ES2248083T3 - Procedimiento para el fraccionamiento cromatografico de plasma o suero, preparados asi obtenidos y su uso. - Google Patents
Procedimiento para el fraccionamiento cromatografico de plasma o suero, preparados asi obtenidos y su uso.Info
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Abstract
Procedimiento de reciclado para el fraccionamiento preparativo de plasma o suero por cromatografía de interacción hidrófoba utilizando un gradiente salino progresivo, obteniéndose al menos una fracción que contiene inmunoglogulina y una albúmina, caracterizado porque (a) se aplica una solución de partida que contiene suero o plasma en presencia de una elevada concentración salina a la fase de cromatografía hidrófoba, (b) se recoge de forma continua una primera fracción que contiene albúmina, (c) la primera fracción obtenida de (b) se concentra de forma continua, (d) el permeado obtenido de (c) con elevada concentración salina se reconduce de forma continua al recipiente de aprovisionamiento de solución tampón 1, entonces (e)se eluye con un tampón mixto de baja concentración salina, preparado a partir de la solución tampón 1 reciclada de alta concentración salina de (d) y una solución tampón 2 exenta de sal, o solo de la solución tampón 2, y (f)el eluido se recoge como una segunda fracción que contiene inmunoglobulina.
Description
Procedimiento para el fraccionamiento
cromatográfico de plasma o suero, preparados así obtenidos y su
uso.
La invención se refiere al procedimiento de
reciclado descrito en las reivindicaciones para el fraccionamiento
cromatográfico de plasma o suero, en especial plasma/suero humanos
en una fase de interacción hidrófoba mediante un gradiente salino
progresivo.
Los primeros ensayos para el fraccionamiento
industrial de plasma humano se realizaron ya en los años 40. El
método utilizado a este respecto se basa en la precipitación de
fracciones proteicas mediante alcohol, en el que por variación del
pH, la fuerza iónica, la temperatura y la concentración de alcohol
se obtienen en estas fracciones distintas proteínas plasmáticas en
forma enriquecida.
Son de especial importancia para la aplicación
terapéutica las fracciones obtenidas conforme a este proceso que
contienen inmunoglobulina y albúmina. Una reseña sobre los métodos
anteriormente indicados puede consultarse en los artículos de reseña
(J.E. More, M.J. Harvey, Blood Separation and Plasma Fractionation,
Wiley-Liss, Nueva York 1991, 261-306
y P. Kistler, H. Friedli, Methods of Plasma Protein Fractionation,
Academic Press, Londres 1980,
3-15).
3-15).
Además de alcohol se utilizan también otros
reactivos de precipitación, como sulfato amónico y polietilenglicol,
para la obtención de fracciones de plasma (A.P. Phillips, K.L.
Martin, W.H. Horton, The choice of methods for immunoglobulin IgG
purification: Yield and Purity of Antibody Activity, J. of
Immunological Methods, 74 (1984) 385-393, A. Poison
y col., The Fractionation of Protein Mixtures by Linear Polymers of
High Molecular Weight, Biochem. Biophys. Acta 82 (1964)
463-475; P.D. Gorevic y col., Methods in Enzymology,
vol. 116, 1985, 3-25; documento DE 2936047C2).
Por principio, todos los métodos de precipitación
para el aislamiento de proteínas plasmáticas presentan algunos
inconvenientes. Los agentes utilizados para la precipitación
provocan una desnaturalización parcial de las proteínas separadas.
Esto se reconoce por la formación de agregados y las
incompatibilidades asociadas a ello en la aplicación terapéutica.
Para obtener preparados tolerables a partir de las fracciones
proteicas así obtenidas son necesarios otros costosos pasos de
purificación.
Otro inconveniente de los métodos radica en que
las reacciones de precipitación, en especial en mezclas tan
complejas como el plasma humano, no se desarrollan nunca
cuantitativamente. Esto y los pasos de purificación adicionales
necesarios conducen a pérdidas de rendimiento considerables.
Estos procedimientos no representan por
consiguiente un aprovechamiento óptimo del valioso material de
partida, en particular del plasma humano o suero humano.
Por este motivo se han hecho intentos de llevar a
cabo el fraccionamiento del plasma por métodos cuidadosos y de
mayores rendimientos. Para ello se proponen métodos de
adsorción.
Para ello se aprovechan propiedades especiales de
las proteínas, como carga, hidrofobicidad, tamaño y propiedades de
unión características para conseguir un enlace de las proteínas a
ligandos adecuados.
Es especialmente ventajoso que estos ligandos
estén unidos a un soporte estacionario insoluble en agua. La unión
de las proteínas al soporte substituido puede llevarse a cabo por
procedimientos de lechos o como cromatografía en columna,
mostrándose como especialmente ventajoso el método cromatográfico.
Para el aislamiento cromatográfico de proteínas plasmáticas se han
utilizado intercambiadores de aniones y cationes, fases de afinidad
e hidrófobas así como materiales cromatográficos de exclusión.
Estos métodos cromatográficos se han utilizado
hasta ahora principalmente para la purificación fina de fracciones
de plasma precipitadas.
A continuación se exponen algunos ejemplos.
En el documento EP 0447585B1 se describe el
aislamiento de inmunoglobulina G a partir de pasta de Cohn II.
El documento EP 0352500B1 contiene la preparación
de inmunoglobulina M a partir de pasta III precipitada con
alcohol.
La transferrina (documento DE 3733181C1),
\alpha_{1}-antitripsina (documentos EP
0717049A1, US 5,610,285) y antitrombina III (documento EP 0844254A2)
pueden aislarse con ayuda de distintos métodos cromatográficos a
partir de pasta de Cohn IV.
La pasta de Cohn V sirve como material de partida
para la preparación cromatográfica de albúmina (documento EP
0792887A1) así como para la purificación de glicoproteína
\alpha_{1}-ácida (documento US 5,739,293).
Igualmente pueden utilizarse sobrenadantes que
contienen alcohol del fraccionamiento de Cohn como material de
partida para una preparación cromatográfica de albúmina (documento
EP 0402205B1).
Una combinación de precipitación de alcohol y
cromatografía para la obtención de proteínas plasmáticas está
descrita en el documento US 5,138,034.
También la obtención directa de inmunoglobulina G
y albúmina a partir de plasma humano sin precipitación previa y
separación de un precipitado, mediante cromatografía de intercambio
iónico, está descrita en los documentos DE 3640513C2 y WO
94/29334.
Una reseña sobre la aplicación de métodos
cromatográficos para la obtención de proteínas a partir de plasma
humano se encuentra en: J.M. Curling, Separation of Plasma Proteins,
Pharmacia Fine Chemicals AB, Upsala, Suecia, 1993.
Como ya se ha mencionado anteriormente, todos los
procedimientos descritos presentan inconvenientes decisivos. Así,
todas las proteínas plasmáticas obtenidas por reacciones de
precipitación conducen a considerables pérdidas de rendimiento y
exigen costosos pasos de purificación adicionales para permitir su
aplicación terapéutica. Además, es necesario un gran despliegue
técnico para la refrigeración de los recipientes de reacción,
centrífugas o filtros.
Los productos obtenidos mediante cromatografía de
intercambio iónico a partir de plasma requieren una costosa
confección previa del plasma humano.
Para la realización de la cromatografía de
intercambio iónico el plasma debe ajustarse a una baja fuerza iónica
definida. Esto puede conseguirse por dilución o por
tamponamiento.
Con ello se forman grandes volúmenes que limitan
a escala industrial la cantidad del plasma a procesar. Además de
esto, debe eliminarse mediante un paso adicional antes de la
cromatografía el fibrinógeno contenido en el plasma humano para
evitar el bloqueo de la columna.
S. Coheen y col. describen en J. of
Chromatography, 326 (1985), 235-241 un procedimiento
para el fraccionamiento de suero humano. A este respecto se provee a
una columna de Bio-Gel TSK
Phenyl-5PW con la solución de partida y a
continuación se eluye a 0ºC mediante un gradiente salino lineal de
sulfato amónico en tampón de fostato sódico 0,1 M. Una elución
lineal semejante puede llevarse a cabo solamente a escala analítica,
pues en caso contrario, al aplicar la solución de partida y usar la
concentración inicial indicada de 1,7 M la columna se atascaría si
se trabajase a escala preparativa. Además de esto, debe trabajarse a
0ºC para mejorar la resolución del cromatograma. Un modo de proceder
semejante no es transferible a un proceso de alcance preparativo
debido al coste técnico.
Por Goheen, Journal Chromatography, 326, 1985,
páginas 235 a 241, es conocido un procedimiento de fraccionamiento
de suero humano sin precipitación de rivanol mediante un gradiente
salino lineal de sulfato amónico por cromatografía de interacción
hidrófoba (HIC).
La invención se plantea el objetivo de
proporcionar un procedimiento de reciclado a escala industrial
realizable económicamente para el fraccionamiento preparativo de
plasma, en especial de plasma humano, o de suero, en especial de
suero humano, que proporcione con elevados rendimientos proteínas
plasmáticas nativas, no modificadas. Para ello tuvo que evitarse
principalmente una precipitación y disolución de proteínas
terapéuticamente relevantes y desarrollar el proceso a temperatura
ambiente.
Conforme a la invención este objetivo se consigue
con las características de la reivindicación 1. De las
reivindicaciones subordinadas se desprenden variantes
preferidas.
Conforme a la invención se proporciona un
procedimiento de reciclado para el fraccionamiento preparativo de
plasma o suero por cromatografía de interacción hidrófoba utilizando
un gradiente salino progresivo, obteniéndose al menos una fracción
que contiene inmunoglogulina y una albúmina, en el que
- (a)
- se aplica una solución de partida que contiene suero o plasma en presencia de una elevada concentración salina a la fase de cromatografía hidrófoba,
- (b)
- se recoge de forma continua una primera fracción que contiene albúmina,
- (c)
- la primera fracción obtenida de (b) se concentra de forma continua,
- (d)
- el permeado obtenido de (c) con elevada concentración salina se reconduce de forma continua al recipiente de aprovisionamiento de solución tampón 1, entonces
- (e)
- se eluye con un tampón mixto de baja concentración salina, preparado a partir de la solución tampón 1 reciclada de alta concentración salina de (d) y una solución tampón 2 exenta de sal, o solo de la solución tampón 2, y
- (f)
- el eluido se recoge como una segunda fracción que contiene inmunoglobulina.
Conforme a la invención se cromatografía plasma o
suero, en especial de origen humano, preferiblemente un plasma o
suero liberado del factor de coagulación VIII y/o de los factores de
coagulación del complejo PPSB, en especial de origen humano, en una
fase hidrófoba utilizando un gradiente salino progresivo. Como sal
es especialmente adecuado el sulfato amónico.
Sorprendentemente se ha encontrado que con
auxilio de la cromatografía de interacción hidrófoba puede separarse
a escala preparativa plasma o suero en al menos una fracción que
contiene inmunoglobulina y una albúmina, pudiéndose realizar la
cromatografía a temperatura ambiente, sin costosos dispositivos
refrigerantes.
A continuación se explica más detalladamente el
procedimiento conforme a la invención.
Conforme a la invención puede utilizarse plasma
(humano) o suero (humano), que puede liberararse de los factores de
coagulación. Además de esto, también puede utilizarse plasma o suero
animal con o especialmente sin factores de coagulación. El material
de partida puede obtenerse tanto de mezclas de donantes normales
como también de donantes escogidos (seleccionados) con elevados
títulos de anticuerpos contra antígenos virales, bacterianos o
celulares. En el caso de material de partida seleccionado
(hiperinmunoglobulina) se selecciona preferiblemente aquel con
títulos elevados contra CMV, hepatitis B, varicela, tétanos o
anti-D.
Preferiblemente, como material de partida para el
procedimiento conforme a la invención se utiliza un plasma liberado
de los factores de coagulación anteriormente indicados, en especial
plasma o suero humano. La separación de los valiosos factores de
coagulación del plasma, que por sí mismos son de gran interés
terapéutico, es conocida.
Así, por ejemplo para la preparación de
concentrado de factor VII, como material de partida se utiliza el
crioprecipitado obtenido de un proceso de descongelación y los
factores II, VII, IX y X (complejo PPSB) se aislan por adsorción en
un intercambiador de aniones y se utilizan igualmente
terapéuticamente en forma purificada.
Para la obtención del material de partida
preferido para el procedimiento conforme a la invención puede por
consiguiente en especial descongelarse a +4ºC un plasma obtenido
mediante plasmaféresis conforme a las pautas del modo de hacer de la
donación de sangre y eliminar el crioprecipitado por centrifugación.
De este puede prepararse factor VII. Los factores de coagulación del
complejo PPSB se separan por adsorción en un intercambiador de
aniones, p.ej. en un dextrano reticulado, substituido con grupos
dietilamino (como p.ej. DEAE-Sephadex® A50).
Al material de partida, con o sin factores de
coagulación, se le añade preferiblemente la suficiente sal de
gradiente, en el caso de sulfato amónico el sulfato amónico sólido
suficiente, por litro para que tras varias horas, p.ej.
3-20, de agitación a temperatura ambiente, dado el
caso tras adición de agua para inyectables, esté presente la
conductividad de una correspondiente solución salina, en especial de
sulfato amónico, prevista para el comienzo de la cromatografía,
correspondiente a la concentración inicial de sal, en especial de
sulfato amónico, seleccionada. Tras la adición de
0,5-5% de coadyuvante de filtración, p.ej. Standard
Super Cell u otro coadyuvante de filtración adecuado como p.ej.
perlita, harbolita o celita, se filtra la solución. El filtrado se
utiliza como solución de partida para la cromatografía. La fase de
interacción hidrófoba se equilibra a este respecto preferiblemente a
la concentración de partida deseada de sal, en especial de sulfato
amónico, correspondiente a la concentración seleccionada en la
solución de partida.
La separación cromatográfica se basa en la
interacción de dominios hidrófobos de las moléculas de proteína con
grupos hidrófobos sobre la fase cromatográfica estacionaria. Bajo
condiciones fisiológicas los grupos hidrófobos de las moléculas de
proteína no son libremente accesibles, de modo que no tiene lugar
una unión a una fase de interacción hidrófoba. Mediante la adición
de la sal, en especial de sulfato amónico, se reduce la envuelta de
hidrato de la proteína, con lo que los dominios hidrófobos quedan a
disposición para una interacción hidrófoba.
La hidrofobicidad de la fase estacionaria se
selecciona por consiguiente conforme a la invención de modo que
pueda tener lugar una interacción de determinadas proteínas con la
fase. La unión a la fase depende por una parte de la hidrofobicidad
de la matriz cromatográfica, por otra parte de la concentración de
la sal, en especial de la de sulfato amónico. Puesto que a elevadas
concentraciones de sal, en especial de sulfato amónico, se produce
una precipitación de las proteínas, la concentración de la sal,
p.ej. la de sulfato amónico, se selecciona de modo correspondiente a
la hidrofobicidad de la fase cromatográfica de modo que las
interacciones deseadas tengan lugar a una concentración de sal o
sulfato amónico que no conduzca predominantemente a la
precipitación.
Esto se infiere por ejemplo de la tabla 1, en la
que en función de la concentración de sulfato amónico está indicada
la proporción de proteínas que todavía se encuentran en solución. A
valores de 1,4 mol/l de sulfato amónico y superiores no se obtienen
resultados satisfactorios.
Así pues resulta que la concentración de sal, en
especial de sulfato amónico, debería ser < 1,4 mol/l.
Para la separación eficaz de la fracción de
inmunoglobulina y albúmina se empieza en consecuencia
preferiblemente a una concentración de sulfato amónico de < 1,4
mol/l, se ajusta al caso deseado la fase cromatográfica y la
solución de partida, se lava después preferiblemente con un tampón
de esta concentración salina y a continuación se reduce la
concentración de sulfato amónico.
Con especial preferencia la separación se lleva a
cabo cuando la concentración elevada alcanza de 0,6 a < 1,4
mol/l, preferiblemente hasta 1,3 mol/l, en especial de 0,6 a 1,2
mol/l, muy especialmente de 0,7 a 1 mol/l, en especial de 0,8 a 0,9
mol/l, y la concentración reducida de 0,4 a 0 mol/l, en especial de
0,3 a 0 mol/l.
En un gradiente de concentración semejante se
obtiene primeramente una fracción que contiene albúmina y luego una
fracción que contiene inmunoglobulina. La última puede contener
todavía lípidos, que es más ventajoso eliminar. Para ello, en un
segundo paso puede utilizarse otro escalón de concentración de
sulfato amónico, p.ej. empezando a 0,4, en especial a 0,3 mol/l,
hasta 0,1 mol/l, en especial de 0,3 a 0,15 mol/l, muy especialmente
a 0,3 mol/l y subsiguiente reducción a de menos de 0,1 mol/l a 0
mol/l. A este respecto, los lípidos se eliminan primero de la fase a
la concentración más baja, dado el caso a cero (0 mol/l), y con ello
se separan de la fracción de inmunoglobulina, que abandona la fase a
concentraciones de sulfato amónico más elevadas.
En la cromatografía se observan las condiciones
habituales que son conocidas para tales fases, como p.ej. el valor
del pH (p.ej. 7,0), tampón de (hidrogeno)fosfato sódico o
trishidroximetilaminometano como eluyente. Son especialmente
preferidos los tampones de fosfato (p.ej. NaH_{2}PO_{4} 0,01
M).
Como fases de interacción hidrófoba son adecuados
para el proceso conforme a la invención los materiales conocidos. A
estos pertenecen p.ej. fases fenil- o
alquil-substituidas basadas en copolímeros de
metacrilato de glicidilo y dimetacrilato de etilenglicol,
copolímeros de poliestireno y divinilbenceno o geles de sílice
recubiertos con dextrano o polímeros.
Se muestran especialmente adecuados copolímeros
alquil- y muy especialmente preferidos
fenil-substituidos de metacrilato de glicidilo y
dimetacrilato de etilenglicol.
Estos están comercializados bajo los nombres
comerciales de TSK-Phenyl 5PW® y
Toyopearl-Phenyl 650®.
Para ello conforme a la invención puede
seleccionarse por ejemplo una concentración inicial de sulfato
amónico de 0,7 a 1,0 mol/l, preferiblemente de 0,8 a 1,0, en
especial de 0,9 mol/l, para la separación cromatográfica.
Como puede verse en la tabla 2, la separación
cromatográfica en TSK-Phenyl 5PW® a tales
concentraciones conduce a resultados especialmente buenos.
Así, como se ha descrito anteriormente, la
solución de partida ajustada a una concentración de sulfato amónico
de 0,9 mol/l puede aplicarse a la fase cromatográfica hidrófoba
equilibrada. A esta concentración salina se obtiene una fracción 1
que pasa la fase sin unirse. Las proteínas unidas se desprenden de
la fase como fracción 2 con fosfato sódico 0,01 mol/l, pH 7, es
decir, la concentración de sulfato amónico se reduce aquí a 0
mol/l.
En la tabla 3 está expuesta la composición de las
fracciones cromatográficas obtenidas.
Como puede verse en esta, se obtiene una fracción
1 que se denomina fracción de albúmina y que es muy similar en
composición a un sobrenadante II/III del fraccionamiento alcohólico
según Cohn. Esta contiene las importantes proteínas albúmina,
transferrina, antitrombina III y
\alpha-antitripsina.
En la fracción 2 están contenidas casi
cuantitativamente todas las inmunoglobulinas y se parece por
consiguiente a la composición de una pasta II/III obtenida por el
procedimiento de etanol frío.
Como puede verse además en la tabla 3, en la
fracción 2 están contenidos también todos los lípidos y
lipoproteínas. Estos pueden dificultar el posterior procesamiento de
la fracción 2 a soluciones proteicas terapéuticamente aplicables, de
modo que ha mostrado ser ventajoso integrar en el proceso otro paso
de elución para la obtención de una 3ª fracción.
Para ello, tras la obtención de la fracción 1
puede empezarse a la máxima concentración, p.ej. de 0,9 mol/l, de
sulfato amónico y luego seguir procesando con un gradiente
progresivo. Por ejemplo, la fracción 2 puede aislarse a 0,3 mol/l de
sulfato amónico.
Esta fracción 2 que contiene inmunoglobulina no
se diferencia en la composición de proteínas de la fracción
anteriormente descrita (tabla 3, fracción 2) excepto porque el
contenido de lipoproteínas es menor del 5%.
La fracción de lipoproteínas permanece unida a la
fase cromatográfica a concentraciones de sulfato amónico de 0,3
mol/l y mayores y puede eluirse de la fase con fosfato sódico 0,01
mol/l, pH 7,0 como fracción 3, es decir, la concentración de sulfato
amónico se reduce aquí a 0 mol/l.
Por consiguiente preferiblemente se separan 3
fracciones en la cromatografía de interacción hidrófoba conforme a
la invención, a saber, en primer lugar la fracción de albúmina,
luego la fracción de inmunoglobulina y luego la fracción de
lipoproteína.
En la figura 1 está representado esquemáticamente
el proceso conforme a la invención.
En la aplicación industrial del procedimiento se
necesitan soluciones tampón que contienen sal tampón - como sulfato
amónico - en cantidades considerables. Para minimizar este consumo
lo más posible se utiliza conforme a la invención un procedimiento
de reciclado como se representa en la figura 2.
A este respecto puede reconducirse a la
concentración deseada ajustada, p.ej. tampón de sulfato amónico 1
(concentración elevada) como permeado de la primera fracción
obtenida, p.ej. mediante membranas de ultrafiltración adecuadas,
mientras que la primera fracción se recoge de modo continuo y se
concentra. Con objeto de separar la segunda y dado el caso la
tercera fracción se rebaja entonces un tampón a la respectiva
concentración deseada por mezclado del tampón de sulfato amónico 1 y
una sal de no-gradiente, es decir no tampón de
sulfato amónico 2 o utilizando solamente el tampón 2 como se indica
conforme a la invención y se separa la segunda o tercera fracción
según cuantas fracciones se deseen.
Preferiblemente, como se ha descrito
anteriormente, se preparan tres fracciones utilizando un gradiente
progresivo tras la separación de la fracción 1, seleccionándose la
concentración de sulfato amónico anteriormente indicada.
La concentración continua de las fracciones puede
realizarse p.ej. mediante ultrafiltración.
Es además preferido limpiar la fase
cromatográfica conforme a un ciclo con sosa caústica desde un
recipiente de aprovisionamiento 3, realizándose simultáneamente una
esterilización.
Por ejemplo, tras la carga de la columna puede
lavarse después con la solución de proteínas plasmáticas ajustada a
un tampón 1 y filtrada para la obtención de la fracción 1 con tampón
1 (p.ej. sulfato amónico 0,9 mol/l, NaH_{2}PO_{4} 0,01 mol/l, pH
7,0) para obtener la fracción 1 completa. La fracción 1 así obtenida
se recoge y se concentra de modo continuo a través de una unidad de
ultrafiltración con un corte de 10 KD. El permeado así obtenido se
reconduce al recipiente de aprovisionamiento de tampón 1.
Para la elución de la fracción 2 se reduce la
concentración de la sal o sulfato amónico como se ha indicado,
pudiéndose preparar por ejemplo un tampón mezcla o se selecciona
solo un tampón 2 que no contenga sal alguna, p.ej. sulfato amónico,
según cuantas etapas de separación se deseen.
En un gradiente progresivo pueden, por ejemplo
para la elución de la fracción 2, mezclarse en línea, p.ej. en una
relación 1:3, el tampón 1 (sulfato amónico 0,9 mol/l,
NaH_{2}PO_{4} 0,01 mol/l, pH 7,0) y tampón 2 (NaH_{2}PO_{4}
0,01 mol/l, pH 7,0). Esta relación de mezcla proporciona un tampón
de elución para la fracción 2 con la concentración mezcla de p.ej.
sulfato amónico 0,3 mol/l, NaH_{2}PO_{4} 0,01 mol/l, pH 7,0.
La concentración recogida 2 se concentra
igualmente en línea a través de una unidad de ultrafiltración con un
corte de 10-30 KD. El permeado que se obtiene se
desecha.
Entonces se desprenden las lipoproteínas de la
fase hidrófoba solubilizándolas con tampón 2 (NaH_{2}PO_{4} 0,01
mol/l, pH 7,0).
Este procedimiento puede variarse con cambios de
las concentraciones de tampón/sal y de las relaciones de mezcla en
el intervalo respectivamente deseado conforme a la invención y en
las condiciones habituales conocidas para el técnico en la materia
para las fases cromatográficas indicadas. Así, p.ej., con una
concentración de tampón 1 de 1 mol/l puede prepararse con tampón 2
una mezcla de 1:1 a 1:5, etc.
En el procesamiento de grandes cantidades se
llevan a cabo varios ciclos cromatográficos.
Por consiguiente, preferiblemente tras cada ciclo
de separación la fase hidrófoba se limpia con NaOH 1,0 mol/l y
simultáneamente se esteriliza. La lejía de sosa se encuentra en el
recipiente de aprovisionamiento 3.
Las fracciones 1 y 2 obtenidas por el
procedimiento conforme a la invención de la fase hidrófoba pueden
procesarse seguidamente por procedimientos conocidos, como p.ej.
aquellos descritos en las publicaciones mencionadas al principio,
para obtener soluciones de proteínas plasmáticas de alta pureza
aplicables terapéuticamente. Tales preparados se utilizan en
correspondientes estados de carencia o enfermedad, p.ej. en caso de
infecciones pueden administrarse para la correspondiente infección
preparados que han sido elaborados conforme a la invención a partir
de material de partida seleccionado, como p.ej. aquellos que
contienen anti-CMV o anti-HBs,
antivaricela, tétanos o anti-D.
Las cantidades y la forma de administración son a
este respecto correspondientemente conocidas, p.ej. como inyecciones
o inyección i.m. o infusión i.v., pudiendo presentar la composición
farmacéutica además del principio activo los coadyuvantes conocidos.
Entre estos se incluyen p.ej. electrolitos, aminoácidos o
azúcares.
Por ejemplo, a partir de la fracción de
inmunoglobulina (fracción 2) puede prepararse una tolerable i.v., en
especial inmunoglobulina G. Para ello pueden utilizarse métodos
conocidos como los ya descritos en el documento DE 3640513C2 así
como en el documento EP-B 447 585. Este modo de
procedimiento está representado en la figura 3 y comprende
substancialmente cromatografía de intercambio aniónico, dado el caso
filtración de virus, tratamiento con ácido octanoico, cromatografía
de intercambio catiónico y pasos habituales de concentración,
filtración y esterilización.
Así, la fracción 2 de la cromatografía de
interacción hidrófoba concentrada puede tamponarse, p.ej. mediante
diafiltración, a NaH_{2}PO_{4} 0,05-0,10 mol/l
pH 6,5, preferiblemente a NaH_{2}PO_{4} 0,06 mol/l, pH 6,5.
Para el subsiguiente procesamiento esta solución
se somete a una cromatografía de intercambio aniónico. Para ello el
intercambiador aniónico se equilibra con NaH_{2}PO_{4}
0,01-0,05 mol/l, pH 6,5, preferiblemente con
NaH_{2}PO_{4} 0,03 mol/l, pH 6,5 y la solución de proteínas
diafiltrada se diluye con agua para inyectables (WFI) de modo que
también aquí esté presente una concentración salina de
0,01-0,05 mol/l de NaH_{2}PO_{4}, pH 6,5,
preferiblemente de 0,03 mol/l de NaH_{2}PO_{4}, pH 6,5.
Bajo estas condiciones una fracción bruta de
inmunoglobulina G pasa la columna sin unirse mientras que todas las
demás proteínas se unen a la fase cromatográfica.
Con un tampón de concentración salina elevada
(0,02 mol/l de NaH_{2}PO_{4}, 1,0 mol/l de ClNa, pH 6,5) se
eluyen las proteínas unidas.
La fracción bruta de inmunoglobulina G se filtra
dado el caso a través de un filtro de virus, se concentra mediante
ultra-/diafiltración y se tampona a 0,01-0,05 mol/l
de acetato sódico, pH 5,5, preferiblemente a 0,02 mol/l de acetato
sódico, pH 5,5.
Esta fracción bruta ajustada está compuesta por
> 99% de inmunoglobulina G, pero está impurificada con enzimas
proteolíticas.
Estas pueden eliminarse con ácido octanoico
conforme al documento EP 0447585B1. Para ello, la solución
acondicionada se trata con 0,4 a 1,5% en vol., preferiblemente 0,8 a
1,0, en especial 0,8% de ácido octanoico y se filtra adicionando
CaCl_{2}.
A continuación se efectúa una inactivación de
virus con fosfato de tri-n-butilo al
0,3% y Tween 80 al 1%. Tras la finalización del tiempo de reacción
la solución se ajusta a una conductividad de un tampón de acetato
sódico 0,02 mol/l, pH 5,0 con agua para inyectables.
Los agentes del tratamiento con ácido y de la
inactivación de virus así como los agregados de igG contenidos en la
solución se eliminan mediante cromatografía en un intercambiador
catiónico. Para ello se aplica la solución de inmunoglobulina G
ajustada al intercambiador catiónico equilibrado, los agentes se
arrastran lavando con acetato sódico 0,02 mol/l, pH 5,0, y la
fracción valiosa de inmunoglobulina G se eluye con un tampón
compuesto por acetato sódico 0,02 mol/l, cloruro sódico 0,3 mol/l,
pH 5,0. La limpieza de la columna se lleva a cabo con acetato sódico
0,02 mol/l, cloruro sódico 1,0 mol/l, pH 5,0 y NaOH 1,0 mol/l.
La fracción de inmunoglobulina G se diafiltra
contra glicina 0,3 mol/l, pH 5,0 y se concentra a una concentración
de proteínas de 50 g/l.
Análogamente, el preparado de IgG de alta pureza
tolerable i.v. puede procesarse también por otros procedimientos
conocidos.
Los preparados de inmunoglobulina G tolerables
intravenosamente así preparados presentan, frente a las soluciones
convencionales que se obtienen habitualmente por precipitaciones a
partir de plasma, algunas ventajas. Así, por ejemplo, la composición
de la subclase de IgG corresponde a la distribución natural que se
encuentra en el plasma. El contenido de IgA es menor del 0,15% y el
contenido de IgG menor del 0,02% del contenido total de proteínas.
La proporción de agregados de IgG es menor del 0,25%. No son
detectables posibles impurezas que conducen a reacciones de
intolerancia, como activador de precalicreína, precalicreína,
calicreína, cininógeno, plasmina, plasminógeno y factor XI. Todos
los demás parámetros analíticos corresponden a los de la Farmacopea
Europea para preparados de inmunoglobulina G i.v.
Por consiguiente, el preparado así obtenido
presenta todos los criterios requeridos y se diferencia del producto
conocido por una parte por la elevada proporción de IgG y además en
lo que respecta a la composición de las
subclases.
subclases.
\newpage
A partir de la fracción 1 preparada conforme a la
invención pueden obtenerse por ejemplo
antitrombina-III (AT-III),
transferrina y albúmina.
Un procedimiento correspondiente está
representado en la figura 4 y comprende substancialmente
cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico,
inactivación de virus así como pasos habituales de filtración,
concentración y esterilización.
Así, a partir de la fracción 1 ultra- y
diafiltrada mediante cromatografía de afinidad en un soporte de
heparina puede obtenerse antitrombina III a partir de los productos
de partida que la contienen. Un modo de procedimiento semejante está
descrito en el documento EP-A 844 254 como etapa de
prepurificación para la obtención de antitrombina liberada de
impurezas, llevándose a cabo aquí a continuación un tratamiento
térmico y/o de quelato metálico. En el procedimiento conforme a la
invención por consiguiente puede llevarse a cabo igualmente la
cromatografía de afinidad, conduciendo aquí una solución de sal
común de baja concentración, como p.ej. cloruro sódico 0,1 a 0,2
mol/l, para la unión de antitrombina III y una mayor concentración
de sal común, como p.ej. cloruro sódico 1,0 a 2,0 mol/l, para la
elución. Así, la fracción 1 puede ajustarse a un medio tampón de
NaH_{2}PO_{4} 0,02 mol/l, NaCl 0,150 mol/l, pH 7,0 y aplicarse a
la fase de afinidad.
La albúmina y la transferrina pasan la columna
sin unirse. Se lava la columna con NaH_{2}PO_{4} 0,02 mol/l,
NaCl 0,4 mol/l, pH 7,0 y a continuación se eluye la
AT-III unida al soporte de heparina con
NaH_{2}PO_{4} 0,02 mol/l, NaCl 2,0 mol/l, pH 7,0. La solución de
AT-III obtenida se tampona a condiciones
fisiológicas y puede procesarse subsiguientemente por métodos
conocidos, como p.ej. filtración de virus y pasteurización, para
obtener un preparado terapéuticamente aplicable.
La fracción que pasa la cromatografía de afinidad
que contiene albúmina y transferrina puede separarse según el
documento DE 3733181C1 para obtener transferrina y según el
documento EP 0402205B1 o el EP 0792887A1 para obtener albúmina.
Así, por ejemplo tras tamponamiento de la
filtración de paso anteriormente indicada de la cromatografía de
afinidad a Tris 0,02 mol/l, NaCl 0,030 mol/l, pH 7,0, la solución
puede aplicarse a un intercambiador aniónico. La transferrina se
recoge como fracción de paso y mediante métodos conocidos se
inactivan los virus y se procesa subsiguientemente. La fracción de
albúmina eluida a continuación del intercambiador aniónico con Tris
0,02 mol/l, NaCl 1,0 mol/l, pH 7,0 puede ajustarse por ejemplo a una
conductividad de 1,8 mS/cm con un tampón de acetato sódico, pH 6,0 y
someterse nuevamente a una cromatografía de intercambio aniónico.
Mediante el ajuste del valor del pH a 5,2 se eliminan trazas de
transferrina eventualmente presentes. La elución de la albúmina del
intercambiador aniónico se lleva a cabo a pH 4,5 y a una
conductividad de 1,8 mS/cm. El procesamiento subsiguiente a un
preparado de albúmina terapéuticamente aplicable se lleva acabo por
métodos conocidos.
Para todos los pasos cromatográficos utilizados
en los procedimientos anteriormente indicados se utilizan materiales
conocidos.
Como intercambiadores catiónicos pueden
utilizarse p.ej. CM-Accell®,
SP-Spherodex®,
SP-Trisacryl-LS® o
Fraktogel-TSK-SP 650®, Poros HS® o
S-HyperDF® o SOURCE-30S®,
CM-HyperDF® y ajustarse correspondientemente la
concentración salina.
Como intercambiadores aniónicos pueden utilizarse
p.ej. QMA-Accell®, DEAE-Spherosil® o
DEAE-Sepharose®, Poros HQ® o
Q-HyperDF®, SOURCE-30Q®.
Otros materiales adecuados son
CM-Accell®,
SP-Sperodex-M® o fases preparadas
sobre la base de polímeros sintéticos como
SP-Trisacryl-LS® y
CM-Trisacryl-LS®.
Para la cromatografía de afinidad puede
utilizarse p.ej. Heparin-Sepharose® o polímeros
sintéticos con heparina inmovilizada como p.ej. Toyopearl
AF-Heparin 650N®, pudiéndose seleccionar como tampón
igualmente las composiciones anteriormente indicadas.
Preferiblemente en el procedimiento conforme a la
invención se utilizan medios cromatográficos basados en polímeros
sintéticos, como los comercializados bajo el nombre comercial de
Poros®, Source®, Macroprep®, TSK® Toyopearl® e Hyper D®.
Las fases indicadas están disponibles
substituidas como intercambiador aniónico, catiónico, matriz de
interacción hidrófoba y de afinidad. A este respecto constituyen
intercambiadores aniónicos grupos amino terciarios o cuaternarios,
intercambiadores catiónicos carga con grupos sulfoalquilo o
carboxilo, fases hidrófobas o matrices de afinidad substituyentes
como grupos alquilo o fenilo o heparina. Los respectivos medios
tampón y las condiciones de elución para ellas son conocidos para el
técnico en la materia.
Debido a su relativa estabilidad a la presión
también permiten estas con menor tamaño de partícula elevados
caudales. Por consiguiente los procesos descritos pueden
desarrollarse económicamente en poco tiempo y con elevado
rendimiento.
Además, estas fases cromatográficas ofrecen la
ventaja de que son químicamente inertes frente a agentes
esterilizadores y por consiguiente son especialmente adecuadas para
la fabricacion de productos farmacéuticos.
Para la esterilización pueden emplearse
tratamientos, preferiblemente antes del paso de la cromatografía,
con \beta-propiolactona, TNBP/Tween, TNBP/colato
de Na, TNBP, dado el caso en combinación con irradiación con UV o
filtración de virus. Los filtros utilizados como p.ej. Planova®,
Virosolv®, Ultripor DV50® son conocidos.
Los productos preparados de este modo conforme a
la invención pueden almacenarse en estado líquido o
liofilizados.
La ventaja del procedimiento conforme a la
invención radica en que los materiales de partida indicados pueden
purificarse así de modo rápido y sencillo, en que los productos
puros obtenidos pueden conseguirse sin pérdidas substanciales de
rendimiento y corresponden substancialmente a su composición
natural.
La invención se ilustra con los siguientes
ejemplos.
Como material de partida se utilizan 5,4 l de un
plasma humano liberado de factores de coagulación. La eliminación de
los factores de coagulación se lleva a cabo por procedimientos
conocidos mediante separación del crioprecipitado y mediante
adsorción de los factores PPSB en
DEAE-Sephadex-A50®.
A este plasma pretratado se le añaden por
kilogramo 1,2 mol de sulfato amónico y se agita durante 5 h a
temperatura ambiente. Después de esto se diluye con agua para
inyectables (WFI) a una conductividad de 112 mS/cm (20ºC)
correspondiente a la conductividad de una solución de sulfato
amónico 0,9 molar y se agita posteriormente durante
6-12 h. Tras adición de 2% (p/p) de coadyuvante de
filtración (p.ej. Standard Super Cell) y nueva agitación durante 1
hora la solución se clarifica a través de un filtro de lecho
profundo, p.ej. Seitz Supra 80P.
Una columna de acero (373 ml) rellena con
TSK-Phenyl 5PW® se equilibra con sulfato amónico 0,9
mol/l, NaH_{2}PO_{4} 0,01 mol/l, pH 7,0. Con un flujo de 70
ml/min se aplica la solución de proteínas plasmáticas preparada y
filtrada en porciones de 370 ml. Tras el fin de la aplicación se
lava seguidamente con 5 volúmenes de columna del tampón de
equilibrado y se recoge esta fracción (fracción 1). Durante la
recolección de la fracción 1 se lleva a cabo una simultánea
ultrafiltración en una membrana de 10 KD, p.ej. Omega®,
Pall-Filtron, reconduciendo el permeado al
recipiente de aprovisionamiento del tampón de equilibrado.
Después de esto se obtiene la fracción 2 con el
volumen de 4 veces el de la columna de un tampón de elución
compuesto por sulfato amónico 0,3 mol/l, NaH_{2}PO_{4} 0,01
mol/l, pH 7,0. El tampón de elución se prepara mediante una válvula
de mezcla a partir del tampón de equilibrado (sulfato amónico 0,9
mol/l, NaH_{2}PO_{4} 0,01 mol/l, pH 7,0) y una solución de
NaH_{2}PO_{4} 0,01 mol/l, pH 7,0. Para ello se mezclan los dos
tampones en línea en una relación
1:3.
1:3.
Mediante la alimentación de 3 volúmenes de
columna de tampón NaH_{2}PO_{4} 0,01 mol/l, pH 7,0 se desprende
solubilizada la fracción de lipoproteínas y se desecha.
Tras un paso de limpieza con 3 volúmenes de
columna de una solución de NaOH 1 mol/l se lava libremente la
columna con WFI y se equilibra de nuevo.
Para el procesamiento de la totalidad de la
solución de proteínas filtrada utilizada son necesarios 26 ciclos,
recogiéndose las fracciones 1 y 2 respectivamente en un recipiente
colector.
Después de esto se lleva a cabo una
esterilización de las fracciones 1 y 2 separadas.
| Rendimiento de inmunoglobulina G en la fracción 2, | 90,3% |
| Rendimiento de albúmina en la fracción 1, | 100% |
Composición de las fracciones 1 y 2 en la
electroforesis de zonas capilar
\newpage
| Fracción 1 | Fracción 2 | |
| \gamma-Globulina | 0 | 61,5 |
| \beta-Globulina | 6,1 | 13,5 |
| \alpha_{1}-Globulina (%) | 4,3 | 2,1 |
| \alpha_{2}-Globulina (%) | 7,7 | 13,3 |
| Albúmina (%) | 81,9 | 1,8 |
| Fibrinógeno (%) | 0 | 7,6 |
Se procede como en el ejemplo 1.
La solución de proteínas liberada de factores de
coagulación, mezclada con sulfato amónico y filtrada, como se
describe en el ejemplo 1, se cromatografía en una columna de
TSK-Phenyl 5PW®.
Tras elución de la fracción 1 se desprenden de la
columna con NaH_{2}PO_{4} 0,01 mol/l, pH 7,0 las
inmunoglobulinas y las lipoproteínas solubilizadas en una
fracción.
Las fracciones obtenidas muestran los siguientes
rendimientos:
| Fracción 1: | Rendimiento de albúmina | 100% |
| Fracción 2: | Rendimiento de inmunoglobulina G | 95,5% |
Se procede como en el ejemplo 1.
La solución de proteínas liberada de factores de
coagulación, mezclada con sulfato amónico y filtrada se
cromatografía en una columna de 3 l (180x250 mm) rellena con
Toyopearl- Phenyl 650 M®.
El modo de proceder corresponde al del ejemplo
1.
Por ciclo se procesan 2,4 l de la solución de
partida a un caudal de 300 ml/min. Con esta columna son necesarios 3
ciclos para el procesamiento de 4 l de plasma.
Como en el ejemplo 1 se recogen 3 fracciones.
Las fracciones obtenidas muestran los siguientes
rendimientos:
| Fracción 1: | Rendimiento de albúmina | 100% |
| Fracción 2: | Rendimiento de inmunoglobulina G | 96% |
Se procede como en el ejemplo 2.
La solución de proteínas liberada de factores de
coagulación, mezclada con sulfato amónico y filtrada se
cromatografía en una columna de 2,5 l rellena con Toyopearl- Phenyl
650 M®.
El modo de proceder corresponde al del ejemplo
2.
Por ciclo se separan 2,4 l de la solución de
partida a un caudal de 125 ml/min en 2 fracciones. Para ello se
necesitan 3 ciclos.
Las fracciones obtenidas muestran los siguientes
rendimientos:
| Fracción 1: | Rendimiento de albúmina | 100% |
| Fracción 2: | Rendimiento de inmunoglobulina G | 95% |
Se procede como en los ejemplos 1, 2, 3 ó 4. En
lugar de un plasma de partida polivalente se utiliza un plasma
humano preseleccionado con un elevado título contra citomegalovirus
(anti-CMV) y se procesa correspondientemente a los
ejemplos 1 ó 2 ó 3 ó 4.
La fracción 2 obtenida a partir del mismo muestra
los siguientes rendimientos:
| Rendimiento de inmunoglobulina G | 90,5% |
| Rendimiento de título de anti-CMV | 78% |
Se procede como en los ejemplos 1, 2, 3 ó 4. En
lugar de un plasma de partida polivalente se utiliza un plasma
humano preseleccionado con un elevado título contra virus de la
hepatitis B (anti-HBs) y se procesa
correspondientemente a los ejemplos 1 ó 2 ó 3 ó 4.
La fracción 2 obtenida a partir del mismo muestra
los siguientes rendimientos:
| Rendimiento de inmunoglobulina G | 92,0% |
| Rendimiento de título de anti-HBs | 82% |
Se procede como en los ejemplos 1, 2, 3 ó 4. En
lugar de un plasma de partida polivalente se utiliza un plasma
humano preseleccionado con un elevado título contra
anti-D y se procesa correspondientemente a los
ejemplos 1 ó 2 ó 3 ó 4.
La fracción 2 obtenida a partir del mismo muestra
los siguientes rendimientos:
| Rendimiento de inmunoglobulina G | 91,2% |
| Rendimiento de título de anti-D | 54% |
Una fracción 2 que contiene inmunoglobulina G
preparada conforme al ejemplo 1 se ajusta mediante ultra- y
diafiltración a NaH_{2}PO_{4} 0,06 mol/l, pH 6,5 y a una
concentración de proteínas de aprox. 50 g/l. Después de esto se
lleva a cabo una dilución con agua para inyectables (WFI) en una
relación 1:2. Tras un tiempo de agitación de 1 hora se clarifica y
esteriliza por filtración.
Una columna de acero (383 ml) rellena con un
intercambiador aniónico, p.ej. Poros HQ50® se equilibra con un
tampón de NaH_{2}PO_{4} 0,03 mol/l, pH 6,5.
Con un flujo de 120 ml/min se aplican a la
columna 500 ml de la solución que contiene inmunoglobulina G
acondicionada. Después se lava con 10 volúmenes de columna del
tampón de equilibrado y se recoge esta fracción que contiene
inmunoglobulina G.
Las restantes proteínas unidas se desprenden de
la columna solubilizadas con NaH_{2}PO_{4} 0,02 mol/l, NaCl 1,0
mol/l, pH 6,5. Para la limpieza se lava con 2 volúmenes de columna
de NaOH 1 mol/l y a continuación se equilibra de nuevo.
La cantidad total de 2,5 l de la solución de
partida se cromatografía en 5 ciclos.
La fracción de aplicación y paso que contiene
inmunoglobulina G se filtra a través de un filtro de virus,
p.ej.Planova 35, mediante ultra- y diafiltración se tampona a
acetato sódico 0,02 mol/l, pH 5,5 y se ajusta a una concentración
de proteínas de aprox. 40 g/l. A esta solución se le añade 0,8%
(p/p) de ácido octanoico, se agita durante una hora y se mantiene el
valor del pH con NaOH 1 mol/l a pH 5,5. Después de esto se añaden
0,05 mol de CaCl_{2}, se corrige el valor del pH con NaOH 1 mol/l
a pH 5,5 y se agita de nuevo durante 2 horas.
A continuación se mezcla la solución con 2% (p/v)
de coadyuvante de filtración, p.ej. Standard Super Cell, y se filtra
a través de un filtro de clarificación, p.ej. Seitz Supra 80P.
La torta del filtro se lava seguidamente 2 veces
con sendos 100 ml de acetato sódico 0,02 mol/l, pH 5,5.
La solución filtrada se mezcla con 0,3% de TNB
(fosfato de tri-n-butilo) y 1% de
Tween 80 (polisorbato 80) y se agita al menos durante 8 horas a
temperatura ambiente.
Tras la finalización del tiempo de reacción se
ajusta por dilución con WFI a una conductividad de un tampón de
acetato sódico 0,02 mol/l, pH 5,0 y el valor del pH se corrige con
ácido acético al 10% a pH 5,0.
Una columna de acero (388 ml) rellena con un
intercambiador aniónico, p.ej. Poros HS50®, se equilibra con un
tampón de acetato sódico 0,02 mol/l, pH 5,0.
Con un flujo de 120 ml/min se aplican a la
columna 2,15 l de la solución de inmunoglobulina G acondicionada. Se
lava con 10 volúmenes de columna del tampón de equilibrado para
eliminar los reactivos del tratamiento con ácido octanoico y
disolvente-detergente. Esta fracción de lavado se
desecha.
La inmunoglobulina G unida se desprende
solubilizándola con acetato sódico 0,02 mol/l, NaCl 0,3 mol/l, pH
5,0 de la columna y se recoge.
La limpieza de la columna se lleva a cabo con
acetato sódico 0,02 mol/l, NaCl 1,0 mol/l, pH 5,0 seguido de NaOH
1,0 mol/l.
Después de esto la columna se equilibra de nuevo.
La cantidad total de 2,3 l de la solución de partida se
cromatografía en 2 ciclos.
Mediante ultra- y diafiltración contra glicina
0,3 mol/l, pH 5,0 se ajusta isotónicamente la fracción de
inmunoglobulina G, se concentra a un contenido de proteínas de 50
g/l y se esteriliza por filtración.
| Rendimiento de inmunoglobulina G: | 74% |
| Datos analíticos de una solución de inmunoglobulina G al 5% | |
| Actividad anticomplementaria | 0,68 CH_{50}/mg de proteína |
| Inmunoglobulina A | 0,14% |
| Inmunoglobulina M | 0,02% |
| Subclases: | |
| IgG_{1} | 57,6% |
| IgG_{2} | 33,3% |
| IgG_{3} | 5,5% |
| IgG_{4} | 3,6% |
| Electroforesis en acetato de celulosa | 100% de \gamma-globulina |
| Activador de precalicreína | neg. |
| Precalicreína | neg. |
| Calicreína | neg. |
| Cininógeno | neg. |
| Plasmina | neg. |
| Plasminógeno | neg. |
| Factor XI | neg. |
\vskip1.000000\baselineskip
Una fracción 1 que contiene albúmina preparada
conforme al ejemplo 1 se ajusta mediante ultra- y diafiltración a
NaH_{2}PO_{4} 0,02 mol/l, NaCl 0,150 mol/l, pH 7,0.
Una columna de 50 ml (1,5 x 2,5 cm) rellena con
AF-Heparin Toyopearl® se equilibra con
NaH_{2}PO_{4} 0,02 mol/l, NaCl 0,150 mol/l, pH 7,0.
Con un caudal de 7 ml/min se aplican a la columna
100 ml de la fracción que contiene albúmina acondicionada. Se lava
después con 5 volúmenes de columna del tampón de equilibrado y se
recoge esta fracción que contiene
albúmina.
albúmina.
Después, la columna se lava con NaH_{2}PO_{4}
0,02 mol/l, NaCl 0,4 mol/l, pH 7,0 y se desecha esta fracción. La
elución de la AT-III se lleva a cabo con un tampón
compuesto por NaH_{2}PO_{4} 0,02 mol/l, NaCl 2,0 mol/l, pH 7,0.
Esta fracción valiosa se tampona mediante ultra-/diafiltración sobre
PBS, se concentra y se esteriliza por filtración.
La solución de AT-III obtenida
muestra los siguientes datos:
\newpage
| Rendimiento de AT-III | 91% |
| Proteína | 1,1 g/l |
| Actividad de AT-III | 805% d.N. |
| Antígeno de AT-III | 1,0 g/l |
| Albúmina | < 0,006 g/l |
\vskip1.000000\baselineskip
| Proteína (g/l) | IgG (g/l) | IgA (g/l) | IgM (g/l) | Albúmina (g/l) | |
| Inicial | 26,7 | 3,59 | 0,78 | 0,34 | 15,8 |
| Sulfato amónico 0,5 Mol | 26,7 | 3,59 | 0,78 | 0,34 | 15,8 |
| Sulfato amónico 0,7 Mol | 26,7 | 3,59 | 0,78 | 0,34 | 15,8 |
| Sulfato amónico 0,8 Mol | 26,7 | 3,59 | 0,78 | 0,34 | 15,8 |
| Sulfato amónico 1,0 Mol | 26,0 | 3,40 | 0,72 | 0,35 | 14,8 |
| Sulfato amónico 1,2 Mol | 24,9 | 1,93 | 0,38 | 0,21 | 15,7 |
| Sulfato amónico 1,4 Mol | 22,0 | 0,73 | 0,16 | 0,10 | 14,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
| 0,7 Mol | 0,8 Mol | 1,0 Mol | |
| Inicial | |||
| \hskip0,3cm Albúmina (%) | 100 | 100 | 93,7* |
| IgG (%) | 100 | 100 | 94,7* |
| Fracción 1 | |||
| \hskip0,3cm Albúmina (%) | > 95,0 | > 95,0 | > 95,0 |
| IgG (%) | 34,4 | < 2,6 | < 2,0 |
| Fracción 2 | |||
| \hskip0,3cm Albúmina (%) | 1,4 | 1,8 | 3,3 |
| IgG (%) | 57,2 | > 95,0 | > 95,0 |
| * Precipitación por sulfato amónico |
| Inicial (%) | Fracción 1 (%) | Fracción 2 (%) | |
| IgG | 100 | < 5 | > 90 |
| IgA | 100 | < 2 | > 95 |
| IgM | 100 | < 5 | > 90 |
| Albúmina | 100 | > 95 | < 2 |
| Transferrina | 100 | > 95 | < 2 |
| AT-III | 100 | > 90 | < 10 |
| \alpha_{1}-Antitripsina | 100 | > 90 | < 5 |
| Lípidos/Lipoproteínas | 100 | < 5 | > 70 |
Claims (21)
1. Procedimiento de reciclado para el
fraccionamiento preparativo de plasma o suero por cromatografía de
interacción hidrófoba utilizando un gradiente salino progresivo,
obteniéndose al menos una fracción que contiene inmunoglogulina y
una albúmina,
caracterizado porque
- (a)
- se aplica una solución de partida que contiene suero o plasma en presencia de una elevada concentración salina a la fase de cromatografía hidrófoba,
- (b)
- se recoge de forma continua una primera fracción que contiene albúmina,
- (c)
- la primera fracción obtenida de (b) se concentra de forma continua,
- (d)
- el permeado obtenido de (c) con elevada concentración salina se reconduce de forma continua al recipiente de aprovisionamiento de solución tampón 1, entonces
- (e)
- se eluye con un tampón mixto de baja concentración salina, preparado a partir de la solución tampón 1 reciclada de alta concentración salina de (d) y una solución tampón 2 exenta de sal, o solo de la solución tampón 2, y
- (f)
- el eluido se recoge como una segunda fracción que contiene inmunoglobulina.
2. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 1, caracterizado porque la sal es sulfato
amónico.
3. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 2, caracterizado porque la concentración de
sulfato amónico utilizada en el paso (a) asciende a 0,6 a < 1,4
mol/l y la concentración de sulfato amónico utilizada en el paso (e)
a 0 a 0,4 mol/l.
4. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque la concentración
de sulfato amónico utilizada en el paso (a) asciende a 0,7 a 1 mol/l
y la concentración de sulfato amónico utilizada en el paso (e) a 0 a
0,3 mol/l.
5. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la
concentración de sulfato amónico utilizada en el paso (a) asciende a
0,8 a 1 mol/l y la concentración de sulfato amónico utilizada en el
paso (e) a 0 a 0,3 mol/l.
6. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 1, caracterizado porque el paso de elución (e)
se lleva a cabo con el tampón mixto y después de esto
- (f)
- el eluido se recoge como una segunda fracción que contiene inmunoglobulina que está substancialmente exenta de lipoproteínas,
- (g)
- se eluye con un tampón mixto preparado a partir de la solución tampón 1 reciclada con elevada concentración salina de (d) y la solución tampón 2 exenta de sal, con un tampón mixto de una concentración salina menor que la utilizada en el paso (e), o con la solución tampón 2 sola, y
- (h)
- el eluido se recoge como una tercera fracción que contiene lipoproteína.
7. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 6, caracterizado porque la sal es sulfato
amónico.
8. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 7, caracterizado porque la concentración de
sulfato amónico utilizada en el paso (a) asciende a 0,7 a 1 mol/l,
la concentración de sulfato amónico utilizada en el paso (e) a 0,3 a
0,1 mol/l y la concentración de sulfato amónico utilizada en el paso
(g) a < 0,1 a 0 mol/l.
9. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la concentración
de sulfato amónico utilizada en el paso (e) asciende a 0,4 a 0,1
mol/l y la concentración de sulfato amónico utilizada en el paso (g)
a 0 a < 0,1mol/l.
10. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 7, caracterizado porque la concentración de
sulfato amónico utilizada en el paso (a) asciende a 0,9 mol/l y la
concentración de sulfato amónico utilizada en el paso (e) a 0,3
mol/l y en el paso (g) se utiliza la solución tampón 2 con una
concentración de sulfato amónico de 0 mol/l.
11. Procedimiento de reciclado conforme a la
reivindicación 1, caracterizado porque la solución de partida
y la fase de cromatografía hidrófoba se ajusta al principio del
fraccionamiento a la elevada concentración salina de la solución
tampón 1.
12. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque como
material de partida se utiliza un plasma o suero de origen humano o
animal.
13. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque como
material de partida se utiliza un plasma del que se han separado los
factores de coagulación del complejo PPSB (factores II, VII, IX y
X).
14. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque como
material de partida se utiliza un plasma del que se ha separado el
factor de coagulación VIII.
15. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque como
material de partida se utiliza plasma humano polivalente.
16. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque como
material de partida se utiliza un plasma humano seleccionado con
elevados títulos de anticuerpos contra antígenos virales,
bacterianos o celulares.
17. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque como fase
de cromatografía hidrófoba se utilizan copolímeros fenil- o
alquil-substituidos de metacrilato de glicidilo y
dimetacrilato de etilenglicol, copolímeros de poliestireno y
divinilbenceno o geles de sílice recubiertos con dextrano o
polímeros.
18. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque como fase
de cromatografía hidrófoba se utilizan copolímeros
fenil-substituidos de metacrilato de glicidilo y
dimetacrilato de etilenglicol.
19. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque la fase de
cromatografía hidrófoba se trata conforme a un correspondiente ciclo
con lejía de sosa de un recipiente de aprovisionamiento 3.
20. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la primera
fracción obtenida se procesa subsiguientemente para obtener
antitrombina-III, transferrina y/o albúmina de alta
pureza terapéuticamente aplicables.
21. Procedimiento de reciclado conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la segunda
fracción obtenida se procesa subsiguientemente para obtener IgG de
alta pureza terapéuticamente aplicable.
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