등이 잘 알려져 있다. 프로테인 A 크로마토그래피는 특히 모노클로날 항체에 대한 현저한 특이성을 제공하고, 결과적으로 고순도의 모노클로날 항체를 얻을 수 있음이 잘 알려져 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 개발하고, 이러한 항체를 재조합 혈액응고 제VIII인자의 정제에 응용하여, 재조합 혈액응고 제VIII인자를 고순도로 분리 또는 정제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포 및 상기 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합된 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제용 컬럼 및 이를 이용한 재조합 혈액응고 제VIII인자의 정제방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR; 및 서열번호 4 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR을 포함하는 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 숙주세포를 배양하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계 및 상기 생성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하여 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합된 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제용 컬럼을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 컬럼에 재조합 혈액응고 제VIII인자가 포함된 샘플을 로딩하는 단계를 포함하는 재조합 혈액응고 제VIII인자의 정제방법을 제공한다.
본 발명의 다른 기술적 특징 및 실시예는 하기 상세한 설명 및 후술하는 청구항에서 보다 명백하게 기술될 것이다.
도 1은 정제된 항체 단백질을 등전점에 따라 분리하여 항체의 등전점값을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 웨스턴 블랏을 통해 정제된 항체 단백질의 면역학적 특성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정제된 항-FVIII 항체 단백질이 항원인 재조합 혈액응고 제 FVIII인자에 특이적으로 결합하는지 항원, 항체 반응을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR; 및 서열번호 4 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR을 포함하는 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "항체"는 항원을 특이적으로 인식하여 특정 항원에 면역학적으로 반응하는 면역글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자를 의미하며, 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
전체 항체(whole antibody)는 경쇄와 중쇄 사이에 이황화 결합(disulfide bond)으로 결합된 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄로 구성되어 있다. 포유류에서는 IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG으로 알려진 5개의 항체 아형이 있으며, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 4개의 아형으로 추가로 분류된다.
용어 "항체 절편(antibody fragment)"은 적어도 항원-결합 성능을 유지하는 절편을 가리키며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv을 포함할 수 있다. Fab는 항원 결합 부위를 가진, 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역, 경쇄의 불변 도메인, 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)으로 구성되어 있다. F(ab')는 중쇄의 CH1 도메인의 C-말단에 적어도 1개의 시스테인 잔기를 추가로 포함한다는 점에서 Fab과 다르다. F(ab')2는 힌지 부위(hinge region)의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 가진 두 개의 Fab' 분자로 구성된다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 부위로 구성된 Fv(가변 절편)는 부모 면역글로불린의 원래의 특이성을 포함하는 가장 작은 항체 절편이다. 이황화-안정화된 Fv(Disulfide-stabilized Fv, dsFv)는 이황화 결합을 통하여 경쇄의 가변 부위에 중쇄의 가변 부위를 결합시킴으로써 형성된다. 단쇄 Fv (scFV)는, 중쇄와 경쇄의 각각의 가변부위에서 펩티드 링커에 의하여 공유결합적으로 연결된 Fv이다. 프로테아제(예를 들면, Fab 또는 F(ab')2를 제공하는 파파인(papain) 또는 펩신)로 전체 항체를 프로테아제 처리하여 이들 항체 절편을 얻을 수 있으며, 바람직하게는 유전자 재조합 기술에 의하여 구축할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입(isotype)으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변영역은 카파(κ) 또는 람다(λ) 형일 수 있다.
“중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
일반적으로, 면역글로불린은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 기본 구조 단위를 가진다. 중쇄 각각은 1개의 가변영역 및 3개의 불변 도메인으로 구성되어 있는 반면에 각각의 경쇄는 1개의 가변영역 및 1개의 불변 도메인으로 구성되어 있다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변영역은 3개의 상보성-결정 부위(complementarity-determining regions, 이후, "CDRs"로 칭함) 및 4개의 프레임워크 부위를 포함한다. CDRs은 항체의 에피토프에 결합하기 위하여 기능한다. 각 사슬 상의 CDRs는 N 말단으로부터 시작해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 순서대로 배열된다. 이들은 위치한 사슬에 의하여 구별된다.
본 발명에 따른 항체는 예를 들어, 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 7 내지 10으로 구성된 군에서 선택된 서열의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역 (FR); 및 서열번호 11 내지 14로 구성된 군에서 선택된 서열의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역 (FR)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 15의 중쇄 가변영역 및 서열번호 16의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 17의 중쇄 및 서열번호 18의 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 전체 항체(whole antibodies) 및 항체 절편을 포함한다. 또한, 키메라 항체(e.g., 인간화된 쥐 항체), 2가 또는 2중 특이성 분자(bispecific molecules)(e.g., 2중 특이성 항체), 다이어바디(diabodies), 트리어바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies)는 본 발명에 사용되는 항체의 범위에 속한다.
여기에 사용된 용어 "모노클로날 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 동일한 집단의 항체로부터 수득하고, 단일 에피토프에 대한 결합 특이성 및 친화성을 보이는, 균일한 분자 조성을 가진 항체 분자를 가리킨다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
"인간 항체(human antibody)"는 CDRs, 프레임워크 부위 등을 포함하여, 인간 면역글로불린의 모든 성분의 아미노산 서열로 전체적으로 구성된 분자이다. 인간 질환의 치료법에서 인간 항체는 적어도 3가지의 잠재적인 장점을 가지고 있다. 첫째, 인간 항체는 인간 면역체계와 보다 바람직하게 상호작용하여 효과적으로 보체의존성 세포독성반응(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체의존성 세포-매개 세포독성반응(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의한 타겟 세포의 소멸을 매개한다. 둘째, 다른 이점으로는 인간 면역체계가 인간 항체를 외부 물질(exogenic molecule)로 인식하지 않아 인체내 투여시 키메라 항체 또는 인간화 항체의 경우 발생할 수 있는 면역복합체(immune complex) 형성에 의한 부작용 (adverse effect)을 극소화할 수 있다. 셋째, 이러한 면역복합체(immune complex) 형성이 인체 내 투여한 키메라 항체 또는 인간화 항체 제제의 짧은 반감기의 원인이 될 수 있는 반면 인간 항체의 반감기는 보다 소량 또는 적은 투여 빈도로 투여되는 경우에도 인간 면역계에서 자연적으로 발생하는 항체와 유사하다.
본 발명의 항체가 일정한 도메인을 포함할 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 또는 이들의 조합 또는 하이브리드로부터 유래할 수 있다.
여기에 사용된 "조합(combination)"은 동일한 기원의 단쇄 면역글로불린 Fc 절편을 코딩하는 폴리펩티드가 다른 기원의 단쇄 폴리펩티드에 결합되어 다이머 또는 멀티머를 생성하는 것을 의미한다. 다이머 또는 멀티머는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 도메인으로 구성된 군에서 선택된 2개 또는 그 이상의 불변 도메인으로부터 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
여기에 사용된 용어 "하이브리드(hybrid)"는 다른 기원의 2개 또는 그 이상의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열이 단쇄 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 내에 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 도메인 하이브리드는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 군에서 선택된 1개 내지 4개의 도메인으로 구성될 수 있다. 또한, 하이브리드의 조합은 IgG 아형(isotype)인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변 도메인으로부터 생성될 수 있다. 하이브리드의 조합은 상기에 정의한 바와 같다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 혈액응고 제VIII인자를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-혈액응고 제VIII인자 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬(side chain) 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 염기성(basic) 잔기; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 작은 크기(small in size)의 아미노산; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 방향성(aromatic) 곁사슬을 갖는 아미노산으로 분류되는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath and R.L. Hill (Eds), “The Proteins”, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 분리하고, 이를 복제(replication) 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"뉴클레오티드"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 뉴클레오티드에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 서열번호 20의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 21의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 서열번호 22의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 23의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하고, 벡터 성분에는 일반적으로, 아래에 열거한 것들 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 1) 신호 서열(sigal sequence, signal peptide) 2) 복제 기점(replication origin) 3) 하나 이상의 마커 유전자 (marker gene) 4) 증강인자 요소(enhancer elements) 5) 프로모터 (promoter), 및 전사 종결 서열(transcription termination sequences).
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코스미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV, adeno-associated virus vector) 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
“작동적으로 연결(operably linked)”은 폴리뉴클레오티드 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 폴리뉴클레오티드 서열의 전사(transcription 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시(initiation of translation)를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결(translation termination) 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터 및 EF 1 alpha 프로모터 및 이들의 변이체가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 재조합 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 튜린겐시스(Bacillus thuringensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) (예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 숙주세포를 배양하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및 상기 생성된 항체를 회수하여 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한 없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심 분리 또는 한외여과(ultrafiltration)에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화(affinity) 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용(hydrophobic interation) 크로마토그래피, 히드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HA) 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합되어 있는 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제용 컬럼에 관한 것이다.
“분리 및 정제”는 특정 단백질, 예를 들어 혈액응고 제VIII인자를 혼합물(complex mixture)에 혼재한 불순물로부터 구별되도록 하고, 다른 불순물을 제거하여 순도를 높이거나 품질을 향상하기 위한 일련의 방법/과정을 의미한다. 컬럼에 부착된 항-혈액응고 제VIII인자 항체에 따라, 항체에 특이적으로 결합하는 혈액응고 제VIII인자를 샘플에 혼재된 불순물로부터 검출한다. 상기 불순물은 정제의 과정에서 목적 물질 이외에 혼합된 물질로서, 예를 들어 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 잔류물, 세포 파쇄물 및 단백질, DNA, 내독소(endotoxin) 및 세포생장을 위한 배양 인자 등이 포함될 수 있다.
“컬럼”은 목적 단백질(target protein)의 물리-화학적 특성을 이용하여 혼합물(complex mixture)로부터 목적 단백질(예: 재조합 혈액응고 제VIII인자)의 분리, 검출 또는 정제를 위한 크로마토그래피 과정에 사용되는 정지상(stationary phase)이 충전되어 있는 장치(device)이다. 구체적으로, 목적 물질(target material)의 친수성이나 소수성 정도 또는 분자의 전위, 특정 물질과의 결합력 여부 등에 따라 해당 정지상이 충전된 컬럼을 제작하여 혼합물 또는 불순물로부터 목적 단백질을 선택적으로 분리할 수 있다.
상기 컬럼에 혈액응고 제VIII인자 친화성 정지상 물질이 충전 될 수 있으며, 상기 정지상 물질은 예를 들어, 수지 또는 아가로스 비드(agarose bead) 형태일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시예에 기술된 바와 같이, 가교된(cross-linked) 아가로스 비드 형태의 수지인 세파로스(Sepharose)에 항-혈액응고 제VIII인자 항체를 리간드로서 결합시킨 정지상이 충전된 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제용 컬럼을 제작한다.
본 발명은 나아가, 재조합 혈액응고 제VIII인자가 포함된 샘플이 상기 컬럼 정지상에 결합된 리간드와 상호작용하는 단계를 포함하는 재조합 혈액응고 제VIII인자 정제방법에 관한 것이다.
상기 컬럼에 로딩되는 샘플은 예를 들어 세포 배양 액체 또는 발효 브로스일 수 있으며, 이러한 샘플을 컬럼에 로딩하여 정제 과정이 진행되면 샘플로부터 목적 단백질 이외의 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 잔류물, 예를 들어 세포 파쇄물 및 단백질, DNA, 내독소 등이 제거될 수 있다.
샘플에 포함된 재조합 혈액응고 제VIII인자는 상기 컬럼 정지상에 결합된 항-혈액응고 제VIII인자 항체에 항원-항체 반응을 통해 결합한다. 이후 별도의 용출 과정을 통해 항-혈액응고 제VIII인자 항체에 결합된 재조합 혈액응고 제VIII인자를 분리할 수 있다. 용출액의 조성 및 용출 조건은 당업자가 통상 수행 가능한 조건으로 설정 가능하며, 적합한 완충제 또는 액체와 합해져서 이동상을 제공할 수 있다.
이를 통해 실질적으로 순수한 재조합 혈액응고 제VIII인자를 분리 및 정제할 수 있다. 상기 “실질적으로 순수한”은 실질적으로 모든 재조합 혈액응고 제VIII인자이외의 물질이 제거되었음을 의미하고, 유리하게는, 오염물질 총량의 약 80％ 이상, 예를 들어 약 95％ 이상, 즉 95-100％ 사이, 예를 들어 약 98％ 이상, 즉 98-100％ 사이, 바람직하게는 약 99％ 이상, 즉 99-100％가 제거될 수 있음을 의미한다. 가능한 순도는 컬럼에 적용되는 샘플 내의 재조합 혈액응고 제VIII인자의 농도 및 사용되는 다른 조건에 따라 결정될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 예시의 목적일 뿐 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님은 당업자에 자명하다.
실시예 1: Hybridoma 제조
재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질 (서열번호 19)에 대한 단일클론 항체 생산을 위해서 면역주사에 사용할 재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질을 세포배양액으로부터 분리 및 정제하여 준비하였다. 면역에 필요한 동물로 Balb/c 생쥐를 사용하였다.
재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질과 동량의 항원보강제 (Freund’s Adjuvant complete)를 잘 혼합하여 생쥐 Balb/c 에 복강 주사하였다. 25일 후 동량의 재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질과 항원보강제를 혼합하여 추가 주사한 후 생쥐에서 혈청을 채취하여 재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질에 우수한 양성반응을 보일 때까지 추가 주사를 진행하였다.
마지막 면역주사 후 3일째에 생쥐로부터 혈청을 채취하여 효소면역 분석방법 (ELISA)으로 혈청 중에 항체가 생성되었음을 확인한 후 생쥐를 개복하여 비장 (Spleen)을 꺼내 분쇄하였다. 분쇄된 비장세포 (Splenocyte)를 공지 방법 (Galfre G. et al., Nature 266, 550-552 (1977))에 따라 생쥐골수종 세포 (SP2/0)와 융합시켰다. 비장세포와 비장세포의 1/5만큼의 생쥐골수종 세포를 준비한 후 PEG1500과 혼합하여 융합 반응시켰다. 융합 반응 후 HAT (Hypoxanthine, Aminopterine, Thymidine)가 포함된 선택배지에 현탁하여 96 웰 플레이트로 옮겨 배양하면서 융합반응이 되지 않은 세포들의 성장을 저해시켰다. HAT가 포함된 선택배지로 배양액을 교체하면서 융합된 세포가 충분히 성장하였을 때 재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질 특이적인 ELISA법으로 분석하였고, 양성 반응을 보이는 웰의 세포들은 새로운 플레이트로 옮겨 배양하였다. 세포수가 충분히 확보되었을 때 한계 희석법 (Limiting dilution)으로 단일클론 생산 세포주 선별을 수행하였다. 콜로니가 형성된 웰의 배양액을 이용하여 ELISA 법으로 분석하여 양성 반응을 보이는 33개의 클론을 선택하였다. 선택된 클론들의 배양액은 Biacore를 이용하여 항원과의 결합력을 확인한 후 재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질 정제용 항체로 가장 적합하다고 판단되는 2개의 클론 (3F6-2-5와 5F4-9-1)을 선택하였다. 2 클론 중 항원과의 결합력이 더 우수한 3F6-2-5를 재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질에 대한 항체 생산 하이브리도마 클론으로 선택하였다. 3F6-2-5 클론이 생산하는 항체의 이소타입 (isotype)을 분석한 결과 중쇄 (heavy chain)는 IgG1 이었고, 경쇄 (light chain)는 kappa 그룹에 속하는 항체임을 확인하였다.
실시예 2: 항체 유전자 확보
재조합 혈액응고 제VIII인자 단백질 (FVIII)에 대한 항체 (이하 항-FVIII 항체)의 중쇄 및 경쇄 유전자는 FVIII에 대한 항체를 생산하는 생쥐 하이브리도마 세포 (3F6-2-5) 로부터 RNA를 추출한 후, RT-PCR을 수행하여 확보하였다.
중쇄 유전자를 확보하기 위해서 3F6-2-5 하이브리도마 세포로부터 RNA를 추출한 후, 5’ RACE를 수행하였다. 3’ 불변영역에 대한 GSP1 (gene specific primer), GSP2 및 네스티드 프라이머 (nested primer)를 제작하였고, RACE PCR을 수행한 후 형성된 PCR 산물을 T-vector에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 이에 따라 신호서열 (signal sequence)을 포함하는 5’ 부분의 염기서열을 확인할 수 있었다. 확인된 염기서열에 따라 프라이머를 제작하였고, RT-PCR을 통해 중쇄 유전자를 확보하였다.
GSP1: 5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGT (서열번호 24)
GSP2: 5’-CCTTGGCCCCAGAAGTGGTAA (서열번호 25)
Nested: 5’-TAAATGCCAGTGTCTTCAGC (서열번호 26)
염기서열을 확인한 후 중쇄 유전자를 팬젠 고유 발현벡터 (pPGIX)에 클로닝하기 위해서 5’-Nhe I, 3’-Xho I 제한효소 인식 서열이 포함되도록 프라이머를 제작 한 후 T-vector에 삽입된 중쇄 유전자를 증폭하였다. PCR 산물과 발현 벡터를 Nhe I 과 Xho I 제한 효소로 처리한 후 pPGIX-Anti-FVIII-HC을 제작한 후 삽입된 중쇄 유전자의 염기서열을 확인하였다 (서열번호 22).
경쇄 유전자는 3F6-2-5 하이브리도마 세포로부터 RNA를 추출한 후, 알려진 신호 서열 (signal sequence)을 바탕으로 제작된 5’-프라이머 11 종과 3’ 불변영역에 대한 프라이머(MKCIII)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
RT-PCR 결과 MKV7 프라이머와 3’-MKCIII 프라이머를 이용한 PCR 산물에서 경쇄 가변영역과 불변영역을 포함하는 700bp 크기의 밴드를 확인하였다. 확보된 PCR 산물을 T-vector로 클로닝 한 후 염기서열을 확인하였다.
MKV1: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG (서열번호 27)
MKV2: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG GAG WCA GAC ACA CTC CTG YTA TGG GTG (서열번호 28)
MKV3: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GSG TTG (서열번호 29)
MKV4: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG AGG RCC CCT GCT CAG WTT YTT GGM WTC (서열번호 30)
MKV5: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG GAT TTW CAG GTG CAG ATT WTC AGC TTC (서열번호 31)
MKV6: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG AGG TKC YYT GYT SAG YTY CTG RGG (서열번호 32)
MKV7: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG GGC WTC AAG ATG GAG TCA CAK WYY CWG G (서열번호 33)
MKV8: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG TGG GGA YCT KTT TYC MMT TTT TCA ATT G (서열번호 34)
MKV9: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG GTR TCC WCA SCT CAG TTC CTT G (서열번호 35)
MKV10: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG TAT ATA TGT TTG TTG TCT ATT TCT (서열번호 36)
MKV11: 5’-GCT AGC GCC ACC ATG GAA GCC CCA GCT CAG CTT CTC TTC C (서열번호 37)
MKCIII: 5’-CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT C (서열번호 38)
염기서열을 확인한 후 경쇄 유전자를 팬젠 고유 발현벡터 (pPGIX)에 클로닝하기 위해서 5’-Nhe I, 3’-Xho I 제한효소 인식 서열이 포함되도록 프라이머를 제작 한 후 T-vector에 삽입된 경쇄 유전자를 PCR로 증폭하였다. PCR 산물과 발현 벡터를 Nhe I 과 Xho I 제한 효소로 처리한 후 접합하여 pPGIX-Anti-FVIII-LC을 제작한 후 삽입된 경쇄 유전자의 염기서열을 확인하였다 (서열번호 23). 발현 플라스미드 pPGIX-Anti-FVIII-HC와 pPGIX-Anti-FVIII-LC에 삽입되어 있는 중쇄와 경쇄 유전자는 발현효율이 더 높은 세포주 개발을 위해 팬젠 고유발현 벡터 pPGX로 옮겨 형질도입에 사용하였다. pPGIX-Anti-FVIII-HC와 pPGIX-Anti-FVIII-LC 플라스미드 DNA를 Nhe I 과 Xho I 제한 효소로 처리한 후 동일한 제한 효소로 처리된 pPGX에 각각 접합시켜 pPGX-Anti-FVIII-HC와 pPGX-Anti-FVIII-LC 플라스미드 DNA를 구축하였다.
실시예 3: CHO세포 발현
CHO DG44 숙주세포주로 발현 플라스미드의 형질도입은 24-well 규모로 수행하였으며, pPGX-Anti-FVIII-HC와 pPGX-Anti-FVIII-LC, pDCH1P (dhfr)를 전기 천공법 (Electroporation)을 이용하여 동시 형질도입시켰다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후 세포들이 충분히 자랐을 때 형질 전환된 세포들만 생장할 수 있도록 선택배지에서 배양하였다. 약 2주 후 세포가 충분히 성장하였을 때 배양액의 일부를 취하여 ELISA 분석법으로 항-FVIII 항체 발현 세포군을 선별하였다. ELISA 분석 결과를 바탕으로 5 세포군 (ADBA1001, ADBA1003, ADBA1011, ADBA1013, ADBA1014)을 선별하여 발현 효율이 높고 안정적인 세포주 (stable cell line) 확보를 위해 단일 클론 선별 (single clonal selection)을 수행하였다. 배양배지에 1 cell/well이 되도록 96-well plate에 분주하였고, 약 4주 후 형성된 콜로니를 분석하여 발현 효율이 높은 세포주를 선별하여 배양하였다. 충분한 수의 세포가 확보되었을 때 ELISA 분석법으로 단일클론 세포주의 발현 효율을 비교 분석하였고, 생산성이 높은 6 개의 단일클론 세포주 (ADBA1003-22, ADBA1011-19, ADBA1013-14, ADBA1013-27, ADBA1014-11, ADBA1014-69)를 후보 세포주로 선발하였다.
항체 생산성이 높은 6개의 단일클론 세포주는 90일의 장기 계대배양동안 안정적으로 항체 단백질을 발현함을 확인하였고, 이 중 항체 생산성이 가장 높은 ADBA1013-14 세포주를 최종 세포주로 선발하였다. 이로부터 생산된 항체는 표 1의 서열을 가짐을 확인하였다.
Figure PCTKR2017014747-appb-T000001
실시예 4: 항체 정제
ADABA1013-14 세포주의 배양액을 이용하여 항체 단백질을 분리 및 정제하였다. 단백질 A 레진 (Protein A resin)이 충전된 컬럼을 이용하여 친화 크로마토그래피를 수행하였다. AKTA Pure (GE healthcare)에 컬럼을 장착하고 20 mM Sodium phosphate/150 mM Sodium chloride (pH7.4)평형버퍼로 컬럼을 평형화한 후 배양액을 로딩하였다. 이후 컬럼을 세척하고 20 mM Sodium citrate (pH3.5)용출버퍼로 항체 단백질만을 용출하였다. 용출된 단백질 분획의 바이러스 불활화를 위하여 1N HCl을 이용하여 용출액의 pH를 3.5로 낮춘 후 상온에서 180분 동안 반응시켰다.
바이러스 불활화 후 4배 부피의 주사용수로 희석한 후 Q 세파로스 컬럼 크로마토그래피 (Q Sepharose column chromatography)를 수행하였다. AKTA Pure (GE healthcare)에 컬럼을 설치하고 4 mM Citric acid/10 mM Sodium phosphate 평형버퍼로 컬럼을 평형화 한 후 시료를 로딩하였다. 시료를 로딩할 때 나오는 flowthrough를 모아 0.22 μm PES membrane으로 필터 한 후 나노여과 (Nanofiltration)를 수행하였다.
실시예 5: 정제된 항체의 특성 분석
1. N-당화 사이트 확인 (N-glycosylation site determination)
펩타이드 매핑 (peptide mapping) 분석법을 이용하여 정제된 항체 단백질의 N-당화 사이트를 규명하였다.
TCA 침전 (Trichloroacetic acid precipitation) 방법을 이용하여 정제된 항체 단백질을 탈염 및 농축 (desalting & concentration)하였다. 확보된 시료에 Trypsin 그리고 Trypsin/PNGase F를 각각 처리한 후, DTT와 이오도아세트아마이드 (iodoacetamide)를 처리하여 환원 (reduction) 및 알킬화 (alkylation)시켰다. PNGase F 처리 전과 후의 시료를 이용한 LC-MS/MS 펩타이드 시퀀싱 (LC-MS/MS peptide sequencing) 분석을 통해 당화 (glycosylation)된 Asparagine 아미노산 위치를 규명한 결과 중쇄의 288번 Asparagine에 당이 결합되어 있음을 확인하였다.
2. 등전점 (Isoelectric point, pI) 규명 (Isoelectric focusing)
정제된 항체 단백질을 등전점 (Isoelectric point, pI)에 따라 분리하여 항체의 등전점값을 규명하였다.
IEF 마커 (pI 3-10)와 정제된 항체 단백질 20 μg을 Novex® pH 3-7 IEF Gel에 로딩하고 100 V, 200 V, 500 V 전압에서 각각 1시간, 1시간, 30분 전기 영동을 수행하였다. 12% TCA (Trichloroacetic acid)에서 30분 동안 겔을 고정한 후 초순수로 10분씩 3회 세척하고 GelCode Blue Stain Reagent로 충분히 염색될 때까지 처리하였다. 염색이 완료된 후 초순수로 세척하여 pI 밴드를 육안으로 확인하였고, Gel Doc XR+ 이미저 (imager)를 사용하여 각 pI 값을 분석하였다.
IEF 밴드의 pI를 Gel Doc XR+ 이미저 (imager)로 분석한 결과 정제된 항체 단백질의 pI는 6.2 ~ 6.8임을 확인하였다 (도 1).
3. 분자량 확인 (Intact molecular weight determination)
정제된 항체 단백질의 분자량 측정을 통해 단백질의 1 차원적 구조를 규명하였다.
1 mg/mL로 희석한 정제된 항체 단백질에 1 M DTT 용액을 최종 농도 20 mM이 되도록 처리하여 상온에서 40분 동안 반응시킨 후 LC-MS를 이용하여 중쇄/경쇄의 분자량을 측정하였다.
HPLC에서 분리된 펩타이드 (peptide)들을 Q-TOF MS의 ESI 소스 (source)에 연결시켜 펩타이드 이온들의 질량값을 측정하였다. 분자량 확인은 DataAnalysis software를 이용하였고, 최대 엔트로피법 (Maximum Entropy method)로 디콘볼루션 (deconvolution)하여 분석하였다.
정제된 항체 단백질의 비변형 형태 (Native form) 분자량은 147,859 ~ 148,394 Da로 확인되었다. 당 분자량을 제외한 이론적 항체 단백질의 분자량에 비해 약 3,000 Da 증가한 패턴으로 확인되었고, 이것은 두 곳의 중쇄에 결합된 당 분자량의 평균으로 판단된다. 경쇄의 분자량은 24,323 Da (±2 Da)으로 측정되었고, 이론적 항체 단백질의 경쇄 분자량과 정확히 일치하였다. 중쇄의 경우 주 (major) 분자량은 49,715 Da 으로 검출되었다. 이론적 중쇄의 분자량에 비해 약 1,300 Da의 분자량이 증가하였고, 이것은 중쇄 288 번의 Asn에 결합된 당의 분자량에 의한 것으로 판단된다.
4. 웨스턴 블랏 (Western blot)
항원, 항체 반응을 통한 정제된 항체 단백질의 면역학적 특성을 분석하였다.
정제된 항체 단백질을 1 mg/mL이 되도록 희석하여 1, 3, 5 μg을 준비한 후, PBS를 첨가하여 최종부피가 10 μL가 되도록 하였다. 5X 비환원 샘플 버퍼 (Non-reducing sample buffer)와 5X 환원 샘플 버퍼 (Reducing sample buffer) 2.5 μL를 각각 혼합한 후, 환원 (reducing) 조건의 시료는 95℃ 이상의 온도에서 10분 동안 끓인 다음 얼음에 5분간 빙냉하여 시료를 준비하였다. 준비된 시료를 10% SDS-PAGE gel에 로딩한 후, 80 V로 30분, 100 V로 1시간 30분 동안 전기영동을 수행하였다. 러닝 (Running)이 종료된 후 니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane)으로 이동 (transfer) 하였고, 5% 스킴 밀크 (skim milk)로 1 시간 동안 차단 (blocking)하였다. 차단 이후 1:1,000으로 희석한 염소 항-마우스 IgG, AP 접합체 (Goat anti-mouse IgG, AP conjugate)를 실온에서 2시간 동안 처리한 후, 10분씩 3회에 걸쳐 1X TBST로 워싱하였다. 워싱 단계가 끝난 후, 단백질 검출을 위해 막에 NBT/BCIP를 처리하여 발색시켰고, 충분히 발색이 된 것을 관찰한 후 흐르는 물에 씻어 반응을 멈추었다.
웨스턴 블롯 결과 환원 조건에서는 50 kDa 부근에서 중쇄 및 25 kDa 부근에서 경쇄가 검출되었고, 비환원 조건에서는 약 150 kDa의 항체 단백질이 확인되었다 (도 2). 따라서, 마우스 IgG인 정제된 항체 단백질이 항-마우스 IgG 항체 (anti-mouse IgG antibody)와 특이적으로 결합함이 확인되었다.
5. FVIII에의 특이적 결합 (Specific binding to FVIII) 확인
정제된 항-FVIII 항체 단백질이 항원인 재조합 혈액응고 제 FVIII인자에 특이적으로 결합하는지를 항원, 항체 반응을 통해 확인하였다.
재조합 혈액응고 제 FVIII인자를 0.02 mg/mL이 되도록 희석하여 200, 400 ng을 준비한 후, PBS를 첨가하여 최종부피가 20 μL가 되도록 하였다. 5X 환원 샘플 버퍼 (reducing sample buffer) 5 μL를 혼합하고 95℃ 이상의 온도에서 10분 동안 끓인 다음 얼음에 5분간 빙냉한 후 원심분리하여 시료를 준비하였다. 준비된 시료를 7.5% gel에 로딩한 후, 80 V로 30분, 100 V로 1시간 30분 동안 전기영동을 수행하였다. 러닝 (Running)이 종료된 후 니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane)으로 이동 (transfer) 하였으며, 5% 스킴 밀크 (skim milk)로 1 시간 동안 차단 (blocking) 하였다. 차단 이후 1:1,000으로 희석한 정제된 항체 단백질 (Mouse IgG)을 4℃에서 오버나이트 (overnight)로 처리한 후, 10분씩 3회에 걸쳐 1X TBST로 워싱하였다. 워싱 단계가 끝나면 1:5,000으로 희석한 2차 항체 (secondary antibody : Goat anti-mouse IgG, AP conjugate)를 상온에서 2시간 반응시킨 후 1X TBST로 10분씩 3회 워싱하였다. 단백질 검출을 위해 막에 NBT/BCIP를 처리하여 발색시켰고, 충분히 발색이 된 것을 관찰한 후 흐르는 물에 씻어 반응을 멈추었다.
웨스턴 블롯 결과 그림과 같이 혈액응고 제 FVIII인자의 중쇄에 해당하는 90 kDa 부근에서 밴드가 검출되어, 정제된 항체 단백질이 혈액응고 제 FVIII인자와 특이적으로 결합함이 확인되었다 (도 3).
6. 항원 항체 결합력 확인 (SPR)
항원, 항체 반응을 통해 정제된 항체 단백질과 재조합 혈액응고 제 FVIII인자 단백질 사이의 키네틱 친화도 (Kinetics affinity: Ka, Kd, KD)를 SPR (Surface Plasmon Resonance) 방법에 의해 측정하였다.
Biacore T200 장비에 CM5 chip을 장착한 후, 리간드인 재조합 혈액응고 제 FVIII 인자 단백질을 10 mM 소듐 아세테이트 (sodium acetate), pH 5.0 버퍼에 희석하여 샘플 채널 (sample channel)에 10분간 주입하여 고정화 (immobilization) 시켰다. 검체 (analyte)인 정제된 항체 단백질을 버퍼로 희석하여 2 μM의 농도로 준비한 후, 연속 희석하여 10개 농도 (0.0039, 0.0078, 0.015, 0.031, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 μM)를 얻었다. 결합 (Association)과 해리 (Dissociation)의 시간을 각각 3분과 4분으로 설정하여 결합과 해리를 측정하였다.
정제된 항체 단백질과 재조합 혈액응고 제 FVIII인자 단백질의 키네틱 친화도를 분석하기 위해 BIAevalution 분석소프트웨어를 이용하였다. 10개 농도의 결합/해리 데이터를 1:1 키네틱 결합 모델 (kinetic binding model : A + B ↔ AB)에 대입하여 결합력, 해리력과 해리 상수를 아래와 같이 산출하였다.
SPR 시험 결과, 재조합 혈액응고 제 FVIII인자 단백질에 대한 정제된 항체 단백질의 KD 값은 5.53E-08 M로 분석되었다.
Figure PCTKR2017014747-appb-T000002
실시예 6: 항원 정제용 컬럼 제작
혈우병 치료제 재조합 혈액응고 제FVIII인자 단백질 정제 컬럼 제작을 위해서 정제된 항체를 이용하여 Mab gel을 제조하였다.
정제된 항체를 CNBr 활성화 세파로스 4B (CNBr-activated Sepharose 4B) 레진에 커플링시키기 위해서 커플링 완충용액 (sodium bicarbonate, sodium phosphate, pH 8.3)으로 교환하였다.
CNBr-activated Sepharose 4B 레진을 1 N HCl로 스웰링 (swelling)하여 슬러리 상태로 만든 후 커플링 완충액으로 교환된 항체를 혼합하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 낮은 pH와 높은 pH의 세척용액으로 번갈아 레진을 세척한 후 Mab gel 제조를 완료하였다.
실시예 7: 항원 항체 결합 확인
제조된 Mab gel의 재조합 혈액응고 제FVIII인자 단백질에 대한 결합력을 확인하기 위해서 재조합 혈액응고 제FVIII인자 배양액을 이용하여 성능시험을 실시하였다. Mab gel이 충전된 컬럼을 평형 완충액으로 평형화 한 후 5000 IU의 재조합 FVIII 단백질을 포함하고 있는 배양액을 로딩하였다. 세척 완충액으로 비특이적 결합 단백질을 제거한 후 단백질을 용출하였다.
재조합 FVIII 배양액, 용출액, 플로우-스루 (Flow-through)는 Chromogenic assay를 수행하여 정량분석하였다. 분석결과 Mab gel에 약 85%의 재조합 FVIII 단백질이 결합한 후 용출된 것이 확인되었다.
따라서, 생산된 항체를 이용하여 제작된 정제용 Mab gel은 재조합 혈액응고 제FVIII인자 단백질과의 결합능력이 확인되어 재조합 혈액응고 제FVIII인자 단백질 상업 생산를 위한 정제용 항체 레진 제작에 사용하는 것이 적합함을 확인하였다.
실시예 8: 정제용 Mab gel을 이용한 재조합 혈액응고 제FVIII인자의 정제
제조된 정제용 Mab gel이 재조합 혈액응고 제FVIII인자의 상업 생산을 위한 정제용 레진으로 적합한지를 검증하기 위해서 50L 규모의 배양액을 이용한 면역친화 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatography)를 수행하였다.
정제용 Mab gel 약 1,000 mL을 컬럼에 패킹 (Diameter: 11.6 cm, Height: 9.5 cm) 하여 정제에 사용하였다. AKTA Pure (GE healthcare)에 컬럼을 장착하고, 컬럼을 평형화하였다. 컬럼이 안정화되면 배양액을 1/2만 로딩하고 3 CV 동안 세척 후 7 ~ 9 CV 동안 용출을 진행하였다. 동일한 방법으로 남은 배양액을 컬럼에 로딩하여 면역친화 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatography)를 수행한 후 용출된 재조합 혈액응고 제 FVIII인자를 수집하였다. 수집된 재조합 혈액응고 제FVIII인자를 0.22 μm PES 막 (membrane)으로 여과한 후 4℃에 보관하였다.
면역친화 크로마토그래피 단계의 정제 수율을 확인하기 위해서 정제 전과 후 시료를 이용하여 Chromogenic assay를 수행하였다. 활성분석 결과, 50 L 배양액에 포함된 재조합 혈액응고 제FVIII인자는 3.95 MIU이었고, 정제된 단백질은 3.25 MIU이었으므로 정제수율은 82.3%로 확인되었다.
따라서, 생산된 항체를 이용하여 제작된 정제용 Mab gel이 상업생산 규모에서 재조합 혈액응고 제 FVIII 인자 단백질과의 결합능력이 확인되어, 재조합 혈액응고 제 FVIII 인자 단백질 상업 생산을 위한 정제용 항체 레진으로 사용하는 것이 적합함을 확인하였다.
본 발명에 따른 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 혈액응고 제VIII인자에 대한 우수한 친화도 및 결합력을 나타내므로, 이를 결합한 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제용 컬럼 및 이를 통한 재조합 혈액응고 제VIII인자의 정제방법을 제공함으로써, 고순도의 재조합 혈액응고 제VIII인자 정제가 가능하고, 안정적이고 향상된 품질의 재조합 혈액응고 제VIII인자생산이 가능하다.
구체적 구성을 참조하여 본 발명을 상세하게 기재하였으나, 이러한 기재는 바람직한 구현예에 관한 것이고, 발명의 범위를 제한하지 않음은 당업자에 자명한 것이다. 이에, 본 발명의 실질적 범위는 출원된 청구항 및 그 등가물에 의해 정의된다 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (11)

  1. 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR; 및
    서열번호 4 내지 6으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR을 포함하는 혈액응고 제VIII인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 7 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역 프레임워크 영역 (FR); 및
    서열번호 11 내지 14로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역 프레임워크 영역 (FR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 15의 중쇄 가변영역 및 서열번호 16의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    서열번호 17의 중쇄 및 서열번호 18의 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  8. 제7항의 발현 벡터로 형질전환된 재조합 숙주세포.
  9. 제8항의 재조합 숙주세포를 배양하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계 및 상기 생성된 항체를 회수하여 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제를 위한 리간드로서 컬럼 정지상에 결합되어 있는 재조합 혈액응고 제VIII인자 분리 또는 정제용 컬럼.
  11. 재조합 혈액응고 제VIII인자가 포함된 샘플을 제10항의 컬럼에 로딩하는 단계를 포함하는 재조합 혈액응고 제VIII인자의 분리 또는 정제방법.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100245542B1 (ko) * 1991-08-22 2000-02-15 모저 하., 라우페 하. 페. 응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체
KR100254574B1 (ko) * 1998-01-24 2000-05-01 허일섭 폰 빌리브란트 인자에 대한 키메라 항체를 이용하여 제 8인자를정제하는 방법
KR20030029128A (ko) * 2001-06-12 2003-04-11 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼 인간형 항-혈액 응고 인자 ⅷ 항체
JP2009502149A (ja) * 2005-07-29 2009-01-29 ライフ・サイエンシーズ・リサーチ・パートナーズ・フェレニゲング・ゾンデル・ウィンストーメルク 新規な抗第ｖｉｉｉ因子抗体
WO2013098676A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Grifols, S.A. Method for purifying factor viii

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100245542B1 (ko) * 1991-08-22 2000-02-15 모저 하., 라우페 하. 페. 응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체
KR100254574B1 (ko) * 1998-01-24 2000-05-01 허일섭 폰 빌리브란트 인자에 대한 키메라 항체를 이용하여 제 8인자를정제하는 방법
KR20030029128A (ko) * 2001-06-12 2003-04-11 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼 인간형 항-혈액 응고 인자 ⅷ 항체
JP2009502149A (ja) * 2005-07-29 2009-01-29 ライフ・サイエンシーズ・リサーチ・パートナーズ・フェレニゲング・ゾンデル・ウィンストーメルク 新規な抗第ｖｉｉｉ因子抗体
WO2013098676A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Grifols, S.A. Method for purifying factor viii

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