NO870124L - Fremstilling av monomert igg. - Google Patents

Description

FREMSTILLING AV MONOMERT IgG

1. Området for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for behandling av normalt eller hyperimmunt humant gammaglobulin (IgG), f.eks. det produkt som oppnås fra Cohn Fraction II eller andre egnede materialer, hvorved aggregert og monomert IgG separeres til å frembringe et produkt hovedsakelig bestående av monomert IgG som kan tilføres ved intravenøs injeksjon. Oppfinnelsen vedrører ytterligere forskjellige metoder for fjernelse av forurensende proteiner inklusive IgA, IgM, plasminogen, plasmin, faktor XII, prekallikreinaktivator (PKA), kallikrein og andre kallikreinliknende esterase-aktiviteter.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å komme videre med å overvinne visse ulemper forbundet med hittil tilgjengelige IgG preparater. Det er funnet at fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse tillater fjernelse av aggregerte og dimere former fra monomere former av immunoglobulin, som vanligvis alle er tilstede i IgG. rike fraksjoner som f.eks. Cohn Fraction II, og følgelig reduserer såkalt antikomplementær aktivitet (ACA) og videre tillater vesentlig fjernelse av andre forurensende proteiner, særlig dem som kan føre til utvikling av kininer.

2. Bakgrunn for oppfinnelsen

Humant blodserum eller plasma er rikt på immunoglobulin G (IgG) rettet mot antigener fra forskjellige kilder med et området av forskjellige egenskaper. F.eks. vil invadering av virale eller bakterielle mikroorganismer og den resulterende utsetning av individer for spesifikke immunogener vanligvis resultere i fremstilling av spesifikke antistoffer av IgG klassen ved hjelp av B celle-lymfosytter. Disse antistoffer styrer effektivt den ytterligere formering av mikroorganism- en, i konjunksjon med makrofager og plasmaproteiner av kom-plementsystemet, og prosessen er kjent som humoral immunitet.

Evnen til et individ til å reise et humoralt respons mot et spesifikt immunogen varierer i grad og med arten av immuno-genet. Humoral immunitet er på sitt svakeste mellom den 6. og 24. levemåned og fortsetter å utvikle seg over de første 20 års levetid. Noen mennesker har en dårlig evne til å fremstille IgG og har følgelig en sviktende immunitet. Disse betingelser kan være arvelige, f.eks. infantil X-kromosom-tilknyttet hypogammaglobulinaemia (Bruton's sykdom) eller kan være ervervet og viser seg vanligvis som et selektivt eller partielt antistoff-defisiens-syndrom. Slike personer lider vanligvis fra forskjellige, ofte flere ganger forekommende infeksjoner og tilføres når det er mulig IgG fremstilt fra en porsjon av en normal givers blod. Passiv immunisering med IgG har også blitt en viktig mulighet ved behandling og prevensjon av smittsomme sykdommer, spesielt de tilfeller med infeksjon av bakterier som er resistente mot antibiotisk behandling og mer nylig ved behandling av idiopatisk trombocytopenisk purpura. Følgelig er behovet for et preparat av humant IgG veletablert og bevist.

Etter den kliniske innføring av IgG preparater (dvs. gamma-globulinkonsentrater) av Stokes et al. i 1944 (Stokes, J., Maris, E.P. og Gellis, S.S., J.Clin.Invest. (1944) 23 531) har det vært gjort mange forsøk på å fremstille et preparat som kunne tilføres intravenøst uten å bevirke bivirkninger. På grunn av de vanskeligheter som er nevnt i det følgende, ble imidlertid forholdet med intramuskulaer injeksjon av Cohn II fraksjonert IgG, anvendt av Bruton i 1952 (Bruton, O.C. Pediatrics (1952) 9 72-727) ved behandling av agammaglobulin-aemia, standard praksis i mange år og er faktum bare nylig blitt avlegs i USA. Den intramuskulære tilførsel har et antall vesentlige ulemper sammenliknet med den intravenøse tilførsel. F.eks. er injeksjonsvolumet begrenset og er spesielt problematisk i barn med en liten muskelmasse, absorpsjonen fra injeksjonsstedet er forholdsvis sakte, en større andel av immunoglobulinet nedbrytes ved proteolyse ved injeksjonsstedet og plamanivåer er følgelig variable og lite forutsigbare og injeksjonen er smertefull.

Fra de ulemper som er skisert i det foregående, er det klart at den intravenøse tilførselsmåte for IgG er den tilførsels-måte som velges. En viktig ekstra fordel er at det kan gjøres mer effektiv bruk av IgG. F.eks. er den dose av anti D IgG som kreves for å nøytralisere D rhesus positive celler tilveiebragt fra fosteret under svangerskap flere ganger mindre når den tilføres intravenøst enn når den tilføres intramuskulaert . Som det allerede er nevnt kunne imidlertid de tidligere preparater av IgG ikke tilføres intravenøst på grunn av de bivirkninger som de medførte (Janeway C.A. et al., New Engl.J.Med. (1968) 278 919). De fleste av de preparater som idag anvendes er fremdeles ikke uten uønskede virkninger og tilføres følgelig vanligvis meget sakte i en fortynnet form, spesielt i pasienter med antistoff-defisiens-syndromer som er mer sensitive for de skadelige egenskaper av IgG preparater enn deres normale motstykker.

Skadelige reaksjoner mot de tidlige gammaglobulinkonsentråt-er var alvorlige og resulterte i en sjokkreaksjon ofte be-virket ved hjelp av hypotensiv sirkulasjonssvikt. Mange av den annen generasjons IgG konsentrater, dvs. dem som var modifisert for intravenøs injeksjon, bevirker fremdeles reaksjoner som nausea, oppkast, pyreksia, rigor, ryggsmerter, brystkassekonstriksjon, rødme og hypotensjon, spesielt i utsatte pasienter som f.eks. dem som lider av agammaglobulin-aemia. De anafylaktoide og anafylaktiske reaksjoner er til-skrevet den antikomplementære aktivitet (ACA) av aggregert IgG, som finnes i variable mengder i IgG preparater, som aggregert IgG og ble vist å innaktivere komplement, dvs. å aktivere komplementkaskaden, på en liknende måte som anti-gen-antistoffkomplekser (Ishizaka, T. , Ishizaka, K. & Boros, T., J.Immunol. (1961) 87 433).

Aktivering av komplementkaskaden utvikler blant annet anafyl-atoksiner som har dilatorvirkninger på blodkar og som øker permeabiliteten av kapillarer. En ukontrollert aktivering kunne derfor føre til hypotensjon og sirkulasjonskollaps.

De komplement-fikserende steder er blitt vist å være lokali-sert i Fc fragmentet av IgG molekylet (Taranta, A. & Franklin, E.C., Science (1961) 134 1981) og dette har deretter ført til produkter hvor Fc delen av IgG fjernes enzymatisk (se det følgende). Det er også vist at to Fc fragmenter må bringes i apposisjon for fiksering av komplement (Isliker, H., Jacot-Guillarmod, H. & Jalon, J.C., Ergebn.Physiol. (1965) 56 67). Denne"ikke spesifikke aktivering" av Fc regionen synes å være resultatet av skade på IgG under ekstraksjonen men mekanismen er ikke ennå forstått. IgG kan undergå en konformasjonell endring som fører til utsettelse for tidligere kryptiske steder som så kan være i stand til å bindes til og aktivere Fc reseptorsteder på celler og vev. Det følger at metoder for fremstilling av IgG må unngå prosesser som kunne føre til aktivering av IgG og vektleggerønskeligheten av å ha IgG i den monomere form.

Klinisk bevis for at aggregates bevirker eller er særlig ansvarlige for skadelige reaksjoner mangler fremdeles. Denne utilfredsstillende situasjon tilskrives mangel på egnede farmakologiske modeller for detektering og kvantitering av faktorer som er ansvarlige for skadelige reaksjoner. Det har hittil vært vanskelig under standardiserte kliniske betingelser å undersøke alle de faktorer som kunne danne grunnlag for skadelige reaksjoner på grunn av mekanismene for de skadelige virkninger er lite forstått og de nåværende intra-venøse IgG preparater er så heterogene.

Mulighetene for at produsenter kan fremstille IgG preparater sikre for intravenøs tilførsel har vært hindret av denne ufullstendige kjennskap til mekanismene for de skadelige reaksjoner. Den heterogene karakter av produktene til de forskjellige produsenter har også bidratt til kontroversen på dette området. Det er derfor ikke overraskende at det i patentlitteraturen og den vitenskapelige litteratur forelig-ger et stort antall metoder for rensing av IgG. Noen av de mere velkjente metoder er drøftet kort i det følgende. (a) Fraksjonering av IgG: Flere metoder er kjent for fraksjonering av IgG fra utgangsmaterialer av human eller animalsk opprinnelse som f.eks. blodplasma, blodserum, plasenta og andre fluider. F.eks. fraksjonering med alkoholer ved en lav temperatur (Cohn, E.j. et al., J.Am.Chem.Soc. (1946) 69 459-475; Onclkey, J.L., Melin. M.(Richert, D.A., Cameron, J.W. og Gross, Jr., P.M., J.Am.Chem.Soc. (1949) 71 541; Kistler, P. og Nitschmann, H., Vox Sang. (1962) 7 414-424); fraksjonering med Rivanol (handelsbetegnelse for akrinol)- ammoniumsulfat, (Horejisi, J. og Smetana, R., Acta Medica Scandinavica

(1956) 155 65-70) og ionebyttingskromatografering (Hope,

H. et al., Munchen Medizinische Wochenschrift (1967) 34 1749-1752 ) .

Videre viser Canadisk patentskrift 1.137.413 at ved modifisering av disse metoder ved å gjennomføre frak-sjoneringene i nærvær av i det minste en vannoppløselig basisk nitrogenholdig organisk forbindelse med dissosia-sjonskonstant på 7 eller mindre, eller et syresalt av denne, kan et produkt med høyere monomerinnhold oppnås.

(b) Fjernelse av IgG aggregater: Ultrasentrifugering kan frembringe et produkt med lav ACA som tåles godt intra-venøst (Barundan, S. et al., Vox Sang. (1962) 7 157-174), men preparativ ultrasentrifugering er et upraktisk forslag. Fjernelse av IgG aggregater har også vært for-søkt ved adsorpsjon ved hjelp av aktivert trekull (Steinbuch, M., Vox Sang. (1967) 13 103), med stivelse, med silikater (Tysk Offenlegungsschrift 26 68 334) såvel som ved utfelling med polyetylenglykoler (Tysk Offen-

legungsschrift 27 51 717) (jevnført Polson, A. et al. Vox Sang (1972)23 107-118; Scheider, W. et al. Vox Sang. (1976) 31 141-151). Noen av disse metoder tillater fullstendig fjernelse av den antikomplementære aktivitet. (c) Enzymatisk nedbrytning: Enzymatisk spaltning av IgG med pepsin (Schultze, H.E. og Schwick, G., Dtsch. Med.Wschr.

(1967) 87 1643) har vært anvendt for fremstilling av et

kommersielt preparat fritt for ACA. F.eks. beskriver Fransk patentskrift 2.382.000 et slikt produkt. Denne metode nedsetter effektivt ACA uten å redusere antistoff innholdene . Fc-fragmentet blir imidlertid fullstendig ødelagt slik at vevsbindingsevnen for IgG molekylene fjernes. Dette trekk, og tapet av små fragmenter i urinen (Barandun et al. supra) svarer for den sterkt reduserte halveringstid for dette preparat i kroppen (Koblet, H., Diggelmann, H., Barandun, S. og Gerber, H. Bibl.Haemat.(Basel) (1965) 23 1102). Videre er et slikt preparat med Fc fragmentet fjernet ikke i stand til å passere plasentabarrieren.

Behandling av IgG med humant plasmin kan resultere i dets spaltning i tre komponenter med 50.000 molekylvekt og et produkt som er fritt for ACA (Sqouris, J.T., Vox Sang. (1967) 13 71). Når tilstrekkelig lave nivåer av plasmin anvendes, blir bare 15% av molekylene spaltet, med 85% tilbake som inntakt gammaglobulin (Sqouris, supra). Det intakte gammaglobulin som er tilbake uopp-sluttet viser liten antikomplementær aktivitet og har vært tilført intravenøst uten skadelige reaksjoner (Hinman, J. et al., Vox Sang. (1967) 13 85). Det således fremstilte material synes å bibeholde in vitro og in vivo beskyttende aktivitet (Fitzpatrick, F.K., Vox Sang. (1967) 13 85). En ulempe ved dette forslag er at plasminet ikke kan fullstendig fjernes. Således fortsetter nedbrytning selv når materialet lagres ved 4°C. Et plasminbehandlet IgG preparat er beskrevet i Tysk Offenlegungsschrift 27 52 694.

Barandun, S. et al (supra) viste at inkubasjon av gammaglobulin ved pH 4,0 ved 37°C reduserer den antikomplementære aktivitet. F.eks. eliminerte inkubasjon i 24 timer denne aktivtet fullstendig. Det er foreslått at dette resultat kan tilskrives aktiviteten av en liten mengde serumenzym tilstede som en forurensning i gamma-globulinet (Blatrix, C., et al., Presse Med. (1969) 77 635-637). Som med det plasminbehandlede gammaglobulin er dette "pH 4,0 gammaglobulin" funnet å gjenvinne sin antikomplementære aktivitet før tilførsel til en pasient

(malgrad, J. et al., Rev . Fr ane . Tr ans . (1979) 13 .173.

Både plasminbehandlet gammaglobulin og pH 4,0 gammaglobulin har kortere halveringstider in vivo enn umodifisert gammaglobulin, f.eks. 14-16 døgn sammenlignet med 20 døgn for umodifisert IgG (Koblet, H. et al., Vox

Sang. (1967) 13 93; Merler, E. et al., Vox Sang. (1967)

13 103). (d) Kjemisk modifisering: Et antall metoder er tilgjengelig fra litteraturen og har funnet kommersiell anvendelse som vist i de følgende eksempler: i) Blokkering av koplementreseptorene av Fc segmentet av IgG med p -propiolakton (Stephan, W., Vox Sang.

(1975) 28 422-437). De således oppnådde produkter fiks-erer ikke lenger noe komplement og består av monomerer i en grad av 90%. Den biologiske halveringstid er imidlertid redusert til 4 til 12 døgn (Europeisk patentan-søkning 13.910; Barandun, S. et al., Monograph. Allergy,

(1975) 9 39-60 Karger, Basel).

ii) Reduksjon og sulfonering av disulfidbroene i IgG molekylet reduserer i sterk grad den antikomplementære

aktivitet (Yamanaka, T. et Al., Vox Sang. (1979) 37 14-20; ytterligere beskrevet i Canadisk patentskrift 1.128.418 og US patentskrift 4.168.303).

iii) Delvis reduksjon og alkylering (Schroder, D.D. et al., Vox Sang. (1981) 40 383-394 og ytterligere beskrevet i US patentskrift 3.903.262) eller amidering (Tysk Of fenlegungsschrift 24 42 655) frembringer et mindre reaktivt preparat.

Endringer i molekylstrukturen, tap av enkelte viktige fysiologiske funksjoner og tilsynekomst av nye antigene determinanter i IgG molekylet kan imidlertid ikke ute-lukkes ved hjelp av disse kjemiske inngrep. (d) Ionebytter-kromatografiske metoder: Preparative metoder for immunoglobulin G (IgG) fra humant plasma og serum basert på ionebytter-kromatografering er veletablert (Baumstark, et al., Archiv.Biochem. & Biophys. (1964) 108 514-522; Webb, A.J., Vox Sang. (1972) 23 279-290). Bruken av DEAE cellulose for å fjerne uønskede komponenter som IgG aggregater og andre uønskede proteiner fra Cohn Fraction II til å gi et produkt med lav ACA er beskrevet (Habeeb, A.F.S.A., et al., Vox Sang. (1977) 32 143-158; US patentskrift 4.312.949) og likeledes bruken av DEAE Sephadex A-50 (patentansøkning PCT/US83/01016) som er påstått å være nyttig for fjernelse av protrom-bin-kompleksproteiner. Rensing av hyperimmunt IgG som Rho (D) og antitetanus immunoglobulin ved hjelp av ionebytting (DEAE Sephadex) er også beskrevet (Hoppe, et al., Vox Sang. (1973) 25 308-316; Friesan, et al., J. Appl.Biochem. (1981) 3 164-175) og ionebytter-kromatografering har også vært anvendt ved rensing av sulfonert monomert IgG (Canadisk patent 1.128.418).

Kationbyttere som karboksymetylcellulose er beskrevet for den delvise separasjon av IgG aggregater fra monomerer (Australsk patentansøkning AU A91328/82).

Kombinert ionebytting (DEAE Sepharose Fast Flow) og affinitetskromatografering (Arginine-Sepharose 4B og Benzamidine-Sepharose 6B) er rapportert å fjerne aggregater, fragmenter og PKA fra IgG konsentrater, ved lavt mg innhold (Berglof, J.H. og Eriksson, S. 18. Cong.Int. Soc.Blood Transfusion Munchen 1984).

Et mulig og særlig ønskelig trekk ved ionebyttingskromatografering er dens evne til å fjerne eller redusere innholdene av forurensende hepatitt B overflate-antigen som f .eks. når IgG bindes på og preferert elueres fra DEAE Sephadex eller QAE Sephadex, som beskrevet i Australsk patentansøkning AU Al 7277/83.

Der er også noen velkjente ulemper ved tradisjonell ionebytter-kromatografering. F.eks. lider metoder som avhenger av at monomert IgG binder til ionebyttermate-rialet og deretter elueres preferert, av den begrensede bindingsevne for materialet og den generelle langsomhet av prosessen. Ofte kombineres ionebytter-kromatografering med et Si02absorpsjonstrinn for å absorbere lipidsubstanser og proenzymer men dette bidrar til vesentlige tap av IgG (20%). En annen ulempe er at kromatografering selv kan medføre IgG aggregering. F.eks. omhandler patentansøkning PCT/US83/01016 inklu-sjon av forskjellige hovedsakelig ikke-overflateaktive stabiliseringsmidler for IgG for å overvinne denne tendens når IgG renses ved hjelp av ionebytterharpikser.

Strømningstakter på tradisjonelle iondebyttermedier har typisk ikke oversteget 25-30 cm/h lineær strømnings-hastighet selv om agarosegeler med forbedret fornetting har vært anvendt med strømningstakter på 120 cm/h. Disse konvensjonelle ionebytterharpikser kan videre fremvise andre ulemper som begrenser deres brukbarhet for den hurtige høyoppløsende separering av biopoly-merer, inklusive immunoglobulinpreparater, som 1. dårlig mekanisk stabilitet, 2. harpiksdeformasjon som skyldes valg av elueringsbetingelser, strømningstakt, temperatur etc., 3. polydispersitet av harpikspartiklene både med hensyn til partikkeldiameterfordelinger og porestørrelsesfor-delinger, 4. lave belastningskapasiteter under dynamiske betingelser , 5. vanskeligheter med regenerering av harpiksen etter bruk på grunn av mekaniske, fysikalske eller kjemiske endringer i partikkelegenskapene, 6. lav separering per tidsenhet med høye lineære strøm-nings hastigheter, 7. problemer forbundet med begrensning av valg av

elueringsmiddelsammensetning nødvendig for å oppnå den optimale separering ved en spesiell gjennomstrømning.

8. vesentlige tap av biologisk aktivitet som skyldes

det lange oppholds- og separeringstider som kan være nødvendig på grunn av den lave grad av soneutvikling, dvs. de lavere lineære strømningstaktigheter som er mulig.

Som tidligere skisert er det et formål for den foreliggende oppfinnelse å unngå de ulemper som er forbundet med disse kjente metoder og produkter, og å tilveiebringe en fremgangsmåte for separering av immunoglobulin G-holdige frak sjoner slik at det tilveiebringes et produkt bestående hovedsakelig av monomert IgG.

I henhold til et første aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det en fremgangsmåte for rensing av et IgG holdig material som omfatter trinnene med (i) fraksjonering av et immunoglobulin G-holdig material på en mikropartikkelformet, sterk anionbytterharpiks med meso-og makro-porøse overflater, og (ii) utvinning av en renset IgG fraksjon fra harpiksen ved hjelp av eluering.

Med hensyn til dette aspekt omfatter oppfinnelsen også rensede IgG som oppnås ved hjelp av den ovenfor beskrevne metode .

Den mikropartikkelformede anionbytterharpiks kan f.eks. ta nominelle partikkeldiametere på 3, 5, 10, 30 og 90^um, med snever partikkeldiameterfordeling og snever porestørrelses-fordeling, basert på porøsitet på > 10 nM. Slike anionbyttere er beskrevet av Ugelstad, J., Mork, P.C., Berge, A., Ellingsen, T. og Kahn, A.A. i Emulsion Polymerization, utgitt av I. Piirma, pp. 383-413, Academic Press, New York, 1983. Foretrukket er anionbytterharpiksen basert på det material som er tilgjengelig under handelsbetegnelsen Monobeads (Pharmacia Fine Chemicals), som f.eks. Mono Q harpikser.

Bruken av sterke anionbytterekarakterisert vedpartikkel-størrelse og porøsitet som generelt beskrevet i det foregående er funnet å muliggjøre fjernelse av aggregater av gammaglobulin, antikomplementær aktivitet, prekallikrein aktivatoraktivitet, Factor XII aktivitet, plasmin og plasminogenaktiviteter, IgA og IgM fra IgG holdige utgangsmaterialer som f.eks. Cohn Fraction II pasta eller pulver. Denne prosess bidrar derfor til fremstilling av et intravenøst tål-bart IgG.

Bruken av mikropartikkelformede kvaternære og tertiære sterke anioniske harpikser som Mono Q harpiksene gir:

1. god mekanisk stabilitet,

2. harpikser som ikke deformeres i særlig grad under elueringsbetingelser, 3. harpiksene viser begrenset spredning med hensyn til partikkelstørrelsesfordeling og porestørrelsefordeling,

4. høye belastningskapasiteter,

5. forholdsvis lett regenerering på grunn av høye lineære strømningshastigheter, god mekanisk stabilitet etc,

6. høy separering per tidsenhet,

7. bruk av en meget lang rekke forskjellige elueringsmid-delblandinger, strømningstakt og temperatur uten ned-settelse av den mekaniske og kjemiske stabilitet av harpiksen og uten skadelig forventet separering og

gjenvinning,

8. økt gjenvinning og nedsatt tap av biologisk aktivitet

på grunn av de korte oppholdstider og separasjonstider.

Andre harpikser med egnede egenskaper for hurtig behandling i stor skala inkluderer silikabaserte harpikser som f.eks. Accell QMA (Diosynth, Oss, Nederland) og Spherosil QMA (Rhone Poulenc, Frankrike) og i en mindre grad de sterkt fornettede agarosebærere som f.eks. Fast Flow Q (Pharmacia, Uppsala, Sverige).

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte som anvender farge-affinitetskromatografering for å fjerne kallikreinliknende esteraseaktivitet fra IgG holdige materialer. Denne fremgangsmåte kan anvendes alene eller i kombinasjon med den ovenfor beskrevne anionbyttermetode.

I henhold til dette aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes det en fremgangsmåte for fjernelse av kallikreinliknende esterase og andre protease-enzym eller protease-zymogenaktivitet fra et IgG holdig material, omfattende trinnene ved å bringe IgG holdige material i kontakt med et proteinbindende fargestoff immobilisert på en makroporøs, mekanisk stabil gelbærer, og utvinning av det rensede, IgG holdige material som er berøvet kallikreinet.

Oppfinnelsen vedrører også renset IgG oppnådd ved hjelp av den ovenfor beskrevne metode.

Foretrukket er det IgG holdige material et IgG rikt material som f.eks. et Cohn Fraction II preparat (som eventuelt på forhånd har vært underkastet det ovenfor beskrevne anion-by tter tr inn ) . Sammenkoblingen av anionbyttertrinnet med fargestoff-affini tetskronratograferingsprosedyren tilveiebringer en fremgangsmåte for hurtig separering av monomert IgG fra slike IgG rike preparater med god separering for å frembringe et IgG preparat egnet for intravenøs injeksjon. Foretrukket gjennomføres fargestoff-affinitetskromatograferingen før anionbytterprosedyren.

Det proteinbindende fargestoff er foretrukket et triazinyl-fargestof, typisk av Procion typen (ICI Australia Operations) eller dets ekvivalent når det fremstilles av andre fabrikan-ter. Også foretrukket er den grunnmasse som anvendes ved fargestoff-affinitetskromatograferingen en halvfast grunnmasse som f.eks. Fractogel (Merck, Darmstadt, Tyskland) eller dets ekvivalent som f.eks. TSK (Toyo, Soda), eller Trisacryl (reactifs I.B.F., Frankrike) eller et liknende material.

Fargestoff-affinitetskromatografering har vært anvendt ved rensing av mange enzymer og proteiner. Generelt har det vært anvendt klortriazinbaserte fargestoffer. Disse har vært kovalent bundet til en rekke forskjellige bærere inklusive agarose, Sephadex, kornet cellulose, metaloksyder, polyakryl-amid, Sephacryl S200, Spheron, glass, mikropartikkelformet silika og agarose-akrylamid (Ultragel) kopolymerer (se Low, C. og Pearson, J., Methods in Enz. 104, del C. 97-113). Klortriazinfargestoffene har også vært anvendt ved rensing eller fjernelse av noen serumproteiner i laboratorieskala-prosedyrer.

Den mest vanlig anvendte fargestoff-grunnmasse har vært Cibacron F3GA (Ciba Geigy) koblet til agarose. Cibacron F3GA grunnmassen har vært anvendt ved fraksjonering av forskjellige plasmaproteiner (Gianuzza, E. og Ainaud, P., Biochem J.

(1982) 201 129-136), ved fjernelse av serumalbumin og lipo-proteiner fra andre serumproteiner (Travis, J., og Pannell, R., Clin.Chim.Acta. (1973) 49 49) ved rensing av komplement-proteiner (Gee, A., et al., J.Tmm.Meths. (1979) 30 19) og ved rensinger av CX 2 makroglobulin (Virca, G., et al., Anal. Bioch. (1978) 89 274). Blått dekstran (Cibacron Blue F3GA koblet til dekstran) har vært anvendt ved rensing av serum-lipoproteiner, (Wille, L., Clin.Chim.Acta. (1976) 71 35) ved isolering av Factor X (Viccan, L. og Tishkoff, G., Biochim. Biophys.Acta (1976) 434 199), og ved separering av levrings-faktorer II, VII, IX og X (Swart, A. og Hemker, H., Biochim. Biophys.Acta. (1970) 222 692). Procion Red (ICI Australia) koblet til agarose har vært anvendt for ekstraksjon av plasminogen fra serum (Harris, N. og Byfield, P., FEBS Ltrs.

(1979) 103 162) .

Ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er andre triazinfargestoffer som f.eks. fargestoffer av Procion serien (ICI Australia Operations), som ikke tidligere har vært anvendt, blitt koblet til mekanisk stabile gel-grunnmasser egnet for separasjoner i stor skala/industriell prosessskala, som f.eks. Fractogel og Trisacryl og anvendt for å fjerne kallikrein-liknende aktivitet fra gammaglobulin-oppløsninger. Fractogel består av hydrofile vinylpolymerer og Trisacryl er en kopolymer av en akrylmonomer og en bifunk-sjonell hydrofil monomer. Fordeler ved disse bærere inkluderer :

i høy mekanisk stabilitet,

ii generelt lav ikke-spesifikk binding av protein til gel-grunnmassen,

iii høy bindingskapasitet for fargestoff (vanligvis vil 1 ml Fractogel eller trisacryl binde 10 mg av et Procion-fargestoff fra MX serien mens 1 mL av agarose binder 1-3 mg fargestoff (Lowe, C, og Pearson, J. Methods in Enz. 104 del C 97-113).

iv motstand mot nedbrytning av mikroorganismer.

Forskjellige Procion fargestoffer knyttet til Fractogel er blitt påvist å binde kallikrein-liknende aktivitet i gammaglobulin-preparater. Eksempler på fargestoffer egnet for høyaffinitetsbinding av kallikrein-liknende aktivitet fra IgG preparater er Navy HER, Navy HERD, Red HE3B, Red MX5B, Red MX8B, Scariet MX GR og Yellow MX GR.

Fargestoff-affinitetskromatografering som anvendt ved denne oppfinnelse tilbyr flere fordeler fremfor bruk av immobili-serte substrater som benzamidin for fjernelse av kallikrein-aktivitet. Disse inkluderer større proteinbindende kapasi-teter, en lavere pris, generell tilgjengelighet, lett kobling til grunnmassematerialer, motstand overfor bakteriell og enzymatisk nedbrytning og lav giftighet. Dette gjør farge-stof f-af f initetskromatograf ering ideell for proteinrensing i stor skala.

Etanol er en hovedkomponent av Cohn Fraction II pasta (25%). Følgelig kan etanolkonsentrasjonene i utgangsmaterialet være betraktelige. Konsentrasjoner på opptil 10% etanol er blitt vist å ha liten eller ingen virkning på separering av komponenter beskrevet ovenfor både ved ionebytter- og fargestoff-affinitetskromatograferinger .

Ved et typisk eksempel på ionebytterprosedyren i samsvar med oppfinnelsen, ekvilibreres Mono Q harpiks i 20 rnM Tris Cl pH 8,0 (Buffer A), 60 mM NaCl. Gammaglobulinoppløsningen fremstilt fra Cohn Fraction II pasta eller pulver fylles på kolonnen og elueres fra kolonnen i Buffer A 60 mM NaCl til å frembringe en gammaglobulinoppløsning fritt for aggregater, med et redusert innhold av dimert gammaglobulin, lav antikomplementær aktivitet og ingen påvisbar PgA, IgM, PKA, Factor XII, plasmin eller plasminogenaktiviteter. Dette oppnås med høy gjenvinning av gammaglobulin. Denne metode er illustrert i eksemplene 1 og 3.

En typisk prosedyre med fargestoff-affinitetskromatografering i henhold til oppfinnelsen anvender Procion-fargestoffet som Yellow MX GR koblet til Fractogel TSK-HW 55 (F) eller TSK-HW 65 (F). Denne fargestoff-affinitetskolonne ekvilibreres i Buffer A, 60 mM NaCl. Gammaglobulinoppløsningen fremstilt fra Cohn Fraction II pasta eller former fylles på kolonnen og elueres fra kolonnen i Buffer A, 60 mM NaCl, for å frembringe en gammaglobulinoppløsning med redusert kallikrein-aktivitet. Typisk sees en reduksjon på mellom 95 og 70% av kallikrein-liknende aktivitet med en høy utvinning av gammaglobulin. Den resterende aktivitet, kan fjernes ved ione-by tterprosedyren som tidligere er beskrevet og skyldes sannsynligvis nærværet av PKA. Denne metode er illustrert i eksempel 2.

Et preparat av gammaglobulin fritt for aggregater (trimere eller mer) antikomplementær aktivitet, PKA, Factor XII, kallikrein, plasmin og plasminogen, IgA og IgM kan oppnås i samsvar med den foreliggende oppfinnelse ved å kombinere fargestoffaffinitet- og ionebytter-kromatografering. Ved en foretrukket metode anvendes Yellow MX-GR Fractogel og Mono Q harpiks. Ved denne prosedyre ekvilibreres kolonnene i Buffer A 60 mM NaCl. Gammaglobulinoppløsningen føres så gjennom begge kolonner og elueres med Buffer A 60 mM NaCl til å gi gammaglobulin-oppløsning med de ovennevnte egenskaper. Den foretrukne rekkefølge av kromatografering er fargestoff-affinitetskromatografering etterfulgt av ionebytterkromato- grafering, ettersom kromatografering på fargestoff-affini-tetsbæreren kan utvikle lave innhold av aggregat IgG og følgelig øke antikomplementær aktivitet. Denne fjernes ved hjelp av ionebytterprosedyren. Videre kan eventuelt fargestoff som slipper ut fra affinitetskolonnen fjernes ved hjelp av ionebytteren.

Bruk av andre ionebytterharpikser (Accell QMA, Fast Flow Q) er illustrert i eksemplene 5, 6 og 7. Bruken av et ytterligere fargestoff (Red MX5B) som kan anvendes er illustrert i eksemplene 4 og 6. I disse eksempler er fargestoffet blitt koblet med en lavere liganddensitet enn i eksempel 2 og til en annen grunnmasse (Trisacryl GF 2000). Fjernelsen av kallikrein-liknende aktivitet var mindre effektiv i dette eksempel mens utvinningen av IgG var større.

EKSEMPEL 1

Mono Q behandling av Cohn Fraction II pasta

Kromatografering ble gjennomført på et FPLC system fra Pharmacia som besto av en LCC 500 mikroprosessor, en UV1 kontroll og optisk enhet, en REC 482 to kanals grafisk regi-streringsanordning, 2 P500 pumper, et blandekammer, en MV7 motorisert ventil og en 50 ml superkrets. Alle buffere ble fremstilt under anvendelse av vann som var kvartsdestillert og avionisert under anvendelse av en Milli Q system (Milli-pore, Bedford, M.O. USA). Alle buffere var avgasset og filtrert gjennom en 0,45^um membran. Alle bufferfor-bindelser var oppnådd fra Sigma Chemicals Co. St. Lous, Miss., USA. Den anvendte ionebytter var Mono Q HR 16/10 fra Pharmacia.

Mono Q HR 16/10 (20 ml kolonnevolum) ble forbundet til FPLC systemet og ekvilibrert i 20 mM Tris/Cl pH 8,0 (Buffer A) 60 mM NaCl. 10 gram av Cohn Fraction II pasta ble opptatt i 30 ml av Buffer A, 60 mM NaCl og filtrert gjennom en 0,45^um membran. Konsentrasjonen av den filtrerte oppløsning var 65 mg/ml. 17 ml av denne oppløsning ble ført inn på Mono Q HR 16/10 kolonnen med en strømningstakt på 3,0 ml/min. Etter påfyllingen ble strømningstakten sakte økt til 6 ml/min. slik at tilbaketrykket ikke oversteg 3,5 MPa. Ikke tilbakehold protein ble samlet, analysert ved hjelp av HPSEC og assay-bedømt for proteolytiske og antikomplementære aktiviteter. Tabell 1 sammenlikner egenskapene av Cohn Fraction II oppløs-ning før og etter behandlingen gjennom Mono Q.

Fotnoter til tabell 1

1. Aggregatinnhold av IgG i gammaglobulinoppløsninger ble målt ved hjelp av High Performance Size Exclusion Chromatography (HPSEC) på en 600 x 7,5 mm TSK G3000SW kolonne (Toya Soda Manufacturing Co., Japan). Alle kromatografiske data ble samlet under anvendelse av en modell M600A løsningsmiddel-tilførselspumpe, en U6K universal injektor, en modell M450 detektor med varia-bel bølgelengde og en modell 730 Data Module, samtlige fra Waters Assoc. Kromatografering ble gjennomført i 0. 1 M Na fosfat pH 7,0 med en strømningstakt på 1 ml/ min.

2 Antikomplementære aktivitet ble målt ved hjelp av en mikrotiterplate-immun-hemolysemetode basert på metoden i Weir (1978) (Handbook of Experimental Immunology vol. 1, seksjoner 5A3-13, 3. utgave, 1978 Blackwell). En samling av humane AB sera, fri for anti A^antistoff tjente som kilde for komplement og hemolysin og en 1,4% volum/volum suspensjon av saue-røde blodlegemer (gruppe ii) ble anvendt som hemolyseindikatorsystemet. IgG ble inkubert med 4 CH^Qenheter komplement i en time. Resultatene er angitt som komplementenheter "forbrukt" (dvs. ikke lenger tilgjengelige for hemolysereaksjon-en), ved en en times inkubajson med IgG per mg IgG tilstede. 3 PKA. Assaybestemmelsesprosedyren er basert på prose-dyren i Imanari et al., 1974 (Fogerty Int. Center Proe. nr. 27 pp 205-213). Assaybestemmelsen avhenger av evnen til prekallikreinaktivator (PKA) til å omdanne prekallikrein (ekstrahert fra human plasma) til kallikrein, og overvåking av kallikreinaktiviteten ved utvikling av H metanol fra det syntetiske substrat "^H TAME (tosyl arginin metylester). Resultatene er uttrykt på basis av et Bureau of Biologics Reference preparat for en 60 mg IgG/ml oppløsning.

PKA utviklet fra Factor XII nedbrytning ble bestemt ved ført å inkubere IgG prøvene i nærvær av prekallikrein og dekstransulfat (basert til metoden til Tankersley, D.L. et al., Blood (1983) 62 448) og bestemmelse av dekstransulfatavhengig PKA under anvendelse av metoden beskrevet i det foregående. 4 Plasmin og kallikreinaktiviteter ble målt spektrofoto-metrisk (&A405, dvs. paranitroanilinutvikling) under anvendelse av de kromogene substrater.henholdsvis S2251 og S2303 (Kabi Vitrum, Stockholm) og et Cary modell 15 spektrofotometer.

Alle assaybestemmelser ble gjennomført ved 37°C i 50

mM Tris Cl, 50 mM NaCL pH 8,0 (Buffer C) med et reak-sjonsvolum på 200^ul inneholdende 40^ul substrat (1 mM) og 40^ul prøve. Reaksjoner ble stanset ved tilsetning 800 ^,ul 2% edikksyre. Plasminogenaktivi-teten ble bestemt ved forhåndsinkubering av prøvene i nærvær av 250 enheter per ml streptokinase i 30 minut-ter ved 37°C og etterfølgende bestemmelse av strepto-kinaseavhengig plasminaktivitet.

EKSEMPEL 2

Yellow MX GR - Fractogel behandling av Cohn Fraction II pasta

Yellow MX GR, et diklortriazinfargestoff (i det følgende benevnt fargestoff), oppnådd fra ICI Australia ble koblet til Fractogelbæreren som følger: 10 g fuktig vekt gel ble supendert i 30 ml vann hvortil ble tilsatt 0,15 g fargestoff oppløst i 10 ml vann. 4 ml %M NaCl ble tilsatt og blandingen ble inkubert ved romtemperatur under omrysting i 1 time. 0,125 ml 5M NaOH ble tilsatt og inkubasjon ble fortsatt med omrysting ved 30°C i 2 timer. Etter denne koblingsprosedyre ble fargestoff-Fractogelbæreren vasket med 2-5 volum 6M urea, 0,5 M NaOH og deretter grundig vasket med vann.

En Yellow MX GR-Fractogelkolonne på 7 ml volum ble fremstilt i en HR 10/10 kolonne fra Pharmacia. Denne var forbundet til FPLC systemet beskrevet i eksempel 1 og ekvilibrert i 20 mM Tris/Cl pH 8,0 (Buffer A) 60 mM CaCl. 2 gram pasta ble opptatt i 6 ml Buffer A, 60 mM NaCl og filtrering gjennom en 0,45^um membran. Konsentrasjonen av den filtrerte opp-løsning var 50 mg/ml. 3,5 ml av denne oppløsning ble fylt på fargestoffkolonnen med en strømningstakt på 1,0 ml/min. Strømningstakten ble økt til 2,0 ml/min. etter påfylling slik at tilbaketrykket ikke oversteg 0,7 MPa (7 kg/cm2 ). Ikke tilbakeholdt protein ble oppsamlet. Den ikke-tilbakeholdte proteinoppløsning inneholdt 87% av det totalt tilførte protein. Denne oppløsning ble analysert ved hjelp av HPSEC og assaybestemt for antikomplementære og proteolytiske enzymaktiviteter. Tabell 2 sammenlikner egenskapene av Cohn Fraction II oppløsning med fargestoffkolonnebehandlet Cohn Fraction II.

For forklaring av parameterne se fotnotene til tabell 1.

EKSEMPEL 3

Mono Q, Yellow MX GR - Fractogel behandling av Cohn Fraction II pasta

Kolonnene med Mono Q HR 16/10, det Yellow MX GR Fractogelkolonne (7 ml fargestoff - Fractogel, fylt i en Pharmacia HR 10/10 kolonne) ble forbundet i serie slik at prøven ble ført inn på Mono Q kolonnen og ikke-tilbakeholdt protein passerte direkte inn på fargestoff-Fractogelkolonnen. Kolonnene ble ekvilibrert i 20 mM Tris/Cl pH 8,0 (Buffer A), 60 mM NaCl. 10 g Cohn Fli pasta ble opptatt i en 30 ml Buffer A, 60 mM NaCl og filtrering gjennom en 0,45^,um membran. Konsentrasjonen av den filtrerte oppløsning var 65 mg/ml. 12 ml av denne oppløsning ble fylt inn på kolonnen. Den initiale strømningstakt var 2 ml/min men ble nedsatt til 0,5 ml/min under påfyllingen for å holde tilbaketrykket under 3,5 MPa. Strømningstakten bleøket tilbake til 2 ml/min ettersom tilbaketrykket falt etter påfylling. Ikke-tilbakeholdt protein ble samlet. Den ikke-tilbakeholdte proteinoppløsning inneholdt 70% av totalt tilført protein. Denne oppløsning ble analysert ved hjelp av HPSEC og assaybestemt for antikomplementære og proteolytiske enzymaktiviteter. Tabell 3 sammenlikner egenskapene av Cohn Fraction II oppløsning med Mono Q-fargestoffbehandlet Cohn Fil.

For forklaring av parameterne se fotnite til tabell 1.

I de etterfølgende eksempler ble utgangsmaterialet fremstilt ved å blande Cohn Fraction II pasta med 20 mM Tris/Cl~, 60 mM NaCl, pH 8,0 buffer i et forhold på 1:4 til å gi en ende-lig proteinkonsentrasjon på 54 mg/mL. Alle harpikser ble fylt inn i 10 ml kolonner og forhåndsekvilibrert i 20 mM Tris Cl", 60 mM NaCl pH 8,0.

EKSEMPEL 4

Red MX5B - Trisakrylbehandling av Cohn Fraction II oppløsning

Red MX5B ble koblet til trisakryl GF 2000 ved hjelp av metoden beskrevet i eksempel 2 med unntagelse av av forholdet mellom 10 g fuktig gel og 0,05 g av fargestoffet ble anvendt i dette eksempel. 10 ml av Cohn Fraction II oppløsning ble fylt inn på kolonnen med en takt på 1 ml/min. Den ikke-tilbakeholdte topp ble samlet og inneholdt 95% av det totalt tilførte protein. Noen av egenskapene av utgangs- og Red MX5B trisakryl-behandlede materialer ble sammenliknet i tabell 4.

EKSEMPEL 5

Accell QMA behandling av Cohn FII oppløsning

4,3 ml av Cohn FII oppløsning ble fylt inn på en Accell QMA kolonne med en strømningstakt på 2 ml/min. Den ikke-tilbakeholdte topp ble samlet og inneholdt 95% av tilført totalt protein. Noen av egenskapene av utgangs- og Accell QMA-behandlede materialer er sammenliknet i tabell 4.

EKSEMPEL 6

Kombinert Red MX5B - Trisacryl, Accell QMA behandling 10 ml av den ikke-tilbakeholdte topp fra eksempel 4 ble fylt inn på en Accell QMA kolonne med 2 ml/min. Gjenvinning fra de kombinerte trinn ble beregnet å være 87%. Noen av egenskapene av utgangs- og fargestoff-Accell QMA-behandlede materialer er sammenliknet i tabell 4.

EKSEMPEL 7

Fast Flow Q behandling av Cohn FII oppløsning

5 mL av Cohn FII oppløsning ble fylt inn på en Fast Flow Q kolonne med 1 mL/min. Den ikke-tilbakeholdte topp ble samlet og inneholdt 84% av det totale protein. Noen av egenskapene av utgangs- og Fast Flow Q-behandlede materialer er sammenliknet i tabell 4.

EKSEMPEL 8

1 kg Cohn Fraction II pasta ble oppløst i 1,5 L 20 mM Tris/ Cl", 60 mM NaCl pH 8,0 buffer og filtert. Filtratet ble

behandlet gjennom en 300 mL Yellow MX Gr Fractogel kolonne og en HR 16/10 Mono Q kolonne i flere porsjoner. Kolonneeluat-ene ble samlet og surgjort og etanol ble fjernet og protein-konsentrasjonen innstilt til 6% vekt/volum ved diafiltrering. Oppløsningen ble deretter sterilfiltrert og analysert for IgG subklasse og IgA innhold.

Som det kan sees fra tabell 5 var alle klasser av IgG til stede i preparatet i akseptable konsentrasjoner. Videre innehold oppløsningen mengder av IgA under deteksjonsnivået for to av de tre forskjellige kommersielle testsett for IgA (tabell 6). Grunnene for de klart avvikende verdier mellom de tre forskjellige sett som ble sett i duplikat-assaybestem-meler, er imidlertid ikke kjent på dette stadium.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte for rensing av et IgG holdig material, karakterisert ved at den omfatter trinnene med: (i) fraksjonering av et immunoglobulin G-holdig material på en mikropartikkelformet, sterk anion-bytterharpiks med meso og makro-porøse overflater, og (ii) utvinning av en renset IgG fraksjon fra den nevnte harpiks ved eluering.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at harpiksen er en mikro-partikkelf ormet kvaternaer eller tertiær sterk anionbytter harpiks.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at harpiksen har nominelle partikkeldiametere på 3, 5, 10, 30 og 90^ um, med snever partikkeldiameter-fordeling og snever porestørrelsesfordel-ing, basert på porøsitet på > 10 nM.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-3, karakterisert ved at det immunoglobulin G-holdige material er Cohn Fraction II pasta eller pulver.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-4, karakterisert ved at anionbytterharpiksen er Mono Q harpiks.

6. Renset IgG fraksjon fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i krav 1 til 5.

7. Fremgangsmåte for fjernelse av kallikrein-liknende esterase og annen protease-enzym eller protease-zymogen aktivitet fra et IgG holdig material, karakterisert ved trinnene med: (i) det IgG holdige material bringes i kontakt med et proteinbindende fargestoff immobilisert på en macro-porøs, mekanisk stabil gelbærer, og (ii) det IgG holdige material som er berøvet enzym og zymogen-aktivitet gjenvinnes.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at det IgG holdige material er en renset IgG fraksjon fremstilt ved hjelp av metoden som angitt i krav 1 til 5.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at det IgG holdige material er Cohn Fraction II pasta eller pulver.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at det IgG holdige material som er gjort fattig på enzym-og zymogen-aktivitet renses videre ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i krav 1 til 5.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 7 - 10, karakterisert ved at det proteinbindende fargestoff er et triazinylproteinbindende fargestoff.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11, karakterisert ved at triazinylfargestoffet er et fargestoff av Procion typen.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at fargestoffet velges fra gruppen bestående av Navy HER, Navy HERD, Red HE 3B, Red MX 58, Red MX 8B, Scharlet MX GR og Yellow MX GR.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 7-13, karakterisert ved at gelbæreren er en halvfast eller fast grunnmasse.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved at grunnmassen er sammen-satt av Fractogel og dets ekvivalente eller trisakrylmate-rial.

16. Et IgG holdig material som er gjort fattig på kallikrein, plasmin og plasminogen, karakterisert ved at det er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i krav 7 til 15.