JP6219947B2 - トランスジェニック第vii因子を精製するための方法 - Google Patents
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Description
(a)TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有する供給源生物材料を、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaに特異的なリガンドと、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaがリガンドに結合することを可能にする条件下で接触させる工程と、
(b)前記リガンドとの相互作用を非破壊的な形で分断することによって、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを回収する工程と
を含む、親和性クロマトグラフィーの工程を含む方法である。
(a)上記で定義されたリガンドが固定化されたクロマトグラフィー樹脂に、組換え生成されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有するトランスジェニック雌ウサギ由来のミルクを、リガンドがTgFVIIおよび/またはTgFVIIaに結合することを可能にする条件下で充填する工程と、
(b1)未結合の材料を洗浄する工程と、
(b2)TgFVIIおよび/またはTgFVIIaよりも弱いリガンドとの親和性を有する夾雑物を洗浄する工程と、
(b3)樹脂からTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを溶出させる工程と
をさらに含む。
本発明の精製方法は、特に、トランスジェニック第VII因子(TgFVII)および/またはトランスジェニック活性化第VII因子(TgFVIIa)に対する特異的親和性を示すリガンドの使用に依拠する。
本発明の方法は、本明細書では「供給源生物材料」と呼ばれる様々な生物学的起源から得られるトランスジェニックFVIIおよび/またはFVIIaを精製するのに特に有用である。
本発明は、トランスジェニックFVIIおよび/またはFVIIaを精製するための方法を提供する。そのような方法は、特に、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有する供給源生物材料を、TgFVIIおよびTgFVIIaと高度に特異的であるリガンドと接触させることを含む。
ミルクの初期の処理としてのミルク清澄化は、場合により特許出願WO2007/138198またはWO2008/099077に記載のような手順によって実施されるが、本発明を適用する前のミルク処理に制限はない。例えば、プロセスの第1工程が流動床親和性捕捉により実施される場合、場合により清澄化を迂回してもよい。場合により、乳業において利用可能な任意の技術による脂肪デカンテーションまたはスキム分離を、精製の前に実施してもよい。本発明のある実施形態においては、ミルクをクエン酸バッファーと混合して、ミルクの安定化された乳漿のような相を迅速に取得した後、遠心分離またはデカンテーション、次いで、深層濾過などの液相分離により脂肪分離を得る。本発明のある実施形態においては、好ましくは深層濾過は、低剪断応力、非酸化技術、および急速なバイオバーデン減少およびミルク採取に由来する関連不純物のサイズ保持の組合せにより、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaの完全な生物活性分子を調製するために有利に実施される。そのような実施形態においては、深層フィルター相対孔径は、30〜0.1μmの範囲であり、深層濾過は、好ましくは、連続的な25〜0.5μmの濾過、次いで、0.5μm〜0.1μmの濾過により実行される。セルロースに基づく深層フィルターは、顆粒状アジュバントまたは他のフィルター補助化合物を用いて、または用いずに、この工程に良好に適合される。本発明のある実施形態においては、クエン酸塩濃度およびプロセス温度は、0.15Mから飽和までのクエン酸塩および15℃〜30℃、好ましくは、0.2M〜0.5Mのクエン酸塩および22℃〜27℃の範囲である。クエン酸塩および温度のこれらの組合せは、ミクロンオーダー未満にミルクタンパク質のサイズ集団を維持し、透明な乳漿様相溶液を得るために必要である。「透明な」とは、本発明のプロセスにおける清澄化されたミルクが、500NTU(正規化濁度単位)未満の制御された濁度または1000AU(相対吸収単位)未満のλ400ナノメートルで分光光度計上で読み取られた光密度を示すことを意味する。
リガンド
供給源生物材料からTgFVII/TgFVIIaを精製するための本発明の方法は、トランスジェニックFVII/FVIIaに特異的であるリガンド上での親和性クロマトグラフィーによる分離の少なくとも1つの工程を含む。
フレームワーク1ドメインについて、
GGSVQTGGSLRLSCEISGLTFD (配列番号1)
GGSVQTGGSLRLSCAVSGFSFS (配列番号2)
GGSEQGGGSLRLSCAISGYTYG (配列番号3)
GGSVQPGGSLTLSCTVSGATYS (配列番号4)
GGSVQAGGSLRLSCTGSGFPYS (配列番号5)
GGSVQAGGSLRLSCVAGFGTS (配列番号6)
GGSVQAGGSLRLSCVSFSPSS (配列番号7);
フレームワーク4ドメインについて、
WGQGTQVTVSS (配列番号8)
WGQGTLVTVSS (配列番号9)
WGQGAQVTVSS (配列番号10)
WGQGTQVTASS (配列番号11)
RGQGTQVTVSL (配列番号12)および/または、
CDR3ドメインについて、
ALQPGGYCGYGX----------CL (配列番号13)
VSLMDRISQH------------GC (配列番号14)
VPAHLGPGAILDLKKY------KY (配列番号15)
FCYSTAGDGGSGE---------MY (配列番号16)
ELSGGSCELPLLF---------DY (配列番号17)
DWKYWTCGAQTGGYF-------GQ (配列番号18)
RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY (配列番号19)
QKKDRTRWAEPREW--------NN (配列番号20)
GSRFSSPVGSTSRLES-SDY---NY (配列番号21)
ADPSIYYSILXIEY--------KY (配列番号22)
DSPCYMPTMPAPPIRDSFGW---DD (配列番号23)
TSSFYWYCTTAPY---------NV (配列番号24)
TEIEWYGCNLRTTF--------TR (配列番号25)
NQLAGGWYLDPNYWLSVGAY---AI (配列番号26)
RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY (配列番号27)
DGWTRKEGGIGLPWSVQCEDGYNY (配列番号28)
DSYPCHLL--------------DV (配列番号29)
VEYPIADMCS------------RY (配列番号30)
から選択することができるアミノ酸配列を含む。
CH2ドメインについて、
APELLGGPTVFIFPPKPKDVLSITLTP (配列番号31)
APELPGGPSVFVFPTKPKDVLSISGRP (配列番号32)
APELPGGPSVFVFPPKPKDVLSISGRP (配列番号33)
APELLGGPSVFIFPPKPKDVLSISGRP (配列番号34)
CH3ドメインについて、
GQTREPQVYTLA (配列番号35)
GQTREPQVYTLAPXRLEL (配列番号36)
GQPREPQVYTLPPSRDEL (配列番号37)
GQPREPQVYTLPPSREEM (配列番号38)
GQPREPQVYTLPPSQEEM (配列番号39)
から選択されるアミノ酸配列を含むCH2およびCH3ドメインを含む。
GTNEVCKCPKCP (配列番号40)または、
EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP (配列番号41)
である。
トランスジェニックFVII/FVIIaを含有する供給源生物材料を場合により前処理(例えば、清澄化または濾過工程)した後、上記リガンドを含む親和性支持体上に充填する。
本発明のある実施形態においては、第1の洗浄工程は、充填された溶液中に含まれる未結合の材料を溶出させるために行われる。前記第1の洗浄は、好ましくは、2〜9の範囲のpHを有する洗浄バッファーを用いて実施される。いくつかの実施形態においては、第1の洗浄バッファーのpHは、親和性樹脂への適用時に、3〜10、3〜7、5〜9、6.5〜8.5または6.5〜10.0の範囲である。いくつかの興味深い実施形態においては、第1の洗浄バッファーのpHは、4.0〜7.0、7.0〜9.0、または4.5〜8.5の範囲である。
本発明のある実施形態においては、第2の洗浄バッファーは、TgFVIIまたはTgFVIIaよりも弱い親和性を有するが、樹脂上に結合した夾雑物を除去するために、TgFVII/TgFVIIaの溶出の前に有利に適用される。ある実施形態においては、第2の洗浄バッファーは、エーテルジオール化合物および少なくとも1つの可溶性塩を含有する。
洗浄工程の後、親和性カラムのリガンド上に結合したTgFVII/TgFVIIaを、溶出バッファーを用いて溶出させ、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaの精製された溶液を溶出液として採取する。ヒトFVIIまたはFVIIaの脱離は、好ましくは、抗原結合リガンドが最早ヒトFVIIまたはFVIIaに結合しないように物理化学的条件を変化させることによって達成される。溶出は、pH、塩、温度または任意の他の好適な尺度に関する条件を変化させることによって達成することができる。
本発明によれば、親和性精製された材料を透析濾過または希釈してイオン強度を低下させた後、さらに精製することができる。本発明のある実施形態においては、5〜50kDa、好ましくは10〜30kDaの範囲のカットオフを有する限外濾過膜が用いられる。バッファー交換により、イオン強度は、1〜50mM、好ましくは5〜15mMの範囲の、ナトリウム塩を含有する、本発明のある実施形態においては、クエン酸三ナトリウムを含有するバッファーに減少する。
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のプロセスは、TgFVIIおよびTgFVIIaをさらに精製するための少なくとも1つのイオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含む。
事前精製された材料を、最初に同じ伝導範囲で平衡化し、使用時に同じ塩で平衡化された陰イオン支持体に吸着させる。
本発明のある実施形態においては、第1の洗浄は、塩濃度、特に、塩化ナトリウム塩濃度を、50〜175mM、より好ましくは、130〜160mMの範囲に増加させることにより適用される。この洗浄を、勾配または工程により適用することができる。本発明のある実施形態においては、この洗浄は、ミルク内因性トランスフェリンの特異的溶出を示すが、同時に、イミダゾールバッファーの存在下で、TgFVII/TgFVIIaはイオンゲル上に留まり、他のタンパク質と複合体化した微量のトランスジェニックFVIIもまた吸着されたままである。
本発明の実施形態において、TgFVII/TgFVIIaは、塩濃度、特に、塩化ナトリウム塩濃度を、0〜75mM、より好ましくは、40〜60mMの範囲に減少させ、同時に、2〜9mM、より好ましくは、5〜8mMの範囲の非常に低濃度のカルシウム塩を導入することにより、陰イオン交換体から溶出される。カルシウムと、FVII分子などのglaドメイン含有タンパク質との特異的相互作用が長い間にわたって研究されてきた。FVII分子におけるコンフォメーション変化は、低い伝導性での溶出を可能にする全体的な電荷の変化をもたらす。本発明のある実施形態においては、イミダゾールの存在下では、他のタンパク質と複合体化した微量のTgFVIIは吸着されたままである。トリス-ヒドロキシメチルアミノメタンまたはクエン酸三ナトリウムのような他の塩は、遊離TgFVIIおよび/または他のタンパク質と複合体化したTgFVIIとの同時溶出を示す。
本発明のある実施形態においては、陰イオン交換クロマトグラフィーから採取され、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有する溶出液を、有利には、ヒドロキシアパタイトゲル[Ca10(PO4)6(OH)2]上での偽親和性クロマトグラフィーによりさらに精製する。
最終的な微量のRMPは、質量分析または特異的ELISAによってのみ同定することができる。最終的な研磨工程の前に、RMPは50〜500ppmの範囲であり、最も好ましくは、300ppm以下である。
本発明の方法はまた、少なくとも1つのウイルス不活化/除去専用工程を含んでもよいが、最も好ましくは、少なくとも2つの直交ウイルス不活化/除去専用工程を含む必要がある。清澄化されたミルクを、溶媒を用いる化学的処理および/もしくは界面活性剤処理または他の型の効率的処理によりウイルス不活化することができる。本発明のある実施形態においては、溶媒/界面活性剤は、特に、Tween(登録商標)80(1%〜1.5%w/v)とTnBP(トリ-n-ブチルホスフェート0.3%〜0.5%v/v)との混合物の存在下で、エンベロープウイルスを不活化するために用いられる。限定されるものではないが、Octoxynol100またはTriton X114またはコール酸ナトリウムまたはTween(登録商標)20のような他の非イオン性界面活性剤は、Tween(登録商標)80と置き換えるか、またはそれを補完することができる。
一度、精製されたTgFVIIおよびTgFVIIaを含有する最後の溶出液が回収されたら、前記溶出液を、0.22μmのフィルター上での濾過工程に提出し、容器中に充填した後、凍結/乾燥することができる。
特異的抗FVII/FVIIaリガンドの調製
ラマを、高純度ヒトFVIIa抗原で免疫した。2回目の追加免疫の後、100倍を超える力価の増加が観察され、ヒトFVIIa/FVII抗原に対する特異的富化を示していた。ラマからRNAを採取し、VHH発現ライブラリーを作成した。ヒトFVIIaに結合する能力を有するラマVHHの発現について、クローンをELISAで試験した。23個のVHHクローンを選択し、それらが血漿由来ヒトFVIIおよびFVIIaおよび組換えウサギFVIIに結合する能力についてさらに試験した。全てのクローンが、ヒトFVIIおよびFVIIaに結合することができることが見出され、組換えウサギFVIIに対する架橋は観察されなかった。クローンを、FVII/FVIIaに関するその結合および溶出能力について、ならびに酸性pHでのその結合特性の安定性についてさらに試験した。選択された候補をBAC酵母発現系中に再クローニングし、対応するリガンドを発現させた後、マトリックス1mlあたり2.5mgのリガンド密度でNHS-Sepharose上にカップリングさせた。
ミルクからのTgFVIIaの精製
本実施例は、150リットルのウサギミルクからの高度に精製された活性化TgFVII溶液の調製を記載する。
ミルクの複合出発プールは、1Lのボトルに一緒に充填され、生物学的安全性対照(バイオバーデン、内毒素および内因性ウイルス)のために試料化され、次いで、長時間保存(<-20℃で数ヶ月間)のために非常に低い温度(<-60℃)で保存、凍結された、6つの毎日採取されたミルクのミニプールの完全な泌乳サイクルにあった。ミルクを、ミルキングの自然のサイクルに対応する4日目から24日目まで採取した。
ミルクを含有する凍結したボトルを、32〜37℃に維持された大きい解凍タンクに入れた。各ボトル中に最後の氷片を得るために、解凍時間は約1時間であった。147.4kgの解凍された供給源材料(SM)を、500Lの混合系バッグに移し、プールした。0.315Mのクエン酸三ナトリウムバッファーを添加して、20〜40g/Lの範囲のタンパク質濃度を得た。混合物の温度を24〜26℃に調整した。混合系を停止させて、希釈し、クエン酸化されたSMの上層中の脂肪のデカンテーションを可能にした。
ポリソルベート80およびトリ-n-ブチルホスフェートの溶液の添加を、材料の清澄化された供給源(CSM)に対して行って、0.8〜1.5%w/vの界面活性剤および0.2〜0.5%v/vの溶媒を含有する509.8kgの溶液を得た。温度を25±2℃に調整し、そのような条件で少なくとも2時間の接触時間を維持して、生物源中の任意の潜在的な非エンベロープウイルスを不活化した。また、ミルクに由来する微量の残留脂質またはトリグリセリドを、界面活性剤および溶媒の添加により化学的に溶解させ、溶液をさらなるクロマトグラフィー工程にとってより好適なものにした。
カラムを50mMトリスバッファー、pH7.5で平衡化した後、タンパク質を含有する溶液を220L/hで充填した。6リットルの親和性ゲルは、処理されたミルクプールから全てのTgFVIIを吸着させるのに十分に大きいものであった。充填後、第1の洗浄をトリスバッファーを用いて行った。安定な基準への回復を保証するためには、90リットルが必要であった。非特異的相互作用により結合したタンパク質は、この大きい洗浄の間に除去された。
代替手段として、保存することができる中間生成物を、限外濾過技術を用いて製造した。親和性S/D処理された溶出液を、Novasep社からの1回使用のTangenX Sius-LS(登録商標)の30kDaのポリエーテルスルホン膜上で濃縮および安定化した。再循環ポンプ速度の調整により、濃縮段階中に膜貫通圧力を20psigに維持した。2g/Lのタンパク質濃度が得られた場合、クエン酸バッファー中で透析濾過を行って、親水性化合物、塩および化学的溶媒を除去した。
2638ユニットの比活性を有する10.4Lの濃縮された中間体を、1mgずつ、1Lの容器中、層流フード下でSartobran(登録商標)0.45/0.2μmカプセルを用いて無菌濾過した。
TgFVII/TgFVIIa生成物の臨床および医薬としてのヒトでの使用のためには、さらなる精製が必要であった。最初に、潜在的なウイルス量を減少させるために、中間体を濾過トレインを通して濾過した:
・Sartorius社からの0.2/0.1μmのSartopore 2(登録商標)使い捨てカプセル
・ASAHI KASEI社からの1sq.mのPlanova(登録商標)20、次いで、1sq.mのPlanova(登録商標)15
TgFVIIの純度および活性化は、イオン交換クロマトグラフィーおよびカルシウム依存的溶出によって増強された。ナノ濾過された溶液を、pH7.0の10mMクエン酸ナトリウムで予め平衡化させたQ-Sepharose XL陰イオン交換体(GE Healthcare社)上に充填した。
保存の間に、いくらかのFVII切断、特に、重鎖上での切断が起こる可能性があるが、軽鎖はカルシウムイオンによって保護される。ヒドロキシアパタイトおよびリン酸カルシウム吸着剤は、FVII/FVIIaなどの凝固因子、より広くは、Gla-ドメインを含有するタンパク質を吸着することが周知である。この偽親和性を、プロセスの研磨工程のために用いた。
単量体TgFVII/TgFVIIaの安定化を、プロセスの最後の研磨工程によって行った。SECにより、リン酸カリウムの除去ならびに少なくともポリソルベート80およびアルギニンへの製剤化が可能になった。
最終的なTgFVII/TgFVIIa溶液を、5mMクエン酸ナトリウム、114mMアルギニンHCl、46mMイソロイシン、16mMグリシン、6.5mMリシン、0.07%(v/v)Tween 80、pH6.0を含む製剤化バッファー1Lあたり1gのTgFVIIaの濃度で製剤化した。
次いで、5243mLの製剤化され、安定化されたTgFVII/TgFVIIa溶液を、0.2μmのMillipak 100膜上で無菌濾過した。
進行中の分析結果
実施例2に記載の精製プロセス中に生成された試料を分析した。
8つのバッチに関する各工程のFVIIの収率、次いで、FVIIアミド分解アッセイまたは吸光度を、Table 1(表1)およびTable 2(表2)にまとめる。
試験したバッチに関する平均RMPクリアランスを決定し、図2に示す(RMPクリアランス)。
- FVII/FVIIaに特異的であるリガンド上での親和性クロマトグラフィー
- Q Sepharose XLクロマトグラフィー、および
- Superdex 200クロマトグラフィー
であった。
また、ウサギDNAクリアランスを、Q-PCR技術により異なるプロセス中間体中のその含量をアッセイすることによって評価した。対応する結果を、図3に示す(DNAクリアランス)。結果を、ミルク中でのELISAによって、および他の中間体についてはOD280によってアッセイされたTgFVII/TgFVIIa濃度に関してppbで表す。
上記に開示されたように、TgFVIIはプロセス中にTgFVIIaに活性化し、活性化は主としてQ Sepharose XLクロマトグラフィーを用いた場合に増強する。以下のTable 5(表5)に詳述されるように、プロセスの終わりに、抗原単位による凝固単位の比によって定義される活性化比は、17〜25であった。
本実施例のために、ヒドロキシアパタイト(CHT)溶出液画分を3.9g/LのTgFVIIaに濃縮し、RP-HPLCの結果を、Table 7(表7)に示されるSECの結果と比較してTable 6(表6)にまとめた。
高度に精製されたTgFVIIa調製物の品質
4.1 精製溶液中の残留RMPの定量
したがって、より古典的なクロマトグラフィー技術(イオン交換、ヒドロキシアパタイト偽親和性およびサイズ排除)と組み合わせた、ラマ抗体から誘導されるFVII-高特異性リガンドの使用により、ミルクからのTgFVII/TgFVIIaの精製を最適化する、より特には、RMPを可能な限り除去することが可能になった。
したがって、記載のプロセスは、4ppb未満の標的残留DNAを達成する。
ウサギはその循環中に内因性第VII因子を有し、血流からミルク中への血清タンパク質のいくらかの受動的漏出が存在するため、精製プロセスがウサギFVIIについてヒトを分離する能力を評価した。精製された生成物中のそのような潜在的な付随タンパク質の存在の調査のために、特異的ELISAを社内で開発した。結果は、LLOQ未満(分析した全調製物について45pg/ml未満)であった。
TgFVIIa特異的リガンド上で親和性クロマトグラフィーの工程を実施した後のエンベロープウイルス(MLV、マウス白血病ウイルス)に関するウイルスクリアランス試験
マウス白血病ウイルス(MLV)の特徴を、以下のTable(表9)に記載する。
5.1.1. 感染価滴定の原理
滴定方法は、ウイルス力価測定が、特定の細胞変性効果の観察による、感染細胞中でのウイルス生成の検出に基づくものである、定量アッセイである。
・試験試料を、96穴プレートにわたって連続3倍希釈(それぞれの希釈率について8回の反復を行う)により培養培地で希釈する(「試料希釈プレート」)。
・次いで、「試料希釈プレート」からの各ウェルを、新しい96穴プレートの対応するウェル上に接種する(「試料滴定プレート」)。
・倒立光学顕微鏡下での観察により、感染後に病巣を有するウェルを計数する。
・または染色オーバーレイ(クリスタルバイオレット1p-ガラクトシダーゼ)を添加し、ウェルを細胞変性効果について検査する。感染ウェルは透明な領域として見えるが、非感染ウェルは染色される(もしくはウイルスに応じてその逆)。
*陰性対照
各滴定アッセイの間に、細胞を細胞参照対照として調製する。これらの細胞を、それらがスパイクされていない培養培地に接種されることを除いて、予備アッセイ中に作成された試料の滴定に用いられたものと同じ条件で調製する(それぞれの96穴プレート中4〜8ウェル)。
各滴定アッセイの間に、約103〜105TCID50/mLのウイルス参照対照を、予備アッセイ中に作成された試料の滴定に用いられたものと同じ条件で滴定する。
滴定アッセイは、
・各滴定プレートのための細胞参照対照が予想された結果と一致する場合
・得られたウイルス参照対照の感染価が予想された範囲内にある場合
に保持および検証される。
ウイルス力価を、Schwartz D.、1993 (Schwartz D.、「Methodes statistiques a l'usage des medecins et des biologistes」、Flammarion Medecine-Sciences、第4版、1993); Kaplan M.およびKoprowski H.、「Laboratory techniques in rabies、第3版、World Health Organization(編)、Geneva、1973に従って決定する。
プロセスにおいて実行される工程は以下の通りである:
- 清澄化された供給源材料の解凍;
- 1%のエンベロープウイルスMLVを用いる解凍され清澄化された供給源材料の感染;
- 0.2μmのフィルターを用いる事前濾過;
- FVII選択カラムへの充填;
- カラムの洗浄;
- 溶出。
ウイルスクリアランスを、事前濾過の工程の後(ロード2と命名された試料)および親和性FVII選択クロマトグラフィー上での溶出の後(溶出液と命名された試料)の解凍および清澄化された供給源材料の試料中で測定した。結果を、Table 10(表11)に示す。
TgFVIIa特異的リガンド上で親和性クロマトグラフィーの工程を実施した後の非エンベロープウイルス(PPV、ブタパルボウイルス)のウイルスクリアランス試験
ブタパルボウイルス(PPV)の特徴を、以下のTable(表12)に記載する。
プロセスにおいて実施される工程は、以下の通りである:
- 清澄化された供給源材料の解凍;
- 1%の非エンベロープウイルスPPVを用いる解凍され、清澄化された供給源材料の感染;
- 0.65/0.45μmおよび0.45/0.2μmのフィルターを用いる事前濾過;
- 溶媒/界面活性剤処理(1時間);
- FVII選択カラムへの充填;
- 洗浄;
- 溶出。
ウイルスクリアランスを、事前濾過および溶媒/界面活性剤処理の工程後(初期ロードと命名された試料)ならびに親和性FVII選択クロマトグラフィー上での溶出の後(溶出液Aと命名された試料)の解凍および清澄化された供給源材料の試料中で測定した。結果を、図5にヒストグラム形態の下で示す。
サイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200調製等級の工程を実施した後のエンベロープウイルス(MLV)および非エンベロープウイルス(PPV)に関するウイルスクリアランス試験
7.1 実験プロトコール
プロセスにおいて実施される工程は、以下の通りである:
- 臨床バッチからサンプリングされた出発材料[セラミックヒドロキシアパタイト-1(CHT-1)溶出液]の解凍;
- 1%のスパイク (1%のMLVまたは1%のPPV)を用いる出発材料の感染;
- 0.2μm(MLV)フィルターまたは0.1μm(PPV)フィルターを用いる事前濾過;
- S200カラム上への2.3%カラム容量(CV)の充填;
- S200溶出液(FVIIに対応する画分)の採取。
ウイルスクリアランスを、0.2μmフィルター(MLVウイルスのため)または0.1μmフィルター(PPVウイルスのため)上での事前濾過工程の後(ロード2と命名された試料)、およびサイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200上での溶出後(溶出液と命名された試料)のCHT-1溶出液の試料中で測定した。結果を、Table 13(表15)に示す。
- ウイルスクリアランスの高い減少率は、親和性FVII選択クロマトグラフィーを用いた場合に得られ、それはエンベロープウイルス(MLV)については4.37log10より優れており、非エンベロープウイルス(PPV)については3.8log10に等しい;
- ウイルスクリアランスの減少率中央値は、サイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200を用いた場合に得られ、それはエンベロープウイルス(MLV)および非エンベロープウイルス(PPV)については3.0log10に等しい;親和性FVII選択クロマトグラフィーは、エンベロープおよび非エンベロープウイルスのウイルス力価を減少させることについて、サイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200よりも効率的である。
いくつかの技術を実施した後のエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスのためのウイルスクリアランス試験
8.1 実験プロトコール
FVII選択親和性クロマトグラフィー、ナノ濾過およびQ Sepharose XLウイルス検証試験を、それぞれの精製単位操作および対象の画分中のスパイクされたウイルスの滴定のために出発材料中の1%スパイクの様々なウイルスを用いて別々に実施した(FVIIであったものは回収される)。それぞれの精製単位操作について得られたLog10減少率を、それぞれのウイルスについて加え、全体的な減少率をウイルスごとに見積もった。
結果を、Table 14(表16)に与える。
- プロセスにおけるFVII選択クロマトグラフィー工程およびナノ濾過およびQ Sepharose XLイオン交換クロマトグラフィー工程の実施は、9.3log10までのウイルス減少の増加をもたらし、PPVウイルスモデルについて18.5log10よりも高いか、またはそれと等しい非エンベロープウイルスに関する全体的減少率をもたらす、
- プロセスにおけるFVII選択クロマトグラフィー工程およびナノ濾過およびQ Sepharose XLイオン交換クロマトグラフィー工程の実施は、10.5log10までのウイルス減少の増加をもたらし、MLVウイルスモデルについて16.5log10と等しいエンベロープウイルスに関する全体的減少率をもたらす
ことを示している。
Claims (20)
- トラスジェニック非ヒト動物のミルクにおいて生成されたヒトトランスジェニック第VII因子(TgFVII)および/またはヒトトランスジェニック活性化第VII因子(TgFVIIa)を精製するための方法であって、
以下の工程:
(a)(i)ヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaを含有する前記ミルクを、ヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaに特異的であるリガンドと、ヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaがリガンドに結合することを可能にする条件下で接触させる工程と、
(ii)前記リガンドとの相互作用を非破壊的な形で分断することによって、ヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaを回収する工程と
を含む、親和性クロマトグラフィーの工程であって、
前記リガンドが、ポリペプチド軽鎖を含まない、少なくとも1つのヒトTgFVIIまたはヒトTgFVIIaエピトープに対する抗原結合タンパク質である、工程、
(b)ヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaがイオン交換体上に保持される条件下で、イオン交換体上で、溶出されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaをクロマトグラフィー精製する工程、
(c)ヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaが偽親和性樹脂上に保持される条件下で、偽親和性樹脂上で、溶出されたヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaをクロマトグラフィー分離する工程、
(d)サイズ排除支持体上で、溶出されたヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaをクロマトグラフィー分離する工程
を含む、方法。 - 前記リガンドが、2つの完全な抗原結合部位を形成する2つのポリペプチド重鎖を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記リガンドが、ラクダ科動物の免疫グロブリン重鎖から誘導される、請求項1に記載の方法。
- 工程(ii)が、リガンドからヒトTgFVIIまたはヒトTgFVIIaを溶出させる前に未結合の材料を除去するための少なくとも1つの洗浄工程を含み、さらに場合により、弱く結合した材料を除去するための第2の洗浄工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 動物が哺乳動物の雌である、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物の雌が、ウサギの雌である、請求項5に記載の方法。
- 工程(a)の前に、ミルクを採取し、清澄化する予備工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ミルク清澄化工程が、クエン酸塩の添加、その後の濾過により実施される、請求項7に記載の方法。
- 工程(b)のイオン交換体が、陰イオン交換体である、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)の偽親和性樹脂が、ヒドロキシアパタイトである、請求項1に記載の方法。
- ウイルスを除去および/または不活化する少なくとも1つの工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ウイルスを除去および/または不活化する工程が、ナノ濾過および/または溶媒/界面活性剤処理により実施される、請求項11に記載の方法。
- 精製されたヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaを製剤化、滅菌および凍結乾燥する最終工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 親和性クロマトグラフィーの工程が、
(a)請求項1から3のいずれか一項に規定のリガンドが固定化されたクロマトグラフィー樹脂に、組換え生成されたヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaを含有するトランスジェニック雌ウサギ由来のミルクを、リガンドがヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaに結合することを可能にする条件下で充填する工程と、
(b1)未結合の材料を洗浄する工程と、
(b2)弱く結合した材料を洗浄する工程と、
(b3)樹脂からヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaを溶出させる工程と
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記親和性クロマトグラフィー工程中に、弱く結合した材料を除去するための前記第2の洗浄工程が、10%〜50%の疎水性薬剤を含み、そのイオン強度が200〜600mMの範囲であるバッファーを用いて実施される、請求項4に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィー工程中に、樹脂からヒトTgFVIIおよび/またはヒトTgFVIIaを溶出させるための前記溶出工程が、20%〜70%の疎水性薬剤を含み、そのイオン強度が500〜2500mMの範囲であるバッファーを用いて実施される、請求項4に記載の方法。
- 得られる精製されたヒトトランスジェニックFVIIが、分解、タンパク質分解または酸化された形態を低い割合しか含まない、ほぼ完全に活性化された高純度ヒトFVIIである、請求項1に記載の方法。
- 親和性クロマトグラフィー工程および/またはイオン交換クロマトグラフィー工程および/またはサイズ排除クロマトグラフィー工程が、3log10より優れたウイルス減少率を得ることを可能にすることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ウイルス減少率が、4log10より優れている、請求項18に記載の方法。
- ウイルス減少率が、5log10より優れている、請求項19に記載の方法。
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