JPH023700A - Ｖｌａタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 し発明の背景〕 本発明は、細胞外マトリックス接着機能を有するヒト細
胞組織から単離した超遅延抗原（ＶＬＡ）タンパク質群
に係わる。

ヒｌ〜超遅延抗原（ＶＬＡ）へテロダイマーＶＬＡ−１
及びＶＬＡ−２が、ＩＩｅ＋ｎ１ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、に
よって開示されている（Ｊ、　　ＩｍＩｎｕｎｏｌ、　
　１３１：　　３３４．　１９８３；　　Ｊ、　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、１３２：３０１１　１９８４；　Ｅｕｒ、
　Ｊ、　Ｔｍ１ｕｎｏ１．１５：　５０２．１９８５；
Ｊ、　Ｉｔｉｏｌ、　ＣＩ＋ｃｎ＋、　２６０：　１５
２４６．１９８５；　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７８：　６９６．１９８６）。これら
は、それぞれＭ。

２１００００／１３０，０００及びＭ、１６５，０００
／１３０，０００の別個のタンパク貰複合体であり、　
Ｍ、１．３０，０００のβサブユニットは共通であるが
αサブユニットは異なるものを有する。Ｖｌ、Δ−１も
ＶＬＡ−２ちＴ細胞の活性Ｃヒ後非常に遅れて現れ、長
期のＴ細胞培養の間にＶＬＡ−１がＶｌ、＾−２に関し
様々な量で得られる。ネズミ科動物ハイブリドーマＴＳ
２／７から得た、ＶＬＡ−１に対するモノクローナル抗
体がＴ　Ｃｅ１ｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、によ
って販売されており、この抗体は、長期間もしくは慢性
的に活性１ヒされたＴ細胞及び胸腺リンパ球の同定、並
びにヒトＴ細胞の、特に抗原刺激及びマイトジェン刺激
に応答する機能の評価に用いられる。　ＶＬＡ−１の検
出は、多発性硬化症、全身性エリ１−マド−デス及び慢
性関節リウマチのような慢性自己免疫疾患並びに慢性ウ
ィルス感染の相関化及び評価にも用いられる。例えば、
活動性多発性硬化症患者のＴ、！（ｌＩ胞の表面におい
てＶＬＡ−１発現の増加が観察された。

〔発明の概要〕

本出願人は今や、超遅延抗原（ＶＬＡ）タンパク質群が
更に３種のへテロダイマー、即ちＶＬＡ−３、ＶＬＡ４
及びＶＬＡ−５を含むことを発見した。これらのヘテロ
ダイマーを免疫精製し、各ＶＬＡαサブユニ・／トのＮ
末端アミノ酸配列を決定した。本発明は、ＶＬＡ４を認
識するモノクローナル抗体も開示する。

〔発明の詳細な説明〕

今や、ＶＬΔβタンパク質サブユニ・ントがほぼ総ての
ヒト組繊及び細胞型において発現されること、及び、主
にＴ、［胞についての研究との相関化に用いられる公知
ＶＬＡタンパク質ＶＬＡ−１及びＶＬＡ−２に加えて、
共通のβサブユニットと、互いに異なるが関連するαサ
ブユニットとをα：β−１：１の割合で有する３種の付
加的ＶＬＡタンパク質が存在することが判明した。共通
のβサブユニットは、Ｈｒｌｌｏ、０００（還元前）及
びＭｒ１３０，０００（還元後）を有する。

Ｖｌ、八−３、ＶＬＡ−４及びＶＬＡ−５の互いに異な
るαサブユニットは、それぞれＭ、１５０，０００（Ｅ
１元前）及びＨ・１３５．０００（ｉ元後）のαコ、Ｍ
ｒ１４０，０００（還元前）及びＭ、１５０．０００（
還元を表）のα４並びに旧１５０，０００（還元前）及
びＭ、１３０，０００（還元後）のα５として同定でき
る。

本明ＭＪ３中で用いる略号＋ｎＡｂは゛モノクローナル
抗体“、ＶＬＡは“°超遅延抗原“”　、ｐｓは“′部
位特異的“、Ｎ−ＣＡＭは“°神経細胞接着分子′°を
それぞれ意味する。

モノクローナル　　（ｍＡｂ） 輸＾ｂ　ＴＳ２／７．１２Ｆ１、Ｊ１４３及びｎ−５ｃ
ｔｏがそれぞれＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３及
びＶＬＡ−４ノα１、α２、α３及びα４サブユニツト
を認識する６慴＾ｂ　１２Ｆ１及びＪ１４３は、それぞ
れに、　Ｐｉｓｃｈｅｌ　ａｎｄ　Ｖ、　Ｗｏｄｄｓ。

［１ｎｉｖｅｒｓｉＬｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ
、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ及びＲＫａｎｔｏｒ　　ａｎｄ
　　Ｌ、Ｏｌｄ、Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　　
Ｉｎ５ｔｉｔｕＬｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　、　ＮＹから入手可能である。

石＾ｂ　ＴＳ２／７及びロー５Ｇ１０はＭ、　Ｈｅｍ１
ｅｒ、　Ｄａｎａ　ＦａｒｂｅｒＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍ＾から入手可能で
ある　。　ｍＡｂ　　＾−１八５（Ｍ、　　ｌｌｅｍｌ
ｅｒ、　　Ｄａｎａ　　Ｆａｒｂｅｒ　　Ｃａｎｃｅｒ
ＴｎｓｔｉｔｕＬｅ）は、全ＶＬＡタンパク質に共通の
βサブユニットを特異的に認識する（Ｊ、口ｉｏ１．　
Ｃｂｅｍ。

２６２：　３３００．１９８））。これらの輸＾ｂを腹
水から４５％硫安沈澱によって精製して、ＣＮＢｒ活性
化した５ｅｐｈａｒｏｓｃ　４Ｂ（１’ｈａｒｍａｃｉ
ａ）と結合させ、その際製造者の指示に従い包装顆粒１
ｍｌ当たり３ＢのｍＡｂを用いた。

ＶＬＡ−１ヒＶＬＡ−３ノ’ 新鮮なヒト胎ｇ！！（Ｂｒｉｇｂａｍ　ａｎｄ　Ｗｏｍ
ｅｎ’　ｓ■ｏｓｐ　ｉ　−ｔａｌ、　Ｂｏｓｔｏｎ、
　Ｍ＾から入手）を氷冷０．９％ＮａＣｌで大規模に洗
浄して羊膜及び絨毛膜を除去し、拭いて乾燥した。組織
（湿潤重量１００ｇ）を賽の目切りにし、ワーリングブ
レンダー（１分間隔で３０秒ずつ４回作動）において５
ｖｏｌの１０ｍＭ１・リスＩＩｃＩ　ｐＨ７，５１０，
１５ＭＮａＣｌ／１ｍＭフェニルエチルスルホニルフル
オリド／１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（［ｌ’ｌ’ｒ
液＾）中で０°Ｃで均質化した。

ホモシネ−！・を１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離
し、上澄み液をコムギ胚レクチン−５ｅｐｈａｒｏｓｅ
　（２０ｍ　ｌ　）及びリシン−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　
（４０ｎ＋　ｌ　）カラム（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ）に
継続的に装荷した。１０カラムｖｏｌの緩衝液晶で濯い
だ後、結合物質を、それぞれ５％Ｎ−アセチルグルコサ
ミンまたは５％ガラクトースを含有する緩衝液晶で溶離
した。結合レクチンカラム溶量液をオボアルブミン−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（１０ｍｌ）に通して、非特異的に接
着する物質を除去し、ＴＳ２／７　　Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ（５ｍｌ）及びＪ１４３−　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１
ｍｌ）カラムに継続的に装荷し、その後１カラムｖｏｌ
のＷＬ街液＾、１カラムｖｏｌの５Ｏｎ＋Ｍ　ＮａＣ１
１０，１％デオキシコレート、更に１０カラムｖｏｌの
１０ｍＭ　トリスｌｌＣｌ　　ｐＨ７，５１０，１５Ｍ
ＮａＣｌ１０．１％デオキシコレートで濯いだ。Ｖ’Ｌ
＾−１及びＶＬＡ−３を各一方のカラムから５０ｍＭジ
エチルアミン１０．１％デオキシコレート７５％グリセ
ロールｐＨ１１，５で溶離し、０．１ｖｏｌのＩＭトリ
スＨＣＩ（ｐＨ８，８）で直ちに中和した。

ＶＬＡ−５ＶＬＡ−２ＶＬＡ−４の ＴＳ２／７−１１２Ｆ１−及びＪ１４３−５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅクロマトグラフイーによってヒト胎盤糖タンパク
質調製物から他のＶＬＡ構造物を除去した後、残りの胎
盤糖タンパク質フラクションからＶＬＡ−５をβ特異的
＾１＾５−５ｅｐｂａｒｏｓｅクロマトグラフイーによ
って精製した。ＶＬＡ−２は２５ｇの古い血小板（Ｄａ
ｎａ　Ｆａｒｂｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕＬｅ血液銀行及び
＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ、　Ｄｏｓ−ｔ
ｏｎ、　Ｍ＾から入手）から１２Ｆ１−５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅあるいは＾−１＾５−５ｅｐｈａｒｏｓｅクロマト
グラフイーによって精製し、またＶＬＡ−４は１００ｇ
のＮｏｔ−４細胞から、Ｂ−５Ｇ１０−５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　（５ｍ　ｌ　）を用いて上記と同様の手続きで精
製した。

ゲルタ＼離　びが列分析 １〜２１ｇ以下のタンパク質を含有するカラムフラクシ
ョンのアリコートを７％アクリルアミドゲルでのＮａＤ
ｏｄＳＯ１／ＰＡＧＥによって分析し、その後収率及び
純度を評価するべく銀染色を実施した。比較的大量のＶ
ＬＡタンパク質（２０〜５ｈｇ）を分離用５％ＮａＤｏ
ｄＳ０４／ＰＡＧＥゲルに対して用い、また１２５■で
標識した精製ＶＬＡタンパク質のアリコートを、分離し
たサブユニットの位置決めを容易にするマーカーとして
用いるべく隣接レーンにおいて用いた。

ＶＬＡ−３及びＶＬＡ−５のサブユニツ！・分離には（
α及びβサブユニットの共移動防止のため）還元しない
分離用ゲルを用い、一方ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２及びＶ
ＬＡ−４のサブユニット分Ｍには還元条件を採用した。

ＮａＤｏｄＳＯＪＰＡＧＥでの分Ｎｆ＆、各ＶＬＡ複合
体由来のαサブユニットを含有するゲル片を切り取り、
ヒーロ些且しニジＪ！ｌ工９１：　２２７（１９８３）
に述べであるように電気溶射して、各々約３０−１０１
００ｐ　ｌを＾ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓＬｅｎ＋５（
Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ＾）の気相４７０＾・タ
ンパク質シーケンサ−で配列分析し、この分析はＩＩ　
ａ　ｒ　−ｖａｒｄ　Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ＾）で実
施した。

ＶＬＡ　ンパク　の ヒト胎盤抽出物を糖タンパク質に関して濃厚化し、その
後免疫親和性カラムで継続的に精製したところ、ＶＬＡ
−１、ＶＬＡ−３及びＶＬＡ−５のα及びβサブユニッ
トが大量に得られ、−・方ＶＬＡ−２の量は比較的少な
く、またＶＬＡ−４は得られなかった。ＴＳ２／７−１
２Ｆ１−及びＪ　１４３−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅクロマ
トグラフイーによって他のＶＬＡタンパク質を実質的に
除去した後、β鎖特異的＾−１Δ５−５ｅｐｂａｒｏｓ
ｅカラムを用いてＶＬＡ−５を精製した。精製した胎盤
ＶＬＡ−５をマウス抗ＶＬＡ−５血清との反応性を試験
することにより同定し、その際上記抗血清は、他の総て
のＶＬＡタンパク質の不在下に細胞系に−５６２からＶ
ＬＡ−５に対して調製した（Ｎａｔｕｒｅ　３２６：　
６０７．１９８７）。胎盤からは少址のＶＬＡ−２しか
得られなかったが、比較的大量のＶＬＡ−２を血小板か
ら、＾−１＾５−５ｅｐｂａｒｏｓｅあるいは１２ＦＩ
　　５ｅｐｈＬ１ｒｏｓｅを用いて得ることができた。

血小板では主としてＶＬＡ−２が、可変量のＶＬＡ−５
と共に発現される。八−］八へ　−５ｅｐｂａｒｏｓｃ
免疫親和性精製の後、Ｎ末端配列分析の前にＶＬＡ−２
のα２サブユニツＩ・を任意の汚染α３サブユニツト物
質から、還元条件下での分離ＮａＤｏｄＳＯ＜／ｒ’八
Ｇへにより容易に分離しな。ＶＬＡ−４は、胎慇及び血
小板からは得られなかったもののＴリンパ芽球様細胞系
Ｍｏ１ｅ〜４からト５Ｇ１０−Ｓｃｐｂａｒｏｓｅを用
いて精製できた。最終的に特にα１サブユニットが得ら
れ、βサブユニットの方は恐らく解離により失われた。

ＶＬＡ−４のα４サブユニツトとβサブユニットとは容
易に解雛すると考えられる。

ｕＱｌｌまＪｌｌ　Ｉ（７）し順 各ＶＬ八へサブユニツＩ・の最初の１４個のＮ末端残基
の配列を決定したく表１）。これらの配列は、特に部位
１〜６並びに１０〜１４でかなりの相同性を示した。

個々のＶＬＡαサブユニット同士の相同率（表■参照）
は２１％（α１とα３）から７５％（α２とα５）で、
全αサブユニット対の平均相同率は４２％であった。通
常のアミノ酸置換を考慮すると、任意のＶＬＡαサブユ
ニット対の相同率は平均で５９％（範囲は４３〜７５％
）に上昇する。ＶＬＡ−４としばしば共発現される旧８
０．０００のペプチドのｉ４末端配列はα４サブユニツ
トに関して示したちのと同じであった。この８０，００
０Ｍｒペプチドは、タンパク質加水分解によってＶＬＡ
α４サブユニットから生じると考えられる。

六−」− 相同率は、表１に示した各配列（表■左端に当該サブユ
ニット掲示）の部位１１〜１４のアミノ酸残基を各ＶＬ
Ａ（表Ｕ上方に掲示）のαサブユニットの配列と比較す
ることにより算出した。通常のアミノ酸置換を勘案した
相同率を括弧内に示す。通常の置換基と看做したアミノ
酸は、ｌ・レオニン、セリン；フェニルアラニン、チロ
シン；バリン、イシロイシン、ロイシン；アスパラギン
酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；アルギ
ニン、リジン；並びにアラニン、グリシンであった。

生化学的研究に基づき、ＶＬＡ−４ｔＶ１造物は、白血
病起源のＴリンパ芽球様細胞並びに末梢血Ｔ細胞におい
て得られる独得のＭ、１５０，０００／１３０，０００
α４βヘテロダイマーとして同定されている。α４サブ
ユニツトに特異的なｍＡｂが存在しないとＶＬＡ−４の
同定及び研究は困難であり、なぜなら １）α４サブユニツトは、いずれも還元後類似の大きさ
（Ｍ、１４０，０００〜１５０，０００＞を有するα２
、α３あるいはα５と混同され易く、 ２）α４は、βサブユニットとの会合が明らかに弱いた
め、抗β反応物質を用いてＶＬＡ−４を分析する間にし
ばしば失われ、更に ３）ＶＬＡ−４の詩興的細胞表面発現を分析することは
不可能である からである。

本出願人は今や、ＶＬＡ−４を特異的に認識してＶＬＡ
４ヘテロダイマーの存在を確認する蹟＾ｂを発見した。

そのうえ、本出願人はこの反応物質を、１）α４βサブ
ユニット会合、 ２）細胞分布、 ３）Ｔ＃ｊｌ胞活性化に際しての変化、並びに４　）　
Ｍ、８０，０００及び７０，０００の付加的ペプチドと
の関係 に関してＶＬＡ−４を分析するのに用いた。

ＶＬＡ　ンバ　− １００ｇのＴ白血病細胞系ＨＰＢ−ＡＬＬから細胞膜を
得、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０界面活性剤中で可溶化し
、その後連続するレンズマメレクチン、リジン及びコム
ギ胚しクチン親和性カラムを用いて糖タンパク質に関し
濃厚化した。レクチンカラムからの糖タンパク質溶離液
を５ｅｐｈａｒｏｓｅと結合させた糟＾ｂ＾−１＾５の
カラムに付与し、続く洗浄後カラムをｐＨ１１，５の５
０ｍＭジエチルアミンで溶離した。精製した物質のアリ
コートを５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色法によって
収率及び純度について評価した。

モノ　ローナル　　の　１ 新規な…＾ｂを、免疫精製したＶＬＡ−４タンパク質で
９カ月掛けて腹膜組織内免疫した［！ＡＬＢ／ｃマウス
から得た。まず、　（２０ｇの細胞から得た）　ＩＩ　
ｒ　Ｉｆ−＾ＬＬタンパク質と複合させ、かつ黄色ブド
ウ球菌株Ｃｏｗａｎ１に吸収させた＾−１＾５抗体を注
射し、それから１．５力月後に不完全フロインドアジュ
バント中の２〜３１Ｈの親和性精製Ｖｌ、＾−４タンパ
ク質を注射した。更に５力月経過後、黄色ブドウ球菌Ｃ
ｏｗａｎ　１−免疫複合体を再び注射し、その２力月後
には精製抗原を再び注射した。４日後、凛準的な技術（
Ｎａｔｕｒｅ　２Ｂ、６：−５５０，１９７７）ニよッ
テマウス肺臓細胞をＰ３ＸＡｇ８．６５３骨髄腫細胞（
Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１２３：　　１５４８．
　１９７９）と１０：１の割合で融合させ、養育細胞と
して正常なマウス肺臓細胞を伴ったヒボキサンチン／ア
ミノプテリン／チミジン（ＩＩＡＴ）培地において９６
ウエルプレー１・に分割した。第二の抗体として！２５
■−ヤギ抗マウスＩｇを用いてＩＩＰＢ−ＡＬＬ細胞と
の結合を実現するためハイブリドーマ上澄み液をスクリ
ーニングし、プリスタン感作ＢＡＬＢ／ｃマウスでの腹
水産生前に少なくとも２回限界稀釈を行なうことによも
って陽性のウェルをサブクローン化した。新規な…＾ｂ
　Ｂ−５Ｇ１０及びＢ−５８７は、抗サブクラス血清を
用いた放射免疫拡散法によってＩｇＧ１抗体であること
が判明しな。ＶＬＡ−３及びＶＬＡ−５に対するモノク
ローナル抗体も同様方法で製造することができる。

し人」猪３■ｕＬり亙Ｍ ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２あるいはＶＬＡ−３から区別で
きる、ＶＬＡ−４と名１寸けたタンパク質ヘテロダイマ
ーがＴリンパ芽球様細胞系１１ＰＢ−ＡＬＬで発現され
ると考えられたので、このタンパク質を１ＩＰｎ−ＡＬ
Ｌ細胞から２段階で精製した。まず、レクチン−５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅアフイニテイークロマトグラフイーにより
糖タンパク質に関して濃厚化し、次に＾−１＾５−５ｅ
ｐｌ＋ａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって、Ｖｌ、
＾βタンパク質並びに付随する任意のαサブユニットを
特異的に単離した６免疫精製した物質は、銀染色法が示
すようにＶＬＡβサブユニット（Ｍ、１３０．Ｇｏｏ）
と、ａ　’　（Ｍｒ１５０，０００）に関して予測され
る位置に存在する少量の物質と、Ｍｒ８０，０００及び
７０，０００の付加的物質とを含有した。これらのタン
パク質バンドはいずれも、対照実験では現れなかった。

抗ＶＬＡ−４ｍＡｂを得るため、免疫精製したＶＬＡタ
ンパク質を用いてマウスを免疫し、その後ハイブリドー
マを形成し、スクリーニングを行なった。

ＶＬＡ−４陽性細胞系１１Ｐト＾ＬＬとは結合したがＶ
ＬＡ−４陰性の赤白血病細胞系に５６２とは結合しなか
ったことによって蛸＾ｂ　Ｄ−５（：１０を選択した。

同時に、ＩＩ　Ｐ　Ｂ＾Ｌｌｌ胞ともに５６２Ｍ！Ａ胞
とも強度に結合した別の蘭＾ｂ　ｌｔ−５１３７も選択
した。

Ｂ−５Ｇ１０によルｖＬ＾−４の Ｄ−５Ｇ１０及びＢ−５Ｂ）の反応性を、免疫沈降法で
更に分析した。Ｂ−５Ｇ１０に関する分析結果は抗α４
（従って抗ＶＬＡ−４）特異性を強力に示唆し、なぜな
ら１　）　ｎ−５Ｇ１０はα應すブユニットに関して予
測されるのと同じ大きさを有するＭ、１５０，０００の
主°要タンパク質をもたらし、 ２）　Ｂ−５Ｇ１０は、ＶＬＡ−４に関して陽性である
と知られている細胞系（ｌＩＰ［ｌ−ＭＬＴ）において
は強度に陽性であツタが、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、Ｖ
ＬＡ−３及びＶＬＡ−５に関してはごく弱い陽性か、あ
るいは陰性を示し、３）　Ｂ−５Ｇ１０は、ＶＬＡ−４
陰性でかツｖＬ＾−５陽性である細胞系に５６２からタ
ンパク質を免疫沈降させず、更に ４）　８−５Ｇ１０は比較的多くのα４サブユニツトと
、諭＾ｂ＾−１＾５あるいはＢ−５Ｂフが認識したもの
より少ないβサブユニットとを認識した からである。実際、論＾ｂ　Ｂ−５８７は、α４を殆ど
あるいは全く伴わないβを主に認識した。β特異的であ
ることの必然の結果として、ｌｔ−５８７も＾−１＾５
もに５６２からＶＬＡβタンパク質を免疫沈降させた。

α４とβとの相対レベルがきわめて様々であることによ
って、ＶＬＡ−４のα４サブユニツトとβサブユニット
とが解離し易く、かつこの解離は成る抗体（Ｂ−５Ｇ１
０、［１−５８７＞によって他の抗体（＾−１＾５）に
よるよりも容易に惹起されることが示唆される。本出願
人は、ｐｎを８．０付近かあるいはそれより小さい値に
維持すれば、及び／または１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４
０に替えて０．３％ＣＨ八ＰＳへ面活性剤を用いればα
４β会合をより良好に維持し得ることを発見した。

α４サブユニツト並びに可変に会合したβサブユニット
に加えて、Ｂ−５Ｇ１０免疫沈降物はしばしば町ｓｏ、
ｏｏｏの顕著なタンパク質並びにより小さいＭ。

７０．０００ペプチドをも含有した。　Ｍ、７０．Ｇｏ
ｏ、８０，０００といった比較的小さいこれらのタンパ
ク質はα４に由来すると考えられ、なぜなら １）これらのタンパク質は血清学的にα４と交叉反応性
であるが、ＶＬＡβサブユニットとは交叉反応性でなく
、 ２）これらのタンパク質の大きさを合わせるとα４サブ
ユニツトの大きさであるＭ、１５０．Ｇｏｏとなり、３
）これらのタンパク質は、存在する場合は普通ＶＬＡ−
４＜７）（Ｚ’と共発現されるが、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ
−２、ＶＬＡ−３及びＶＬＡ−５とは共発現されず、更
に４）　Ｍ、８０，０００ペプチドはα４と同じＮＨ２
末端配列を有する からである。

Ｍ、８０，０００及び７０，０００タンパク質はα４同
様、場合によりβサブユニットとの安定な会合状態を維
持し得ると考えられる。例えば、Ｍ、７０，０００タン
パク質はβと直接架橋結合することが観察でき、また両
ペプチドとも抗血清並びに輸＾ｂあるいはへテロ血清を
用いて得た免疫沈降物中に可変に存在した。

上述のＶＬＡタンパク質は細胞間接着機構を妨害し、即
ち細胞がコラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンの
ようなマトリックスタンパク質（もしくは１１１１７１
１連結タンパク質）と結合するのを阻止する。従って、
これらのＶＬＡタンパク質は腫瘍細胞の転移を阻止し、
免疫細胞機能を損なう。細胞試料において１種以上の上
記ＶＬＡタンパク質を検出することによって、細胞の接
着能並びに好ましい成長培地を予測することができる。

ｙａｍ遺伝子が細胞間接着に及ぼす影響も、天然細胞及
び形質転換細胞の両方におけるＶＬＡの存在を比較する
ことによって決定し得る。また、上記ＭＬ＾タンパク質
は、特に抗原刺激及びマイトジェン刺激に応答するヒｌ
−Ｔ細胞機能の評価、並びに慢性自己免疫疾患の相関化
及び評価に適用することもできる。これらのＶｌ、＾タ
ンパク買に対するモノクローナル抗体は、試料において
ＶＬＡタンパク質の存在を検出するのに有用であり、そ
のような検出はエリトマト−デス、多発性硬化症及び慢
性関節リウマチのような慢性疾患、慢性のウィルス及び
細苗感染、並びに移植拒絶反応の診断のため慢性的に活
性化されているＴ［１を数量評価するうえでの一助とな
る。

ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−４及びｖＬ＾−５を認識するモノ
クローナル抗体は、通常の手続きで実施する直接あるい
は間接免疫蛍光法に用いることができる。例えば゛、５
νＩ　（１００ｇ）の精製抗体を、０．２％ＢＳ＾並び
にｐＨ７，４の０．１％ナトリウムアジドを伴ったＰ［
１Ｓ１００ｕ　Ｉ中に５×１０５個からＩＸ　１０’個
の分析するべき細胞を懸濁させた細胞懸濁液１００ｕｌ
と混合する。３０分間４℃に保温後、混合物を約２１の
ＰＢＳ−ＢＳＡ−アジド緩衝液で稀釈し、４℃で１０分
間３００ｘｇで遠心分離し、吸引する。上澄み液を廃棄
した後、細胞ペレットを、例えば流動細胞計測法あるい
は蛍光ｍ微鏡法といった実施するべき分析方法に応じた
適当量のＰＢＳ　−ＢＳＡ−アジドＭ街液中に再懸濁さ
せる。間接免疫蛍光法の場合は、細胞ペレットを約ｔｏ
ｏｕ　ＩのＰＢＳ−ＢＳＡ−アジド緩衝液中に再懸濁さ
せ、得られた懸濁液に、Ｉ’Ｂ５−ＢＳＡ−アジド緩衝
液で約２０１ｇ／ｎ＋　Ｉに稀釈した５Ｇ、　ｌのＦＴ
ＩＣ結合抗マウス免疫グロブリンを添加する。３０分間
４℃に保温後、混合物を上記と同様に稀釈し、遠心分離
し、かつ吸引し、細胞ペレットをＰＢＳ−ＢＳＡ−アジ
ド緩衝液中に、選択した分析方法に適当であるように再
懸濁させる。

代穏人弁環士　タａ 山 武

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）高度に精製したタンパク質ＶＬＡ−３あるいはそ
   の生物学的に等価な合成物。
2. （２）高度に精製したタンパク質ＶＬＡ−４あるいはそ
   の生物学的に等価な合成物。
3. （３）高度に精製したタンパク質ＶＬＡ−５あるいはそ
   の生物学的に等価な合成物。
4. （４）請求項１、２あるいは３のタンパク質の高度に精
   製したαサブユニット。
5. （５）請求項１、２あるいは３のタンパク質をコードす
   る組み換え体ＤＮＡ。
6. （６）請求項４のαサブユニットをコードする組み換え
   体ＤＮＡ。
7. （７）（ａ）【遺伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 （ｃ）【遺伝子配列があります】 から成る群から選択されたＮ末端配列をコードする組み
   換え体ＤＮＡ。
8. （８）請求項１、２あるいは３のタンパク質に由来し、
   当該タンパク質のαサブユニットと特異的に結合するモ
   ノクローナル抗体。
9. （９）請求項４のαサブユニットに由来し、該αサブユ
   ニットと特異的に結合するモノクローナル抗体。
10. （１０）モノクローナル抗体Ｂ−５Ｇ１０。