KR100254574B1 - 폰 빌리브란트 인자에 대한 키메라 항체를 이용하여 제 8인자를정제하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폰 빌리브란트 인자(von Willebrand factor)와 특이적으로 그리고 높은 친화력으로 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 구성된 키메라 항체를 리간드로 하는 친화성 크로마토그래피에 의해, 인혈장, 냉동 인혈장 침전물이나 재조합 혈액응고 제 8인자 발현하는 동물세포 배양액에서 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)를 고농도로 순수하게 정제하는 방법 및 전기 생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 중쇄, 경쇄를 암호화하는 DNA의 염기서열에 관한 것이다. 본 발명의 혈액응고 제 8인자의 정제방법은 인간 유래가 아닌 타 단백질의 오염을 극소화시킴과 동시에, 고농도의 혈액응고 제 8인자를 고순도로 제공한다. 따라서, 이렇게 정제된 혈액응고 제 8인자는 의약용으로 사람에게 사용가능하다.

Description

폰 빌리브란트 인자에 대한 키메라 항체를 이용하여 제 8인자를 정제하는 방법

본 발명은 폰 빌리브란트 인자(von Willebrand factor)에 대한 키메라 항체를 이용하여 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)를 분리정제하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 폰 빌리브란트 인자와 특이적으로 그리고 높은 친화력으로 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 구성된 키메라 항체를 리간드로 하는 친화성 크로마토그래피에 의해, 인혈장, 냉동 인혈장 침전물이나 재조합 혈액응고 제 8인자 발현하는 동물세포 배양액에서 혈액응고 제 8인자를 고농도로 순수하게 정제하는 방법 및 전기 생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 중쇄, 경쇄를 암호화하는 DNA의 염기서열에 관한 것이다.

항 혈우병인자(제 8인자)는 혈액응고 과정에서 제 10인자(Factor Ⅹ)의 활성을 촉진시켜 피브린 혈전의 형성이 촉진되도록 하는 기능을 가진 단백질 조효소이다. 제 8인자는 혈우병 환자의 혈장에서 혈액응고의 결함을 보정하는 기능을 하며, 폰 빌리브란트 인자(von Willebrand factor, 이하 편의상 'vWF'라 함)와 복합체를 이루어 혈장 내를 순환한다. vWF는 폰 빌리브란트 병에 있어 혈소판 기능의 결함을 변화시킬 수 있는 단백질로서 제 8인자와 복합체를 이룬다.

이 복합체 중에서 혈액응고 활성을 가진 부분을 인자 Ⅷ 혈액응고 단백질, Ⅷ 응고 활성 또는 단순히 Ⅷ:C 인자라 하고, 폰 빌리브란트 병에 있어서 혈소판 기능의 결함을 보정하는 활성을 가진 다른 부분을 인자 Ⅷ관련 항원, Ⅷ:Ag, Ⅷ:RP인자, vWF라 한다. 이 복합체는 비공유결합으로 형성되며, 적당한 조건에서는 각각의 독립된 특성을 가진 두가지 단백질로 나누어질 수 있다.

Ⅷ:C 인자에 기인하는 혈액응고 활성의 의약적 가치와, Ⅷ:C/vWF 복합체, Ⅷ:C 인자 및 vWF의 구조를 확인하기 위해, Ⅷ:C 인자와 vWF를 분리 정제하고 그를 농축하려는 많은 시도가 있어 왔다. 이때 사용된 기술은 일반적으로 면역흡착(immunoadsorption)이나 이온교환 크로마토그래피에 근거하고 있는데, 이러한 기술들은 전하를 띤 이온성 물질로 부터 단백질의 활성에 영향없이 목적 단백질을 탈리시키거나 동일 활성을 가진 상태로 단백질을 회수하기가 곤란하다는 문제점을 갖고 있어, 산업적으로 적용되지 못하고 있는 실정이다.

투덴햄(Tuddenham) 등은 면역흡착 크로마토그래피를 사용하여 vWF로 부터 Ⅷ:C 인자를 분리하는 방법을 보고하였다(참조: E.G.D. Tuddenham et al., Journal of Laboratory Clinical Medicine, 93:40(1979)). 즉, vWF에 대한 다가 항혈청(anti-vWF)이 결합된 아가로즈 비드를 충진시킨 칼럼 크로마토그래피를 이용하여, vWF와 다른 혈장 단백질들로 부터 Ⅷ:C 인자를 분리한다. Ⅷ:C/vWF를 포함하는 혈장을 Ⅷ:C 인자와 vWF 둘 모두를 흡착하는 칼럼에 통과시켜, 다른 원하지 않는 혈장 단백질들은 완충용액으로 세척하여 칼럼으로 부터 제거하고, 원하는 Ⅷ:C 인자는 그 후 칼슘이온으로 용출시켜 얻는다. 이 방법은 Ⅷ:C 인자의 순도와 효율면에서 개선된 것이기는 하지만, 최종산물에는 여전히 vWF와 다른 혈장 단백질들이 포함되어 있다. 이러한 불순물들은 아가로즈 비드에 결합하는 다가 항혈청을 사용했기 때문인 것으로 예측된다. 항혈청을 구성하는 대부분의 면역글로불린은 vWF에 특이적이 아니기 때문에, vWF에 특이적인 항체가 아가로즈에 결합하는 정도는 다른 종류의 항체와의 경쟁 때문에 상대적으로 적어, 최종산물에는 다른 혈장 단백들이 오염된 경우가 많다.

또한, 오스틴(Austen) 등은 아미노헥실(aminohexyl)로 치환된 아가로즈가 충진된 컬럼 크로마토그래피를 통하여, vWF와 리스토세틴 보조인자(ristocetin cofactor)로부터 Ⅷ:C 인자를 분리하는 방법을 보고하였다(참조: D.E.G. Austen, British Journal of Haematology, 43:669(1979)). 이 방법은 인간과 돼지의 Ⅷ:C/vWF 복합체에 대하여 보다 개선된 방법이나, 최종 산물에 불순물이 포함되는 결함을 갖고 있다.

상기 투덴햄 등과 오스틴 등의 방법들은 모두 최종 정제산물의 농도가 낮고 불순물을 다량 포함하고 있다는 단점이 있다.

나아가, 짐머만(Zimmerman) 등은 2단계 정제를 이용하여 고순도의 Ⅷ:C 인자를 vWF로부터 고농도로 분리하는 방법을 보고하였다(참조: USP 4,361,509). 즉, 1단계는 혈장과 농축액에 포함된 Ⅷ:C 인자의 면역흡착 단계인데, 사용된 흡착제는 vWF에 특이적인 단일클론 항체를 아가로즈 비드와 같은 적절한 매질에 결합시킨 것이다. 이때, 단일클론 항체는 생쥐 복수에서 생산된 것을 정제하여 사용한다. Ⅷ:C/vWF를 포함하는 혈장을 전기 흡착제가 충진된 칼럼에 통과시켜 Ⅷ:C/vWF를 먼저 흡착시킨 다음, 완충용액으로 세척하여 흡착되지 않은 단백질을 칼럼으로 부터 제거하고, 칼슘을 포함하는 용액으로 처리하여 흡착된 Ⅷ:C 인자만을 용출시킨다. vWF 부분은 매질에 결합된 항 vWF 단일클론 항체에 흡착된 채 남아 있다. 이렇게 회수된 Ⅷ:C 인자는 순도가 높고 불순물이 거의 없지만, 의약용으로 사용하기에는 농도가 너무 묽다는 단점이 있다. 그래서, 이 공정의 제 2단계는 친화성 크로마토그래피 기술을 이용하여 정제된 Ⅷ:C 인자를 농축하는 과정이다. 제 1단계에서 얻은 약 10∼20IU(international unit)의 Ⅷ:C 인자 함유 용액을 아미노헥실로 치환된 아가로즈가 충진된 칼럼에 주입하고, 완충용액으로 충분히 세척한 다음, 칼슘이온 함유 용액을 주입하여, 1000 unit/ml 이상의 농도를 가진 Ⅷ:C 인자를 용출시키는데, 이는 혈장으로 부터 약 160,000배 이상 농축된 것에 해당하는 양이다. 그러나, 이 정제방법은 Ⅷ:C 인자의 용출시 매질에 결합된 항 vWF 단일클론 항체(생쥐 복수에서 생산된)가 탈리됨으로 인하여, 최종 용출액에는 생쥐 유래의 단백질 즉, 항 vWF 단일클론 항체가 공존하게 되며, 이 용출액을 Ⅷ:C 인자 요구의 사람에게 투여하기에는 적절히 못하다는 문제점을 갖고 있었다

따라서, 단백질의 오염을 최소화시키면서, vWF로부터 Ⅷ:C 인자를 고농도로 분리정제할 수 있는 보다 개선된 새로운 방법이 당업계에서 절실히 요구되었다.

이에, 본 발명자들은 전술한 당업계의 요구를 충족시킬 수 있는 Ⅷ:C 인자의 정제방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, vWF와 특이적으로 그리고 높은 친화력으로 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 구성된 키메라 항체를 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산하고, 이 키메라 항체를 리간드로 하는 친화성 크로마토그래피에 의해, 인혈장, 냉동 인혈장 침전물이나 재조합 Ⅷ:C 인자를 발현하는 동물세포 배양액으로부터, 타 단백질의 오염을 극소화시키면서 Ⅷ:C 인자를 고농도로 정제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 vWF에 대한 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 구성된 키메라 항체를 이용하여, Ⅷ:C 인자를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 키메라 항체를 구성하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 각 DNA의 염기서열을 제공하는 것이다.

도 1은 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 이루어진 키메라 항체의 경쇄를 암호화하는 유전자의 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2a 내지 2b는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 이루어진 키메라 항체의 중쇄를 암호화하는 유전자의 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 이루어진 키메라 항체의 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터 RC/CMV-Ch/H의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 4는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 이루어진 키메라 항체의 경쇄 유전자를 포함하는 발현벡터 RC/CMV-dhfr-Ch/L의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명은 특이적이면서도 고친화력으로 vWF와 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 구성된 키메라 항체를 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산하고, 이 키메라 항체를 리간드로 하는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 Ⅷ:C 인자를 고순도로 정제한다.

우선, 상기 재조합 키메라 항체를 제조하기 위하여, vWF와 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 중쇄 DNA와 인간 항체 불변영역의 중쇄 DNA를 연결한 융합 DNA를 포함하는, 키메라 중쇄 발현의 플라스미드를 제조한다. 또한, vWF와 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 경쇄 DNA와 인간 항체 불변영역의 경쇄 DNA를 연결한 융합 DNA를 포함하는, 키메라 경쇄 발현의 플라스미드를 제조한다. 이들 두가지 플라스미드로 CHO 세포주를 동시에 트랜스펙션시키고, 메소트렉세이트에 의한 순응(adaptation) 과정을 거쳐, 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 구성된 키메라 항체(항 vWF 키메라 단일클론 항체)를 생산하는 CHO 세포주를 얻는다. 이 세포주를 무혈청 배지에서 배양하여 항 vWF 키메라 단일클론 항체를 생산하고, 그를 순수하게 분리한다.

그런 다음, 상기 키메라 항체를 적절한 매질에 커플링시키고, 칼럼에 충진시킨 다음, Ⅷ:C/vWF 복합체가 포함된 인혈장, 냉동 인혈장 침전물이나 세포배양 농축액을 전기 칼럼에 주입한다. 이때, 매질은 세파로즈 겔, 아가로즈 겔, 셀룰로즈 겔, 울트로 겔 또는 트리아실 겔 등이 가능하다. Ⅷ:C/vWF 복합체를 흡착시킨 후, 완충용액으로 세척하여 매질 입자에 결합하지 않은 단백질들을 제거하고, 칼슘 이온을 포함하는 완충용액을 컬럼에 주입하여 흡착된 물질 Ⅷ:C 인자를 용출시킨다. 이 시기에 최초 흡착된 Ⅷ:C 인자의 약 20∼45%가 고도로 정제된 상태로 회수된다.

상술한 본 발명의 방법과 투덴햄(Tuddenham) 등 및 짐머만(Zimmerman) 등의 종래 방법을 비교하면, 본 발명은 vWF 키메라 항체를 면역흡착제의 리간드로 사용함으로써 다음과 같은 우수한 효과를 가진다.

본 발명의 키메라 항체를 면역흡착제로 사용했을 때, 칼럼에 주입된 vWF의 약 90∼100%가 제거되어 순수한 Ⅷ:C 인자를 용출액 mL 당 5∼15 단위의 양으로서 얻을 수 있었다. 이는 생쥐의 복수에서 생산된 vWF-특이적인 단일클론 항체를 면역흡착제로 사용하는 짐머만(Zimmerman) 등의 방법에서도 얻을 수 있는 유사한 효과상 결과이나, 짐머만 등의 방법에서는 후술하는 문제점을 내포하고 있었다. 또한, vWF에 대한 단일클론이 아닌 다가 항체를 면역흡착제로 사용하는 투덴햄(Tuddenham) 등의 방법에서는 칼럼에 주입된 vWF가 약 53∼83% 제거되어 Ⅷ:C 인자를 용출액 mL 당 0.5∼1.25 단위의 양으로서 얻을 수 있었다.

아울러, 짐머만(Zimmerman) 등의 방법에서는 Ⅷ:C 인자의 정제시 매질로부터 항 vWF 단일클론 항체가 탈리되어, 최종 Ⅷ:C 인자 용출액에는 생쥐 유래 단백질(항 vWF 단일클론 항체)의 공존에 의해 야기된 단백질의 오염 문제가 있으나, 본 발명에서는 인간 항체의 불변영역이 조합된 키메라 항체를 사용하므로, 탈리에 의한 생쥐 유래 단백질의 오염을 최소화시키면서, vWF로부터 Ⅷ:C 인자를 정제할 수 있다.

아울러, 본 발명에 의하면, 특이적인 단일클론 키메라 항체는 유전공학기술에 의해 재조합 단백질로서 언제든지 공급이 가능하므로, 배치(batch)마다 발생하는 변이를 제거할 수 있다.

다음으로, 본 발명은 상기 친화성 크로마토그래피에 의해 회수된 정제 Ⅷ:C 인자를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 회수한 Ⅷ:C 인자 함유 용출액을 아미노헥실 아가로즈로 충진된 컬럼에 통과시키고, 0.025M 염화칼슘이 포함된 동일 완충용액으로 세척한 다음, 0.5M 칼슘이온 함유 용액을 주입하여, 용출액 mL당 300 단위 이상의 농도를 가진 농축 Ⅷ:C 인자를 얻는다. 따라서, 이 농축단계는 고순도 고농도의 의약용으로 사용가능한 Ⅷ:C 인자를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: vWF에 대한 단일클론 키메라 항체 발현 벡터의 제조

vWF에 대한 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 이루어진 단일클론 키메라 항체는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 상업적으로 시판되고 있는 GREEN EIGHT 추출액(주식회사녹십자, 대한민국)으로부터 나카무라(Nakamura) 등의 방법(참조: Clinical laboratory techniques for the 1980's, R.M. Nakamura et al. eds., Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 339-349(1980))에 의해 고순도의 Ⅷ:C/vWF를 정제하였다. 이것을 생쥐에 면역시키고 제거하여, 브라운 등이 기술한 표준 방법(참조: J.P. Brown et al., Jorunal of biological chemistry, 225:4980-4983(1980))에 따라 vWF에 대한 생쥐유래의 단일클론 항체를 생산하는 세포주를 획득하였다. 양성인 클론을 결정한 후, 적어도 두 번 정도 서브클론 배양하였다. 각 양성인 클론들 중에서 vWF에 대한 친화력이 적당하다고 생각되는 클론을 선발하였다.

선발된 하이브리도마로 부터 생쥐 IgG의 가변영역의 유전자를 확보하기 위하여, 세포를 T-75 플라스크에서 배양한 후 Clontech사의 표준 방법에 따라 전(total) RNA를 분리하였고, 이로 부터 cDNA를 제조하였다. 이 cDNA로 부터 하기와 같은 프라이머를 사용하는 PCR을 수행하여, 생쥐 IgG의 경쇄와 중쇄 가변영역 유전자를 증폭하였다:

① 경쇄용 5' 프라이머

프라이머 1 : GGG AAG CTT CAC CAT GGA GAC AGA CAC ACT CCT GCT AT

프라이머 2 : GGG AAG CTT CAC CAT GGA TTT TCA GGT GCA GAT TTT CAG

프라이머 3 : GGG AAG CTT CAC CAT GRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT Y

프라이머 4 : GGG AAG CTT CAC CAT GAG GKC CCC WGC TCA GYT YCT KGG R

프라이머 5 : GGG AAG CTT CAC CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT G

② 경쇄용 3' 프라이머

프라이머 6 : CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC

프라이머 7 : CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC AAT

③ 중쇄용 5' 프라이머

프라이머 8 : GGG GCG GCC GCC ACC ATG GRA TCS AGC TGK GTM ATS CTC TT

프라이머 9 : GGG GCG GCC GCC ACC ATG KAC TTS GGA YTG AAC TAY GTA TT

프라이머 10 : GGG GCG GCC GCC ACC ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T

프라이머 11 : GGG GCT CGA GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCA ; VH1-BACK

프라이머 12 : ATG RAA TGS ASC TGG GTY WTY CTC T ; MH-SP-ALT2

프라이머 13 : AGG TSM ARC TGC AGS AGT CA ; VH1.BX

④ 중쇄용 3' 프라이머

프라이머 14 : CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC ; CH1

프라이머 15 : AYC TCC ACA CAC AGG RRC TGG ATA GAC ; 130

프라이머 16 : TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC ; VH1.FOR

경쇄 가변영역 유전자는 프라이머 4번과 6, 7번을 쌍으로 하였을 때 증폭되었으며, 중쇄 가변영역 유전자는 프라이머 9번과 14번을 사용하였을 때 증폭되었다.

상기에서 증폭된 유전자는 pCRII TA 벡터(Invitro사, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열을 기초로, 항체의 유전자임이 확인된 클론을 선택하고, 중쇄의 염기서열을 포함하는 플라스미드를 'pCRII(TA)-MuHV'로, 경쇄의 염기서열을 포함하는 플라스미드를 'pCRII(TA)-MuLV'로 명명하였다.

한편, 전기 생쥐 IgG 가변영역과 연결할 사람의 불변영역 염기서열은 대한민국 특허출원 제 96-17625호에 개시된 플라스미드 pTA-Hu-Hc 및 pTA-Hu-Lc에 삽입된 유전자를 사용하였다. 상기의 가변영역과 사람의 불변영역 유전자를 연결하기 위하여, 재조합 PCR 방법을 이용하였다. 이 방법은 연결되는 서열 양 끝에 서로 상보적으로 중첩되는 서열을 만들어 줌으로서 최초 PCR의 프라이머이면서 주형으로 작용하도록 한 것으로, 대한민국 특허출원 제 96-17625호에 개시된 표준방법을 사용하였다. 연결과정을 더욱 상세하게 설명하면, 후술하는 도 3 및 도 4와 같다. 먼저, 키메라 중쇄를 제조하기 위하여, pCRII(TA)-MuHV를 주형으로 하고, 하기 프라이머 17과 18을 사용한 PCR을 실시하여, 중쇄 가변영역만을 증폭하였다. 아울러, 사람 IgG Ck을 주형으로 하고 하기 프라이머 19와 20을 사용한 PCR을 실시하여 사람 불변영역을 증폭한 후, 프라이머 17과 20을 사용한 재조합 PCR을 수행하여 키메라 중쇄를 만들었다. 프라이머 17에는 Not I 제한효소 인식부위가 있고, 프라이머 20에는 Xba I 제한효소 인식부위가 있다. 키메라 경쇄를 제조하기 위하여, pCRII(TA)-MuLV를 주형으로 하고, 하기 프라이머 21과 22를 사용한 PCR을 실시하여, 경쇄 가변영역만을 증폭하였다. 사람 IgG Ck을 주형으로 하고, 하기 프라이머 23과 24를 사용한 PCR을 실시하여 사람 불변영역을 증폭한 후, 프라이머 21과 24를 사용한 재조합 PCR을 수행하여 키메라 경쇄를 제조하였다. 프라이머 21에는 Hind III 제한효소 인식부위가 있고, 프라이머 24에는 Apa I 제한효소 인식부위가 있다.

프라이머 17 : GGG GCG GCC GCC ACC ATG TAC TTG GGA CTG AAC TAT GTA TTC ATA

프라이머 18 : TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT TCC TTG GCC CC

프라이머 19 : ACC TGG TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA

프라이머 20 : ACT CTA GAG TCG ACC TGA CCC GTG GA

프라이머 21 : GGG AAG CTT CAC CAT GAG GGC CCC TGC TCA GTT TCT GGG GCT

프라이머 22 : AGT CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC TCC

프라이머 23 : GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC

프라이머 24 : TCC GGG CCC CCC CTC GAG GT

생쥐의 단일클론 항체의 가변영역에 인간 항체의 불변영역이 연결된 재조합 키메라 항체를 구성하는 경쇄와 중쇄의 DNA 염기서열은 도 1, 도 2a 및 도2b에 나타내었다.

재조합 PCR법으로 생성된 키메라 중쇄의 DNA를 NEB사의 표준방법에 따라 NotI과 XbaI 제한효소로 절단하고, NotI과 XbaI 제한효소들로 절단된 pRc/CMV(Invitrogen사, USA)와 연결하여, 키메라 중쇄 발현 플라스미드인 pRc/CMV-Ch/H를 제조하였다(참조: 도 3).

재조합 PCR법으로 생성된 키메라 경쇄의 DNA를 HindⅢ와 ApaI의 제한효소로 절단한 후, dhfr 유전자를 포함하는 플라스미드 pRC/CMV-dhfr(KCTC 8671P)의 HindⅢ-AapI의 위치에 삽입함으로써, 키메라 경쇄 발현 플라스미드 pRc/CMV-dhfr-Ch/L를 제조하였다(참조: 도 4).

실시예 2: 항 vWF 단일클론 키메라 항체를 생산하는 CHO 세포주의 제조

중쇄 발현벡터 pRc/CMV-Ch/H와 경쇄 발현벡터 pRc/CMV-dhfr-Ch/L를 동시에 리포펙션(lipofectin) 방법을 사용하여 CHO 세포(DG44)에 트랜스펙션(transfection)시켰다. 벡터의 도입 방법은 Life Technologies사의 Lipofection Reagent^R의 지시에 따랐다.

이와 같이 트랜스펙션된 CHO 세포는 B2로 명명되어 1998년 1월 6일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0420BP로 기탁하였다.

그런 다음, G418을 포함하는 α-MEM(Gibco 12000) 배지를 사용하여 10⁴세포/웰이 되도록 트랜스펙션된 CHO 세포주를 96웰 플레이트에 분주하였다. 3일 간격으로 배지를 갈아주면서 14일 동안 배양하였다. 생존한 클론의 배양상층액을 이용하여 간접 ELISA 방법에 의해 인간화 키메라 항체를 생산하는 양성세포주들을 선별하였다.

상기에서 선발된 클론의 유전자를 증폭하기 위해, 1 x 10⁵세포씩 T-25 플라스크에 옮기고, 메소트렉세이트 20nM을 함유하고 10% 투석된 송아지 혈청을 함유한 α-MEM 배지(GIBCO사, USA)에서 37℃의 온도로 2일 동안 배양한 후, 2일 간격으로 배지를 교환하면서 2주 동안 배양하였다. 그 결과, 메소트렉세이트 20nM을 함유하고 10% 투석된 송아지 혈청을 함유한 α-MEM 배지에서 HuvWF 세포주들의 생산성이 약 2∼4배 높아짐을 확인하였다. 메소트렉세이트 농도를 점차 높혀 1μM까지 증폭시켰을 때, 선발된 클론들의 생산성은 8∼15㎍/10⁶cell/day이었다. 선발된 클론들중에서 세포생산성이 뛰어난 세포주를 무혈청배지에서 배양하여, 생쥐 단일 클론항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 이루어진 키메라 항체를 생산하였다.

실시예 3: 항 vWF 단일클론 키메라 항체의 정제 및 커플링

실시예 2에서 생산된 키메라 항체를 포함하는 배양 상층액을 한외여과하여 항체를 농축하였다(회수율: 약 75%). 약 40배 정도 농축된 배양 상층액을 20mM 인산 완충용액(pH 8.0)으로 투석하여, 미리 20mM 인산 완충용액으로 평형화시킨 DEAE-Toyopearl(TOSHO, Japan) 칼럼에 주입하고, 인산 농도 80∼140mM의 직선구배로 항 vWF 키메라 항체를 용출시켰다(회수율: 약 43%). 이어, 전기 용출액은 다시 단백질 A-세파로즈 4B(Protein A-Sepharose 4B, Pharmacia, Sweden) 크로마토그래피를 실시하여 정제하였다.

상기에서 정제한 항 vWF 키메라 항체는 카보네이트 완충용액(pH 8.3)에 현탁하고, 고체매질 CNBr-Activated 아가로즈 젤과 반응시켜, 항 vWF 키메라 항체가 고체매질 젤 ml당 0.5mg∼1mg으로 결합하도록 하였다.

실시예 4: 키메라 항체를 리간드로 하는 친화성 크로마토그래피에 의해 Ⅷ:C 인자의 정제

실시예 4-1: 냉동 인 혈장유래의 냉동침전물(cryoprecipitate)에서 Ⅷ:C 인자를 정제

냉동 인 혈장(plasma)을 용해 후 원심분리하여 얻은 침전물(cryoprecipitate) 1kg을 0.8%(w/v) 염화나트륨이 포함되어 있는 2리터의 주사용 제제수에 넣고, 37℃에서 침전물이 거의 대부분 용해되도록 하여, 침전물에 포함되어 있는 Ⅷ:C 인자를 용출시켰다. 그런 다음, 1N 초산을 넣어 용해액의 pH를 6.5∼7.5로 맞추고, 2%(w/v)의 알부민 하이드록사이드 겔 65g을 가하여 30분간 교반하였다. 교반된 용액을 3000 x g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 1.5M 구연산 나트륨 14ml를 첨가하여 pH를 7.4로 조절한 후, 1㎛의 여과막으로 여과하고, TNBP(Tri-n-butyl phosphate)와 Tween 80을 각각 0.3%(v/v), 1%(w/v)의 농도가 되도록 첨가하여, 25℃에서 8시간 동안 바이러스 불활화를 실시하였다. 불활화가 끝난 용액을 Ⅷ:C 인자 완충용액(0.1M 리신, 0.02M 히스티딘, 0.15M NaCl, pH 6.8)에 3배 희석하여, 항 vWF 키메라 항체가 리간드로 커플링된 vWF항체-세파로즈 4B 겔이 충진된 칼럼(15 x 30 cm)에 1분당 50ml의 유속으로 통과시켰다. 동일한 Ⅷ:C 인자 완충용액으로 칼럼의 5배 부피로 세척하고, 0.35M 염화칼슘으로 Ⅷ:C 인자만 용출시켰다. 이 용출액을 한외여과막으로 투석한 후, 완충용액(0.1M 리신, 0.02M 히스티딘, pH 6.8)으로 평형화된 EAH(enhanced aminohexyl)-아가로즈 친화성 칼럼(4 x 10 cm)에 1분당 5ml의 유속으로 통과시키고, 25mM 염화칼슘이 포함된 동일 완충용액으로 세척한 다음, 0.5M 염화칼슘이 포함된 동일 완충용액으로 Ⅷ:C 인자를 용출시킨 결과, 비 특이활성이 약 2100 단위인 고순도의 Ⅷ:C 인자를 얻었고, 회수율은 약 40%를 나타내었다(참조: 표 1).

냉동 인 혈장 유래의 냉동침전물로부터 Ⅷ:C 인자의 분리

정제단계	부피(L)	총 단백량 (g)	총 활성(I.U.)	비활성(I.U./mg)	수율(%)
바이러스 불활화 용액	20	100	104,000	1.04	100
항 vWF 항체-세파로즈 4B 칼럼 비흡착액	22	100	36,400	0.3	35
항 vWF 항체-세파로즈 4B 칼럼 용출액	10	0.02	42,640	2,100	41
EAH 친화성 칼럼 용출액	0.2	0.02	42,000	2,100	40

실시예 4-2: 냉동 혈장에서 Ⅷ:C 인자를 정제

냉동 혈장을 약 30℃ 항온 수조에서 신속히 용해시켜 침전이 생기지 않도록 한 다음, 용해된 혈장을 유리필터로 여과하여 침전물을 제거하고, Ⅷ:C 인자 완충용액(0.1M 리신, 0.02M 히스티딘, 0.15M NaCl, pH 6.8)에 3배 희석하고 TNBP와 Tween 80을 각각 0.3%(v/v), 1%(w/v)의 농도가 되도록 첨가하여, 25℃에서 8시간 동안 바이러스 불활화를 실시하였다. 불활화가 끝난 용액을 Ⅷ:C 인자 완충용액에 3배 희석하고, 항 vWF 키메라 항체가 리간드로 커플링된 vWF항체-세파로즈 4B 겔이 충진된 칼럼(4 x 20 cm)에 1분당 10ml의 유속으로 통과시켰다. 동일한 Ⅷ:C 인자 완충용액으로 칼럼의 5배 부피로 세척하고, 0.35M 염화칼슘으로 Ⅷ:C 인자만 용출시켰다.

이 용출액을 한외여과막으로 투석한 후, 완충용액(0.1M 리신, 0.02M 히스티딘, pH 6.8)으로 평형화된 EAH(enhanced aminohexyl)-아가로즈 친화성 칼럼(2 x 5 cm)에 1분당 2ml의 유속으로 통과시키고, 25mM 염화칼슘이 포함된 동일 완충용액으로 세척한 다음, 0.5M 염화칼슘이 포함된 동일 완충용액으로 Ⅷ:C 인자를 용출시킨 결과, 비 특이활성이 약 980 단위인 고순도의 Ⅷ:C 인자를 얻었고, 회수율은 약 20%를 나타내었다(참조: 표 2).

냉동 혈장으로부터 Ⅷ:C 인자의 분리

정제단계	부피(L)	총 단백량 (g)	총 활성(I.U.)	비활성(I.U./mg)	수율(%)
냉동혈장	5	280	4,000	0.014	100
항 vWF 항체-세파로즈 4B 칼럼 비흡착액	5.2	275	2,800	0.01	70
항 vWF 항체-세파로즈 4B 칼럼 용출액	1.6	0.0008	800	980	20
EAH 친화성 칼럼 용출액	0.002	0.0008	785	970	20

실시예 4-3: 세포 배양액에서 Ⅷ:C 인자를 정제

재조합 Ⅷ:C 인자를 발현하는 동물 세포주 V88(KCTC 0421BP)의 무혈청 세포 배양액을 0.4㎛ 여과막으로 여과한 다음, 분자량 50,000의 한외여과막을 사용하여 20배로 농축하였다. 이 농축용액을 Ⅷ:C 인자 완충용액(0.1M 리신, 0.02M 히스티딘, 0.15M NaCl, pH 6.8)에 3배 희석하고, 항 vWF 키메라 항체가 리간드로 커플링된 vWF항체-세파로즈 4B 겔이 충진된 칼럼(15 x 15 cm)에 통과시켰다. 동일한 Ⅷ:C 인자 완충용액으로 칼럼의 5배 부피로 세척하고, 0.35M 염화칼슘으로 Ⅷ:C 인자만 용출시켰다.

이 용출액을 한외여과막으로 투석한 후, 완충용액(0.1M 리신, 0.02M 히스티딘, pH 6.8)으로 평형화된 EAH(enhanced aminohexyl)-아가로즈 친화성 칼럼(4 x 7 cm)에 1분당 5ml의 유속으로 통과시키고, 25mM 염화칼슘이 포함된 동일 완충용액으로 세척한 다음, 0.5M 염화칼슘이 포함된 동일 완충용액으로 Ⅷ:C 인자를 용출시킨 결과, 비 특이활성이 약 2150 단위인 고순도의 Ⅷ:C 인자를 얻었고, 회수율은 약 32%를 나타내었다(참조: 표 3).

세포배양액으로부터 재조합 Ⅷ:C 인자의 분리

정제단계	부피(L)	총 단백량 (g)	총 활성(I.U.)	비활성(I.U./mg)	수율(%)
세포배양 상층액	10	100	104,000	2.8	100
농축액	0.5	5.4	27,360	5.1	72
항 vWF 항체-세파로즈 4B칼럼 비흡착액	12	5.1	11,780	2.3	32
항 vWF 항체-세파로즈 4B 칼럼 용출액	4.2	0.00017	12,160	2,150	32
EAH 친화성 칼럼 용출액	0.1	0.00017	12,200	2,150	32

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, vWF와 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 구성된 키메라 항체를 이용한 본 발명의 Ⅷ:C 인자 정제방법은 인간 유래가 아닌 타 단백질의 오염을 극소화시킴과 동시에, 고농도의 Ⅷ:C 인자를 고순도로 제공한다. 따라서, 이렇게 정제된 Ⅷ:C 인자는 의약용으로 사람에게 사용가능하다.

Claims (9)

1. (i) 폰 빌리브란트 인자(von Willebrand factor)와 특이적으로 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 중쇄 DNA와 인간 항체 불변영역의 중쇄 DNA를 연결한 융합 DNA를 포함하는, 키메라 중쇄 발현의 플라스미드, 및

   폰 빌리브란트 인자와 특이적으로 결합하는 생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 경쇄 DNA와 인간 항체 불변영역의 경쇄 DNA를 연결한 융합 DNA를 포함하는, 키메라 경쇄 발현의 플라스미드를 제조하는 단계;

   (ii) 상기에서 제조된 두가지 플라스미드로 동물세포주를 동시에 트랜스펙션(transfection)시키고 배양하여, 생쥐 단일클론 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역으로 구성된 키메라 항체를 생산하고, 그를 정제하는 단계;

   (iii) 상기에서 정제된 키메라 항체를 고체 매질에 커플링시켜, 폰 빌리브란트 인자 친화성 흡착겔을 제조하는 단계; 및,

   (iv) 상기에서 제조한 폰 빌리브란트 인자 친화성 흡착겔이 충진된 칼럼에, 폰 빌리브란트 인자와 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 복합체를 포함하는 용액을 주입한 다음, 세척하고 칼슘 이온을 포함하는 완충용액을 컬럼에 주입하여, 혈액응고 제 8인자를 용출시키는 단계를 포함하는

   혈액응고 제 8인자의 정제방법.
2. 제 1항에 있어서,

   키메라 중쇄 발현의 플라스미드는 pRc/CMV-Ch/H인 것을 특징으로하는

   방법.
3. 제 1항에 있어서,

   키메라 경쇄 발현의 플라스미드는 pRc/CMV-dhfr-Ch/L인 것을 특징으로 하는

   방법.
4. 제 1항에 있어서,

   트랜스펙션된 동물세포주는 키메라 중쇄 발현의 플라스미드 pRc/CMV-Ch/H 및 키메라 경쇄 발현의 플라스미드 pRc/CMV-dhfr-Ch/L가 동시에 도입된 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포(KCTC 0420BP)인 것을 특징으로 하는

   방법.
5. 제 1항에 있어서,

   생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 중쇄 DNA는 다음과 같은 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는

   방법:
6. 제 1항에 있어서,

   생쥐 단일클론 항체의 가변영역의 경쇄 DNA는 다음과 같은 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는

   방법:
7. 제 1항에 있어서,

   고체 매질은 세파로즈 겔, 아가로즈 겔, 셀룰로즈 겔, 울트로 겔 및 트리아실 겔로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는

   방법.
8. 제 1항에 있어서,

   복합체를 포함하는 용액은 인혈장, 냉동 인혈장 침전물 (cryoprecipitate) 또는 재조합 혈액응고 제 8인자를 발현하는 동물세포 배양액인 것을 특징으로 하는

   방법.
9. 제 1항의 (iv)단계 후에, 회수한 혈액응고 제 8인자 함유 용출액을 아미노헥실 아가로즈 컬럼 크로마토그래피하는 단계를 추가로 포함하 는, 혈액응고 제 8인자의 정제방법.