KR20160108553A

KR20160108553A - 개선된 FVIII:C/FVIII:Ag의 비를 갖는 인자 VIII의 제조방법

Info

Publication number: KR20160108553A
Application number: KR1020167022707A
Authority: KR
Inventors: 스테판 빙에; 마리나 다다이안; 에리카 요한손; 비르테 훅스
Original assignee: 옥타파마 아게
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2015-01-20
Publication date: 2016-09-19
Also published as: WO2015107222A1; AU2015207472A1; JP2017509593A; ES2688144T3; CN106414491A; EP3097118B1; CN106414491B; RU2016134000A3; US20160340410A1; US10822393B2; DK3097118T3; AU2015207472A8; AU2015207472B2; RU2695428C2; IL246671B; CA2934705A1; CA2934705C; KR101908074B1; JP6778111B2; RU2016134000A

Abstract

크로마토그래피를 사용하여 인자 VIII의 산물에서 FVIII:C/FVIII:Ag 의 비가 0.7이상인 인자 VIII 산물의 제조방법으로서 다음을 채용함으로써 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행된다;
ㆍ친화성 크로마토그래피 수지에 고정된 친화성 리간드에 의해 달성되는 것으로서 인자 VIII에 대해 특이적으로 결합하는 친화성을 갖는 친화성 크로마토그래피 수지로서 상기 친화성 리간드는 인자 VIII 분자에 대한 13kD의 효모 유래 Fab 항체 단편임.
ㆍ음이온 크로마토그래피 수지.
ㆍ크기 배제 수지.
상기 방법에 따라 수득할 수 있는 인자 VIII 산물은 모노머 함량이 > 98%이고, 혈우병 치료 및 저해제의 형성을 회피하기 위한 것이다.

Description

개선된 FVIII:C/FVIII:Ag의 비를 갖는 인자 VIII의 제조방법{A process for manufacturing Factor VIII having an improved ratio of FVIII:C/FVIII:Ag}

본 발명은 크로마토그래피를 이용함으로써 인자 VIII 산물에서 개선된 FVIII:C/FVIII:Ag의 비를 갖는 인자 VIII 산물의 제조방법, 및 상기 방법으로 수득할 수 있고 모노머 함량이 98% 이상인 산물을 포함하는 약제에 관한 것이다.

원래의(native) 인자 VIII 분자는 통상의 조건에서 경쇄(플라즈마 유래의 전장 및 B-도메인 결실된 VIII 둘 다에 대해; 80kDa)와 중쇄(플라즈마 또는 재조합 전장 유래된 인자 VIII 200kDa에 대해 및 B-도메인 결실된 재조합 인자VIII 90kDa에 대해)를 갖는 복합체로 순환하고 있다. 상기 중쇄와 경쇄 결합(association)의 정확한 조건은 자세히 알려져 있지 않으나 논문들은 금속 이온 다리가 소수성 상호작용과 함께 개입하여 상기 복합체를 형성하고 같이 묶는 것으로 제안하고 있다. 상이한 금속 이온이 상기 상호작용에 참여하는 것으로 제안되었는데 칼슘, 구리, 아연, 망간 등을 포함한다. 최근에 개발된 B-도메인 결실 재조합 인자 VIII 산물에 대해 그 분자는 세 개의 금속이온; 칼슘, 구리 및 아연을 함유한다고 설명되었다. 금속 다리가 없는 인자 VIII 분자만의 경쇄와 중쇄는 여전히 항원 활성은 있어도 생물학적 활성은 없다. 특히 인자 VIII 경쇄에 대해 저해제를 형성하는 생체내(in vivo) 위험성이 있다는 것에 관해 몇가지 문헌이 발행되었다. 따라서 환자에게 주사되는 인자 VIII 산물에서는 가능한한 소량의 단일 경쇄 및 중쇄가 존재해야 하고 FVIII:C/FVIII:Ag 활성의 비는 1.0(일)에 가까워야 하는데 특별히 인자 VIII 경쇄에서 그렇다.

일반적으로 단백질 응집은 정제 공정에서 위험 요소인데 이는 원하는 산물의 손실 뿐만 아니라 잠재적인 저해제의 형성 때문이기도 하다. 어떤 생화학적 조건하에서 재조합 인자 VIII은 응집하여 그 생물학적 활성이 상당히 감소된다. 따라서 응집된 인자 VIII을 갖는 인자 VIII 산물은 단량체(monomer) 함량 <100%로 인자 VIII의 비활성형을 함유할 것이다. 약제학적 단백질 산물의 단량체 함량은 100%에 가까워야 하고 인자 VIII의 비활성형(응집체, 단편 등) 양이 가능한한 낮아야 한다.

재조합적으로 인자 VIII(rFVIII)을 생산하는 배양물이나 플라즈마로부터 인자 VIII을 정제하기 위해 많은 공정이 기재되어 왔다. 예를 들면 WO 2009/156430에는 비동물 유래된 Fab 기반 친화성 단계(13k달톤 리간드가 인자 VIII의 경쇄에 결합)를 포함하여 인자 VIII을 정제하기 위한 일련의 크로마토그래피 단계들이 개시되어 있다. 상기 출원에서 언급된 기타 크로마토그래피 단계는 음이온 및 양이온 혼합형 수지, 양이온 교환, 음이온 교환 및 겔 여과를 포함한다. 인자 VIII의 비활성형이나 응집체의 제거에 관하여 이 특허출원에서 제공되는 정보는 없다. 논문(새로운 재조합 인자 VIII의 정제와 특성화)에서는 인자 VIII의 4단계 크로마토그래피 정제 방법이 기재되어 있는데 인자 VIII의 중쇄에 결합하는 리간드로서 단일클론 항체를 갖는 친화성 단계를 포함하고 있다. 다른 세개의 단계는 혼합형 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 수지 및 겔 여과 단계이며 인자 VIII의 비활성형의 제거나 응집체의 함량에 관하여 이 논문에서 제공되는 정보는 없다. 논문(인자 VIII의 cGMP 생산위해 펩티드 리간드를 이용한 친화성 크로마토그래피 단계의 개발 및 검증)에서는 펩티드 기반 친화성 단계를 포함하여 5개 단계 크로마토그래피법이 기재되어 있는데 여기선 2.7k달톤 리간드가 인자 VIII의 경쇄에 결합한다. 배양 공정으로부터의 과잉의 인자 VIII 경쇄는 펩티드 친화성 수지를 세척하는 동안 제거된다고 기재하고 있다. 다른 4가지 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 수지, 음이온 교환 수지, 소수성 상호작용 수지 및 겔 여과 단계이다. 펩티드 친화성 수지 이후의 두 가지 크로마토그래피 단계는 과잉의 인자 VIII 경쇄를 제거한다고 기술하나 그 단계 내에서 더 규정된 바는 없다. 논문(재조합 인자 VIII 화합물의 포착 및 정제를 위한 신규한 친화성 흡수체의 적용)에서 Fab 기반 13k달톤 리간드 친화성 수지가 인자 VIII의 정제를 위해 기재되어 있지만 인자 VIII의 비활성형의 제거나 응집체의 함량에 관하여 제공되는 정보는 상기 논문에는 없다.

상기 논문에 기재된 바와 같이 시장에서 상업적으로 입수가능한 재조합 인자 VIII 산물은 인자 VIII(인자 VIII;Ag)의 총량에 관련된 생물학적 활성 인자 VIII(인자 VIII:C)의 비로써 측정되는 바와 같이, 면역학적 반응과 관련하여 환자에 대한 부정적 효과의 잠재성을 띤 채 비활성 인자 VIII 형을 함유한다.

생물학적으로 활성인 인자 VIII은 통상의 생체 내(in vivo) 조건에서 효소 반응을 통하여 인자 VIIIa로 활성화될 수 있는 인자 VIII 활성을 갖는 인자 VIII로서 정의되는데 상기 효소작용은 출혈을 멈추기 위한 목적으로 응고 연쇄과정(coagulation cascade)의 필수적인 부분이다. 생물학적으로 활성인 인자 VIII은 상이한 시험관 내(in vitro) 분석법으로 측정할 수 있는데(FVIII:C), 예를 들면 FVIII 발색성 어세이(chromogenic assay) 및/또는 일단계 혈전 어세이이다. 발색성 어세이는 보조인자로서의 인자 VIII의 생물학적 활성을 측정하는 이단계 광도측정법이다. 인자 VIII은 인자 X을 인자 Xa로 활성화시키는데 이는 차례차례 효소적으로 절단되어 분광광도계로 정량할 수 있는 산물을 낳는다. 일단계 혈전 어세이는 인지질, 접촉 활성자 및 칼슘 이온의 존재하에 인자 VIII 결핍 플라즈마의 응고 시간을 보정하는 인자 VIII 함유 샘플의 능력에 기반한다.

국제특허출원공개공보 제WO-A-2008/134310호는 냉동 저장에 대한 재조합 단백질의 대단위 용액을 안정화시키는 방법에 대해 개시하는데, 이는 적어도 100mM 1가염 농도를 갖는 재조합 단백질의 부분 정제된 용액을 제공하는 단계와 탄수화물을 그 용액에 대해, 냉동시 그 용액이 -56℃ 이상의 유리 전이온도를 갖도록 충분량으로 첨가하는 단계를 포함한다.

국제특허출원공개공보 제WO 2010/115866A1호는 인간 인자 VIII 또는 그것의 생물학적으로 활성인 부분(들)에 대해 상당한 동일성을 갖는(상동적인, homology to) 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 분자 및 폴리펩티드, 관련 분자(예컨대 그런 폴리펩티드를 코딩하는 핵산), 그러한 폴리펩티드를 포함하는 조성물(예컨대 약제학적 제형) 및 그러한 폴리펩티드를 제조하고 이용하는 방법을 개시한다.

국제특허출원공개공보 제WO 97/33178A1호는 인자 VIII을 함유하는 단백질 분획의 적절성을 시험하는 공정을 개시하는데 그것의 추가적인 공정은 파스퇴르화 단계를 수반하며, 20-50 kD 범위에서 단편화를 위한 출발물질을 시험하는 것을 수반한다. 이 범위 내의 인자 VIII 단편은 사전에 인자 VIII로 치료한 환자에게서 저해제 형성을 명백하게 낳는다. 이러한 단편으로 오염된 뱃치조차 친수성 물질상에서의 크기 제외 크로마토그래피를 적용함으로써 매우 순수한 무-바이러스 인자 VIII을 생산하기 위해 사용될 수 있다.

미국 특허 제US 4,675,385호는 순차적 고성능 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 첫째 저염농도 조건에서, 둘째 고염농도 조건에서 재구성된 상업적 인자 VIII:C (복합체를 이룬 인자 VIII) 농축액으로부터 인간, 소 및 돼지 응혈원혈장 단백질(procoagulant protein) 인자 VIII을 큰 단위로 정제하는 빠르고 간단한 방법을 개시하고 있다. 상기 크로마토그래피 분리는 입자크기 약 13 내지 약 35 미크론, 기공 지름 약 500 내지 약 2000 옹스트롬 및 기공 부피 약 1.0 내지 약 1.8 ml/그램의 다공성 비드로 채워진 고성능 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 상에서 수행된다. 제 1 크로마토그래피 분리는 완충 수용액을 용리액으로서 이용하여 완충 수용액 내에서 수행된다. 저분자량 구성분(불순물)은 인자 VIII 및 고분자량 구성분(불순물)로부터 분리된다. 제 2 크로마트그래피 분리는 약 0.25 내지 0.45M 칼슘 이온 농도를 갖는 완충액 내에서 인자 VIII이 해리된 후 수행될 수 있다. 제 2 크로마토그래피 컬럼은 제 1 컬럼과 같은 어떤 패킹으로 채워져 있고 0.25 내지 0.45M 칼슘 이온을 함유하는 완충 수용액으로 용리된다. 2.5 x 60cm 컬럼에서 상업적 인자 VIII 농도의 4gms를 2시간 내에 정제할 수 있다. 상기 공정은 용이하게 단위를 크게(scale up) 할 수 있다.

유럽 특허출원공개공보 제0 412 466 A2호는 고도의 비활성(specific activity)과 안정성을 갖는 것으로서 파스퇴르화한 인자 VIII 농축액의 제조공정이 기재되어 있는데 Al(OH)₃, 음이온 교환체 또는 Ca₃(PO4)₂를 이용하는 두 가지 이상의 흡착에 의해, 바람직하게는 이러한 군 중 상이한 두 개의 흡착체를 이용하여 VIII 함유 용액으로부터 불순물을 흡착된 채로 포함되는 것을 개시한다.

프랑스 특허출원공개공보 제FR 2 650 393 A1호는 비활성 및 고수율의 인자 VIII 농축물을 수득하는 것을 개시하는데 여기서의 농축물은 비-인간 기원의 외부 단백질이 없는 것이다. 임의의 공정으로 수득한 인자 VIII은 제 1 완충액으로 사전평형화한(preequilibrated) 음이온 교환 겔 함유 컬럼 상에 침전(deposit)된다. 인자 VIII을 컬럼에 채운 후, 시각적 밀도가 0.1 이하로 얻어질 때까지 겔은 제 2 완충액으로 세척한다. 정제된 인자 VIII은 이후 제 3 완충액으로 방출시킨다. 크로마토그래피 후 비활성은 30/1600 IU/mg이다.

Cheng, Elisabeth 등의 논문[Biotechnology Letters, v.32, n.9, p.1207-1214, 2010]에서 인간 FVIII이 음이온 교환 크로마토그래피 이후 겔 여과를 이용하여 플라즈마로부터 직접 정제되었음을 개시하고 있다. 세가지 Q-세파로즈(Sepharose) 수지가 시험되었는데 Q-세파로즈 XL 수지를 이용하여 FVIII 활성의 40% 회수율, Q-세파로즈 Fast Flow를 이용하여 약 80%, Q-세파로즈 Big Beads를 이용하여 70%라는 결과를 낳았다. 비타민K-의존성 응고인자(coagulation factors)는 음이온 교환 컬럼으로부터 FVIII와 공-용리(co-elute)된다. 정제 제 2 단계에서 세파로즈 6FF가 사용될 때는 FVIII 활성의 70%가 비타민K-의존성 인자 없이 회수되었다.

WO-A-2008/134310, WO 2010/115866A1, WO 97/33178A1, US 4,675,385 A, EP 0 412 466 A2, FR 2 650 393 A1

참고문헌 Wang etal., Coagulation Factor VIII; structure and stability, International Journal of pharmaceutics 259 (2003) 1-15. Svensson etal., Evaluation of the metal binding site in a recombinant coagulation factor VIII identifies two sites with unique metal binding sites, Biological Chemistry, DOI:10.1515/hsz-2012-0298 Peerlinck etal., Factor VIII inhibitors in previous treated Haemophilia A patientse with a double virus inactivated plasma derived Factor VIII concentrate, Thrombosis and Haemostasis 77 (1) 80-86 (1997). Fang etal., The protein structure and effect of Factor VIII, Thrombosis Research (2007) 119, 1-13. Lin etal., Relationship between Factor VIII:Ag and Factor VIII in recombinant and plasma derived Factor VIII concentrate, Haemophilia (2004), 10, 459-469. Mire-Sluis etal., Analysis and immunogenic potential of aggregates and particles, Bioprocess International 9(11) December 2011 38-43. Grillo etal., Conformational origin of the aggregation of recombinant human Factor VIII, Biochemistry 2001, 40, 586-595. Wang etal., Correlation with rFVIII inactivation with aggregation in solution, Pharmaceutical Research, Vol.20, No.4, April 2003. Thim etal., Purification and characterization of new recombinant Factor VIII (N8), Haemophilia (2010), 16, 349-359. Kelley etal., Development and validation of ab 친화성 chromatography step using a peptide ligand for cGMP production of Factor VIII, Biotechnology and Bioengineering, Vol.87, No.3, August 5, 2004. McCue etal., Application of a novel 친화성 adsorbent for the capture and purification of recombinant Factor VIII compounds, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 7824-7830. Kusch etal., Factor VIII assay mimicking in vivo coagulation conditions, Haemophilia (2013), 1-7. Sommer etal., Comparative field study evaluating activity of recombinant FVIII Fc fusion protein in plasma samples at clinical haemostatis laboratories, Heamophilia (2013) 1-7. Muyldermans, Single domain camel antibodies: current status, Reviews in Moleculer Biotechnology 74, (2001), 277-302. Fay, Factor VIII: Function and structure, International Journal of Hematology 83 (2006) 103-108. Metal ion-independent association of Factor VIII subunits and the roles of calcium and copper ions for cofactor activity and inter-sub-unit 친화성, Biochemistry 2001, 40, 10293- 10300. Rosen, Assay of Factor VIII:C with a chromogenic substrate, Scand J Haemetol-Suppl 40, Vol.33, 1984, 139-145. Girma etal., Assay of Factor VIII antigen (FVIII:CAg) in 294 Haemophilia A patients by a new commercial ELISA using monoclonal antibodies, (Haemophilia 1998), 4, 98-103. Cataldi etal., Carbohydrate analysis by high performance 음이온-교환 chromatography with pulsed amperometric detection: the potential is still growing, Fresenius J Anal Chem 2000;368:739-58. Casademunt et al., The first recombinant human coagulation factor VIII of human origin: human cell line and manufacturing characteristics. Eur J Haematol. 2012;89(2):165-76. Collins etal., Factor VIII brand and the incidence of factor VIII inhibitors in previously untreated UK children with severe haemophilia A, 2000-2011, Bloodjournal.org, DO1 10.1182/blood-2014-07-580498 Boedeker, Production processes of licensed recombinant factor VIII preparations, Seminars in thrombosis and hemostasis volume 27, number 4, 2001. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248-54.

본 발명의 목적은 인자 VIII의 제조 공정에서 단일 경쇄 및 중쇄의 양을 감소시키는 방법을 제공하는 것이고 높은 단량체 함량의 산물, 특히 재조합으로 생산된 인자 VIII을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 단일 경쇄와 중쇄(단편) 및 응집된 인자 VIII 형이 제거될 수 있고 결과적인 필수 단량체 인자 VIII 용액이 냉동 및/또는 냉동 건조 상태에서 수년간 그 높은 단량체 인자 VIII 함량을 유지한채로 저장될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

놀랍게도 본 발명의 발명자들은 크로마토그래피를 사용함으로써 인자 VIII의 산물에 있어서 FVIII:C/FVIII:Ag의 비가 0.7 이상이고 높은 단량체 함량을 갖는 인자 VIII의 제조방법이 본 발명을 뒷받침하는 상기 목적을 해결할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 방법은 친화성 크로마토그래피 수지에 고정된 친화성 리간드에 의해 달성되는 인자 VIII에 대해 특이적으로 결합하는 친화성을 갖는 친화성 크로마토그래피 수지를 채용하는 수단에 의해 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되는 절차를 포함하며 상기 친화성 리간드는 인자 VIII 분자에 대한 13kD의 효모 유래 Fab 항체 단편이다.

상기 친화성 리간드는 FVIII 분자의 경쇄 부분에 결합한다.

놀랍게도, 복합체 내에서 인자 VIII의 경쇄 및 중쇄에 의해 형성된 원래의 인자 VIII을 함유하는 혼합물 및 어떠한 생물학적 FVIII 활성도 없는 단일 경쇄 FVIII을 포함하는 용액 내에서 상기 어떠한 생물학적 응고 활성도 없는 FVIII 경쇄는 특이적인 세척 조건을 채용함으로써 상기 친화성 수지상에서 공정을 진행하여 상기 혼합물로부터 제거될 수 있었다. 통상의 기술자는 또한 원래의 인자 VIII 분자, 즉 경쇄와 중쇄의 복합체가 제거된다는 것을 기대할 것이다.

상기 리간드는 특히 친화성 크로마토그래피 수지상에 친수성 스페이서 팔을 통해 고정되는데, 그 수지는 교차연결(cross-linked)된 아가로스계 매트릭스이며, 상기 친화성 리간드는 인자 VIII 분자에 대한 13kD의 효모 유래 Fab 항체 단편이고, VIIISelect라는 상표로 GE 헬스케어(GE Healthcare)사로부터 상업적으로 입수가능하다.

대안적으로 상기 목적은 FVIII:C/FVIII:Ag의 비가 0.7 이상을 제공하고 결과적으로 높은 인자 VIII 단량체 함량을 초래하는 방법으로 달성되는데 여기서 음이온 교환 크로마토그래피 수지상에 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 채용하는 수단에 의해 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되는 것이다.

본 발명의 또 다른 대안에서 FVIII:C/FVIII:Ag의 비가 0.7 이상이고 높은 인자 VIII 단량체 함량을 제공하는 방법이 개시되는데 여기서 특이적인 크로마토그래피 조건 및 완충액 조성물 조건하에 크기 배제 크로마토그래피를 채용하는 수단에 의해 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되는 것이다.

본 발명의 또 다른 대안에서는 FVIII:C/FVIII:Ag 제거에 관하여 동일한 크로마토그래피 단계를 이용하고 인자 VIII 산물 이후 단량체 함량이 ≥98%이다.

본 발명의 추가적인 대안에서 이전의 크로마토그래피 단계로부터의 결과적으로 높은 FVIII:C/FVIII:Ag 비 및 높은 FVIII:단량체 함량은 FVIII:C/FVIII:Ag 특성 및/또는 높은 인자 VIII 단량체 함량의 변함없이 환자가 사용할 때까지 12개월 이상, 바람직하게는 24개월 이상 및 가장 바람직하게는 36개월 이상 냉동 및/또는 냉동-건조 상태로 저장될 수 있다.

본 발명의 세 개의 방법 중 두 방법을 조합한다면 0.8 이상의 FVIII:C/FVIII:Ag 비를 성취하는 것이 가능하며 세 개를 모두 조합한다면 0.9 이상의 비가 가능하다.

예를 들어 본 발명의 방법은 크로마토그래피를 사용함으로써 FVIII:C/FVIII:Ag의 비가 0.7 이상이고 ≥98%의 높은 인자 VIII 단량체 함량 및 필수적인 응집된 인자 VIII 산물이 없는 인자 VIII 산물의 제조방법으로 대표되는데,

여기서

단계 (a) 친화성 크로마토그래피 수지에 고정된 친화성 리간드에 의해 달성되는 인자 VIII에 대해 특이적으로 결합하는 친화성을 갖는 친화성 크로마토그래피 수지를 채용하는 수단에 의해 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되는 것으로서 상기 친화성 리간드는 본 발명의 방법에 따라 인자 VIII 분자에 대한 13kD의 효모 유래 Fab 항체 단편이고

여기서 단계 (b) 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 수지상에서 수행된다. 단계의 순서는 (a) 다음에 (b) 또는 (b) 다음에 (a)일 수 있다.

본 발명에 따르면 크로마토그래피를 사용함으로써 FVIII:C/FVIII:Ag의 비가 0.7 이상이고 ≥98%의 높은 인자 VIII 단량체 함량 및 필수적인 응집된 인자 VIII 산물이 없는 인자 VIII 산물을 제조하기 위한 하기 공정을 수행하는 것이 또한 가능한데,

여기서 단계 (a) 친화성 크로마토그래피 수지상에 고정된 친화성 리간드에 의해 달성되는 인자 VIII에 대해 특이적으로 결합하는 친화성을 갖는 친화성 크로마토그래피 수지를 채용하는 수단에 의해 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되는 것으로서 상기 친화성 리간드는 본 발명의 방법에 따라 인자 VIII 분자에 대한 13kD의 효모 유래 Fab 항체 단편이고

단계 (c) 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 크기 배제 크로마토그래피 단계를 채용하는 수단에 의해 수행된다. 단계의 순서는 (a) 다음에 (c) 또는 (c) 다음에 (a)일 수 있다.

여기서 단계 (b) 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 수지상에서 수행되고

단계 (c) 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 크기 배제 크로마토그래피 단계를 채용하는 수단에 의해 수행된다. 단계의 순서는 (b) 다음에 (c) 또는 (c) 다음에 (b)일 수 있다.

또 다른 구체예는 본 발명의 세 공정을 조합하는 것이다. 그렇다면 예를 들어 본 발명의 공정이 크로마토그래피를 사용함으로써 FVIII:C/FVIII:Ag의 비가 0.9 이상이고 ≥99%의 높은 인자 VIII 단량체 함량 및 필수적인 응집된 인자 VIII 산물이 없는 인자 VIII 산물을 제조하기 위한 하기 공정으로 나타나는데,

단계 (b) 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 수지상에서 수행되고

단계 (c) 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 크기 배제 크로마토그래피 단계를 채용하는 수단에 의해 수행된다. 단계의 순서는 (a), (b), (c); (a), (c), (b); (c), (b), (a); (c), (a), (b); (b), (c), (a); (b), (a), (c)일 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 공정에서 사용되는 인자 VIII 분자는 경쇄와 중쇄의 복합체이며 FVIII:C/FVIII:Ag의 개선된 비율은 상기 복합체로부터 인자 VIII 경쇄, 인자 VIII 중쇄 및/또는 분리된 인자 VIII 경쇄/인자 VIII 중쇄의 고갈로부터 비롯된다. 분리된 인자 VIII 사슬은 돌연변이, 단백분해/물리적 퇴화(proteolytic/physical degeneration) 등에 의한 배양 생산 공정으로부터 생기거나 또는 정제 공정 동안 효소적/물리적 퇴화 때문에 있을 수 있다. 분리된 VIII 경쇄 및/또는 VIII 중쇄는 환경, 예컨대 완충액, 단백질 농도 등에 의존적으로 VIII 단편을 형성하거나/하고 VIII 응집체를 형성할 것이다. 따라서 단량체가 아니거나/아니고 인자 VIII의 원래의 형태보다 쉽게 응집체를 형성할 잠재성이 있는 모든 형태의 인자 VIII을 제거하는 것이 유리하다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라 최종 산물의 생물학적 활성의 높은 비 및 높은 단량체 함량을 갖는 본 발명의 동일한 용액에 도달하면서 인자 VIII 산물의 반감기 연장을 개선하기 위해 공정에서 사용하는 인자 VIII 분자는 다른 물질, 예를 들면 vWF, PEG, HES 및/또는 항체의 or F_C 단편 등에 비공유 및/또는 공유 결합될 수 있다.

본 발명의 특별한 구체예에서 인자 VIII의 용리 되기 전에 인자 VIII이 친화성 수지에 결합하고 분리된 경쇄는 씻어내 제거하는 조건하에서 친화성 크로마토그래피 단계가 수행된다. 친화성 크로마토그래피 수지에 대한 인자 VIII의 결합은 약 0.1 - 약 0.5 mol/kg 염화나트륨 농도에 상당하는 저염 조건하에서 발생한다. 다음으로 약 0.3 - 약 4 mol/kg 염화나트륨 범위에 상당하는 증가된 염농도 하에서 친화성 크로마토그래피의 세척은 경쇄의 제거를 위해 수행하고, 이후 약 40 - 약 60%의 알코올, 바람직하게는 에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 또는 그것의 혼합물과 조합하여 약 0.5 - 약 4 mol/kg 염화나트륨 및/또는 MgCl₂ 범위에 상당하는 염농도를 채용함으로써 분리된 분획 내에 인자 VIII을 수득하기 위해 용리 및 수집 단계가 선택적으로 수행된다.

친화성 수지는 인자 VIII 분자의 다른 부분보다 경쇄에 결합하기 위해 디자인되었다. 이는 특이한 크기의 친화성 리간드를 사용함으로써 가능하였다. 너무 작은 친화성 리간드, 예를 들어 화학적으로 합성된 분자는 공간적 방해(sterically hindrance) 때문에 때때로 표적 단백질에 결합하기에 어려움이 있음이 공지되어 있다. 따라서 본 발명에서 요구되는 친화성 리간드의 크기는 ≥10k달톤의 범위 내이다. 이 크기의 F_ab 단편 분자 및 그 리간드에 대해 기대되는 강한 친화성이 인자 VIII 경쇄에 대한 것이므로 FVIII 중쇄를 FVIII 경쇄와 함께 함유하는 원래의 복합체를 용리하기 전에 인자 VIII 경쇄가 씻겨 나갈 수 있다는 것은 사실상 놀라웠다. 특히 상기 친화성 수지는 약 74μm의 평균 입자크기를 갖는 교차연결된 아가로스 매트릭스에 기초하고, 약 13 kD 효모 유래 F_ab 항체 단편 친화성 리간드는 친수성 스페이서 팔을 통해 상기 매트릭스에 결합되어 리간드가 인자 VIII 분자에 결합하는 것을 더 용이하게 한다. 상기 친화성 리간드는 생물학적으로 활성인 인자 VIII 분자의 인자 VIII 경쇄에 붙는다.

본 발명의 공정 중 또 다른 구체예에서 친화성 크로마토그래피 조건은 다음 조건 중 2개 이상을 포함한다:

- 5,000 IU/mL 수지 이상, 바람직하게는 10,000 IU/ml 수지 이상 및 가장 바람직하게는 20,000 IU/mL 수지 초과의 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 수지 로딩,

- 인자 VIII 로딩 중의 완충액 조건; pH 6.2-6.8에서 약 0.1 - 약 0.5 mol/kg NaCl, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg CaCl₂, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg L-히스티딘, 약 0.005 - 약 0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80, 약 0.5 - 약 2% 트리톤 X-100, 약 0.1 - 약 1% TNBP,

- 세척 중의 완충액 조건; pH 6.2-6.8에서 약 0.5 - 약 4 mol/kg NaCl, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg CaCl₂, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg L-히스티딘, 약 0.005 - 약 0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80,

- 인자 VIII 용리 중의 완충액 조건; pH 6.2-6.8에서 약 0.5 - 약 4 mol/kg NaCl, 약 40 - 약 60% 에틸렌글리콜, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg CaCl₂, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg L-히스티딘, 약 0.005 - 약 0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80.

본 발명 공정의 또 다른 특별한 구체예에서 음이온 교환 크로마토그래피는 인자 VIII이 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합하고 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 용리 전이나 후에 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 생물학적으로 비활성 형이 제거되는 조건하에서 수행된다. 용리 분획에서 인자 VIII 단량체 함량은 ≥98%이다. 본 발명의 공정에 따르면 인자 VIII의 결합을 위해 인자 VIII의 로딩은 0.01 - 0.15 mol/kg 염화나트륨 농도에 상당하는 저염 조건하에서 행하며 인자 VIII 비활성 형이 제거되고, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 인자 VIII의 비활성 형의 제거를 위해 0.15 - 0.3 mol/kg 농도에 상당하는 중염 농도 조건에서 세척하고, 0.3 - 1 mol/kg 염화나트륨 농도에 상당하는 고염 조건을 채용함으로써 인자 VIII을 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 용리하고 분리된 분획 내에서 수집한다.

나아가 비활성 인자 VIII 형은 1 - 2 mol/kg 염화나트륨 농도에 상당하는 고염 조건을 채용함으로써 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 용리하고 분리된 분획 내에서 수집한다.

본 발명의 음이온 교환 공정의 특별한 구체예에서 생물학적으로 비활성인 인자 VIII은 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 통해 제거되며 결과적으로 산물 용리 분획 내에서 단량체 함량은 ≥98%인데, 다음 크로마토그래피 조건 중 2개 이상을 포함한다:

- 10,000 IU/mL 수지 이상, 바람직하게는 15,000 IU/ml 수지 이상 및 가장 바람직하게는 20,000 IU/mL 수지 초과의 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 수지 로딩;

- 수지 VIII 로딩 중 완충액 조건; pH 6.0-7.5에서 약 0.05 - 약 0.15 mol/kg NaCl, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg CaCl₂, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg L-히스티딘, 약 0.005 - 약 0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80;

- 세척 중 완충액 조건; pH 6.0-7.5에서 약 0.15 - 약 0.3mol/kg NaCl, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg CaCl₂, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg L-히스티딘, 약 0.005 - 약 0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80;

- 인자 VIII 용리 중 완충액 조건; pH 6.0-7.5에서 약 0.3 - 약 0.5 mol/kg NaCl, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg CaCl₂, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg L-히스티딘, 약 0.005 - 약 0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80.

본 발명의 음이온 크로마토그래피 공정에서의 또 다른 구체예에 있어서, 음이온 교환수지는 총이온 결합능(binding capacity) 약 0.18 - 약 0.25 mmol/mL, 구형 지름 약 45 - 약 165μm의 교차연결된 6% 아가로스 매트릭스에 커플된 리간드로서 제4차 아민을 갖는 강음이온 교환체이다.

본 발명의 공정에서의 또 다른 특별한 구체예에 있어서,

크기 배제 크로마토그래피는 다음 크로마토그래피 조건 중 2개 이상을 포함한다:

- 샘플 로딩은 컬럼 부피의 약 4 - 약 8%,

- 컬럼 높이는 약 60 - 약 90cm,

- 샘플 로딩시 생물학적으로 활성인 인자 VIII 의 농도는 10,000 IU/mL이상, 바람직하게는 15,000 IU/ml이상 및 가장 바람직하게는 20,000 IU/mL초과,

- 인자 VIII 의 비활성형의 응집을 위한 컬럼 평형 완충액; pH 6.0 - 7.5에서 약 0.2 - 약 0.7 mol/kg NaCl, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg CaCl₂, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg 시트르산나트륨, 약 0.5 - 약 2% (w/w) 수크로스, 약 0.5 - 약 2% (w/w) L-아르기닌, 약 0.1 - 약 1% (w/w) 폴록사머 188,

여기서 생물학적으로 활성인 인자 VIII는 단량체 형태로 수집되는 반면 비활성형 인자 VIII는 크기 배제 크로마토그래피 단계의 응집된 비활성형(응집된 단편(비활성) 및 응집된 단량체 인자 VIII(단량체일 때는 활성이지만 응집된 때에는 부분적으로 비활성) 둘 다일 수 있음)을 함유하는 분획 내에서와/내이거나 크기 배제 크로마토그래피 단계에서 인자 VIII의 단편화된 형을 함유하는 분획 내에서 발견되고,

- 컬럼의 배출구에서 약 30 - 약 40 mAU 흡수피크가 기록될 때 인자 VIII 단량체 수집이 시작되며, 흡수피크가 약 1 - 약 40 mAU로 돌아갈 때 정지하는데 이는 샘플 적용량의 2-3배에 관한 것임.

본 발명의 크기 배제 크로마토그래피의 특별한 구체예에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피 수지는 평균지름(mean diameter) 약 34 μm 및 최적 분리범위 10,000 - 600,000 달톤인 구형 교차연결된 아가로스/덱스트란 매질이다.

본 발명의 공정의 또 다른 특별한 구체예에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피의 용출액이 12개월 이상, 특히 36개월 안정된 것은 다음 조건 중 두가지 이상을 포함한다:

- 다음을 포함하는 완충 조성물; pH 6.0 - 7.5에서 약 0.2- 약 0.7 mol/kg NaCl, 약 0.01- 약 0.05 ≥mol/kg CaCl₂, 약 0.01- 약 0.05 mol/kg 시트르산 나트륨, 약 0.5- 약 2% (w/w) 슈크로스, 약 0.5- 약 2% (w/w) L-아르기닌, 약 0.1- 약 1% (w/w) 폴록사머 188,

- 동결 용액 저장 ≤-60℃

- 실온으로부터 ≤-40℃까지 용액의 동결은 ≤90분에서 이루어짐.

- ≤-60℃에서의 저장에 따른 동결액은 18-25℃에서 ≤90분으로 해동됨.

- 해동된 용액을 상기 언급된 완충액으로 인자 VIII 농도를 조정하고 유리관 당 250 IU, 500 IU, 1000 IU, 2000 IU, 3000 IU, 4000 IU 또는 5000 IU로 유리관에 채운 후 한 후 동결 건조 공정에 적용.

- 상기한 바에 따른 동결 건조 산물은 인자 VIII 단량체의 함량이 ≥99%.

- 상기한 바에 따른 동결 건조 산물은 재구성후 인자 VIII 단량체의 큰 변함없이 환자가 사용할 때까지 12개월 이상, 바람직하게는 24개월 및 가장 바람직하게는 36개월 이상 저장될 수 있음.

- 상기 재구성된 산물은 다음의 완충액 조성을 가짐; pH 6.0 - 7.5에서 약 0.2 - 약 0.7 mol/kg NaCl, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg CaCl₂, 약 0.01 - 약 0.05 mol/kg 시트르산나트륨, 약 0.5 - 약 2% (w/w) 수크로스, 약 0.5 - 약 2% (w/w) L-아르기닌, 약 0.1 - 약 1% (w/w) 폴록사머 188.

본 발명의 주요 사안은 또한 본 발명의 방법에 따라 수득되는 인자 VIII 산물로서 혈우병 치료나 저해제의 형성을 회피하기 위한 것이며 그 산물은 동결 및/또는 냉동건조 조건에서 6개월 이상, 바람직하게는 12개월 이상, 더 바람직하게는 24개월 이상 및 가장 바람직하게는 36개월에 이르기까지 안정된다. 이러한 인자 VIII은 상기 세개의 정제 단계, 순서대로 1.친화성 단계, 2.음이온 교환 단계, 3.크기 배제 크로마토그래피 단계를 거치는 특별한 공정에 의해 수득된다.

정제 계획의 이러한 순서를 제공함으로써 높은 FVIII C/Ag비와 높은 단량체 함량(낮은 응집체 및 단편과 동등함)과 관련하여 결과적인 FVIII 산물의 질을 상이한 정제 계획을 사용하는 시판되는 재조합 FVIII 산물과 비교하였다. 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명의 인자 VIII 산물은 인자 VIII C/Ag의 높은 비와 높은 단량체 및 낮은 단편 함량과 관련하여 우수한 결과를 보여주었다. 본 발명의 산물과 시판되는 한 재조합 산물 간 생체 내(in vivo) 비교를 더 해보면 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이 이전에 치료되지 않은 혈우병 A 환자에서 저해제 양이 감소된 것을 주목할 수 있다. 표 2에서 정제방법 A를 이용하는 rFVIII 산물은 FVIII C/Ag비를 높이고 높은 단량체 및 낮은 단편 함량의 산물을 보여주는 능력이 본 발명의 정제 방법과 동일하게 높지 않은데 이는 확실히 이전에 치료되지 않은 혈우병 A 환자에서 면역 작용량에 영향을 주는 것이다.

[표 1]

[표 2]

본 발명의 또 다른 주요사안은 EP2537862A1에 비하여 개선된 본 발명의 생산성이다. 이는 상기 세개의 정제 단계, 순서대로 1. 친화성 단계, 2. 음이온 교환 단계, 3. 크기 배제 크로마토그래피 단계를 거치는 특별한 공정에 의해 수득된다. 나아가 환자에게 요구되는 높은(>0.9) 인자 VIII C/Ag 비 및 단량체 함량(>99%)을 보장하는 본 발명의 크기 배제 단계의 특이한 공정 조건을 포함한다. 이는 인자 VIII이 본 발명의 특이적인 완충액 조건, 즉 마지막의 크기 배제 완충 교환 단계 및 산물의 동결-건조에 의해 제공되는 조건을 이용하여 저장될 때 -70℃에서 12 개월 저장 후에도 또한 성취된다. 이는 바람직하지 않은 인자 VIII C/Ag 비 및 저장 기간 동안 단량체 함량의 감소를 최소화하는 것으로 보이는데, 이것은 (상기 저장된 동결-건조 산물의 재구성 이후)환자에게 주어진 산물이 환자에게 주사되는 용액 내에서 응집체/단편 때문에 원하지 않는 면역 반응이 일어나는 위험성을 감소시키는 것을 보장한다. 나아가 브래드포드 분석법을 이용하여 FVIII:C/단백질 농도로 측정된 비활성(specific activity)이 EP2537862A1 (8061 IU/mg, n=1)에 개시된 값에 비해 통계적으로 상당히 더 높다(10000 IU/mg, n=9). 상기 비활성은 FVIII 산물의 순도를 나타내는 것으로서(상이한 단백질 측정법은 상이한 결과를 낸다고 알려졌으므로 값의 비교를 위해서는 동일한 단백질법이 필요하다), 단백질의 불순물은 환자에게 저해제 발생의 위험인자 중 하나이므로 EP2537862A1에 비하여 본 발명의 산물이 우수한 성능을 나타낸다는 것을 가리키는 것이다. 게다가 EP2537862A1에 개시된 바와 같이 등전점 전기영동(isoelectric focusing)에 의하고 본 발명의 도 17에서 볼 수 있는 단배질 지문 분석(protein fingerprinting analysis)은 각 산물의 산물 특성의 차이를 나타낸다.

본 발명의 특별한 구체예에 있어서 인자 VIII은 마지막 단계 이후 인자 VIII(FVIII:Ag)의 총량에 대해 생물학적으로 활성인 인자 VIII (FVIII:C)의 비율(quotient)이 ≥0.7, 바람직하게는 ≥0.8, 더 바람직하게는 ≥0.9 그리고 가장 바람직하게는 1이고, 인자 VIII 단량체 함량은 ≥98%, 바람직하게는 ≥99% 그리고 가장 바람직하게는 100%라는 점과 필수적인 응집된 인자 VIII이 검출될 수 없다는 점에서 특징적이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 인자 VIII은 그 생물학적 활성, 높은 함량의 단량체 인자 VIII과 낮은 함량의 응집된/단편화된 인자 VIII을 유지하고 있다.

또 다른 구체예에 있어서 본 발명의 인자 VIII은 생물학적 활성을 가지고, 플라즈마 유래된, 재조합 유래 및/또는 인자 VIII의 결실 유도체 또는 절단형(truncated form), 특히 B 도메인 결실된 FVIII이라는 점에서 특징적이며 이는 참조 문헌에 기재되고 통합되는 바이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서 인자 VIII이 재조합으로 유래 및/또는 결실 유도체인 경우 인간 세포에서 생산된다는 점에서 특징적이다.

본 발명의 또 다른 특별한 구체예에 있어서 인자 VIII이 예전에 상기 산물로 치료되거나 치료되지 않은 혈우병 A 환자는 저해제의 양이 <25%, 바람직하게는 <20%, 더 바람직하게는 <10% 및 가장 바람직하게는 0%이라는 점에서 특징적이다.

본 발명의 주제는 또한 혈우병의 치료 및 저해제의 형성을 막기 위한 것으로서 본 발명의 방법에 따라 수득되는 인자 VIII 산물이다.

특히 본 발명에 따른 산물은 인자 VIII이 예전에 본 발명의 산물로 치료 후 치료되거나 치료되지 않은 혈우병 A 환자는 저해제의 양이 < 약 25%, 바람직하게는 < 약 20%, 더 바람직하게는 < 약 10%, 그리고 가장 바람직하게는 약 0%라는 점을 보여준다.

단백질을 둘러싼 비정형 매트릭스를 형성함으로써 동결 건조 공정 동안 및 저장하는 동안 단백질을 보호하기 위해 저온보호제/동결건조보호제(cryo-/lyoprotectants)가 추천된다.

동결-건조 동안 기계적 지지를 하게 하고 약 산물의 건조 중량을 증가시키기 위해 증량제도 포함되어 케이크 형성자로서 기능할 수 있다. 증량제는 그에 따라 동결건조품에 대해 균일한 질과 외관을 제공하는 것에 기여할 수 있다.

나아가 단백질에 대해 또한 산물의 치료적 용도에 대해 적절한 값으로 pH를 유지하기 위하여 완충제(buffering agent)를 가할 수 있다. 동결건조된 단백질을 위한 적절한 첨가성분은 예를 들어 WO2010/026186 A에 개시된 바와 같으며 참조로서 여기에 통합된다.

본 발명에 따른 "생물학적으로 비활성인 인자 VIII 형"이란 용어는 화학적, 생화학적 또는 효소적 원인 때문에 그 생물학적 활성을 상실한 인자 VIII 형태를 의미한다. 생물학적으로 비활성인 인자 VIII은 예를 들어 단일 인자 VIII 경쇄 또는 중쇄, 인자 VIII의 절단형 또는 인자 VIII의 활성화된 형(FVIIIa 같은 것)(그러나 응집 사이클에서 활성화로 정의된 바와 같이 불안정함) 및/또는 응집된 또는 추가적으로 단편화된 인자 VIII일 수 있다.

본원에서 사용되는 mol/kg의 정의는 물 1,000 g에 가해지는 몰의 양이며, 몰(Molar)의 정의는 물 1,000 mL까지 가해지는 몰의 양이다.

샘플에서 생물학적으로 활성 및 비활성 인자 VIII 둘다의 총량은 (FVIII:Ag)의 ELISA 분석법에 기초한 항원으로 측정된다. 생물학적으로 완전히 활성을 가진 샘플(in vivo에서와 같이)에서 생물학적으로 활성인 인자 VIII(FVIII:C) 및 인자 VIII(FVIII:Ag)의 항원 함량 간의 비는 1.0에 상당하여야 한다. 상기 비가 1 보다 작으면 샘플 내에 인자 VIII의 비활성 형이 존재한다는 것을 가리킨다. 비활성형은 응집된 인자 VIII 및/또는 단일 인자 VIII 경쇄 및 중쇄로 분리된 인자 VIII 분자일 수 있다.

FVIII 경쇄(분자량이 약 80kD인 인자 VIII의 A3, C1 및 C2 도메인)는 그 생물학적으로 활성인 인자 VIII 분자 내에서 FVIII 중쇄(분자량이 90 - 210kD인 A1 및 A2 인자 VIII 도메인)와의 금속/소수성 복합체이다. 이 복합체는 생체내(in vivo)의 원래의(native) 인자 VIII 분자로서 통상적 조건에서, 퇴화(degeneration)로부터 보호하는 von Willebrandt Factor (vWF)에 결합한 채 순환한다. 응고 시스템이 활성화될 때 원래의 인자 VIII 분자는 vWF로부터 유리하여 활성화된 혈소판에 결합하고 단백질가수분해적으로 FVIIIa (활성화된 인자 VIII)로 전환되는데, 이는 원래의 FVIII 분자의 활성형으로서 응고 시스템의 중요한 부분이다. 응고 연쇄반응(cascade)에 의해 FVIIIa 분자는 신속히 소비되며 이후 상이한 프로테아제 저해제에 의해 효소적으로 비활성화된다. 복합체가 분리되면 경쇄 또는 중쇄는 생물학적 활성이 없거나 거의 없으며 FVIII:C/FVIII:Ag 비는 0에 가깝다. 만일 원래의 복합체가 단백질가수분해적으로 비활성화되면 경쇄 및 중쇄 둘다의 분자량은 감소하여 인자 VIII 분해 산물은 처음엔 잔존하는 생물학적 활성을 갖지만(예컨대 FVIIIa), 불안정하며 생체내에서(in vivo) 상대적으로 신속히 비활성화될 것이다. 인자 VIII 분해 산물(단백질가수분해적으로 분해(degraded)된 것 및 비단백질가수분해적으로 분리(dissociated)된 것 둘다)은, 크기에 기초하여 생물학적으로 활성 및 비활성 인자 VIII을 특이적으로 보여주는 인자 VIII 웨스턴 블롯 분석법으로 검출할 수 있다. 원래의 인자 VIII 분자는 그 분자가 B-도메인이 결실되었는지 여부에 따라 약 170k달톤 또는 290k달톤의 분자량을 갖는다. B-도메인은 인자 VIII 분자 내에서 생물학적으로 활성 기능을 갖지 않으며 따라서 생물학적으로 활성인 인자 VIII 분자는 B-도메인을 갖거나 가지지 않을(또는 그 일부를 가지지 않을) 수 있다.

인자 VIII 단량체 산물은 여기서 원래의 완충 조건하에서 수행되는 분석적 HPLC 크기 배제 크로마토그래피법으로 정의되는 분자량과 같은 분자량을 갖는 생물학적으로 활성인 인자 VIII 분자로 정의된다. 응집된 인자 VIII형은 감소된 생물학적 활성을 갖는 반면 단편화된 인자 VIII형은 주로 비활성이다. 두 형태 다 이론적으로 생체내에서 (in vivo) 저해제 형성위험이 증가되어 혈우병 A 치료를 목적으로한 인자 VIII 산물에서는 가능한 한 함량이 낮아야 한다. 단량체 인자 VIII 산물은 정제 공정 끝에는 함량이 가능한 한 높아야 하고 인자 VIII 산물의 (동결 상태)제약 공정 전 그리고 실제 제약 공정하에서(동결-건조 또는 병 내에 용액 채우기) 재구성되고 환자에 의해 소비되기까지는 또한 안정적이어야 한다. 이러한 시간 주기는 종종 수개월에서 1 - 3년에 이를 수 있다. 인자 VIII 동결액에서 안정성의 한 예는 US 8,187,799 B2에 제공되는데 여기에 특이적 완충 조성은 청구되어 있으나 인자 VIII 응집체/단량체 함량은 그 문헌에서 논의한 바가 없다.

본 발명의 재조합 인자 VIII은 특히 B-도메인이 전부 혹은 부분적으로 없는 결실 유도체로서 이에 의해 최종 정제 산물에서 5,000 IU/mg를 막대하게 초과할 수 있는 비활성(specific activity)을 제공하는 것이다. B-도메인이 전부 혹은 부분적으로 없는 그러한 결실 유도체의 예는 인간 세포주로부터 EP-A-1136553 및 EP-A-1739179에 개시되고 제조되어 있다. 본 발명의 조성물은 하기에서 기재된 바와 같이 그러한 인자 VIII 결실 유도체 또는 유사한 고순도의 다른 인자 VIII 산물에 적용할 수 있도록 특별히 적합하다는 점을 인식하여야 한다.

도 1은 FVIII 항체를 이용한 웨스턴 블롯이다. 왼편으로부터 분자량 기준,
레인 1; 출발물질 친화성 단계, FVIII:Ag 5.0 IU/mL, 레인 2; 친화성 단계를 통한 흐름, FVIII:Ag 132 IU/ml, 레인 3; 친화성 세척 분획, FVIII:Ag 26 IU/ml, 레인 4; 친화성 용출액 (출발물질 Q), FVIII:Ag 5.8 IU/ml, 레인 5; 음이온 교환 흘러 나온것 +eq., FVIII:Ag 1.7 IU/ml, 레인 6; 음이온 교환 세척, FVIII:Ag 5.0 IU/ml. 도 1은 흘러나온 것 및 친화성 단계에서 세척 분획 및 음이온 교환체 단계에서 비활성 FVIII:C이 제거된 것을 보여준다. 친화성 단계의 세척 분획은 거의 FVIII 경쇄만 함유한다.
도 2는 FVIII 항체를 이용한 웨스턴 블롯이다. 왼편으로부터 분자량 기준,
레인 1; FVIII 대조군, FVIII:C 5.0 IU/mL, 레인 2; 친화성 용출액, FVIII:C 5 IU/ml, 레인 3; 희석된 친화성 용출액, FVIII:C 5 IU/ml, 레인 4; 음이온 교환 용출액, FVIII:C 5 IU/ml, 레인 5; 크기 배제 용출액, FVIII:C 5 IU/ml. 도 2는 친화성 단계 이후, 음이온 교환 단계 이후 및 크기 배제 단계 이후 균등한 FVIII:C 농도에서 FVIII 웨스턴 블롯 패턴을 보여주는데 전부 FVIII 대조군과 동일한 패턴을 보여준다.
도 3은 실시예 3에 따른 제조적인 크기 배제 크로마토그래피로부터의 크로마토그램인데, 상이한 수지 로딩 및 인자 VIII 농도를 이용하는 3개의 상이한 실험에서 단량체 인자 VIII로부터 응집체 및 단편의 분리를 보여준다. 실시예 3에 따른 평형 완충계 및 크로마토그래피 조건은 응집을 용이하게 하여 인자 VIII 단량체로부터 응집체를 제거하는 것을 용이하게 한다(용리). 크로마토그래피 피크는 흡광도 280nm에서 측정된 단백질을 반영한다.
도 4는 실시예 2에 따라 제조된 샘플(용리)로부터의 크로마토그래피 프로파일 및 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 백분율로 각각 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)으로부터의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >98%인데 응집체는 <0.5%이고 단편은 <1.5%이다.
도 5는 실시예 3에 따라서 제조된 샘플(용리)로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 백분율로 각각 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 전형적으로 >99%이며 응집체는 눈에 보이는 양이 아니고 단편은 <1%이다.
도 6은 실시예 4에 따른 제조적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 크로마토그램인데, 이는 상이한 수지 로딩 및 인자 VIII 농도를 이용한 5개 상이한 실험에 대해 단량체 인자 VIII로부터 응집체와 단편이 분리된 것을 보여준다. 실시예 4에 따른 평형 완충계 및 크로마토그래피 조건은 응집을 용이하게 하여 단량체 인자 VIII로부터 응집체의 제거를 용이하게 한다(용리). 크로마토그래피 피크는 흡광도 280nm에서 측정된 단백질을 반영한다.
도 7은 실시예 4(음이온 교환 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >97%이며 응집체는 <0.7%이고 단편은 <2.5%이다.
도 8은 실시예 4(크기 배제 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >98%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <2%이다.
도 9는 실시예 4(음이온 교환 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >98%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <2%이다.
도 10은 실시예 4(크기 배제 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >98%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <2%이다.
도 11은 실시예 4(음이온 교환 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >98%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <1.5%이다.
도 12는 실시예 4(크기 배제 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >98%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <1.5%이다.
도 13은 실시예 4(음이온 교환 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >99%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <1.5%이다.
도 14는 실시예 4(크기 배제 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >98%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <1.5%이다.
도 15는 실시예 4(음이온 교환 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >99%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <1%이다.
도 16은 실시예 4(크기 배제 용출액)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC1)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 >98%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 <1.5%이다.
도 17은 크기 배제 크로마토그래피 이후 본 발명의 실시예 4에 따라서 공정진행된 샘플의 전하 및 크기의 분석적 2차원 전기영동(2D-PAGE) 지문이다.
도 18은 본 발명의 정제 공정 동안 인자 VIII의 순도가 증가됨을 보여준다.
도 19는 실시예 7(본 발명에 따라 정제 및 동결건조됨)에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편의 동결 건조 산물(1000IU vial(병))의 재구성 이후 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC2)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 원칙상 >100%(단량체 피크상 왼편의 약간의 어깨부분은 분자량 표준 보유 곡선(도 23)에 기초하여 인자 VIII 단량체 피크에 포함되어야 함)이고 SEC-HPLC2 크로마토그램에서 약 7 - 10분 용출했으며 응집체 및 단편은 눈에 보이는 흔적이 없다.
도 20은 정제 방법 A22 및 동결-건조에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편의 동결 건조 산물(1000IU 병)의 재구성 이후 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC2)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 약 76%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 약 24%이다. rFVIII 산물은 분자량 약 300kD의 원형(intact) B-도메인을 갖는 전장 FVIII 산물인데 이는 SEC-HPLC2 크로마토그램에서 약 5 - 8분에 단량체 FVIII 용출을 한다. 단편 피크는 단량체 피크 바로 직후 약 8 - 13분에서 시작하여 계산된다.
도 21은 정제 방법 B22 및 동결-건조에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편의 동결 건조 산물(1000IU vial(병))의 재구성 이후 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC2)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 약 99%(단량체 피크상 왼편의 약간의 어깨부분은 분자량 표준 보유 곡선(도 23)에 기초하여 인자 VIII 단량체 피크에 포함되어야 함)이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 약 1%이다. rFVIII 산물은 분자량 약 170kD의 B-도메인이 결실된 FVIII 산물인데, 이는 SEC-HPLC2 크로마토그램에서 약 7 ~ 10.5분에서 단량체 FVIII 용출을 한다. 단편 피크는 단량체 피크 후 약 10.5 ~ 13분에서 바로 시작하여 계산된다.
도 22는 정제 방법 C22 및 동결-건조에 따라서 제조된 샘플로부터의 크로마토그래피 프로파일과 그것의 응집체, 단량체 및 단편의 동결 건조 산물(1000IU vial(병))의 재구성 이후 함량을 각각 백분율로 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC2)의 크로마토그램이다. 이 샘플의 단량체 함량은 약 80%이며 응집체는 눈에 보이는 흔적이 없고 단편은 약 20%이다. rFVIII 산물은 분자량 약 300kD의 원형의 B-도메인을 갖는 전장 FVIII 산물인데 이는 SEC-HPLC2 크로마토그램에서 약 5 ~ 8분에 단량체 FVIII 용출을 한다. 단편 피크는 단량체 피크 후 약 8 ~ 13분에서 바로 시작하여 계산된다.
도 23은 분자량 표준 샘플(15-600kD, 69385, Sigma-Aldrich Chemie GmbH)로부터의 크로마토그래피 프로파일을 보여주는 분석적 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(SEC-HPLC2)의 크로마토그램이다.

인자 VIII 친화성 크로마토그래피 단계의 상세한 설명

인자 VIII은 평형 완충 조건(0.3 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 6.4-6.6, 전도도(conductivity) 30-36　mS/cm)에서 인자 VIII 친화성 크로마토그래피 컬럼(VIIISelect)에 붙는데, 용매 세정제 화학물질(1% 트리톤 X-100 + 0.3% 트리-n 부틸 포스페이트)유무하에서이며, 이는 바이러스(지질 피복성) 비활성화 목적으로 친화성 단계 전에 인자 VIII 용액에 적용될 수 있는 것이다. 또한 상류의 인자 VIII 정제로부터 다른 화학물질도 인자 VIII 로딩액에 존재할 수 있는데, 0.2 mol/kg 소르비톨 및 0.045 mol/kg 아르기닌같은 것으로서 이는 인자 VIII 안정화 목적으로 가할 수 있다. 전형적으로 인자 VIII 로딩은 약 5,000 - 약 25,000 IU/mL 친화성 수지이며 원칙상 어떠한 순도(1-15,000 IU 인자 VIII/mg 단백질)의 인자 VIII 용액도 친화성 컬럼에 적용시킬 수 있다. 상기 공정은 주변온도, 예컨대 실온에서 수행된다.

인자 VIII 함유 용액을 컬롬 상에서 공정 진행한 후, 그 컬럼을 평형 완충액(0.3 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 6.4-6.6, 전도도 30-36　mS/cm)의 15 컬럼 부피로 린스하여 불순물(산물 및 공정에 관련된 것 둘 다)을 제거한다. 이어서 증가된 염 농도(1 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 6.4-6.6, 전도도 83-89 mS/cm) 5 컬럼 부피로 세척하여 단일 FVIII 경쇄를 특이적으로 제거한다. 이후 증가된 염 농도 및 에틸렌글리콜(1.5 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 50% (w/w) 에틸렌글리콜, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH　6.4-6.6, 전도도 36-42 mS/cm)로 완충액 4 컬럼 부피를 이용하여 생물학적으로 활성인 인자 VIII이 컬럼으로부터 용리된다.

친화성 수지에 붙은 남아있는 단백질은 이후 산 세척(pH 2)으로 제거되는데, 상기 수지 이후, 평형화 후에 또다른 정제 사이클에 준비되는 것이다.

음이온 교환 크로마토그래피 단계의 상세한 설명

인자 VIII은 평형 완충 조건(0.1 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 7.4-7.6, 전도도 12-16 mS/cm)에서 강한 음이온 교환 컬럼(Q Sepharose FF)에 붙는다. 또한 상류의 인자 VIII 정제로부터 다른 화학물질도 인자 VIII 로딩액에 존재할 수 있는데, 5% 에틸렌글리콜과 같은 것이다. 전형적으로 인자 VIII 로딩은 약 10,000 - 약 100,000 IU/mL 친화성 수지이며 출발물질의 순도는 > 5000 IU 인자 VIII/mg 단백질이다. 상기 공정은 주변온도, 예컨대 실온에서 수행된다.

인자 VIII 함유 용액을 컬럼 상에서 공정 진행한 후, 그 컬럼을 평형 완충액(0.1 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 7.4-7.6, 전도도 12-16 mS/cm)의 15 컬럼 부피로 린스하여 불순물(산물 및 공정에 관련된 것 둘 다)을 제거한다. 이어서 증가된 염 농도(0.30 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 7.4-7.6, 전도도 30-35 mS/cm) 5 컬럼 부피로 세척하여 인자 VIII의 비활성형을 제거한다. 이후 증가된 염 농도(0.39 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 5.9-6.1, 전도도 38-42 mS/cm)로 완충액 1 컬럼 부피를 이용하여 생물학적으로 활성인 단량체 인자 VIII이 컬럼으로부터 용리된다.

음이온 교환 수지에 이온 상호작용(ionic interaction)으로 붙은 남아있는 단백질은 이후 염 농도를 2 mol/kg NaCl까지 증가시킴으로써 제거되는데, 이후 상기 수지는 높은 pH (14)를 이용하여 살균하고 평형화 후에 컬럼이 또 다른 정제 사이클에 준비되는 것이다.

크기 배제 크로마토그래피 단계의 상세한 설명

인자 VIII을 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(Superdex 200 p.g.)에 베드 높이 70 cm로 컬럼 부피의 4-8%로 로딩하고 다음으로 평형화하였다; 30.7 g/kg NaCl, 0.5 g/kg CaCl₂, 2.0 g/kg Na-시트레이트, 9.2 g/kg L-아르기닌 염산, 9.2 g/kg 사카로스 2.0 g/kg 폴록사머 188, pH 6.9-7.1, 전도도 47-51 mS/cm. 전형적으로 출발물질에서 인자 VIII 농도는 >10,000 IU/mL이고 완충 조성은 다음과 같다; 0.4 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 6.0-6.5, 전도도 35-42 mS/cm. 출발물질의 순도는 >8000 IU 인자 VIII/mg 단백질. 상기 공정은 실온에서 수행된다; 18-25　℃.

인자 VIII 함유 용액이 크기 배제 컬럼에 적용된 후, 컬럼 배출구에서 280nm에서의 측정된 흡광도가 40mAU로 오를 때까지 컬럼은 평형 완충 공정을 진행하며, 흡광도가 그 처음으로 되돌아갈 때까지(40-1 mAU) 생물학적으로 활성인 단량체 인자 VIII 분자가 수집된다. 생물학적으로 비활성인 응집된 인자 VIII은 단량체인 생물학적으로 활성인 인자 VIII 피크 앞(<40 mAU)에서 제거되고, 비활성 인자 VIII 단편은 그 후(<40 mAU)에 제거된다. 크기 배제 단계 이후 단량체 생물학적 활성 인자 VIII 용액은 전형적으로는 출발물질의 2-3배 부피이다.

여기에서 인용된 모든 참조문헌은 여기서의 표현된 가르침과 일관되지 않는 부분까지 최대한 참조로 통합된다. 발행물, 특허 출원 및 특허를 포함하여 여기서 인용된 모든 참고문헌은 전체가 그리고 각 참조가 개별적으로 및 구체적으로 참조로 통합되는 것으로 지시된 것 그리고 각 참조는 그 전체가 여기서 개시되는 것과 같은 정도로 참조로서 (법이 허락하는 한 최대로)여기에 통합되는데, 그 밖의 특정 문헌으로부터 여기에 개별적으로 제공된 것인지 여부는 불문한다.

본 발명을 기술하는 맥락에서 여기서 다르게 지시되거나 맥락상 명백히 모순되지 않는 한 (영어의) 용어 "하나(a)"와 "하나(an)"과 "그(the)" 및 유사한 지시어를 사용하는 것은 단수와 복수 둘다를 커버하는 것으로 해석되어야 한다. 다르게 설명되지 않는 한, 여기서 제공되는 모든 정확한 값은 대략의 값에 상응하는 것을 나타낸다(예컨대 특정 인자나 측정과 관련하여 제공되는 모든 정확한 예시적 값들은 "약"으로 수식되어 적절하게 상응하는 대략적인 측정값을 또한 제공하는 것으로 간주될 수 있다.)

구성이나 구성들과 관련하여 "포함하는", "갖는", "내포하는" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 이용하여 본발명의 구체예 또는 여하한 측면에 관한 여기서의 기재는 다르게 설명되거나 맥락상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명의 유사한 구체화 또는 측면에 대한 지원을 제공하기 위하여 그 특정된 구성이나 구성들을 "구성으로 하는", "필수적인 구성으로 하는", 또는 "대체로 포함하는"으로 의도된 것이다(예컨대, 다르게 설명되거나 맥락상 명백히 모순되지 않는 한 여기서 특정된 구성을 포함하는 것으로 기재된 조성물은 그 구성을 구성으로 하는 조성물로 기재된 것으로 또한 이해하여야 한다).

모든 제목과 부제는 여기서 편의를 위해서만 사용되는 것이고 본 발명을 어떠한 형태로든 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 여기서 제공된 어떠한 그리고 모든 실시예들, 또는 예시적 언어(예컨대, "와 같은")를 사용한 것은 본 발명을 보다 잘 밝히기 위한 목적일 뿐 다르게 청구되지 않았다면 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 제기되어선 안된다. 명세서 내의 어떠한 언어도 청구되지 않은 구성 중 어느 것도 본 발명의 실시를 위해 필수적임을 가리키는 것으로 해석되어선 안된다.

여기서 특허 서류의 인용과 통합은 편의를 위한 것일 뿐 그런 특허 서류의 유효성, 특허성, 및/또는 권리행사의 어떠한 관점도 반영하는 것이 아니다. 본 발명은 청구범위에서 나열된 주제의 모든 변형체와 균등물 및/또는 여기서 포함되는 측면을 적용법이 허용하는 한 포함한다.

본 발명은 더욱 기재되지만 다음 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

수지상에 커플된 효모 유래 인자 VIII 친화성 리간드로 정제

다음 공정은 효모 유래 인자 친화성 리간드 크로마토그래피 단계 (VIIISelect) 상에서 인자 VIII:C 활성없는 인자 VIII 형의 제거를 제시한다.

컬럼 및 수지

VIIISelect 수지로 BPG140 컴럼을 1.7리터 컬럼 부피가 되도록 베드 높이 11cm까지 채웠다. VIIISelect 수지는 GE Healthcare (Cat. No.17-5450)로부터 얻은 것이다.

출발물질

1614 IU 인자 VIII/mg 단백질의 순도를 갖는 인자 VIII 함유 물질, 0.34 mol/kg NaCl, 0,035 mol/kg CaCl₂, 0,01 mol/kg L-히스티딘, 0,045 mol/kg L-아르기닌, 0,2 mol/kg 소르비톨, 0,02% (w/w) 폴리소르베이트 80, 1% (w/w) 트리톤 X-100, 0,3% 트리-n-부틸 포스페이트 (TNBP, w/w), pH 6.5 를 출발물질로 이용하였다. 상기 출발물질은 참조로서 통합된 WO2009156430A1에 더욱 기재된 바와 같이 제조되었다. 상기 수지상의 FVIII:C 로딩은 15　529 IU/mL 수지였다.

완충액 조성

평형 완충액 (트리톤 X-100 및 TNBP와 함께)

0.3 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂ (2xH₂O), 0.02 mol/kg L-히스티딘, 1% w/w 트리톤 X-100, 0.3% w/w TNBP, pH: 6.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 31 ± 3 mS/cm

세척 완충액 1 (트리톤 X-100 및 TNBP 없는 평형 완충액)

0.3 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH: 6.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 31 ± 3 mS/cm

세척 완충액 2

1.0 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH: 6.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 85 ± 3 mS/cm.

용리 완충액(Elution buffer)

1.5 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, 50% (w/w) 에틸렌글리콜(EG), pH: 6.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 39 ± 3 mS/cm.

평형, 세척 및 용리 완충액은 설명된 pH, 농도, 및 완충액 타입, 염 또는 세정제에 한정되지 않는다.

컬럼은 평형 완충액으로 평형화된 후 출발물질을 로딩한다. 그 이후 수지를 세척 완충액 1 및 세척 완충액 2로 처리하고 이후 표 1에 기재된 바와 같이 용리 완충액으로 처리한다. 샘플을 각각의 분획(출발물질 로딩 동안의 흘러나온 것 + 세척 1, 세척 2 및 용리)으로부터 취하고 FVIII:C, FVIII:Ag 및 FVIII 웨스턴 블롯에 관해 분석하였다.

[표 3] VIIISelect 공정의 결과

표 3은 출발물질로부터 비활성 인자 VIII형의 제거를 도시한다. FVIII:C로 측정되는, 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 비는 FVIII:Ag를 통하여 측정된 바와 같이 이용가능한 인자 VIII의 총량에 대비해 출발물질에서 0.61이었다. 흘러나온 것 및 세척 분획에서 C/Ag비가 또한 측정되었는데 매우 낮았다(<0.05). 용출 분획에서는 출발물질에서 0.61로부터 0.87로 증가되었다. 이것은 VIIISelect 친화성 단계를 통틀어 비활성 인자 VIII이 제거되는 것을 명확히 보여주는 것이다. 이는 도 1에서 인자 VIII 웨스턴 블롯 분석, 레인 1-4를 살펴볼 때에 추가적으로 확인된다. 레인 1은 친화성 컬럼 전 "출발물질"을 보여준다. 레인 2는 많은 인자 VIII 관련 밴드를 보여주는데 이는 인자 VIII 퇴화(degenerated) 산물이 "흘러나온 것+세척 1 분획"에서 제거된다는 것을 보여주는 것이다. 레인 3은 "세척 2 분획"에 단일 (분리된) 인자 VIII 경쇄(80kD)와 동일한 분자량을 갖는 하나의 분명한 주요한 인자 VIII 밴드가 있음을 보여준다. 이러한 인자 VIII 분획은 인자 VIII:C 활성이 없거나 거의 없음을 보여준다(표 3에 나타냄). 레인 4는 인자 VIII 경쇄(80kD), 인자 VIII 중쇄(90kD) 및 비절단 인자 VIII 분자(170kD)를 포함하는 친화성 단계의 용리 분획을 보여준다.

실시예 1 결론

VIIISelect 단계는 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이 흘러나온 것과 세척 분획 중 FVIII:C 활성이 감소 및/또는 없는 인자 VIII 분자를 제거한다(레인 1-4).

실시예 2: 음이온 교환 크로마토그래피 단계 (Q-Sepharose FF)

다음 공정은 높은 인자 VIII 단량체 산물을 유발하는 것으로서 음이온 교환 수지 (Q Sepharose FF) 상에서의 인자 VIII:C 활성을 갖지 않는 인자 VIII 형이 제거되는 것을 보여준다.

컬럼 및 수지

Q Sepharose FF 수지로 BPG140 컴럼을 1.23리터 컬럼 부피가 되도록 베드 높이 8cm까지 채웠다. Q Sepharose FF 수지는 GE Healthcare (Cat. No.17-0510)로부터 얻은 것이다.

출발물질

9470 IU 인자 VIII/mg 단백질의 순도를 갖는 인자 VIII 함유 물질, 0.1 mol/kg NaCl, 0,02 mol/kg CaCl₂, 0,02 mol/kg L-히스티딘, 0,02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 6.5를 출발물질로 이용하였다. 상기 출발물질은 실시예 1에서 더 기재된 바와 같이 제조되었다(산물 용리 분획). 상기 수지상의 FVIII:C 로딩은 15,383 IU/mL 수지이었다.

완충액 조성:

평형 완충액

0.1 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂ (2xH₂O), 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH: 7.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 15 ± 1 mS/cm

세척 완충액

0.32 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH: 7.5 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 32.5 ± 2.5 mS/cm

용리 완충액

0.39 mol/kg NaCl, 0.02 mol/kg CaCl₂, 0.02 mol/kg L-히스티딘, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH: 6.0 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 40 ± 2 mS/cm.

상기 컬럼은 평형 완충액으로 평형화후 출발물질을 로딩하였다. 그 이후 수지를 평형완충액으로 다시 처리하여 인자 VIII이 결합하도록 하고 이후 세척 완충액 및 용리 완충액으로 처리하는데 표 3에 기재된 바와 같다. 샘플을 각각의 분획(출발물질 로딩 동안의 흘러나온 것 + 세척 1, 세척 2 및 용리)으로부터 취하고 FVIII:C, FVIII:Ag, SEC-HPLC1, FVIII 웨스턴 블롯, N-글리칸 지문 매핑 및 트립신 펩티드 지문 매핑에 관해 분석하였다.

[표 4] 음이온 교환 공정으로부터의 결과

표 4는 음이온 교환 단계의 출발물질로부터 비활성 인자 VIII 형의 제거를 도시한다. FVIII:C로 측정되는, 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 비는 FVIII:Ag를 통하여 측정된 바와 같이 이용가능한 인자 VIII의 총량에 대비해 출발물질에서 0.78이었다. 흘러나온 것 및 세척 분획에서 C/Ag 비가 또한 측정되었는데 상당히 낮았다(<0.35). 용출 분획에서는 C/Ag 비가 출발물질에서 0.78로부터 0.91로 증가되었다. 이것은 음이온 교환 단계를 통틀어 비활성 인자 VIII이 제거되는 것을 명확히 보여주는 것이다. 이는 도 1에서 레인 5-6을 살펴볼 때에 추가적으로 확인되는데 여기서 둘다 인자 VIII 분해 산물이 상기 흘러나온 것+평형 분획에서와 세척 분획에서 제거된다는 것을 보여주는 것이다. 도 2에서 레인 4는 눈에 보이는 FVIII 분해 산물없이 인자 VIII 주요 분획(용출액)의 FVIII 웨스턴 블롯 프로파일을 보여준다. SEC-HPLC1로 분석한 바와 같이 용출액 내 높은 (>98%) 단량체 함량은 도 4에 나타나 있다.

실시예 2 결론

음이온 교환 단계는 표 4 및 도 1(레인 5-6)에서 볼 수 있는 바와 같이 흘러나온 것과 세척 분획 중 FVIII:C 활성이 감소 및/또는 없는 인자 VIII 분자를 제거한다. 생물학적으로 활성인 산물 분획(용리)은 높은 단량체 인자 VIII을 함유하는데 이는 도 4에서 볼 수 있다.

실시예 3: 크기 배제 크로마토그래피

다음 공정은 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 (Superdex 200 p.g.) 상에서의 인자 VIII:C 활성을 갖지 않는 인자 VIII 형이 제거된 것을 보여준다.

컬럼 및 수지

Superdex 200 p.g.수지로 BPG140 컴럼을 5.4리터 컬럼 부피가 되도록 베드 높이 69cm까지 채웠다. Superdex 200 p.g.수지는 GE Healthcare (Cat. No.17-1043)로부터 얻은 것이다.

출발물질

10 200 IU 인자 VIII/mg 단백질의 순도를 갖는 인자 VIII 함유 물질, 0.4 mol/kg NaCl, 0,02 mol/kg CaCl₂, 0,02 mol/kg L-히스티딘, 0,02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 6.2를 출발물질로 이용하였다. 상기 출발물질은 실시예 2에서 더 기재된 바와 같이 제조되었다(산물 용리 분획). 상기 수지상의 샘플 로딩은 컬럼 부피의 5.5%이었다.

완충액 조성:

평형 완충액

30.7 g/kg NaCl, 0.5 g/kg CaCl₂, 2.0 g/kg 시트르산 나트륨, 9.2 g/kg 아르기닌, 9.2 g/kg 수크로스, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH: 7.0 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 49 ± 2 mS/cm

평형은 설명된 pH, 농도, 및 완충액 타입, 염 또는 세정제에 한정되지 않는다.

컬럼은 평형 완충액으로 평형화 후 출발물질을 로딩한다. 그 이후 수지를 평형 완충액으로 다시 처리하여 인자 VIII 용액이 크기 배제 컬럼을 통하여 분리되도록 하였다. 컬럼 배출구에서 280nm에서의 측정된 흡광도가 0.035AU 초과로 올랐을 때, 용출액을 수집하기 시작하고 흡광도가 0.05로 감소했을 때 용출액의 수집을 중단하였다. 샘플은 로딩 및 용출액으로부터 취하고 FVIII:C, FVIII:Ag, SEC-HPLC1 및 FVIII 웨스턴 블롯에 관해 분석하였다.

[표 5] 크기 배제 공정으로부터의 결과

표 5는 크기 배제 단계를 통하여 출발물질로부터 비활성 인자 VIII형이 제거되는 것을 도시한다. FVIII:C로 측정되는, 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 비는 FVIII:Ag를 통하여 측정된 바와 같이 이용가능한 인자 VIII의 총량에 대비해 출발물질에서 0.83이고 용출 분획에서 0.94이었다. 이것은 응집 및/또는 단편화 때문에 크기 배제 컬럼을 통틀어 비활성 인자 VIII형이 제거되는 것을 가리킨다. 도 2, 레인 5는 대조군에 비해 용리 분획에 대해 동등한 인자 VIII 밴드 프로파일을 보여준다. 도 5는 원래의(naitive) 조건하에서 SEC-HPLC1 분석을 이용하여 용출액에서 높은(>99%) 인자 VIII 단량체와 낮은(<1%) 응집체 함량을 보여준다. 도 3은 크기 배제 크로마토그램 생산에서 묘사된 바와 같이 단량체 인자 VIII 산물로부터 응집체 및 단편이 실질적으로 제거되는 것을 도시한다.

실시예 3 결론

크기 배제 크로마토그래피 단계는 상이한 크기의 분자들을 분리하는 것을 통하여 FVIII:C 활성이 감소 및/또는 없는 인자 VIII 분자를 제거한다. 크로마토그래피 환경과 공정 파라미터가 상기 과정 동안 이것들의 응집과 제거를 용이하게 하는데 높은 생물학적 활성(C/Ag>0.9)을 갖는 높은(>99%) 단량체 인자 VIII 산물을 유발하며 이는 도 5 및 표 5에서 볼 수 있다

실시예 4: 친화성-, 음이온 교환- 및 크기 배제 크로마토그래피의 연속적 사용

다음 공정은 순차로 진행되는 세 개의 상이한 크로마토그래피 기술로 구성된 정제 수순을 수행하여 인자 VIII:C 활성을 갖지 않는 인자 VIII형이 제거되는 것을 보여준다:

1. 친화성 크로마토그래피(VIIISelect)

2. 음이온 교환 크로마토그래피 (Q Sepharose FF)

3. 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 p.g.)

컬럼 및 수지

1. 친화성 크로마토그래피(VIIISelect)

VIIISelect 수지로 BPG140 컴럼을 1.5리터 컬럼 부피가 되도록 베드 높이 10cm까지 채웠다. VIIISelect 수지는 GE Healthcare (Cat. No.17-5450)로부터 얻은 것이다.

2. 음이온 교환 크로마토그래피 단계 (Q-Sepharose FF)

Q Sepharose FF 수지로 BPG100 컴럼을 0.55리터 컬럼 부피가 되도록 베드 높이 7cm까지 채웠다. Q Sepharose FF 수지는 GE Healthcare (Cat. No.17-0510)로부터 얻은 것이다.

3. 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 p.g.)

Superdex 200 p.g.수지로 BPG100 컴럼을 5.4리터 컬럼 부피가 되도록 베드 높이 69cm까지 채웠다. Superdex 200 p.g.수지는 GE Healthcare (Cat. No.17-1043)로부터 얻은 것이다.

출발물질, 완충액 조성 친화성 단계:

0.34 mol/kg NaCl, 0,035 mol/kg CaCl₂, 0,01 mol/kg L-히스티딘, 0,045 mol/kg L-아르기닌, 0,2 mol/kg 소르비톨, 0,02% (w/w) 폴리소르베이트 80, 1% (w/w) 트리톤 X-100, 0,3% 트리-n-부틸 포스페이트 (TNBP, w/w), pH 6.5를 출발물질로 사용하였다. 상기 출발물질은 WO　2009/156430　A1에 더 기재된 바와 같이 제조되었으며 참조로서 통합된다.

출발물질, 완충액 조성 음이온 교환 단계:

0.15 mol/kg NaCl, 0,02 mol/kg CaCl₂, 0,02 mol/kg L-히스티딘, 0,02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 7.5를 출발물질로 사용하였다.

출발물질, 완충액 조성 크기 배제 단계:

0.39 mol/kg NaCl, 0,02 mol/kg CaCl₂, 0,02 mol/kg L-히스티딘, 0,02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 6.2를 출발물질로 사용하였다.

완충액 조성 친화성 크로마토그래피:

평형 완충액 (트리톤 X-100 및 TNBP와 함께)

세척 완충액 1 (트리톤 X-100 및 TNBP 없는 평형 완충액)

세척 완충액 2

용리 완충액

완충액 조성 음이온 교환 크로마토그래피:

평형 완충액

세척 완충액

용리 완충액

완충액 조성 크기 배제 크로마토그래피:

평형 완충액

30.7 g/kg NaCl, 0.5 g/kg CaCl₂, 2.0 g/kg 시트르산 나트륨, 9.2 g/kg 아르기닌e, 9.2 g/kg 수크로스, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH: 7.0 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 49 ± 2 mS/cm

평형화는 설명된 pH, 농도, 및 완충액 타입, 염 또는 세정제에 한정되지 않는다.

각각의 컬럼(친화성-, 음이온 교환-, 크기 배제 크로마토그래피)은 상기 정의된 바와 같이 평형 완충액으로 평형화되었다.

우선 출발물질을 상기 정의된 바와 표 6에서와 같이 로딩함으로써 친화성 크로마토그래피 수지를 진행시키고 상기 정의한 바와 같이 세척 완충액 1 및 세척 완충액 2로 컬럼을 세척하였다. 이후 생물학적으로 활성인 인자 VIII 산물을 용리 완충액으로 용리하였다. 용출액은 샘플링(FVIII:C, FVIII:Ag)한 후에는 다음의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 출발물질이었다.

친화성 크로마토그래피 단계로부터의 용출액은 10배로 희석하여 상기 정의한 바와 같은 출발물질 조건을 얻었다. 희석된 출발물질을 음이온 교환 컬럼으로 처리하고 상기 정의한 바대로 세척 1 및 세척 2를 하였다. 이후 생물학적으로 활성인 인자 VIII 산물을 용리 완충액을 통하여 용리하였다. 용출액은 샘플링(FVIII:C, FVIII:Ag)한 후에는 다음의 크기 배제 크로마토그래피 단계를 위한 출발물질이었다.

음이온 교환 단계로부터의 용출액은 동결되었다면 해동시키고 그렇지 않다면 상기 및 표 6에서 정의한 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피 단계로 직접 공정을 진행한다. 컬럼 상에 산물을 적용시킨 후, 단량체 인자 VIII 분획이 용리될 때까지 평형 완충액을 컬럼 상에서 공정진행시켰다. 단량체 인자 VIII 분획은 280nm에서 측정시 흡광도가 0.04 AU를 넘어섰을 때 시작되었다. 그리고 흡광도가 280nm에서 측정시 0.01 AU로 돌아왔을 때 단량체 인자 VIII 분획 수집을 정지하였다. 용출액은 샘플링하고 FVIII:C, FVIII:Ag, FVIII 웨스턴 블롯, SEC_HPLC 및 아미노산 조성이 분석되었다.

상기 절차를 특정된 조건(표 6)하에서 5개 상이한 뱃치에 대해 반복하여 재현성을 연구하였는데 그 결과를 표 7에서 볼 수 있다.

[표 6] 5개 상이한 뱃치에 대한 컬럼 로딩 특성

* 크기 배제 컬럼은 2주기로 수행하되 8%의 특정된 최대 컬럼 로드를 초과하지 않도록 하였는데, 여기서 두 개의 받은 용출액을 하나의 풀로 혼합하고 그것으로부터 분석 샘플을 빼냈다.

[표 7] 순차적 정제공정으로부터의 FVIII C/Ag 결과

표 7은 공정의 처음의 정제 단계(친화성 크로마토그래피), 이후 공정의 두번째 정제 단계(음이온 교환 크로마토그래피) 및 마지막으로 공정의 최후의 정제 단계(크기 배제 크로마토그래피)에 대해 5개 상이한 뱃치에서 출발물질로부터의 비활성 인자 VIII형을 제거하는 것을 도시한다.

도 6은 크기 배제 크로마토그래피 단계상에서 수행되는 (표 6 - 7에 따른) 5개 제조 뱃치의 크로마토그래피 오버레이를 보여준다. 수집된 크기 배제 용출액 분획의 시작과 종결은 도면에 나타나 있다.

FVIII:Ag를 통하여 측정되는 바와 같이, 이용가능한 인자 VIII의 총량에 비해 FVIII:C로 측정되는 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 비는 친화성 단계 이전 출발물질의 대표값(mean value)으로서 0.70이었다. 친화성 단계 이후 FVIII C/Ag비는 대표값으로서 0.80으로 증가하고, 음이온 교환 단계이후 평균값(average value)으로서 0.85로 더 증가한다. 마지막의 크기 배제 정제 단계 이후 마침내 0.95로 끝나는데 최적의 FVIII C/Ag비 1.0에 가까운 것이다. 이는 표 7에서 더욱 연구될 수 있는데 수행된 5개 뱃치 전부에 대해 각각 단계의 모든 FVIII:C 및 FVIII:Ag 농도와 FVIII:C/FVIII:Ag 비를 보여주고 있다.

도 7, 9, 11, 13 및 15는 표 6 - 7에 정의된 바와 같이 1 - 5 뱃치에 대한 음이온 교환 용출액의 SEC-HPLC1 분석 이후 결과를 보여준다. 모든 음이온 교환 용출액에 대한 SEC-HPLC1 결과는 응집체가 없거나(4개 뱃치) 매우 낮은(<1%) 양(5개 뱃치의 대표값 0.1%), FVIII 단량체 함량 >97% (5개 뱃치의 대표값 98.5%) 및 단편 함량 <2% (5개 뱃치의 대표값 1.4%)를 보여준다. 친화성 단계 후 음이온 교환 단계를 수행한 이후 음이온교환 용출액은 높은 함량의 인자 VIII 단량체 및 낮은 함량의 잠재적 면역원성 응집체/단편 FVIII 부분을 보여준다.

도 8, 10, 12, 14 및 16은 표 6 - 7에 정의된 바와 같이 1 - 5 뱃치에 대한 크기 배제 용출액의 SEC-HPLC1 분석 이후 결과를 보여준다. 모든 크기 배제 용출액 샘플에 대한 SEC-HPLC1 결과는 눈에 보일 정도나 검출가능량의 응집체가 없고, FVIII 단량체 함량 >98% (5개 뱃치의 대표값 98.6%) 및 단편 함량 <2% (5개 뱃치의 대표값 1.4%)를 보여준다. 친화성 단계 후 음이온 교환 단계를 수행한 이후 크기 배제 용출액은 높은 함량의 인자 VIII 단량체 및 검출가능하거나 눈에 보일 정도의 응집체가 없고 낮은 함량의 FVIII 단편을 보여준다.

실시예 4 결론

실시예 4에 따르면 1-3의 수순으로 수행되는 세 개의 크로마토그래피 단계 전부는 본 발명에 따라 비활성 인자 VIII 분자를 제거하는데에 기여한다. 이는 상이한 단계들을 통하여 제거되는 비활성 인자 VIII 분자는 그 생물리학적 특질이 상이하므로 최저 정도의 비활성 인자 VIII 함량과 최고 정도의 인자 VIII 단량체 함량을 갖는 최종 정제 인자 VIII 산물을 제공하기 위해서는 단계들을 서로 순차적 연계성으로 수행하는 것이 환자 내에서 면역원성 반응의 위험을 가장 낮추게 할 것임을 가리키는 것이다.

실시예 5: 크기 배제 크로마토그래피 파라미터 (컬럼 높이, FVIII:C 농도, 로딩)

하기 실시예는 크기 배제 파라미터(FVIII:C 농도 및 컬럼 로딩) 생물학적 활성(FVIII:C/Ag)의 중요성을 도시한다.

컬럼 및 수지

Superdex 200 p.g. 수지로 BPG200 컴럼을 19.5리터 컬럼 부피가 되도록 베드 높이 62cm까지 채웠다. Superdex 200 p.g.수지는 GE Healthcare (Cat. No.17-1043)로부터 얻은 것이다.

출발물질

다음의 조성을 갖는 인자 VIII 함유 물질을 출발물질로 이용하였다: 0.4 mol/kg NaCl, 0,02 mol/kg CaCl₂, 0,02 mol/kg L-히스티딘, 0,02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH 6.2. 상기 출발물질은 실시예 2 (산물 용리 분획)에서 기재된 바와 같이 제조되었다.

완충액 조성:

평형 완충액

평형화는 설명된 pH, 농도, 및 완충액 타입, 염이나 세정제에 제한되지 않는다.

하기 표 8에 따라 7개의 상이한 뱃치(A-G)가 수행되었다. 컬럼은 평형 완충액으로 평형화된 후 출발물질을 특정적으로 로딩하였다. 이후 그 수지는 평형 완충액으로 처리하여 인자 VIII 용액이 크기 배제 컬럼 상에서 분리되도록 하였다. 컬럼 배출구에서 280nm에서의 흡광도가 0.035 AU를 넘어섰을 때 용출액의 수집을 개시하였고 흡광도가 0.005로 감소했을 때 용출액의 수집을 정지하였다. 출발물질 및 용출액으로부터 샘플을 취하여 FVIII:C, FVIII:Ag 및 SEC-HPLC1에 관해 분석하였다.

[표 8] 실험조건 및 결과적인 생물학적 활성 FVIII:C/Ag

표 8은 크기 배제 단계상에서 출발물질로부터 비활성 인자 VIII형이 제거되는 것은 상이한 파라미터에 의존적임을 도시한다. 뱃치 E (15925 IU/mL, 4.3%) F (14844 IU/mL, 1.9%) 및 G (9149 IU/mL, 3.9%)와 같이 컬럼상 상대적으로 낮은 로딩량과 조합하여 상대적으로 낮은 인자 VIII:C 농도는 FVIII:C/FVIII:Ag 비로 측정시, 각 용출액(E-0.81, F-0.79, G-0.82)에서 뱃치 A-D (A-0.90, B-0.81, C-0.99 및 D-1.01)에 비해 생물학적 활성에 대해 부정적으로 보인다.

실시예 5 결론

컬럼 로딩과 조합한 FVIII:C 농도는 생물학적 활성과 관련하여 크기 배제 단계의 결과에 대한 중요한 파라미터이다. 둘 다 베드 높이 69 cm를 사용하는 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 데이터에 기초할 경우, 약간 낮은 베드 높이(62 cm)를 갖는 실시예 5에 기재된 결과는 아마도 다른 두가지 중요한 인자(FVIII:C 농도 및 컬럼 로딩)와 더불어 크기 배제 단계의 결과에 또한 영향을 미친다. 크기 배제 단계는 높은 인자 VIII:C 농도, 높은 컬럼 베드 높이 및 컬럼 로딩 ≥4%일 때 보다 더 잘되는 것으로 보여진다.

실시예 6: 동결상태에서 생물학적으로 활성인 단량체 인자 VIII의 안정성

다음 실시예는 실시예 4에 따라 공정진행된 생물학적으로 활성인 단량체 인자 VIII 용액의 동결 상태에서의 안정성을 도시한다.

출발물질: 인자 VIII의 총량에 대해 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 비(FVIII:C/FVIII:Ag)로 측정시, 인자 VIII 단량체 함량 >99%, 응집체 함량 <1% 및 비활성 인자 VIII 양 >0.9인 실시예 4에 따라 생산된 인자 VIII 용액

인자 VIII 완충액 환경:

30.7 g/kg NaCl, 0.5 g/kg CaCl₂, 2.0 g/kg 시트르산 나트륨, 9.2 g/kg 아르기닌, 9.2 g/kg 수크로스, 0.02% (w/w) 폴리소르베이트 80, pH: 7.0 ± 0.1, 전도도: +25℃에서 49 ± 2 mS/cmat

동결 및 저장 조건:

인자 VIII 용액을 플라스틱 저밀도 폴리에틸렌 용기에 채우고 급속 냉동 공정을 통하여 최대 60분 동안 -40℃까지 낮추어 냉동하였다. 냉동된 용액은 이후 36개월간 -60℃와 -80℃ 사이 온도에서 저장하였다. 샘플은 0, 6, 9, 12, 18, 24 및 36 개월 저장 후 취하였으며 생물학적 활성과 단량체, 응집체, 단편 함량에 대해 분석하였다.

[표 9] - 60°C와 - 80°C 사이 온도에서 동결 저장된 인자 VIII 용액의 안정성

표 9에서 볼 수 있는 바와 같이 인자 VIII 용액은 생물학적 활성과 인자 VIII 단량체 함량(응집체 및 단편 형성)과 관련하여 -60℃과 -80℃ 사이의 온도에서 36개월 이상 완벽하게 안정되어 있다.

실시예 7: 동결-건조된 산물에서 생물학적으로 활성인 단량체 인자 VIII의 안정성

다음 실시예는 실시예 4 및 실시예 6에 따라 공정진행되고 이후 동결 건조된 생물학적으로 활성인 단량체 인자 VIII 용액의 안정성을 도시한다.

출발물질: 인자 VIII의 총량에 대해 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 비(FVIII:C/FVIII:Ag)로 측정시, 인자 VIII 단량체 함량 >99%, 응집체 함량 <1% 및 비활성 인자 VIII 양 >0.9인 실시예 4에 따라 생산된 동결된 인자 VIII 용액

동결 건조 후 한 병(one vial)의 인자 VIII 함량:

수크로스 13.5 mg

아르기닌 염산 13.5 mg

폴록사머 188 3 mg

염화나트륨 45 mg

염화칼슘 2수화물 0.75 mg

시트르산 나트륨 2수화물 3 mg

생물학적 활성 인자 VIII 250 IU

동결 건조 과정:

인자 VIII 출발물질 2.5 mL를 8 mL 몰드 유리병(타입 I)에 인자 VIII 총량 250 IU으로 채웠다. 그 병을 표 10에 기재된 바대로 동결-건조 공정을 진행한다.

[표 10] 동결-건조 공정

동결-건조 공정 후 그 병들을 브로모부틸 마개로 닫고 알루미늄 캡으로 캠슐화하였다. 그 병들은 24개월 동안 +5℃에서 저장하였다. 샘플은 0, 6, 9, 12, 18 및 24개월 저장 후 주사를 위해 물 2.5 mL 내에서 동결-건조 산물을 재구성함으로써 취하였으며 이후 생물학적 활성과 단량체, 응집체, 단편 함량에 대해 분석하였다. 표 11 참조.

[표 11] +5°C에서 저장된 동결-건조 인자 VIII 용액의 안정성

표 11에서 볼 수 있는 바와 같이 동결-건조된 인자 VIII 산물은 생물학적 활성과 인자 VIII 단량체 함량(응집체 및 단편 형성)과 관련하여 +5℃ 온도에서 24개월 이상 완벽하게 안정되어 있다.

실시예 8: 본 발명에 따른 최종 동결-건조 산물에서의 FVIII C/Ag 비 및 응집체, 단량체의 결정 그리고 상이한 정제법을 이용한 재조합 산물과의 대비

하기 실시예는 본 발명에 따른 산물의 우수한 특성과, 본 발명과 상이한 정제법을 이용하는 기타 상업적으로 입수가능한 재조합 산물을 대비한 것에 관해 도시한다.

출발물질: 본 발명의 실시예 7에 따른 동결건조 인자 VIII 산물을 재구성하고 3개의 상이한 경쟁자 rFVIII의 산물과 대비하였는데 이들은 3개의 상이한 정제법(A-C)으로 정제되고 상이한 형성 완충액(formulation buffer)로 안정화시킨 것이다. 안정화제/FVIII와 관련하여 상이한 형성 조성물간에 좋은 대비를 위해 적어도 1 바이알 농도(vial strengths)(250IU, 1000IU 또는 3000IU)를 분석하였다. 원래의 가동 조건하에서 SEC-HPLC2 분석법에 따라 FVIII C/Ag에 대해, 응집체, 단량체 및 단편에 대해 모든 샘플을 분석하였다.

[표 1]

실시예 8 결론

표 1은 정제된 그리고 동결-건조된 산물에 있어서 100% 단량체 함량 및 FVIII C/Ag 비 > 0.9와 관련된 본 발명에 따른 재조합 FVIII 산물의 우수한 특성을 보여준다. 이는 상이한 조건하에서 정제된 그리고 안정화된 모든 경쟁자에 비해 최종 산물에서 비생물학적 활성 인자 VIII 함량이 없거나 거의 없다는 것을 암시한다.

실시예 9: 사전에 미치료된 혈우병 A 환자에서 본 발명에 따라 정제된, 만들어진, 동결-건조된 및 저장된 rFVIII 산물의 저해제 형성의 대비이며 그것을 하나의 경쟁자 재조합 FVIII 산물에 관해 발행된 데이터와 비교한 것이다. 또한, 두 산물간 FVIII C/Ag 비 및 응집체, 단량체 및 단편을 비교하는 것이다.

하기 실시예는 본 발명에 따른 산물의 우수한 특성과, 본 발명과 시장에서 상업적으로 입수가능한 하나의 재조합 FVIII 산물을 대비한 것에 관해 도시한다.

출발물질: 본 발명의 실시예 7에 따라 제조된 동결건조 인자 VIII 산물을, 시장에서 상업적으로 입수가능한 하나의 경쟁자 rFVIII의 산물로서 실시예 8에 지재된 방법 A에 따라 정제된 것과 대비하였다. 두 산물이 환자에게 주어지고 사전에 미치료된 혈우병 A 환자에 대한 표준 임상 프로토콜에 따라 저해제의 형성을 전개시켰다. 각각의 산물에 대해 저해제를 전개시키는 환자의 양뿐만 아니라 인자 FVIII C/Ag 비 및 응집체/단량체/단편 프로파일을 표 2에서 볼 수 있다.

[표 2]

실시예 9 결론

표는 시장에서 상업적으로 입수가능한 하나의 rFVIII의 산물에 비해 본 발명의 산물을 이용한, 사전에 미치료된 혈우병 A 환자에서 상당히 낮은 양의 저해제를 보여준다. 더욱이 표 10은 각각 2 (250 IU 및 1000 IU)바일 농도(vial strength), 3 (250 IU, 1000 IU 및 3000 IU) 상이한 바일 농도의 산물에 관한 실시예의 인자 FVIII C/Ag 비 및 응집체/단량체/단편 프로파일을 보여준다. 산물에서 소량의 생물학적 비활성 FVIII은 환자에게서 형성되는 저해제의 양을 감소시킬 것이라는 가설을 세울 수 있다. 따라서 면역원성 반응에 관한 환자의 위험을 최소화하기 위하여 재조합 FVIII 산물에 대한 정제, 안정화, 동결-건조 및 저장의 중요성을 암시하는 것이다.

실시예 10: 본 발명에 따라 정제된 재조합 FVIII 산물의 비활성(specific activity)(순도)

하기 실시예는 본 발명에 따라 정제된 재조합 FVIII 산물의 탁월한 순도를 도시한다.

출발물질: 인자 VIII의 총량에 대해 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 비(FVIII:C/FVIII:Ag)로 측정시, 인자 VIII 단량체 함량 >99%, 응집체 함량 <1% 및 비활성 인자 VIII 양 >0.9인 실시예 4 및 실시예 6에 따라 생산된 동결된 인자 VIII 용액을 FVIII:C에 따라 분석하고 브래드포드에 따라 총 단백질함량을 분석하였다.

실시예 10 결론

도 18은 9개 뱃치에 대해 본 발명에 따라 생산 규모상으로 10000 IU/mg 단백질(필수적으로 순수 rVFVIII)의 범위에서 종료되는 것으로 정제됨에 따라서 FVIII:C/mg 단백질로 측정되는 순도의 증가(브래드포드로 측정됨)(3개의 마지막 단계; 친화성 용출액, 음이온 교환 용출액 및 약제 물질(=크기 배제 크로마토그래피 용출액))를 보여준다.

분석의 기재

인자 VIII 생물학적 활성 (FVIII:C)은 크로모제닉 어세이(COATEST SP FVIII kit, 82 4086 63, Chromogenix/Instrumentation Laoboratory (US))로 측정되었는데, 이는 인자 VIII의 생물학적 활성을 보조요소(cofactor)로 측정하는 2단계 광도측정법에 기초하는 것이다.

인자 VIII 항원 함량 (FVIII:Ag)은 ELISA 키트 (ASSERACHROM^® VIII:Ag, 인자 VIII에 대한 이뮤노어세이, 키트, Diagnostica Stago (France))로 측정하였는데, 샘플 희석을 위해 제공된 키트 완충액을 Tris-NaCl 완충액 + 1% 소혈청 알부민으로 교체한 것은 더 기재된 바와 같다.

인자 VIII 단량체, 응집체 및 단편은 두 개의 상이한 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 분석 컬럼 (SEC-HPLC 1,Superdex 200, 10/300 GL, GE Healthcare 와 SEC-HPLC2, BioSEC-3, Agilent Technologies)을 이용하여 측정하였다.

SEC-HPLC1 법(Superdex 200)은 원래의 완충액 조건(25mM HEPES, 0.5M NaCl, 0.3M 아르기닌, 50mM CaCl₂, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 7.5)하에서 공정진행되었다. 샘플 로딩은 크기 배제 컬럼의 약 1%이고 인자 VIII:C 농도는 약 1000IU/ml이다. 단량체는 주된 FVIII 크로마토그램 피크로서, 응집체는 전에 용출되는 피크로서 그리고 단편은 FVIII 단량체 피크 이후 용출되는 크로마트그램 피크로서 정의되었다.

SEC-HPLC2 법 (BiSEC-3) 재조합 발현된 FVIII 샘플은 그것의 FVIII 응집체, 단량체 및 단편의 조성과 관련하여 Shimadzu HPLC 시스템상에서 0.4mL/min의 유속으로 비-변성(non-denaturing) 완충액 조건(25mM Tris-HCl, 50mM CaCl, 500mM NaCl; pH 7.0)하 크기 배제 크로마토그래피(BioSEC-3, 30 x 4.6 mm SEC column Agilent Technologies)를 이용하여 분석하였다. 샘플은 결정된 FVIII 활성 (FVIII:C)값에 따라 약 0.2-0.4 μg으로 로딩하였다. 단량체는 주된 FVIII 크로마토그램 피크로서, 응집체는 전에 용출되는 피크로서 그리고 단편은 FVIII 단량체 피크 이후 용출되는 크로마트그램 피크로서 정의되었다. 분석되는 rFVIII 샘플을 위한 보유 시간(retention time)도 또한 분자량 샘플(15-600kD, 69385, Sigma-Aldrich Chemie GmbH)의 보유 시간과 비교되었다.

크기에 기초한 인자 VIII 퇴화(degeneration) 산물은 FVIII 웨스턴 블롯을 이용하여 측정된다. 인자 VIII 제조시 FVIII 분자량 (molecualr mass) 분포 단백질 및 펩티드는 환원조건하 소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의한 분자량에 따라 분리된다. 이후에 단백질은 전기영동적으로 겔 매트릭스로부터 나이트로셀룰로스 막으로 전이되는데 이 막은 이후 블로킹제로 인큐베이트된다. 다음으로, 전체 인간 인자 VIII 분자에 대한, 상업적으로 입수가능한 다중클론 양 항체가 가하여지고 프루브로서 이후 2차 효소-표지된 항체가 처리된다. 제 3 단계로서 화학발광 기질을 가하는데 상기 효소와 결합시 부산물로서 빛이 발생한다. 발광은 냉각 전하-커플 장치 카메라(cooled Charge-Coupled Device camera)를 이용하여 실시간 이미지로 포착된다. 신호의 강도는 블로팅 막 상의 항원(FVIII)의 풍부성과 상관관계가 있다.

은 착색(Silver Staining)의 2D-전기영동은 인자 VIII 단백질 사슬의 전기영동상의 밴드를 연구하기 위하여 수행되었다. 등전점 전기영동(Isoelectric focusing)은 pH 3에서 10으로의 선형 pH 경사를 이용하는 1차원 주행으로서 수행되었다. 2차원 SDS-PAGE는 트리스-아세테이트(3-8%) 겔을 이용하여 주행되었다. 상기 겔은 2차원 주행 이후 은-착색으로 착색되었다.

아미노산 조성 분석은 단백질의 산 가수분해를 따르는 조성적 아미노산 분석을 통하여 수행하였다. 단백질을 24시간동안 110℃에서 6M HCl로 가수분해하고 이후 술폰화 폴리스티렌 수지상에서 양이온 교환 크로마토그래피로 아미노산을 분리하고 용리액 내에서 연속적으로 검출하였다. 검출은 프롤린에 대해서는 440nm로, 다른 모든 아미노산에 대해서는 570nm로 동시적 측정을 하는 이중 광도계를 이용하는 컬럼후 닌히드린 유도체화법(post column ninhydrin derivatisation)에 기초하였다. 시스테인이나 트립토판은 값 측정을 할 수 없는데 이 방법은 이들 잔기를 올바로 측정하지 않기 때문이다. 라이신 및 아르기닌 값도 완충액 제형 내에 존재하는 라이신 및 아르기닌의 간섭 때문에 또한 생략되었다.

N-글리칸 지문법을 펄스 전류법(pulsed amperometric detection)과 함께하는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD)로 수행하여 N-링크된 글리칸을 측정하였다. 그 N-링크된 글리칸 사슬은 효소적 절단(N-Glycanase Plus, 제품번호 GKE-5010B, Prozyme사제)에 의해 단백질로부터 유리되고 후속적으로 높은 pH(pH 13)에서 음이온 교환 크로마토그래피에 부착하며 후에 증가되는 이온강도 및 감소하는 pH 경사로 처리된다. 크로마토그래피 시스템에선 다양한 글리칸 사슬이 전하, 크기 및 구조 차이로 인해 분리된다. 음이온 교환 컬럼은 Dionex사제 CarboPac™ PA 200 크로마토그래피 컬럼(250 mm x 3 mm ID, 입자크기 5.5 μm, 품번 062896) 및 Dionex사제 CarboPac™ PA 200 가드 컬럼(50 x 3 mm ID, 품번 062895)이었다. 사용된 검출 시스템은 Chromeleon 소프트웨어로 제어되는 것으로서 3 mm 금막(ICS-3000 Au 작업전극, 3 mm, 품번 063723)을 갖춘 ICS-3000 CD 전기화학 검출기였다.

상이한 크로마토그래피 피크에 해당하는 샘플을 각 분획 당 보유 시간 1분에 해당하는 분획 내에서 수집하였다. 글리칸을 다공성 흑연 탄소 컬럼 상에서 탈염하고 이후 각 분획을 농축하였다. 크로마토그래피 분리는 PGC-컬럼을 이용하는 모세관 LC-시스템상에서 수행하고 글리칸을 MS 비행시간으로 온라인 전기분무하였다. 질량을 타이핑하고 가능한 매치를 찾음으로써 Functional Glycomics [www.functionalglycomics.org]의 데이터베이스를 이용하였다. 높은 질량 정확도(약 30 ppm)로 인해 각각의 글리칸의 동정은 정확한 것으로 결정되었다.

트립신 펩티드 지문 맵핑은 두개의 주요 단계를 포함하여 수행하였다. 첫번째 단계에서 트립신은 단백질을 소화하여 폴리펩티드로 분석되었는데 이는 두번째 단계에서 분리되고 HPLC-기술을 이용하여 기록되었다. 이런 식으로 특이적인 패턴("지문")이 만들어진다. 펩티드는 그것의 형광(주로 트립토판)에 따라 검출되는데 이 형광은 UV 검출에 비해 더 단순화된 지도를 산출한다. 시간에 따라 기록된 형광 패턴은 분석되는 샘플에 대한 펩티드 맵을 나타낸다.

VIIISelect는 재조합 B-도메인 결실 인자 VIII의 정제를 위해 디자인된 친화성 크로마토그래피 매질(수지)이다.

데이터 파일 28-9662-37 AB, GE healthcare에 따르면 VIIISelect의 주요 특성은 다음을 포함한다:

ㆍ고수율과 지속적인 특이 활성을 보유한 재조합 B-도메인 결실 인자 VIII의 효율적인 정제

ㆍ높은 선택성

ㆍ탁월한 확장성(scalability)

ㆍ무동물(animal-free) 생산

재조합 혈액 응고 인자의 효율적인 정제 공정은 혈우병 환자를 치료하기 위해 필요하다. VIIISelect는 혈우병 A를 치료하기 위해 사용되는 주된 재조합 혈액 인자인 재조합 B-도메인 결실 인자 VIII의 정제를 위해 디자인된 친화성 크로마토그래피 매질이다. 인자 VIII 분자의 민감한 성격 때문에 하류 공정의 단계의 수를 제한하는 것이 중요하다. VIIISelect를 이용하여 얻어진 높은 선택성과 수율은 한 단계로 수득되는 탁월한 순도의 강고하고 효율적인 정제 공정을 가능하게 한다. 무동물 생산 및 낮은 리간드 유출은 이 매질을 재조합 B-도메인 결실 인자 VIII의 대단위 생산에 지극히 적합한 매질로 만드는 추가적인 특질이다. VIIISelect는 GE Healthcare의 주문제작형 매질 프로그램(Custom Designed Media program)의 부분이다.

매질 성격

VIIISelect는 고도로 교차-연결된 아가로스계 매트릭스에 기초하는데 이 매트릭스는 큰 샘플 부피를 빠르게 공정진행할 수 있다. 리간드인 13kD 재조합 단백질은 재조합 도메인-결실 인자 VIII에 붙기를 더 용이하게 하는 친수성 팔을 통하여 다공성 기재 매트릭스에 붙는다(도 1). 표 1은 VIIISelect의 주된 성격을 요약하고 있다.

기능 원리

친화성 크로마토그래피는 적절한 결합 조건하에서 특이적인 분자나 분자군에 흡착하고 적절한 용리 조건에서 탈리하는 고정된 리간드를 활용한다. 이들 조건은 표적 분자, 주입 조성, 및 크로마토그래피 매질에 의존적이며 표적 분자에 높은 산물 회수율로 결합하기 위한 조건을 확립하기 위해서는 기타 크로마토그래피 파라미터(예컨대, 샘플 로딩, 유속, 베드 높이, 재생, 및 제자리 클리닝(cleaning-in-place))와 함께 연구되어야 한다.

VIIISelect의 부분 구조

재조합 인자 VIII은 밝혀진 세포 용해물이나 상청액으로부터 VIIISelect 컬럼에 직접 적용할 수 있다.

[표 1] VIIISelect의 주요 성격

인자 VIII의 활성 형태 형성을 촉진하기 위하여 완충액은 항상 Ca² ⁺이온을 함유하여야 한다. 표면 유도된 변성(denaturation)/흡착을 저해하기 위해 계면활성제가 존재할 필요가 있다. 중성 pH 완충액과 히스티딘은 특이적 인자 VIII 활성을 유지하기 위해 결합, 세척, 및 용리를 위해 항상 사용되어야 한다. VIIISelect에 적용하는 물질의 성질에 따라 재생은 각각의 사이클 후 통상적으로 필요하며 평형화/로딩 완충액에서의 재평형이 뒤따른다.

안정성

리간드는 안정된 아미드 결합을 통해 고도로 교차-연결된 기재 매트릭스에 연결된다. 도 2는 VIIISelect가 실온에서 일주일 동안 상이한 pH 값에 저장되었을 때의 연구를 보여준다. 상기 도면은 안정성이 pH 3과 10 사이에서 높다는 것을 보여준다. GE는 pH 3과 10 사이에서의 장기 저장과 pH 2와 12 사이에서의 단기 저장을 추천한다.

저장

추천되는 저장 조건은 4℃ 내지 8℃에서 20% 에탄올이다. VIIISelect는 20% 에탄올 용액 내에서 사전에 불린 상태(pre-swollen)로 공급된다.

제자리 클리닝

VIIISelect를 위한 클리닝 프로토콜은 0.1M 시트르산 또는 0.5M 인산으로 구성될 수 있다. 그러나 아가로스 기재 매트릭스가 분해되기 때문에 pH < 2에 연장되어 노출되는 것은 피해야 한다. 수산화나트륨 (0.01M)을 단독으로 또는 안정화제로서의 황산나트륨/염화나트륨(sodium sulfate/chloride)과 조합하여 사용할 수 있다.

Claims

크로마토그래피를 사용함으로써 인자 VIII의 산물에 있어서 FVIII:C/FVIII:Ag의 비가 0.7 이상인 인자 VIII 산물의 제조방법으로서 친화성 크로마토그래피 수지에 고정된 친화성 리간드에 의해 달성되는 인자 VIII에 대해 특이적으로 결합하는 친화성을 갖는 친화성 크로마토그래피 수지를 채용하는 수단에 의해 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되며 상기 친화성 리간드는 인자 VIII 분자에 대한 13kD의 효모 유래 Fab 항체 단편인 인자 VIII 산물의 제조방법.
FVIII:C/FVIII:Ag 의 비를 0.7 이상으로 증가시키고 ≥98% 으로 인자 VIII 단량체를 고함량으로 하며 필수적으로 인자 VIII의 응집체를 유발하지 않는 방법으로서 음이온 교환 크로마토그래피 수지상에서 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 채용하는 수단에 의해 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되는 방법.
FVIII:C/FVIII:Ag 의 비를 0.7이상으로 증가시키고 ≥99% 으로 인자 VIII 단량체를 고함량으로 하며 필수적으로 인자 VIII의 응집체를 유발하지 않는 방법으로서 크기 배제 크로마토그래피 단계를 채용하는 수단에 의해 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행되는 방법.
청구항 1에 있어서, 인자 VIII 분자는 경쇄와 중쇄의 복합체이며 FVIII:C/FVIII:Ag의 개선된 비율은 상기 복합체로부터 인자 VIII분자 경쇄, 인자 VIII분자 중쇄 및/또는 분리된 인자 VIII 경쇄/인자 VIII 중쇄의 고갈로부터 비롯된 것인 방법.
청구항 1 또는 청구항 4에 있어서, 크로마토그래피 단계는 인자 VIII이 친화성 수지에 결합하고 분리된 경쇄를 인자 VIII의 용리 전에 씻어내는 조건에서 수행되는데 친화성 크로마토그래피 수지에 대한 인자 VIII의 결합은 0.1 - 0.5 mol/kg 염화나트륨 농도에 상당하는 저염 조건에서 발생하며, 친화성 크로마토그래피의 세척은 경쇄의 제거를 위해 0.3 - 4 mol/kg 염화나트륨 범위의 증가된 염농도에서 하고, 선택적으로, 40-60% 에틸렌글리콜과 조합하여 0.5 - 4 mol/kg 염화나트륨 범위의 염농도를 채용함으로써 인자 VIII을 용리시켜 분리된 분획 내로 수집을 행하는 방법.
청구항 1, 4 또는 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 수지는 74μm의 평균 입자크기를 갖는 교차연결된 아가로스 매트릭스에 기반하고, 13 kD 효모 유래 F_ab 항체 단편 친화성 리간드는 친수성 스페이서 팔을 통해 상기 매트릭스에 결합되어 리간드가 인자 VIII 분자에 결합하는 것을 더 용이하게 하며 상기 친화성 리간드는 생물학적으로 활성인 인자 VIII 분자의 인자 VIII 경쇄에 붙는 방법.
청구항 1, 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 조건은 다음 조건 중 2개 이상을 포함하는 방법:
- 5000 IU/mL 수지 이상, 바람직하게는 10,000 IU/ml 수지 이상 및 가장 바람직하게는 20,000 IU/mL 수지 초과의 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 수지 로딩,
- 인자 VIII 로딩; pH 6.2-6.8에서 0.1-0.5 mol/kg NaCl, 0.01-0.05 mol/kg CaCl₂, 0.01-0.05 mol/kg L-히스티딘, 0.005-0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80, 0.5-2% 트리톤 X-100, 0.1- 1% TNBP,
- 세척; pH 6.2-6.8에서 0.5-4 mol/kg NaCl, 0.01-0.05 mol/kg CaCl₂, 0.01-0.05 mol/kg L-히스티딘, 0.005-0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80,
- 인자 VIII 용리; pH 6.2-6.8에서 0.5-4 mol/kg NaCl, 40-60% 에틸렌글리콜, 0.01-0.05 mol/kg CaCl₂, 0.01-0.05 mol/kg L-히스티딘, 0.005-0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80.
청구항 1, 4 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 수지는 교차연결된 아가로스 기재 매트릭스인 방법.
청구항 1, 4 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 리간드는 FVIII의 경쇄에 결합하고 이를 특이적으로 제거하는 방법.
청구항 2에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 인자 VIII이 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합하고 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 용리 전이나 후에 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 생물학적으로 비활성 형이 제거되는 조건에서 수행되는데, 여기서 인자 VIII의 결합 및 인자 VIII 비활성 형의 제거를 위해 인자 VIII의 로딩은 0.01 - 0.15 mol/kg 염화나트륨 농도에 상당하는 저염 조건에서 행하며, 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 세척은 인자 VIII의 비활성 형의 제거를 위해 0.15 - 0.3 mol/kg 농도에 상당하는 중염 농도에서 행하고,
0.3 - 1 mol/kg 염화나트륨 농도에 상당하는 고염 조건을 채용함으로써 온전한 단량체 인자 VIII를 용리시키고 분리된 분획 내로의 수집을 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 행하는 방법.
청구항 2 또는 청구항 10에 있어서, 생물학적으로 비활성인 인자 VIII은 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 통해 제거되며 단량체 산물 분획을 얻기 위해 다음 크로마토그래피 조건 중 2개 이상을 포함하는 방법:
- 10,000 IU/mL 수지 이상, 바람직하게는 15,000 IU/ml 수지 이상 및 가장 바람직하게는 20,000 IU/mL 수지 초과의 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 수지 로딩;
- 수지 VIII 로딩 조건; pH 6.0-7.5에서 0.05-0.15 mol/kg NaCl, 0.01-0.05 mol/kg CaCl₂, 0.01-0.05 mol/kg L-히스티딘, 0.005-0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80;
- 세척 조건; pH 6.0-7.5에서 0.15-0.3mol/kg NaCl, 0.01-0.05 mol/kg CaCl₂, 0.01-0.05 mol/kg L-히스티딘, 0.005-0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80;
- 인자 VIII 용리조건; pH 6.0-7.5에서 0.3-0.5 mol/kg NaCl, 0.01-0.05 mol/kg CaCl₂, 0.01-0.05 mol/kg L-히스티딘, 0.005-0.05% (w/w) 폴리소르베이트 80.
청구항 2, 청구항 10 또는 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환수지는 총이온 결합능(total ion binding capacity) 0.18-0.25 mmol/mL, 구형 지름 45-165μm의 교차연결된 6% 아가로스 매트릭스에 커플된 리간드로서 제4차 아민을 갖는 강음이온 교환체인 방법.
청구항 3에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피 단계는 다음 크로마토그래피 조건 중 2개 이상을 포함하는 방법:
- 샘플 로딩은 컬럼 부피의 4-8%,
- 컬럼 높이는 60-90cm,
- 샘플 로딩시 생물학적으로 활성인 인자 VIII 의 농도는 10,000 IU/mL이상, 바람직하게는 15,000 IU/ml이상 및 가장 바람직하게는 20,000 IU/mL초과,
- 인자 VIII 의 비활성형의 최적 응집을 위한 컬럼 평형 완충액; pH 6.0-7.5에서 0.2-0.7 mol/kg NaCl, 0.01-0.05 mol/kg CaCl₂, 0.01-0.05 mol/kg 시트르산나트륨, 0.5-2% (w/w) 수크로스, 0.5-2% (w/w) L-아르기닌, 0.1-1% (w/w) 폴록사머 188,
여기서 생물학적으로 활성인 인자 VIII는 단량체 형태로 수집되는 반면 비활성형 인자 VIII는 크기 배제 크로마토그래피 단계에서 응집 피크 내 및/또는 단편 피크 분획 내에서 발견되고,
- 컬럼 이후 30-40 mAU 흡수피크가 기록될 때 인자 VIII 단량체 수집이 개시되며, 흡수피크가 1-40 mAU로 돌아갈 때 정지하는데 이는 샘플 적용량의 2-3배에 관련된다.
청구항 3 또는 청구항 13에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피 수지는 평균지름(mean diameter) 34 μm 및 최적 분리범위 10,000 - 600,000 달톤인 구형 교차연결된 아가로스/덱스트란 매질인 방법.
청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 수득가능한 인자 VIII 산물로서 혈우병 치료나 저해제의 형성을 회피하기 위한 것이며 그 산물은 동결 및/또는 동결건조 조건에서 6개월 이상, 바람직하게는 12개월 이상, 더 바람직하게는 24개월 이상 및 가장 바람직하게는 36개월에 이르기까지 안정된 인자 VIII 산물.
청구항 14에 있어서, 마지막 단계 이후 인자 VIII (FVIII:Ag)의 총량에 대한 생물학적으로 활성인 인자VIII (FVIII:C)의 비율(quotient)은 ≥0.7, 바람직하게는 ≥0.8, 더 바람직하게는 ≥0.9, 가장 바람직하게는 1이고, 인자 VIII 모노머 함량은 ≥98%, 바람직하게는≥99%, 가장 바람직하게는 100%이고 필수적인 응집된 인자 VIII이 검출되지 않는 것을 특징으로 하는 인자 VIII 산물.
청구항 15 또는 청구항 16에 있어서, 그 생물학적 활성, 높은 단량체 인자 VIII 함량 및 낮은 응집된 인자 VIII 함량을 유지하는 것을 특징으로 하는 산물.
청구항 15 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 인자 VIII분자가 생물학적 활성을 가지고, 플라즈마 유래되거나, 재조합 유래되거나/되고 인자 VIII의 결손 유도체 또는 절단형, 특히 B 도메인 결실된 FVIII인 것을 특징으로 하는 산물.
청구항 15 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 인자 VIII분자가 재조합으로 유래되거나/되고 결손 유도체인 경우 인간 세포에서 생산되는 것을 특징으로 하는 산물.
청구항 15 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 예전에 상기 산물로 치료되거나 치료되지 않은 혈우병 A 환자는 저해제의 양이 <25%, 바람직하게는 <20%, 더 바람직하게는 <10%, 가장 바람직하게는 0%인 것을 특징으로 하는 산물.
청구항 15 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산물은 저온 냉동형(deep-frozen form)인데, 특히 -50℃ 내지 -80℃에서 그러하며, 또는 동결건조형(lyophilized form)인 산물.
청구항 21에 있어서, 하나 이상의 저온보호제/동결건조보호제(cryo-/lyoprotectants), 하나 이상의 증량제 및/또는 완충제가 존재하는 산물.