KR20140129015A - 형질전환 인자 ⅶ 의 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형질전환 공급원으로부터 재조합 인간 활성화 인자 VII 을 정제하는데 특히 유용한 항-인자 VII 친화성 리간드에 관한 것이다. 다른 직교 크로마토그래피 단계와 조합된 친화성 리간드는 분해 또는 산화된 FVII 형태를 낮은 비율로 포함하는 응집물이 없는 완전히 활성화된 고도로 정제된 FVII 용액의 제조를 가능하게 한다.

Description

형질전환 인자 Ⅶ 의 정제 방법 {METHOD FOR PURIFYING TRANSGENIC FACTOR VII}
본 발명은 형질전환 공급원으로부터 재조합 인간 활성화 인자 VII 을 정제하는데 특히 유용한 항-인자 VII 친화성 리간드에 관한 것이다. 다른 직교 크로마토그래피 단계와 조합된 친화성 리간드는 분해 또는 산화된 FVII 형태를 낮은 비율로 포함하는 응집물이 없는 완전히 활성화된 고도로 정제된 FVII 용액의 제조를 가능하게 한다.
인자 VII (Factor VII: FVII) 은 그것의 활성화 형태 (FVIIa) 에서 칼슘 및 조직 인자의 존재 하에 인자 X 및 인자 IX 를 활성화시키는 응고 과정에 참여하는 비타민 K 의존성 당단백질이다. FVII 은 분자량 약 50 kDa 의 406 잔기의 단일 펩티드 사슬 형태로 분비된다. FVII 은 하기 4 개의 독특한 구조적 도메인: N-말단 감마-카르복실 도메인 (Gla), 2 개의 "표피 성장 인자 (EGF)-유사" 도메인, 및 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. FVII 의 FVIIa 로의 활성화는 Arg152-Ile153 도메인 (아르기닌 152-이소류신 153) 연결의 절단에 의해 특징지어진다. 그러므로, FVIIa 는 분자량 약 20 kDa 의 152 개 아미노산의 경쇄, 및 단일 이황 가교 (Cys135-Cys262) 에 의해 서로 연결된 분자량 약 30 kDa 의 254 개 아미노산의 중쇄를 갖는 화합물이다.
혈장 FVIIa 는 하기 여러 개의 번역후 개질을 함유한다: 첫번째 10 개의 글루탐산은 [감마]-카르복시화되어 있고, Asp63 은 부분적으로 히드록시화되어 있고, Ser52 (세린 52) 및 Ser60 (세린 60) 은 O-글리코실화되어 있으며 각각 글루코오스 (자일로오스)0-2 및 푸코오스 패턴을 함유하고, Asn145 (아스파라긴 145) 및 Asn322 (아스파라긴 322) 는 주로 바이안테너리 바이실릴화 복합체 구조에 의해 N-글리코실화되어 있다.
FVII 은 인자 VIII (A 형 혈우병) 또는 인자 IX (B 형 혈우병) 의 결핍을 보이는 혈우병 환자, 응고 인자의 다른 결핍, 예를 들어, FVII 의 선천성 결핍을 보이는 환자의 치료에 사용된다. 그러므로, 주사가능한 FVIIa 의 농축물이 이용가능한 것이 필수적이다.
FVIIa 농축물을 수득하기 위한 가장 오래된 방법은 혈장 분획화로부터 초래되는 혈장 단백질로부터 FVIIa 를 정제하는 것으로 이루어진다. 그 목적을 위해, EP 0 346 241 은, FVII 및 FVIIa 및 기타 단백질 예컨대 인자 IX (FIX), X (FX) 및 II (FII) 를 함유하는 혈장 단백질의 분획화의 2 차 산물, 특히 PPSB (P=프로트롬빈 또는 FII, P=프로콘버틴 또는 FVII, S=스튜어트 인자 (Stuart Factor) 또는 FX 및 B=항혈우병 인자 B 또는 FIX) 의 예비-용리액의 흡착 및 그 후 용리로 수득되는, FVIIa-풍부 분획의 제조를 기재한다. 이러한 과정의 결점은 수득되는 FVII 이 여전히 미량의 다른 응고 인자를 함유한다는 점이다.
마찬가지로, 문헌 EP 0 547 932 는 비타민-K-의존성 인자 및 FVIII 이 거의 없는 고순도 FVIIa 농축물의 제조 과정을 기재한다. 이러한 과정에 의해 수득되는 FVII 은, 그것의 순도에도 불구하고, 잔류 혈전형성 활성을 보인다.
일반적으로 말하면, 이들 과정의 중대한 결점 중 하나는 그들이 오직 소량의 산물을 산출하는 점이다. 더욱이, 혈장에 존재하는 다른 단백질이 전혀 없는 산물을 수득하는 것은 여전히 곤란하다. 마지막으로, 바이러스 및 세균 안전성을 보장하기 위해 혈장 응고 인자의 제조의 단계마다 다수의 예방책이 시행되고 있지만 (공혈자의 추적연구 (follow-up), 알려진 바이러스 및 세균 오염물의 탐지를 위한 시험, 혈액 매개 병원성 물질의 전파 위험을 가능한 한 감소시키기 위한 엄격한 정제 및 바이러스 불활성화 처리), 그럼에도 불구하고, 병원성 물질 오염의 모든 위험이 배제되지는 않는다. 또한, 새로운 변종 크로이츠펠트-야콥병의 출현은 혈액 제제에 의한 통상적이지 않은 병원성 물질의 전파에 대한 두려움을 불러 일으켰다. 더욱이, 공여자로부터 수집되는 혈장의 부피는 여전히 제한적이다.
그러므로, 1980 년대 이후로, 인간 인자 VII 을 인코딩하는 DNA 가 단리되었고 (Hagen et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, 83(8):2412-6), 다양한 발현 시스템에서 발현되었다.
나아가 재조합 인자 VII 의 다양한 정제 과정이 기재되었다 (예를 들어 WO2009/141418 참고). 현재 재조합 인자 VII 폴리펩티드는 전형적으로, 통상의 수지 상에서의 크로마토그래피 만을 이용하거나, 단백질 리간드를 포함하는 친화성 수지를 이용하는 친화성 크로마토그래피를 포함하는, 1 또는 2 개의 상이한 다단계 과정에 의해 정제된다.
재조합 인자 VII 은 발효 배치로부터, 또는 형질전환 포유동물로부터 생성될 수 있다. 특히 암컷 토끼의 젖샘에서 생성된 FVII 의 조성물이, 예를 들어 특허 출원 WO2007/138199 에 기재되어 있다. 형질전환 포유동물에 의해 젖에서 생성된 FVII 은 그 후 예를 들어 접선 여과 및 크로마토그래피에 의해, 또는 칼슘 침전에 뒤이은 여러 크로마토그래피 단계에 의해 젖으로부터 정제될 수 있다.
그러나 이용가능한 정제 방법에 결점이 없는 것은 아니다. 특히 형질전환 포유동물로부터의 고유의 단백질, 특히 형질전환 포유동물로부터의 선천 인자 VII 이 여전히 존재할 수 있으며, 이는 인간 환자에게 투여시 면역원성을 유발할 것이다.
본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는 친화성 크로마토그래피의 단계를 포함하는, 생물학적 공급원 물질로부터 형질전환 인자 VII (TgFVII) 및/또는 형질전환 활성화 인자 VII (TgFVIIa) 을 정제하는 방법이다:
(a) TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 함유하는 생물학적 공급원 물질과 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 에 특이적인 리간드를, TgFVII 및/또는 TgFVIIa 가 리간드에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 리간드와의 상호작용을 비-파괴적 방식으로 방해함으로써 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 회수하는 단계.
본 발명의 하나의 구현예에서, 리간드는 하나 이상의 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 에피토프, 또는 이의 기능성 절편 또는 유도체에 대한 항원-결합 단백질이다. 바람직하게는, 리간드는 2 개의 완전한 항원 결합 부위를 형성하는 2 개의 폴리펩티드 중쇄를 포함하고, 폴리펩티드 경쇄는 결여되고, 낙타과 (Camelidae) 의 면역글로불린 중쇄로부터 유래한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법의 단계 (b) 는 리간드로부터 TgFVII 또는 TgFVIIa 를 용리하기 전에 미결합된 물질을 제거하기 위한 하나 이상의 세정 단계를 포함하고, 추가로, 수지에 결합되고 TgFVII 또는 TgFVIIa 보다 약한 친화성을 갖는 오염물을 제거하기 위한 제 2 세정 단계를 임의로 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, TgFVII 또는 TgFVIIa 의 정제에 사용되는 생물학적 공급원 물질은 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 생성하는 형질전환 동물로부터 수득된다. 바람직하게는, 동물은 포유동물 암컷, 바람직하게는 토끼 암컷이고, 생물학적 공급원 물질은 젖이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은, 단계 (a) 전에, 젖을 수집하고 정화하는 예비 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 젖 정화 단계는 시트레이트 염 첨가 후, 여과에 의해 수행된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 가 이온 교환기 상에 체류되는 조건 하에서, 이온 교환기 상에서의, 바람직하게는 음이온 교환기 상에서의 용리된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 크로마토그래피 정제의 단계 c) 를 추가로 포함한다. 이러한 단계는 바람직하게는 TgFVII 활성화 및 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 폴리싱 (polishing) 을 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 가 유사-친화성 수지 상에 체류되는 조건 하에서, 유사-친화성 수지 상에서의, 바람직하게는 히드록시아파타이트 상에서의 용리된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 크로마토그래피 분리의 단계 d) 를 추가로 포함한다. 이러한 단계는 바람직하게는 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 폴리싱 및 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 분해의 제어를 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 크기 배제 지지체 상에서의 용리된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 크로마토그래피 분리의 단계 e) 를 추가로 포함한다. 이러한 단계는 바람직하게는 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 폴리싱 및 배합을 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은, 바람직하게는 나노여과에 의한 및/또는 용매/세제 처리에 의한, 바이러스의 제거 및/또는 불활성화의 하나 이상의 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 정제된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 제형화, 멸균 및 동결건조의 최종 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 친화성 크로마토그래피의 단계 동안, 본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(a) 상기 정의된 바와 같은 리간드가 고정화된 크로마토그래피 수지 상에, 리간드가 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에, 재조합적으로 생성된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 함유하는 형질전환 암컷 토끼로부터의 젖을 로딩하는 단계;
(b1) 미결합된 물질을 세정하는 단계;
(b2) TgFVII 및/또는 TgFVIIa 보다 약한 리간드와의 친화성을 갖는 오염물을 세정하는 단계; 및
(b3) 수지로부터 TgFVII 및/또는 FVIIa 를 용리하는 단계.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법의 친화성 크로마토그래피 단계 동안, 약하게 결합된 물질의 제거를 위한 상기 제 2 세정 단계는 소수성제를 10% 내지 50% 포함하고 그의 이온 강도가 200 내지 600 mM 의 범위인 완충제를 이용하여 수행된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법의 친화성 크로마토그래피 단계 동안, 수지로부터 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 용리를 위한 상기 용리 단계는 소수성제를 20% 내지 70% 포함하고 그의 이온 강도가 500 내지 2500 mM 범위인 완충액를 이용하여 수행된다.
본 발명의 추가의 특색 및 이점은 비제한적 예로서 제시된 발명의 구현예의 하기 설명으로부터, 아래 나열된 첨부된 도면을 참고로 하여 명백할 것이다.
도 1 은 폴리펩티드 중쇄를 갖고 경쇄가 없는 낙타과 면역글로불린의 IgG1, IgG2 및 IgG3 형태의 도식을 나타낸다.
도 2 는 본 발명의 방법 동안 RMP 소거율의 도식을 나타낸다. RMP 수준은 과정의 단계의 함수로서 ppm 으로 표시되어 있다.
도 3 은 본 발명의 방법 동안 DNA 소거율의 도식을 나타낸다. DNA 수준은 과정의 단계의 함수로서 ppb 로 표시되어 있다.
도 4 는 정제 과정을 통한 TgFVII 의 활성화를 나타낸다. 라인 1 내지 9 는 각각 하기에 해당한다: 라인 1 및 9: 분자량, 라인 2: 정화된 젖, 라인 3: FVII-선별된 용리액 (본 발명의 리간드 상에서의 친화성 크로마토그래피 후에), 라인 4: 중간 산물 1 (한외여과 및 정용여과 후에), 라인 5: 나노여과액, 라인 6: QSXL 용리액, 라인 7: CHT-I 용리액, 라인 8: SEC 풀 (pool).
도 5 는 예비여과 및 용매/세제 처리의 단계 후의 샘플 (초기 로딩으로 명명된 샘플) 및 Affinity FVII Select 크로마토그래피에서의 용리 후의 샘플 (용리액 A 로 명명된 샘플) 중 바이러스 로딩량 (viral load) 의 막대그래프를 보여준다.
형질전환 인자 VII 또는 인자 VIIa
본 발명의 정제 방법은 형질전환 인자 VII (TgFVII) 및/또는 형질전환 활성화 인자 VII (TgFVIIa) 에 대한 특이적 친화성을 나타내는 리간드의 사용에 특히 의존한다.
본 발명에서 사용되는 형질전환 인자 VII 및 인자 VIIa 의 아미노산 서열은 알려져 있다. 형질전환 인자 VII 의 아미노산 서열은 특히 예컨대 미국 특허 제 4,784,950 호에 공개된, 인간 인자 VII 의 아미노산 서열과 일치한다.
생물학적 공급원 물질
본 발명의 방법은 본원에서 "생물학적 공급원 물질" 로 언급되는, 다양한 생물학적 공급원으로부터 수득되는 형질전환 FVII 및/또는 FVIIa 를 정제하는데 특히 유용하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 생물학적 공급원 물질은 형질전환 FVII 및/또는 FVIIa 를 함유하고, 형질전환 FVII 및/또는 FVIIa 를 생성하도록 변형된 형질전환 동물 (또는 변형된 동물의 자손) 로부터의 체액의 분획화로부터 수득된다. 형질전환 동물은 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 소, 토끼, 염소, 양 등이다. 바람직하게는 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 함유하는 생물학적 공급원 물질은 포유동물 젖의 샘플, 즉 젖에서 형질전환 FVII 및/또는 FVIIa 를 생성하는 형질전환 포유동물 젖의 샘플이다.
형질전환 동물의 젖에서 형질전환 FVII 단백질을 생성하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 형질전환 FVII (이의 아미노산 서열은 인간 FVII 의 아미노산 서열에 해당함) 을 코딩하는 유전자로서, 젖에서 자연적으로 분비되는 단백질의 프로모터에 의해 제어되는 유전자를 함유하는 합성 DNA 분자가 비-인간 포유동물의 배아 내로 전달된다. 그 후 배아는 동일한 종의 암컷 포유동물 내로 도입되고,이 동물은 그 후 형질전환 동물을 낳는다. 대상이 충분히 발달되었을 때, 포유동물의 젖분비가 유도되고, 젖이 수집된다. 그때 젖은 원하는 재조합 단백질을 함유한다. 인간 이외의 암컷 포유동물의 젖에서 형질전환 FVII (TgFVII) 의 제조를 위한 과정의 일례가 EP 0 527 063 에 제공되어 있다. 그러한 특정 구현예에서, WAP 유전자에 대한 프로모터를 함유하는 서열의 도입을 통해 WAP 프로모터를 함유하는 플라스미드가 구축되고, 이러한 플라스미드는 WAP 프로모터에 의존적으로 만들어진 외래 유전자를 수령할 수 있게 하는 방식으로 제작된다. 형질전환 FVII 에 대해 코딩하는 유전자가 편입되고, WAP 프로모터에 의존적으로 만들어진다. 프로모터 및 형질전환 FVII 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드가 사용되어 형질전환 동물, 예컨대 토끼가, 토끼 배아의 수컷 전핵 내로의 미세주입을 통해, 수득된다. 그 후 배아는 호르몬으로 준비된 암컷의 난관에 전달된다.
정제 방법
본 발명은 형질전환 FVII 및/또는 FVIIa 의 정제 방법을 제공한다. 그러한 방법은 특히 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 함유하는 생물학적 공급원 물질을 TgFVII 및 TgFVIIa 에 고도로 특이적인 리간드와 접촉시키는 것을 수반한다.
형질전환 토끼의 젖 내로의 형질전환 FVII 또는 FVIIa (TgFVIIa) 의 생성은 제거되어야 하는 수많은 불순물의 존재를 초래한다. 본 발명의 방법은 특히 형질전환 토끼의 젖으로부터 형질전환 FVII 또는 FVIIa (TgFVIIa) 를 정제하면서, 토끼 젖 단백질 (Rabbit Milk Protein: RMP) 뿐만 아니라 토끼 DNA 및 토끼 혈청 단백질로서 토끼 젖을 오염시킬 수 있는 기타 분자를 포함하는, 동반되는 오염성 분자, 소위 숙주 관련 불순물 (Host Related Impurities: HRI) 을 제거하기 위해 고안되어 있다. 혈류로부터 젖 내로의 수동적 누출로 인해 잔류 혈청 단백질 (예를 들어 알부민, 토끼 FVII, 면역글로불린 및 트랜스페린) 이 젖 공급원 물질 내로 도입될 수 있다.
젖은 실제로 가용성 유장 단백질, 불용성 카세인 미셀 (micelle) 및 젖 지방구의 비-무균 콜로이드성 현탁액에 해당한다. 유방 상피 세포에 의해 합성되고 분비되는 TgFVII 은 가용성 유장 분획에 존재한다. 잠재적 오염성 RMP 는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 카세인; 락트알부민, 락토글로불린 및 락토페린. 단백질의 5 가지 패밀리: 트랜스페린, 카세인, 알부민, 유장 산 단백질 및 면역글로불린 (Ig) - 이 전체 토끼 젖 단백질의 약 90% 를 차지하는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 정제 과정은 또한 젖에서 발현되는 지모겐 TgFVII 을 TgFVIIa 로 활성화시키도록 고안되어 있다. 불행하게도, 일단 활성화되면, TgFVIIa 는 추가의 절단에 민감하게 된다. TgFVII 및/또는 TgFVIIa 절단은 Gla 풍부 영역이 일부 또는 전부 결여되는 TgFVII 을 초래하거나, 분자의 효능을 제한할 수 있는 경쇄 (LC) 또는 중쇄 (HC) 절단을 초래할 것이다. 그러므로 TgFVIIa 의 비활성 절단 산물로의 과정내 (in process) 분해 또는 과정내 TgFVII 산화가 가능하고, FVII 의 치료적 적합성을 담보하기 위해 제거되어야 한다.
정화
젖의 예비 처리로서의 젖 정화는 특허 출원 WO2007/138198 또는 WO2008/099077 에 기재된 바와 같은 절차에 의해 임의로 수행될 수 있으나, 본 발명을 적용하기 전에 젖 처리에는 제한이 없다. 예를 들어 과정의 제 1 단계가 유동층 친화성 포획에 의해 수행되는 경우, 임의로 정화는 우회될 수도 있다. 임의로 유업에서 이용가능한 임의의 기술에 의한 지방 디캔테이션 또는 스킴 (skim) 분리가 또한 정제 전에 수행될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 바람직하게는, 젖은 시트레이트 완충액과 혼합되어 젖의 안정화된 혈장-유사 상이 신속하게 수득되고, 그 후 액체 상 분리 예컨대 원심분리 또는 디캔테이션에 뒤이은 심층 여과에 의해 지방 분리가 달성된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 바람직하게는 심층 여과는 유리하게는 낮은 전단 응력, 비-산화 기술, 및 신속한 미생물오염도 (Bioburden) 감소 및 젖 수집에서 비롯되는 관련 불순물의 크기 정체 (size retention) 의 조합에 의해 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 전체 생물학적 활성 분자를 제조하기 위해 수행된다. 이러한 구현예에서, 심층 필터 상대 공극 크기는 30 내지 0.1 ㎛ 범위이고, 심층 여과는 바람직하게는 순차적인 25 내지 0.5 ㎛ 여과에 뒤이은 0.5 ㎛ 내지 0.1 ㎛ 여과에 의해 실행된다. 셀룰로오스계 심층 필터는 과립 아주반트 또는 기타 필터 보조 화합물의 존재 또는 부재 하에 이러한 단계에 잘 적응된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 시트레이트 염 농도 및 과정 온도는 0.15 M 포화 시트레이트 염 및 15℃ 내지 30℃, 바람직하게는 0.2 M 내지 0.5 M 시트레이트 염 및 22℃ 내지 27℃ 범위이다. 시트레이트 염 및 온도의 이들 조합은 젖 단백질의 크기 집단을 마이크론 수준으로 유지하고, 맑은 혈장-유사 상 용액을 수득하기 위해 필수적이다. "맑은" 은, 본 발명의 방법에서 정화된 젖이 500 NTU (정규화된 혼탁도 단위) 하에 제어되는 혼탁도 또는 1000 AU (상대 흡광 단위) 하에 λ400 나노미터에서 분광광도계에서의 광학 밀도 판독을 나타냄을 의미한다.
이들 조건에서, 유리하게는 0.2 ㎛ 공극 크기의 막 여과가 수행되어 단백질의 생물학적 공급원 중 미생물오염도를 감소시킬 수 있다.
결과로서 얻어지는 미생물오염도가 감소된 안정화된 용액은 임의로 -20℃ 미만의 저온에서 수개월 동안 저장될 수 있다.
특이적 리간드 상에서의 친화성 크로마토그래피
리간드
생물학적 공급원 물질로부터 TgFVII/TgFVIIa 를 정제하기 위한 본 발명의 방법은 형질전환 FVII/FVIIa 에 특이적인 리간드 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의한 하나 이상의 분리 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 친화성 리간드는, 완전한 항원 결합 부위 또는 여러 항원 결합 부위를 형성하는 2 개의 폴리펩티드 중쇄를 포함하고, 폴리펩티드 경쇄가 없는 단리된 항원-결합 단백질이다. 따라서 본 발명의 방법에서 사용되는 항원-결합 단백질은 전형적으로는 중쇄의 이량체로 구성되고, 경쇄가 없다. 2 개의 폴리펩티드 중쇄는 하나 이상의 완전한 항원 결합 부위를 형성하기에 충분하다. 본 발명에 따르면 "완전한 항원 결합 부위" 는, 결합 친화성의 시험에 관한 임의의 공지된 방법에 의해 입증될 수 있는, 단독으로 항원의 인지 및 완전한 결합을 허용하는 부위를 의미한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 항원-결합 단백질의 중쇄는 상응하는 경쇄 (이는 부재함) 와의 상호작용을 위한 특색을 갖지 않고, 따라서 보통의 면역글로불린 중쇄와 매우 상이하다. 그들의 특별한 구조에도 불구하고, 상기 항원-결합 단백질은 기준 4-사슬 모델 면역글로불린과 비교할 때 적어도 동등하고, 바람직하게는 개선된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 따라서 상기 항원-결합 단백질을 형성하는 중쇄는 원핵생물 및 저등 진핵생물 세포에 의한 분비에 본질적으로 더욱 적합한 것으로 보인다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에서 친화성 리간드로서 사용되는 항원-결합 단백질은 그들의 폴리펩티드 중쇄가 가변 영역 (VH) 및 불변 영역 (CH) 을 함유하지만, CH1 로 호칭되는 그들의 불변 영역의 제 1 도메인이 없는 것을 특징으로 한다. 따라서 CH1 도메인을 갖지 않는 이들 항원-결합 단백질에서 그들의 사슬의 가변 영역은 가변 영역의 C-말단부에서 힌지 영역에 직접 연결되어 있다. WO 94/25591 은 상기 항체 또는 절편을 인코딩하는 발현가능한 DNA 서열로 곰팡이 또는 효모를 형질전환시키는 것을 포함하는, 그러한 중쇄 항체, 또는 그의 절편의 대규모 제조 방법을 공개한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 항원-결합 단백질은 또한 WO 94/04678 에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 중쇄 면역글로불린의 가변 도메인은, 중쇄 면역글로불린에 존재하지 않는, CH1 도메인 또는 VL 과의 정상적인 상호작용 부위를 갖지 않는다. 그러한 면역글로불린은 또한 문헌에서 "VHH" 로 지명되고 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에서 리간드로서 사용되는 항원-결합 단백질은 그들의 가변 영역이 위치 45 에서, 류신, 프롤린 또는 글루타민 잔기와 상이한 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에서 친화성 리간드로서 사용되는 항원-결합 단백질은 그들의 가변 영역이 프레임워크 (FW) 및 상보성 결정 영역 (CDR), 특히 4 개의 프레임워크 및 3 개의 상보성 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서 그들은 특히 이러한 가변 영역 자체가 하나 또는 수개의 항원 결합 부위를 함유할 수 있고, 경쇄의 가변 영역의 기여를 요구하지 않는다는 사실에 의해 기준 4-사슬 면역글로불린과 구별된다.
프레임워크 1 및 4 의 아미노산 서열은 특히 하기로부터 선택될 수 있는 아미노산 서열을 각각 포함한다:
프레임워크 1 도메인의 경우:
Figure pct00001
;
프레임워크 4 도메인의 경우:
Figure pct00002
및/또는,
CDR3 도메인의 경우:
Figure pct00003
하나의 구현예에서, 항원-결합 단백질의 불변 영역은 하기 서열의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다:
CH2 도메인의 경우:
Figure pct00004
CH3 도메인의 경우:
Figure pct00005
바람직하게는, 항원-결합 단백질은 그들의 힌지 영역이 0 내지 50 개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이들 단백질의 힌지 영역의 특별한 영역은 하기 서열이다:
Figure pct00006
짧은 힌지 영역은 IgG3 분자에 상응하고 긴 힌지 서열은 IgG2 분자에 상응한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 방법에서 리간드로서 사용되는 항원-결합 단백질은 동물로부터 단리될 수 있으며, 보다 구체적으로는 낙타과 (Camelidae), 바람직하게는 낙타과 동물의 혈액으로부터 단리될 수 있다. 추가 구현예에 있어서, 항원-결합 단백질은 낙타과 동물의 면역글로불린으로부터 유래하고, 보다 구체적으로는 구 'camelids' (Camelus bactrianus 및 Camelus dromedarius) 또는 신 'camelids' (Lama pacos, Lama glama 및 Lama vicugna) 로부터 유래한다. 이들이 유래하는 동물에 따라 항원-결합 단백질의 분자량은 대략 대략 43 kDa 내지 대략 47 kDa, 특히 45 kDa 일 수 있다.
하나의 구현예에서, 이들 항원-결합 단백질은 불변 영역의 전부 또는 일부의 대체를 통해 인간 항체의 불변 영역의 전부 또는 일부가 변형될 수 있고 특히 인간화될 수 있다. 예를 들어, 상기 항원-결합 단백질의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 IgG γ3 인간 면역글로불린의 CH2 및/또는 CH3 도메인으로 대체될 수 있다. 이러한 인간화 항원-결합 단백질에서, 가변 서열의 일부, 특히 하나 이상의 골격 잔기 (결합 부위에 개입되지 않음) 는 인간 항체 골격 잔기에 의해 대체된 것일 수 있다. 상기 항원-결합 단백질은 G형 면역글로불린, 특히 계열 2 (IgG2) 또는 계열 3 (IgG3) 의 면역글로불린으로서 규정된 면역글로불린이다.
상기 기술된 항원-결합 단백질의 이점은, 경쇄 가변 도메인이 부족하다는 사실이 가변 도메인의 상이한 조합 쌍의 가능성으로부터 항체 레퍼토리에서 가변성의 여유 치수가 존재하지 않는다는 점을 의미하며, 관련 없는 항원-결합 단백질의 대다수의 생성을 피하며 특정 항원 (본원에서는 형질전환 FVII/FVIIa) 에 대한 항원-결합 단백질을 제조하는 것이 가능하다는 점이다. 두번째 이점은, VHH 도메인이 통상적인 항체보다 더욱 현저하게 안정적이어서, 상기 항원-결합 단백질에 기초한 크로마토그래피 분리가 현저하게 더욱 강건한 것으로 예상된다는 점이다. 또한, 구조적 통합 및 기능적 통합을 유지하기 위한 경쇄 가변 도메인과의 상호작용에 대한 의존성 부족은, 용액에서 제조의 용이함 및 거동 측면에서 다른 작은 항체 단편 보다는 이들 VHH 도메인이 실질적인 이점을 제공한다. 특히, VHH 단편은 면역-친화도 정제에 특히 적합한 분자인데, 왜냐하면 항체의 용리 동안 빈번히 발생하는 변성 완료 후 이의 효율적인 리폴드 능력 및 이의 통상적이지 않은 안정성 때문이다.
본 발명의 방법에 사용되는 친화성 리간드가 상기 정의된 바와 같은 항원-결합 단백질인 경우, 이는 형질전환 FVII/FVIIa 의 임의의 에피토프로 향할 수 있으며, 단 상기 에피토프는 형질전환 FVII/FVIIa 에 특이적이다. 이러한 에피토프는 아미노산, 폴리펩티드, 카르보히드레이트 또는 이의 혼합물로 구성된다.
표현 "형질전환 FVII/FVIIa 에 특이적인 리간드" 란, 본 발명의 친화성 크로마토그래피 단계에 사용되는 리간드가 예컨대 토끼 또는 염소 FVII 또는 FVIIa 와 같은 다른 종으로부터의 FVII 또는 FVIIa 를 포함하는 임의의 다른 단백질의 결합을 실질적으로 제한하거나, 또는 실질적으로 이에 결합하지 않음을 의미한다. 본 발명에 사용되는 리간드는 바람직하게는 형질전환 인자 VII 또는 인자 VIIa 에 대해 1 ㎛ 초과의 친화도를 갖고, 유리하게는 100 nM 이상의 친화도를 갖고, 보다 바람직하게는 형질전환 FVII 또는 FVIIa 에 대해 1 내지 10 nM 의 친화도를 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명에 사용되는 리간드는 토끼 FVII 또는 FVIIa 에 비해 1 로그 이상의 차이로 형질전환 FVII 또는 FVIIa 에 결합한다. 표현 "단백질의 결합을 실질적으로 제한하는" 이란, 본 발명에 사용되는 리간드가 크로마토그래피 지지체 상에 로딩된 초기 용액에 함유된 숙주 관련 불순물 (HRI) 의 적어도 4 로그 또는 99.99% 제거, 형질전환 FVII 를 발현하는데 사용되는 형질전환 포유동물에 의해 내인성으로 생산되는 FVII 또는 FVIIa 단백질의 적어도 3 로그 또는 99.9% 제거를 의미한다.
하나의 구현예에서, 친화성 지지체로부터 용리되는 분획에서 내인성 인자 VII 또는 인자 VIIa 의 질량은 컬럼 상의 로딩된 초기 용액 내에서 이들 단백질의 질량에 대해 100 배, 바람직하게는 1000 배, 가장 바람직하게는 10000 배 이상 감소된다. FVII-특이적 리간드 상에 로딩되고 용리 분획 내에 회수된 형질전환 인자 VII 또는 인자 VIIa 의 상대적인 질량과 비교하여, 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상의 이들 단백질의 질량이 초기 로딩된 용액 내에서 존재한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항원-결합 단백질 (리간드) 는 하기의 운동 결합 상수를 갖는다: Ka= 2.58x108 M 및 Kd= 9.88x10-9M.
상기 기술된 항원-결합 단백질의 임의의 기능적 단편 또는 기능적 유도체는 본 발명의 방법에서 형질전환된 인자 VII 및/또는 활성화된 형질전환 인자 VII (FVIIa) 에 특이적으로 결합하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다.
상기 기술된 항원-결합 단백질의 "기능적 단편" 은 인간 인자 VII 또는 인자 VIIa 에 대한 강한 친화도를 나타내는 단편이고, 바람직하게는 이것이 기원하는 항원-결합 단백질 보다 인간 FVII 또는 FVIIa 에 대해 실질적으로 동일한 친화도를 갖거나, 이것이 기원하는 항원-결합 단백질에 의해 나타나는 친화도의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60, 70, 80 또는 90% 이상의 친화도를 갖는다.
본 발명의 방법에서 리간드로서 사용되는데 고려되는 단편은 하기를 포함한다: 경쇄가 전혀 없는 항원-결합 단백질의 하나의 폴리펩티드 중쇄, 상기 기술되는 항원-결합 단백질의 효소적 소화에 의해 수득되는 단편, 특히 FVHh 단편 (중쇄의 항원 결합 부위를 함유함) 을 야기하거나 Fc 단편 (불변 단편) 을 야기하는 파파인을 이용한 부분 소화에 의해 수득되는 것 또는 이의 이량체 F(VHh)2, 또는 Fc 단편의 C-말단 부분에 상응하는 pFc 단편을 야기하는 Fc 단편의 파파인을 이용한 추가 소화에 의해 수득되는 단편, 다른 단백질 가수분해성 효소를 이용해 수득되는 상동 단편, 항원-결합 단백질의 가변 영역의 10 개 이상 아미노산, 바람직하게는 20 개 이상 아미노산의 단편, 또는 완전 가변 영역, 특히 단리된 VH 도메인 또는 힌지에 연결되는 VH 이량체에 상응하는 단편, 및 항원-결합 단백질의 완전 불변 영역 또는 불변 영역의 10 개 이상, 바람직하게는 20 개 이상 아미노산에 상응하는 단편.
"기능적 유도체" 란, 유도체가 형질전환 FVII 또는 FVIIa 에 대해 결합 친화도 및 특이성을 나타내는 정도로, 아미노산의 하나 또는 수 개의 치환, 결손 또는 첨가에 의해 본 발명의 방법에서 리간드로서 사용되는 항원-결합 단백질과는 상이한 폴리펩티드를 의미한다. "기능적 유도체" 는 바람직하게는 형질전환 FVIIa 에 대해 상기 항원-결합 단백질에 의해 나타나는 친화도의 약 90% 이상, 바람직하게는 약 50, 60, 70 또는 80% 이상의 친화도 또는 상기 기술되는 항원-결합 단백질과 동일한 친화도를 실질적으로 나타낸다. 상기 기능적 유도체는 상기 기술되는 항원-결합 단백질과 높은 동일성%를 나타내는 상동체를 포함하며, 이에 대해 이들은 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일성을 나타내고, 바람직하게는 하나 또는 수개의 보존적 치환에 의해 상기 기술되는 항원-결합 단백질과는 상이하다.
본 발명의 구현예에 있어서, 항원-결합 단백질은 고체 상에 고정된다. 고정은 흡착 또는 화학적 가교에 의해 달성될 수 있다.
통상적으로, 크로마토그래피 매질과 같은 고체 표면으로의 단백질의 부착은, 단백질이 비-특이적 결합 기전을 통해 고체 표면 상에 흡착되도록 고체 상의 표면을 단백질 용액에 농축시킴으로써 일어난다. 단백질 또는 크로마토그래피 매질의 고정화 방법은 문헌에 익히 수립되어 있으며 예를 들어 문헌 [Boschetti E., Egly J.M., Monsigny M., 1983, Practical Guide for use in Affinity chromatography and related techniques, 2nd edition, IBF Villeneuve-la-garenne, France, 페이지 1-157] 을 참조한다. 예를 들어 고체 표면이 폴리스티렌과 같은 소수성 물질에 의해 제공되는 경우, 부착은 일반적으로 소수성 표면 상에 단백질의 소수성 영역의 흡착에 의해 일어난다.
이에 대한 대안책으로 또는 개선사항으로, 고정된 단백질 표면의 제조에 있어서 단백질 흡착 방법을 이용할 수 있다.
하나의 대안적인 접근법은 예를 들어 문헌 [Boschetti E., Egly J.M., Monsigny M., 1983, Practical Guide for use in Affinity chromatography and related techniques, 2nd edition, IBF Villeneuve-la-garenne, France, 페이지 1-157] 에 기술된 바와 같은 통상적인 커플링 화학을 사용하여 활성화된 고체 표면에 공유 부착을 위한 단백질에서의 잔기의 화학적 교차 결합을 사용하는 것이다. 시스테인과 같은 술피드릴 기를 혼입하는 아미노산 잔기는 예를 들어 숙신이미딜-말레이미도페닐부티레이트 (SMPB) 와 같은 이중특이적 시약을 사용하여 공유적으로 부착될 수 있다.
대안적으로는, 리간드 표면에 위치한 라이신 기는 1, 에틸-3- [3-디메틸 아미노프로필] 카르보디이미드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 를 사용하는 통상적인 카르보디이미드 커플링에 의해 고체 표면에서 활성화된 카르복실 기에 커플링될 수 있다. 통상적 화학적 교차결합 시약을 사용하거나 비-공유 흡착에 의해 고체 상에 고정된, 펩티드 테일 (tail) 형태로, 확장을 사용함으로써 리간드를 부착할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 항원-결합 단백질은 통상적인 커플링 화학을 사용하여 공유 가교결합에 의해 고체 상에 부착된다. 고체 상은 자연적으로는 공유 부착에 적합한 가교성 잔기를 포함할 수 있거나 이는 당업계에 익히 공지된 방법에 따라서 적합한 교차결합성 기를 도입하기 위해 코팅되거나 유도체화될 수 있다.
고정화가 일어나는 고체 상은 다양한 물질에 의해 제공될 수 있고 이는 적합하게는 고정화 단백질에 통상 사용되는 고체 상 담체 물질일 수 있다. 본 발명의 방법은, 예비처리 후 또는 직접 단백질 또는 단백질 단편의 고정화를 잘 받아들이는 임의의 고체 상 물질을 이용하여 적용할 수 있다. 담체 물질은 미립자 (예를 들어 비드 또는 과립, 일반적으로 추출 컬럼에서 사용됨) 또는 시트 형태 (예를 들어, 막 또는 필터, 유리 또는 플라스틱 슬라이드, 미세적정 어세이 플레이트, 딥스틱 (dipstick), 모세관 충전 장치 등) 일 수 있으며 이는 편평하거나, 주름이 잡혀 있거나, 중공 섬유 또는 튜브일 수 있다. 다음 매트릭스는 예로서 주어진 것이며, 이에 한정되는 것은 아니며, 이러한 예에는 실리카 (다공성 무정형 실리카), 예를 들어 Biotage (Dyax Corp. 의 분사) 에서 공급되는 60A 불규칙 실리카 (32-63 ㎛ 또는 35-70 ㎛) 를 함유하는 FLASH 시리즈의 카트리지, 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드 지지체, 예를 들어 Amersham Pharmacia Biotech 에서 공급되는 Sepharose 제품 범위 또는 Bio-Rad 에서 공급되는 Affi-Gel 지지체가 있을 수 있다. 또한, 압력-안정성 Affi-Prep 지지체 (Bio-Rad 사제) 와 같은 거대다공성 중합체가 있다. 이용될 수 있는 다른 지지체에는 덱스트란, 콜라겐, 폴리스티렌, 메타크릴레이트, 칼슘 알기네이트, 제어된 공극 유리, 알루미늄, 티타늄 및 다공성 세라믹이 포함된다. 바람직한 구현예에 있어서, 수지는 고체 상으로서 사용될 수 있으며, 시판 수지, 예컨대 Sephadex®, Sepharose®, Fractogel®, CIMGEL® Toyopearl®, HEMA®, 및 가교된 아가로오스, 및 거대다공성 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트가 포함된다. 고체 상은 주로 무기 성질의 것일 수 있으며, 예를 들어 거대다공성 유리 또는 점토 광물, 또는 수지 및 무기물질의 조합, 예컨대 Ceramic HyperD® 또는 실리카 겔이다.
로딩 단계
형질전환 FVII/FVIIa 를 함유하는 생물학적 공급원 물질은 임의적으로는 상기 기술되는 리간드를 포함하는 친화성 지지체 상에 로딩되기 전에 예비 처리된다 (예를 들어, 정화 또는 여과 단계).
생물학적 공급원 물질은 바람직하게는 리간드를 포함하는 친화성 지지체 상에 로딩되기 전에 조정된다. 본 발명의 구현예에 있어서, 완충제를 로딩하는 pH 는 약 6.0 내지 8.0 이다. 본 발명의 이러한 크로마토그래피 단계를 위해, 적합한 로딩 완충제는 전형적으로 완충제, 전형적으로 포스페이트, 시트레이트 또는 트리스를 포함하는 수용액에 상응한다. 그럼에도 불구하고, 중성에 근접한 pK 의 모든 카르복실 또는 양쪽성 이온 완충제가 사용될 수 있다. 2가 이온, 예컨대 칼슘, 마그네슘, 아연 등은 0 내지 50 mM (최종 농도) 에서 로딩 완충제에 첨가될 수 있다.
로딩 단계는 전형적으로 시간 당 10 내지 72 컬럼 부피 (CV), 바람직하게는 18 내지 54 CV/시간의 유속으로 수행된다. 일부 구현예에서, 로딩 유속은 30 내지 48 CV/시간, 바람직하게는 36 CV/시간이다. 이들 특정 범위는 비-해리성 착물을 형성하기 위해 초과 시간 없이 리간드로의 형질전환 FVII/FVIIa 에 대한 충분한 접촉 시간을 허용한다.
본 발명의 구현예에서, 로딩 물질은 컬럼 상에 로딩된 후, 비특이적 결합제 및 오염물이 용리될 때까지 세정된다.
제 1 세정 단계 - 미결합된 물질의 제거
본 발명의 구현예에서, 제 1 세정 단계는 로딩된 용액에 함유되는 미결합된 물질을 용리하도록 수행된다. 상기 제 1 세정은 바람직하게는 2 내지 9 의 pH 범위를 갖는 세정 완충제로 수행된다. 일부 구현예에서, 제 1 세정 완충제의 pH 는, 친화성 수지에 대해 적용 시, 3 내지 10, 3 내지 7, 5 내지 9, 6.5 내지 8.5 또는 6.5 내지 10.0 이다. 일부 관심 구현예에서, 제 1 세정 완충제의 pH 는 4.0 내지 7.0, 7.0 내지 9.0, 또는 4.5 내지 8.5 이다.
제 1 세정 단계 동안, 원료 물질에서 존재하는 오염 단백질 및 고정된 리간드 사이의 약한 상호작용은 이들 특정 pH 범위에서 이러한 완충제에 의해 감소될 수 있다. 실제로, 유리하게는 정전기 반발 상호작용이 약하게 결합된 단백질을 용리하기 위해 사용된다.
제 1 세정 단계는 전형적으로 10 내지 72 컬럼 부피 (CV)/시간, 바람직하게는 18 내지 54 CV/시간의 유속으로 수행된다. 일부 구현예에서, 세정 유속 범위는 30 내지 48 CV/시간, 바람직하게는 36 CV/시간이다. 본 발명의 구현예에서, 제 1 세정 완충제는 완충제, 전형적으로는 포스페이트 또는 트리스를 포함하는 수용액이다. 그럼에도 불구하고 중성에 근접한 pK 의 모든 카르복실 또는 양쪽성 이온 완충제가 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 제 1 세정 완충제는 pH 6.5 내지 8.5, 가장 바람직하게는 pH 7.5 에서 0 내지 100 mM, 바람직하게는 50 mM Tris 완충제를 포함한다.
1개, 2개 또는 수개의 상이한 세정 완충제를 사용하거나 세정 완충제 구배를 적용함으로써 세정 단계를 확장할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
제 2 세정 단계 - 약하게 결합된 물질의 제거
본 발명의 구현예에서, 제 2 세정 완충제는, TgFVII 또는 TgFVIIa 보다 약한 친화도를 갖지 않으나 수지 상에 결합된 오염물을 제거하기 위해, TgFVII/TgFVIIa 의 용리 전에 적용되는 것이 유리하다. 하나의 구현예에서, 제 2 세정 완충제는 에테르 디올 화합물 및 하나 이상의 가용성 염을 함유한다.
본 발명의 구현예에서, 제 2 세정 완충제의 이온 농도는 마그네슘으로서 카오트로픽 염 또는 염화나트륨을 이용하여 증가된다. 하나의 구현예에서, 이온 강도는 1가 또는 다가 음이온성 및/또는 양이온성 염과 같은 이온성 화합물을 이용하여 증가된다. 하나의 구현예에서, 이온 강도 또는 이온 농도는 200 내지 600 mM, 바람직하게는 300 내지 500 mM 또는 350 내지 450 mM 이다. 동시에, 완충제의 소수성은 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 소수성 작용제를 이용하여 증가된다. 하나의 구현예에서, 제 2 세정 완충제에서 소수성 작용제의 백분율은 10% 내지 50%, 20% 내지 40%, 바람직하게는 25% 내지 35% 이다.
"약하게 결합된 물질" 이란, 제 2 세정 단계가 본 발명의 방법에서 사용되는 친화성 리간드에 대해 100㎛ 이상, 바람직하게는 10㎛ 이상의 친화도 (Kd) 를 갖는 물질의 제거를 촉발함을 의미한다.
하나의 구현예에서, 제 2 세정 완충제의 이온성 및 소수성 강도는 가능한 한 많은, 바람직하게는 전부의 친화성 수지에 결합된 오염물을 제거하기 위해 함께 증가된다.
제 2 세정 완충제는 바람직하게는, pH 6.5 내지 8.5 에서 트리스 완충제 중에서 0 내지 0.5 M 의 나트륨 염 및 0 내지 40% 의 글리콜 에테르를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 제 2 세정 완충제는 pH 7.5 에서 트리스 완충제 중에서 0.4 M NaCl 및 30% 프로피렌 글리콜을 포함한다.
제 2 세정 단계 및 용리 단계는 구분된 단계일 필요가 없으나, 특히 용리 단계에서 구배 용리 완충제가 사용되는 경우에서는 결합될 수 있음을 주목한다.
용리 단계
세정 단계(들) 후, 친화성 컬럼의 리간드에 결합된 TgFVII/TgFVIIa 는 용리 완충제를 이용하여 용리되고, 용리액으로서 TgFVII 또는 TgFVIIa 의 정제 용액이 수집된다. 인간 FVII 또는 FVIIa 의 탈착은 바람직하게는 항원-결합 리간드가 더 이상 인간 FVII 또는 FVIIa 에 결합하지 않도록 생리화학적 조건을 변경함으로써 달성된다. 용리는 pH, 염, 온도 또는 임의의 다른 적합한 측정치에 대한 조건을 변경함으로써 달성될 수 있다.
표현 "상기 리간드와의 상호작용을 비-파괴적 방식으로 방해하는" 이란, TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 통합성 및 기능성이 상기 형질전환 FVII 형태를 용리하는 시점에서 보존되는 것을 의미한다.
하나의 구현예에서, 용리는 3.0 미만의 pH 를 갖는 완충제를 이용하여 수행되나, 6.0 이 넘는 pH 에 대한 신속한 중성화가 용리된 분자의 생물학적 활성을 유지하기 위해 필요하다.
용리 완충제는 전형적으로 완충제, 전형적으로 포스페이트 또는 트리스를 포함하는 수용액이다. 그럼에도 불구하고, 중성에 근접한 pK 의 모든 카르복실 또는 양쪽성 이온 완충제가 사용될 수 있다. 용리 단계는 바람직하게는 2 내지 10 의 pH 를 갖는 용리 완충제로 수행된다. 일부 구현예에서, pH 는 3 내지 9, 5 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8 이다. 정전기 반발 상호작용은 TgFVII 또는 TgFVIIa 및 리간드 사이의 특정 친화도 상호작용을 붕괴하는데 충분하지 않다. 용리 완충제는 또한 예를 들어 이의 응집 또는 산화를 피하기 위해 글리코실화와 같은 후-발현 형질전환의 손실 없이 TgFVII/TgFVIIa 의 생물학적 활성을 유지하면서 임의의 추가 성분을 포함하는 것이 또한 유리할 수 있다.
바람직하게는, 용리 완충제의 이온 강도는 마그네슘으로서 카오트로픽 염 또는 염화나트륨을 이용하여 증가된다. 하나의 구현예에서, 용리 완충제의 이온성 강도는 500 내지 2500 mM, 1000 내지 1800 mM, 또는 바람직하게는 1200 내지 1600 mM 이다.
바람직하게는, 용리 완충제의 소수성은 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 소수성 작용제를 이용하여 증가된다. 하나의 구현예에서, 용리 완충제 중 소수성 작용제의 백분율은 20% 내지 70%, 30% 내지 50%, 바람직하게는 40% 내지 50% 이다.
가장 바람직하게는, 용리 완충제의 이온 강도 및 소수성은 pH 7 내지 8 로 완충제 중에서 함께 증가된다. 하나의 구현예에서, 용리 완충제의 소수성 작용제의 백분율은 20% 내지 60% 이고 이온 강도는 0.5 내지 2.0 M 이다. 바람직하게는, 소수성 작용제의 백분율은 30% 내지 50% 이고 이온 강도는 1.0 내지 1.8 M 이거나, 소수성 작용제의 백분율은 40% 내지 50% 이고, 이온 강도는 1.2 내지 1.6 M 이다.
바람직한 구현예에서, 활성이고 안정적인 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 분자의 탈착은 pH 7.5 에서 트리스 완충제 중에서 1.5M 염화나트륨 및 45% 프로필렌 글리콜을 포함하는 완충제를 이용하여 수행된다.
용리 단계는 전형적으로 10 내지 72 컬럼 부피 (CV)/시간, 바람직하게는 18 내지 54 CV/시간의 유속에서 수행된다. 일부 구현예에서, 용리 유속은 30 내지 48 CV/시간, 바람직하게는 36 CV/시간이다. 유속이 증가되는 경우, 자유 고정된 리간드에 대한 잠재적인 재연합이 감소되고 용리액 분획에서 TgFVII 회수가 개선된다. 이러한 효과는 주로 TgFVII 또는 TgFVIIa 에 대한 강한 리간드의 친화도에 관련된 것이다.
본 발명에서 제안된 바와 같은 친화도 정제 후, 90% 초과의 순수 TgFVII/TgFVIIa 가 제조되고, 4 십진법 로그 초과의 토끼 유단백질 (RMP) 감소 (4 log10 또는 99.99% 감소) 를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, RMP 는 전형적으로 500 000 ppm 미만, 바람직하게는 100 000 ppm 미만, 가장 바람직하게는 50 000 ppm 미만이다. 토끼 트랜스퍼린은 RMP 오염을 수반하는 가장 중요한 것 중 하나인 것으로 나타났다.
RMP 를 매우 낮은 수준, 전형적으로는 5 ppm 미만으로 감소시키기 위해, 정제 계획은 다양한 직교 방법으로 통합해야 한다. "직교 방법" 이란, 서로 구분되는 분리 기전을 사용하는 다단계 정제 과정을 의미한다. 본 발명에서, 정제는 크로마토그래피 방법에 기초하는데, 왜냐하면 이의 선택성, 효율 및 단순성이 증가되기 때문이다. 구체적으로, 이들 방법의 조합은 분해되고 산화된 형태의 매우 낮은 수준으로 응집물이 없는, 최종적으로 고품질의 TgVII 및/또는 TgFVIIa 를 보장하도록 설계된 것이다.
게다가, 본 출원인은 친화성 크로마토그래피의 예기치 않고 놀라운 특성, 구체적으로는, 돼지 파르보바이러스 (Porcine ParvoVirus: PPV) 와 같은 비-외피보유 바이러스 및 쥣과 백혈병 바이러스 (Murine Leukaemia Virus: MLV) 와 같은 외피보유 바이러스에 대해 바이러스 역가의 감소를 개선시키기 위한 이의 수용력을 밝혀냈다.
특히 바람직한 방식으로, 친화성 크로마토그래피의 단계가 바이러스 감소 인자 (Reduction Factor: RF) 3 log10 초과, 바람직하게는 4 log10 초과, 보다 바람직하게는 5 log10 초과를 수득하기 위해 수행된다.
"바이러스 감소 인자" 란, 크로마토그래피 단계의 실행 전에 (즉, 초기 로딩의 바이러스 역가의 값) 측정된 바이러스 양의 값 (역가 × 부피) 및 크로마토그래피 단계의 실행 이후에 (즉, 용리액 중 측정된 역가 값) 측정된 바이러스 양의 값 (역가 × 부피) 사이의 비율의 생성치를 의미한다. 바이러스 역가는 문헌 [Federal Gazette N°84, May 4 1994] 및 [Schmidt, N.J. & Emmons, R.W. (1989) in Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection, 6th Edition] 에서 기술된 바와 같은 "Spearman Kaerber" 방정식을 사용하여 계산된다.
한외여과/정용여과
본 발명에 따르면, 친화도 정제된 물질은 추가 정제 전에 이온 강도를 감소시키기 위해 희석되거나 정용여과될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 5 내지 50 kDa, 바람직하게는 10 내지 30 kDa 의 컷-오프 (cut-off) 한외여과막이 사용된다. 완충제 교환에 의해, 이온 강도는 본 발명의 구현예에서 삼나트륨 시트레이트 염, 및 나트륨 염 을 함유하는 1 내지 50 mM, 바람직하게는 5 내지 15 mM 의 완충제 범위로 감소된다.
본 발명의 구현예에서, 장기간 저장이 이 단계에서 바람직하게는 -20℃ 이하의 저온에서 수행되는 것이 유리하다.
본 발명의 구현예에서, 염 감소, 장기간 저장 및 미생물 제거에 의해 안정화된 친화도 정제 물질은 추가로 정제될 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 TgFVII 및 TgFVIIa 를 추가로 정제하기 위해 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가 포함한다.
바람직하게는, 하나 이상의 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 수지 상에서 수행된다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 강염기 또는 약염기 유형 크로마토그래피 지지체를 이용하여 실행될 수 있다. 일부 구현예에서, Q-Sepharose (GE Healthcare 사제), 가장 바람직하게는 Q Sepharose XL 유형과 같은 상이한 시판 수지로부터의 4차 암모늄 관능화 기가 사용될 수 있다. 상기 목록은 한정적인 것이 아니며, Bio-Rad, Pall Biosepra, Merck, Millipore 또는 다른 공급처로부터의 강력한 음이온 교환기가 사용될 수 있다.
유리하게는, TgFVIIa 로의 TgFVII 활성화는 음이온 교환기에 대해 수행되는 분리 단계 동안 증가된다.
로딩 단계
예비 정제된 물질은 사용시 동일한 범위의 전도성 및 동일한 염에서 우선 평형화된 음이온 지지체에 흡착된다.
본 발명의 구현예에서, 염 변경은 음이온 전하에 대한 RMP 상호작용을 강화하기 위해 로딩 직후 도입된다. 나트륨 염, 보다 특히 삼나트륨 시트레이트 염은 낮은 전도성을 이용하여 이미다졸 완충제로 교체된다. 이러한 특정 완충제에서, 이미다졸 범위는 1 내지 50 mM, 바람직하게는 5 내지 30 mM, 보다 바람직하게는 20 mM 이다. 또한, 완충제의 pH 는 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 7 내지 8 에서 유지된다. 이러한 조건에서, 트랜스페린 및 비-활성 TgFVII 또는 다른 단백질에 착물화된 TgFVII 는 음이온 교환 수지에 대해 강화된 상호작용을 나타낸다.
제 1 세정
본 발명의 구현예에서, 제 1 세정은 염 농도를 증가시킴으로써, 특히 염화나트륨 염 농도를 50 내지 175 mM, 보다 바람직하게는 130 내지 160 mM 범위가 되게 함으로써 적용된다. 이러한 세정은 구배기 또는 단계에 의해 적용될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 이러한 세정은 젖 내인성 트랜스페린의 특정 용리를 나타내면서, 동시에, 이미다졸 완충제, TgFVII/TgFVIIa 의 존재가 이온성 겔에 머무르고 소량의 다른 단백질에 착물화된 형질전환 FVII 가 또한 흡착되어 유지된다.
TgFVII/TgFVIIa 용리
본 발명의 구현예에서, TgFVII/TgFVIIa 는 염 농도를 감소시킴으로써, 특히 염화나트륨 염 농도를 0 내지 75 mM, 보다 바람직하게는 40 내지 60 mM 범위가 되게 함으로써, 동시에, 칼슘 염을 매우 저 농도로, 2 내지 9 mM, 보다 바람직하게는 5 내지 8 mM 범위로 도입함으로써 음이온 교환기로부터 용리된다. FVII 분자와 같은 단백질을 함유하는 gla-도메인을 이용하는 칼슘의 특정 상호작용은 장기간 연구되어 왔다. FVII 분자에서 형태학적 변경은 낮은 전도성에서 용리를 허용하는 전체적인 전하 변경을 야기한다. 본 발명의 구현예에서, 이미다졸의 존재 하에서, 다른 단백질에 착물화된 소량의 TgFVII 는 흡착되어 유지된다. 트리스-히드록시메틸 아미노메탄 또는 삼나트륨 시트레이트와 같은 다른 염은 다른 단백질에 착물화된 TgFVII 및/또는 자유 TgFVII 의 공동-용리를 나타낸다.
음이온성 교환기로부터 용리된 TgFVII 는 50% 내지 100% 활성화된 형태의 TgFVIIa, 보다 바람직하게는 80% 내지 100% 활성화된 형태의 TgFVIIa 를 포함한다.
게다가, 본 출원인은 이온 교환 크로마토그래피의 예기치 않고 놀라운 특성, 구체적으로는, 돼지 파르보바이러스 (PPV) 와 같은 비-외피보유 바이러스 및 쥣과 백혈병 바이러스 (MLV) 와 같은 외피보유 바이러스에 대해 바이러스 역가의 감소를 개선시키기 위한 이의 수용력을 밝혀냈다.
특히 바람직한 방식에서, 이온 교환 크로마토그래피의 단계는 3 log10 초과, 바람직하게는 4 log10 초과, 더 바람직하게는 5 log10 초과의 바이러스 감소 인자 (Reduction Factor: RF) 를 얻기 위해 수득된다.
유사-친화성 크로마토그래피, 바람직하게는 히드록시아파타이트 상의 크로마토그래피
본 발명의 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피로부터 수집되고 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 함유하는 용리액은 또한 유리하게는 히드록시아파타이트 겔 (Ca10(PO4)6(OH)2) 에서의 유사-친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다.
이러한 추가 유사-친화성 크로마토그래피는 바람직하게는 하기 조건 하에 수행된다: 컬럼은 7.5 내지 8.5 의 pH 에서, 10 내지 30 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트 또는 이의 혼합물을 포함하는 수성 완충액 A 에 의해 평형이 유지된다.
칼슘과 함께 제형화된 TgFVII/TgFVIIa 분자는 지지체에 유지되는 한편, Des-gla-FVII 및 기타 절단물은 통과액에 제거된다 ("Des-Gla-FVII" 는 가능하게는 단백질 분해에 의해 제거되는 FVII GLA 도메인을 의미함).
로딩 단계 직후에, 완충액 A 의 침투는 공정 동안 일부 절단된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 일부를 용리시키고, 이는 원치 않는 FVII 형태, 예컨대 저활성 또는 비활성 TgFVIIa 의 양호한 제거를 허용한다.
TgFVIIa 의 용리는 바람직하게는 7.5 내지 8.5 의 pH 와 함께 0.1 M 내지 0.5 M, 바람직하게는 0.1 M 내지 0.2 M 나트륨 포스페이트를 포함하는 완충액 B 를 나타내는 소정의 농도로 포스페이트 염, 예컨대 나트륨 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트 또는 이의 혼합물을 포함하는 완충액을 사용하여 수행된다. 생성된 용리액은 완전한 활성 TgFVIIa 와 함께 절단 형태를 낮은 비율로 함유한다.
크기 배제 크로마토그래피
최종 미량의 RMP 는 오로지 질량 분광계에 의해 또는 특수 ELISA 에 의해 식별될 수 있다. 최종 폴리싱 단계 전에, RMP 는 50 내지 500 ppm 범위이고, 가장 바람직하게는 300 ppm 이하이다.
본 발명의 구현예에서, 추가 정제 단계는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 크기 배제 컬럼 높이, 수지 다공성 및 크로마토그래피 완충액은 최상의 선택성을 달성하기 위해 선택되어야 한다. Superdex S75 prep 등급 또는 더 바람직하게는 Superdex S200 prep 등급에 상응하는 고성능 수지가 폴리싱 단계에 필요하다. 60 cm 초과 및 120 cm 미만, 더 바람직하게는 80 cm 초과 및 110 cm 미만의 겔 층 높이는 2 추가 log 의 RMP 미량물을 제거하기에 충분한 분해능을 허용한다.
구현예에서, SEC 동안 적용된 완충액 교환은 20 내지 500 ppm, 바람직하게는 50 내지 200 ppm 의 농도로 비이온성 세제와 함께 아미노산 예컨대 아르기닌 또는 글리신 또는 당을 제한 없이 함유한다. 완충액에서 이온성 세제의 존재는 유리하게는 SEC 동안 TgFVII/TgFVIIa 의 단량체성 상태를 유지하는 것을 도와, FVII 및 오염 분자 사이의 최적 분리를 야기한다. 본 발명의 구현예에서, 제형 완충액은 미국 특허 2012/0087908 에 기재된 바와 같은 소르비탄 모노라우레이트 및/또는 모노올레에이트와 상이한 아미노산의 혼합물을 함유한다. 10 내지 40 cm/hr, 더 바람직하게는 20 내지 25 cm/hr 의 선형 흐름 속도와 함께 SEC 컬럼 부피의 1% 내지 10% 범위, 더 바람직하게는 SEC 컬럼 부피의 2 내지 5% 의 로딩 부피가 적용되어, RMP 의 5 ppm 미만의 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 단량체성 피크 또는 99.9995% 초과의 순도를 얻는다.
또한, 본 출원인들은 크기 배제 크로마토그래피의 예상치 못하고 놀라운 특성, 구체적으로 쥐 백혈병 바이러스 (MLV) 와 같은 외피성 바이러스 및 돼지 파보 바이러스 (PPV) 와 같은 비-외피성 바이러스에 대한 바이러스 역가 (viral titer) 의 감소를 개선하는 이의 능력을 발견하였다.
특히 바람직한 방식에서, 크기 배제 크로마토그래피의 단계는 3 log10 초과, 바람직하게는 4 log10 초과, 더 바람직하게는 5 log10 초과의 바이러스 감소 인자 (RF) 를 얻기 위해 수행된다.
따라서, 친화성 크로마토그래피 단계 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 단계 및/또는 크기 배제 크로마토그래피 단계는 3 log10 초과, 바람직하게는 4 log10 초과, 더 바람직하게는 5 log10 초과의 바이러스 감소 인자 (RF) 를 얻는 것을 허용한다.
바이러스의 제거/비활성화
본 발명의 방법은 또한 하나 이상의 바이러스 비활성화/제거 전용 단계를 포함할 수 있지만, 가장 바람직하게는 둘 이상의 직교 바이러스 비활성화/제거 전용 단계가 포함되어야 한다. 정화된 젖은 용매를 사용한 화학적 처리 및/또는 세제 처리 또는 기타 유형의 효율적 처리에 의해 바이러스 비활성화될 수 있다. 본 발명의 구현예에서 용매/세제는 특히 Tween® 80 (1% 내지 1.5% w/v) 및 TnBP (트리-n-부틸 포스페이트 0.3% 내지 0.5% v/v) 의 혼합물의 존재 하에 사용되어, 외피성 바이러스를 비활성화시킨다. 기타 비이온성 세제 예컨대 제한 없이 Octoxynol100 또는 Triton X114 또는 나트륨 콜레이트 또는 Tween® 20 은 또한 Tween® 80 을 대체 또는 보완할 수 있다.
또한, 기재된 크로마토그래피 단계 중 어느 하나로부터 생성된 용리액은 나노여과의 단계에 적용되어, 효과적으로 바이러스, 특히 비-외피성 바이러스, 예컨대 파르보바이러스 B19 를 제거할 수 있다. 특히 15 nm 초과의 크기를 갖는 바이러스를 보유하는 필터 ASAHI PLANOVA™15 를 사용할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 나노여과는 바람직하게는 제 1 크로마토그래피 단계 이후에 수행되고, 여기서 TgFVII 순도는 90% 초과이고, 단백질 예컨대 카제인 미셀의 고분자 크기의 주요 부분은 상기 공극 크기 나노필터에서의 여과를 허용하기에 충분히 제거된다. 출발 FVII 농도는 바람직하게는 1.0 내지 2.5 g/L, 더 바람직하게는 1.3 내지 2.2 g/L 이고, 전형적 흐름 속도는 5 내지 15 LMH, 바람직하게는 8 내지 12 LMH 이다 ("LMH" 는 시간 당 제곱 미터 당 리터를 의미함, 또는 L/m2/h).
바이러스 제거 이외에, 나노여과는 또한 나노필터의 넓이를 통한 분자체 메카니즘에 의한 내인성 DNA 의 유리한 감소를 나타낸다.
본 발명의 구현예에서, Planova15 나노미터 평균 공극 크기와 등가인 나노여과 필터가 사용될 수 있다. 20 나노미터 공극 크기 필터는 15 나노미터 필터를 대체할 수 있고 15 나노미터 필터는 높은 다공성을 갖는 필터에 커플링될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 순차적인 0.2㎛/0.1㎛ 이후 Planova 20 나노필터 이후 Planova 15 나노필터는 유리하게는 TgFVII/TgFVIIa 의 생물학적 활성의 손실 없이 동시에 임의의 위험성 (미생물오염도, 마이코플라스마, 바이러스, 우발적 작용제, TSE) 을 감소시킬 수 있다.
제형화, 멸균, 동결건조
정제된 TgFVII 및 TgFVIIa 를 함유하는 마지막 용리액이 회수되면, 상기 용리액을 0.22 ㎛ 필터 상에서의 여과 단계에 적용하고, 용기에 충전한 후, 동결/건조시킬 수 있다.
바람직하게는, 개질된 PVDF 막은 단백질의 낮은 결합 및 공급자에 의해 기재된 비이온성 세제의 낮은 흡착으로 인해 본 발명에서 유리하게 사용된다. Millipore 사제의 Durapore® 막 필터는 기타 상업적 필터의 제한 없이 이러한 단계에 익히 적합화되어 있다.
아래 실시예는 본 발명 범주의 제한 없이 본 발명을 설명한다.
실시예
실시예 1: 특이적 항-FVII/FVIIa 리간드의 제조
라마를 고순도 인간 FVIIa 항원으로 면역화하였다. 제 2 부스트 이후, 100 배 초과 증가된 역가가 관찰되었고, 인간 FVIIa/FVII 항원에 대한 특이적 강화를 나타냈다. RNA 를 라마로부터 수집하였고, VHH 발현 라이브러리를 생성하였다. 인간 FVIIa 에 결합하는 능력을 갖는 라마 VHH 의 발현에 대하여 ELISA 에서 클론을 시험하였다. 23 개의 VHH 클론을 선택하고, 혈장 유래 인간 FVII 및 FVIIa 및 재조합 토끼 FVII 에 결합하는 이의 능력에 대해 추가 시험하였다. 모든 클론은 인간 FVII 및 FVIIa 에 결합할 수 있음이 밝혀졌고, 재조합 토끼 FVII 에 대해 교차-결합이 관찰되지 않았다. 또한 FVII/FVIIa 에 대한 이의 결합 및 용리 능력에 대해, 또한 산성 pH 에서 이의 결합 특성의 안정성에 대해 클론을 추가 시험하였다. 선택된 후보를 BAC 이스트 발현 시스템으로 다시 복제하였고, 상응하는 리간드를 발현시킨 후, 1 ml 매트릭스 당 2.5 mg 의 리간드 밀도로 NHS-세파로오스에 커플링하였다.
실시예 2: 젖으로부터 TgFVIIa 의 정제
본 실시예는 150 리터의 토끼 젖으로부터 고도로 정제된 활성화 TgFVII 용액을 제조하는 것을 기재하고 있다.
2.1 젖 수집
젖의 복합 출발 풀은 6 일 수집된 젖으로부터의 미니-풀 (mini-pool) 의 완전한 젖분비 사이클로 구성되고, 함께 1L 병에 채우고, 생물학적으로 안전 제어 (미생물오염도, 엔도톡신 및 내인성 바이러스) 를 위해 샘플링한 후, 저장하고, 장기간 저장 (-20℃ 미만에서 수 개월) 을 위해 매우 낮은 온도 (-60℃ 미만) 에서 동결시켰다. 젖을 착유의 자연적 사이클에 해당하는 제 4 일 내지 제 24 일에 수집하였다.
2.2 정화
젖을 함유하는 동결 병을 32 내지 37℃ 에서 유지된 큰 해동 탱크에 넣었다. 해동 시간은 각 병에서 마지막 얼음 조각을 얻기까지 약 1 시간이었다. 147.4 kg 의 해동된 공급원 물질 (SM) 을 옮기고, 500 L 혼합 시스템 백에 합쳤다. 0.315 M 삼나트륨 시트레이트 완충액을 첨가하여, 20 내지 40 g/L 범위의 단백질 농도를 수득하였다. 혼합물의 온도를 24-26℃ 로 조절하였다. 혼합 시스템을 정치시켜, 희석되고 시트레이트가 첨가된 SM 의 상층에서의 지방 상층분리를 허용하였다.
STAX 장치 (Pall Corporation) 에 의해 취급되는 15 내지 0.5 ㎛ (PDH4) 및 0.3 내지 0.1 ㎛ (PEKS) 의 공극 크기 범위를 갖는 Depth Filter 를 완충액에서 예비로 평형을 유지시켰다. 시트레이트 완충액으로 처리된 젖을 여과하고, 444 Kg 의 여과액을 일회용 백에 충전한 후, 0.45/0.2㎛ Sartobran® 필터 (Sartorius Corporation) 를 사용하여 0.2 ㎛ 여과를 수행하였다. 상이한 필터의 여과도는 점진적 평균 공극 크기에 따라 제곱 미터 당 약 2 내지 15 kg 의 단백질로부터 막힘 없이 여과를 위해 적합화되었다.
2.3 S/D 처리
정화된 공급원 물질 (CSM) 에 폴리소르베이트 80 및 트리-n-부틸 포스페이트 용액을 첨가하여, 0.8-1.5% w/v 세제 및 0.2-0.5% v/v 용매를 함유하는 509.8 Kg 의 용액을 수득하였다. 온도를 25 ± 2℃ 로 조절하였고, 상기 조건에서 2 시간 이상의 접촉 시간을 유지하여, 생물학적 공급원에서의 임의의 잠재적 비-외피보유 바이러스를 비활성화시켰다. 젖으로부터 유래된 미량의 잔여 지질 또는 트리글리세리드를 또한 세제 및 용매의 첨가에 의해 화학적으로 용해시켜, 추가 크로마토그래피 단계에 더 적합한 용액을 제조하였다.
2.4 형질전환 FVII/FVIIa 특이적 리간드에 대한 친화성 크로마토그래피
컬럼을 pH 7.5 에서 50 mM 트리스 완충액을 사용해 평형을 맞춘 후, 단백질을 함유하는 용액을 220 L/H 로 로딩하였다. 6 리터의 친화성 겔은 처리된 젖 풀로부터의 모든 TgFVII 를 흡착하기에 충분히 컸다. 로딩 이후, 제 1 세정이 트리스 완충액을 사용해 이루어졌다. 90 리터가 안정한 베이스라인 복귀를 보장하는데 필요했다. 비특이적 상호작용에 의해 결합된 단백질을 이러한 대량 세정 동안 제거하였다.
RMP 용리의 최대화 및 FVII 탈착의 최소화를 위한 최적화 세정 단계는, 30 % v/v 프로필렌 글리콜에 의한 상대적 소수성 및 500 mM 의 염화나트륨으로의 이온 강도를 초기 트리스 완충액까지 증가시켜 수행하였다.
RMP 탈착의 최소화 및 FVII 용리의 최대화를 위한 최적화 용리 단계는 1500 mM 의 염화나트륨으로의 이온 강도 및 45% v/v 프로필렌 글리콜에 의한 상대적 소수성의 증가에 의해 수행하였다.
50.6 리터를 친화성 용리액 분획에서 수집하였다. 친화성 용리액의 아미도분해성 FVII / 항원 FVII 비는 1 단위의 항원 분자에 대한 1 단위의 응고 인자에 해당하는 1 에 가까웠다. 친화성 단계는 4 log 소거율로, RMP 의 대부분을 제거를 가능하게 한다.
이로써, 응고성 TgFVII/TgFVIIa 를 성공적으로 면역정제 (immunopurify) 하였다.
2.5 한외여과
대안으로서, 저장될 수 있는 중간 생성물을 한외여과 기술을 사용하여 제조하였다. 친화성 S/D 처리 용리액을 농축시키고, 30 kDa 폴리에테르술폰 막, 1회용 TangenX Sius-LS® (Novasep 사제) 에서 안정화시켰다. 막관통 압력을 재순환 펌프 속도의 조절에 의해 상의 농축 동안 20 psig 에서 유지하였다. 2 g/L 의 단백질 농도가 얻어졌을 때, 희석여과를 시트레이트 완충액에서 수행하여, 친수성 화합물, 염 및 화학적 용매를 제거하였다.
2.6 멸균 여과 및 동결 - 중간 생성물 1
mg 으로 2638 단위의 특이적 활성을 갖는 농축 중간체 10.4 L 를 1L 용기에 층류 후드 (laminar flow hood) 하에 Sartobran® 0.45/0.2 ㎛ 캡슐에 의해 무균 여과하였다.
병을 -60℃ 미만에서 저장하여, 다운스트림 공정을 위한 중간 생성물을 구성하였다.
2.7 여과 0.2/0.1 ㎛ 및 20 N 및 15 N Planova 필터에서의 나노여과
TgFVII/TgFVIIa 생성물의 임상적 및 약학적 인간 사용을 위해 추가 정제가 필요하였다. 먼저, 잠재적 바이러스량을 감소시키기 위해, 중간체를 여과 트레인을 통해 여과하였다:
Figure pct00007
Sartorius 사제의 0.2/0.1 ㎛ Sartopore 2® 일회용 캡슐
Figure pct00008
ASAHI KASEI 사제의 1 sq.m Planova® 20 이후 1 sq.m Planova® 15
12 LMH 초기 흐름 속도에서 여과 트라인을 통해 9.45 L 중간체를 직접 펌핑하고, 전체 단계 동안 막관통 압력을 모니터링하여, 각각의 나노필터에서 12 psig 의 최대치를 유지하였다. 이러한 공정 단계에서, 순도는 약 95% 로 계산하였고, 내인성 트랜스페린은 주요 오염물 중 하나로 식별되었다.
이러한 공정 단계에서, TgFVII 활성화를 환원 조건 하에 SDS-PAGE 의 정량화에 의해 20 내지 50 % 에서 평가하였다. 일부 활성화는 정제 공정의 정화 단계 동안 배출된 유칼슘 단백질에 기인한다.
2.8 Q Sepharose XL 에서의 이온 교환 크로마토그래피
TgFVII 의 순도 및 활성화를 음이온 교환 크로마토그래피 및 칼슘-의존 용리에 의해 향상시켰다. 나노여과 용액을 사전에 10 mM 나트륨 시트레이트로 pH 7.0 에서 평형 맞추어진 Q-Sepharose XL 음이온-교환기 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다.
제 1 세정 단계를 25℃ 에서 5 mS/cm 하의 전도성 및 pH 7.5 에서 20 mM 이미다졸을 사용하여 수행하였다. 제 2 세정 단계를 20 mM 이미다졸에 150 mM 의 염화나트륨을 도입함으로써 수행하여, 25℃ 에서 18 mS/cm 의 전도성에 도달하였다. 세정 피크는 주로 유리 트랜스페린으로 구성되는 것으로 확인되었다. TgFVII/TgFVIIa 는 이후 염화나트륨 염을 50 mM 로 감소시키고 동시에 염화칼슘을 7 mM 까지 첨가하는 한편, 이미다졸을 20 mM 에서 유지하여 용리시켰다. 용리 분획은 환원 조건에서 SDS-PAGE 에 의해 평가된 TgFVIIa 의 활성화 형태 90% 초과를 함유하였다. RMP 수준을 ELISA 에 의해 측정하고 TgFVII 와 비교하였고, 잔여 RMP 를 500 ppm 미만에서 계산하였다 (표 3 참조).
QSXL 크로마토그래피는 2 log10 의 평균 점수로, HRI 수준의 감소에 기여하였는데, 이중 1.6 log10 이 트랜스페린이었다.
이러한 단계 동안, FVIIa 로의 할성화는 용리 완충액에서 이온화 칼슘의 존재에 의해 향상되었다. 이후, Q-Sepharose XL 용리액을 +2/+8℃ 에서 밤새 저장하였다.
2.9 히드록시아파타이트에서의 유사-친화성 크로마토그래피
저장 동안, 일부 FVII 절단, 특히 중쇄에서의 절단이 발생할 수 있다 (경쇄는 칼슘 이온에 의해 보호됨). 히드록시아파타이트 및 칼슘 포스페이트 흡착물은 응고 인자 예컨대 FVII/FVIIa, 더욱 넓게는 Gla-도메인을 함유하는 단백질을 흡착하는 것으로 익히 공지되어 있다. 이러한 유사-친화성을 공정의 폴리싱 단계에 사용하였다.
형질전환 FVII/FVIIa 를 함유하는 Q Sepharose XL 용리액을, 사전에 25 mM 칼륨 포스페이트에 의해 pH 8.0 에서 평형 맞춰진 CHT 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I 컬럼 (BioRad) 에서 농축시켰다.
등용매 세정 단계는 pH 8.0 에서 25 mM 칼륨 포스페이트를 사용하여 수행하였다. 이러한 세정 단계는 구체적으로 단백질분해 형태, 특히 중쇄 상에 하나 이상의 절단을 함유하는 TgFVII/TgFVIIa 를 용리시키고, 모니터링하여, 등용매 방식으로 전체 활성 형태의 최소 손실을 제한하였다.
TgFVII/TgFVIIa 는 이후 pH 8.0 에서 150 mM 칼륨 포스페이트를 사용하여 TgFVIIa 의 농축물로서 용리되었다.
2.10 Superdex 200 에서의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
단량체성 TgFVII/TgFVIIa 의 안정화를 공정의 최후 폴리싱 단계에 의해 수행하였다. SEC 는 칼륨 포스페이트의 제거 및 적어도 폴리소르베이트 80 및 아르기닌으로의 제형화를 허용하였다.
사전에 5 mM 나트륨 시트레이트, 114 mM 아르기닌 HCl, 46 mM 이소류신, 16 mM 글리신, 6.5 mM 라이신, 0.07% (v/v) Tween 80, pH 6.0 으로 평형화된 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 에, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리되고 TgFVII/TgFVIIa 를 함유하는 분획을 로딩하였다.
높은 동반경 또는 큰 분자 크기를 갖는 단백질 예컨대 트랜스페린 (70 kDa) 또는 기타 단백질과 복합체를 이룬 FVII 는 크기 배제에 의해 단량체성 TgFVIIa (45 kDa) 직전에 용리되었다.
낮은 동반경 또는 작은 분자 크기를 갖는 단백질 예컨대 카제인 또는 펩티드는 단량체성 TgFVIIa (45 kDa) 직후에 용리되었다.
TgFVII/TgFVIIa 를 함유하는 분획을 컬럼을 평형화하는데 사용된 것과 동일한 완충액을 사용하여 용리시켰다.
2.11 안정화 및 제형화
최종 TgFVII/TgFVIIa 용액을 5 mM 나트륨 시트레이트, 114mM 아르기닌 HCl, 46 mM 이소류신, 16 mM 글리신, 6.5 mM 라이신, 0.07% (v/v) Tween 80, pH 6.0 을 포함하는 제형 환충액 1L 당 1 g TgFVIIa 의 농도로 제형화하였다.
TgFVIIa 의 93.5% 의 활성화 형태를 환원 조건에서 SDS-PAGE 에 의해 평가하였다.
2.12 멸균
5243 mL 의 제형화 안정화 TgFVII/TgFVIIa 용액을 이후 0.2㎛ Millipak 100 막에서 무균 여과하였다.
실시예 3: 과정내 분석 결과
실시예 2 에 기재된 바와 같은 정제 공정 동안 생성된 샘플을 분석하였다.
3.1 정제 공정 재현성.
각각의 단계의 FVII 수율 이후 FVII 아미도분해성 어세이 또는 8 개의 배치에서의 흡착을 표 1 및 2 에 요약하였다.
한외여과까지의 FVII 아미도분해성 수율
정화 S/D 처리 친화성 UFDF
배치 1 98% 136% 56% 75%
배치 2 101% 116% 51% 89%
배치 3 95% 120% 54% 91%
배치 4 109% 85% N/D N/D
배치 5 91% 106% 55% 99%
배치 6 107% 99% 48% 99%
배치 7 N/D 83% 47% 86%
배치 8 104% 94% 48% 93%
평균 100% 110% 53% 91%
SD 7% 18% 3% 10%
N/D: 지정일에 데이터 없음
멸균 여과까지의 FVII 흡착 수율
% 단계 나노여과 QSXL CHT-I SEC
배치 1 88% 61% 75% 92%
배치 2 95% 59% 60% 89%
배치 3 95% 63% 52% 92%
배치 4 93% 55% 58% 81%
배치 5 91% 51% 67% 94%
배치 6 95% 51% 67% 91%
배치 7 92% 49% 49% 86%
배치 8 91% 52% 64% 95%
평균 92% 55% 61% 90%
SD 3% 5% 9% 5%
FVII 수율은 각각의 단계에 대한 평균 값에 관하여 10% 미만의 편차를 가진 일관적 결과를 나타냈다.
3.2 RMP 소거율
시험된 배치에 대한 평균 RMP 소거율을 측정하였고 도 2 에 나타냈다 (RMP 소거율).
정제 공정 동안 RMP 소거율은 완변하게 재현가능하였다. RMP 소거율에 가장 기여하는 단계는 하기와 같았다:
- FVII/FVIIa 에 특이적인 리간드에 대한 친화성 크로마토그래피
- Q 세파로오스 XL 크로마토그래피, 및
- Superdex200 크로마토그래피.
정제 공정 동안 RMP 소거율.
3 개 배치의 평균 정화유 친화성 후 QSXL SEC
RMP (ppm) 417 731 959 52 356 1733 13
공정으로부터 생성된 전체 RMP 소거율은 8 내지 9 log10 이었다.
3.3 토끼 DNA 소거율
토끼 DNA 소거율을 또한 Q-PCR 기술에 의해 상이한 공정 중간체에서 이의 함량을 어세이하여 평가하였다. 해당하는 결과를 도 3 (DNA 소거율) 에 나타냈다. 젖에서 ELISA 에 의해 및 기타 중간체에 관해 OD280 에 의해 어세이된 TgFVII/TgFVIIa 농도에 대하여 ppb 로 결과를 표현하였다.
정제 공정 동안 토끼 DNA 소거율.
정화유 친화성 후 나노여과 SEC
DNA (ppb) 371 134 69 808 <23 <4
가장 기여된 단계는 나노여과였다. Q 세파로오스 XL 크로마토그래피 이후, 모든 배치는 정량화 수준 (LOQ) 미만이었다.
공정으로부터 산출된 전체 DNA 소거율은 5 내지 6 log10 이었다.
3.4 FVII 활성화의 동역학
상기 논의된 바와 같이, TgFVII 는 공정 동안 TgFVIIa 로 활성화되었고, 주로 활성화는 Q 세파로오스 XL 크로마토그래피에 의해 향상되었다. 아래 표 5 에 상세하게 나타낸 바와 같이, 공정의 마지막에, 항원 단위에 의한 응고 단위의 비율로 정의된 활성화 비율은 17 내지 25 이었다.
정제 공정을 통한 Tg FVIIa 정량화
Tg FVII 활성화 (평균 3 PB) Tg FVIIa 활성화 비율 범위
나노여과 이전 23,434 4 내지 5
나노여과액 16,595 7 내지 9
QSXL 용리액 16,032 14 내지 17
CHT-I 용리액 160,822 17 내지 25
SEC 풀 45,855 17 내지 25
TgFVII 는 대략적으로 그리고 용이하게 SDS-PAGE (코마시 블루 (Coomacie Blue) 염색, 도 4) 가 뒤따를 수 있다.
FVII 이소형은 또한 단백질 지도 분석 (RP(C4)-HPLC-MS) 에 의해 더 큰 정확성과 함께 정량될 수 있다. 생물학적으로 활성인 TgFVIIa 를 생성하기 위해 활성화 부위 (중쇄 및 경쇄) 로부터 절단된 형태를 측정하였다. 비절단 사슬은 매우 낮은 생물학적 활성을 갖는 비활성화 TgFVII 및 분자 분해 및 생물학적 활성의 비활성화에 상응하는 경쇄 및 중쇄로부터 절단된 이소형에 상응하였다 (% LC: 경쇄 절단물 또는 % Des-Gla, % HC: 중쇄 절단물).
분석 방법은 산화된 형태를 구체적으로 정량할 수 없었다. 이러한 형태는 비활성화 형태의 정량에 포함되었다.
비활성화, 비분해 TgFVII 는 공정 동안 TgFVII 의 FgFVIIa 로의 활성화 징후를 점차적으로 감소시켰다. 3 개의 시험 배치에서, 활성화는 점진적이었고, 공정의 마지막에 비활성화 형태의 평균 3.6% 가 유지되었다. 이러한 형태는 분해되지 않았고, 이후 공정 (제형화 작업) 에서 및 정맥 투여 동안 활성화되는 그 능력을 유지하였다. 이는 인간 혈장에서의 활성에 대한 그 잠재력을 유지하였다.
3.5 과정내 TgFVIIa 분해
이 실시예의 경우, 히드록시아파타이트 (CHT) 용리 분획을 3.9 g/L TgFVIIa 로 농축시켰고, RP-HPLC 결과를 표 7 에 나타낸 SEC 결과와 비교하여 표 6 에 요약하였다.
CHT 용리액 (RP-HPLC) 에서 FVII 형태 분할:
경쇄 28.21%
분할된 경쇄 1.67%
중쇄 62.29%
분할된 중쇄 6.66%
산화된 + 비-활성화된 사슬 1.10%
정제 생성물 (RP-HPLC) 에서 FVII 형태 분할:
경쇄 31.37%
분할된 경쇄 0.48%
중쇄 61.16%
분할된 중쇄 5.82%
산화된 + 비-활성화된 사슬 1.12%
분할되거나 산화되지 않은 TgFVII 형태의 총 양은 CHT 용리액 및 최종 정제 생성물 (SEC 용리액) 모두에 대해 총 TgFVII 의 90% 초과였다. 이것은 TgFVII 활성화에도 불구하고 TgFVII 분해를 조절하는 CHT 단계의 능력을 명확하게 입증한다.
실시예 4: 고도로 정제된 TgFVIIa 제제의 품질
4.1 정제 용액 내의 잔류 RMP 정량.
좀더 고전적인 크로마토그래피 기법 (이온-교환, 히드록시아파타이트 유사 친화성 및 크기 배제) 과 함께 라마 항체 유래의 FVII-고도의 특이적 리간드를 사용하는 것은 그러므로 좀더 특히 RMP 를 가능한 한 많이 제거하는데 있어, 젖으로부터 TgFVII/TgFVIIa 의 정제를 최적화하는 것을 가능하게 하였다.
RMP 수준은 표 8 에 명시된 바와 같이 소규모 배치 (15 L 의 젖) 의 경우 약 10 ppm 으로 최저정량한계 (Lower Level Of Quantification :LLOQ) 미만이고, 또는 대규모 (150 L 의 젖) 로 생성된 배치의 경우 6 ng/ml 미만이었다.
트랜스페린을 정제 생성물 중에서 ELISA 에 의해 어세이하였고, 이의 함량은 소규모 배치의 경우 3 ppm 에 가까운 것으로 밝혀졌다.
정제 생성물 중의 RMP 및 트랜스페린 오염
RMP ppm 트랜스페린 ppm
소규모 배치 1 13 4
소규모 배치 2 < 6 3
소규모 배치 3 < 6 3
대규모 배치 1 < 6 N/A
N/A: 측정불가
4.2 정제 용액 중의 잔류 토끼 DNA 정량.
그러므로 기재된 방법은 4 ppb 미만의 표적 잔류 DNA 에 도달한다.
4.3 토끼 응고 인자 VII
토끼는 혈액순환 내에 내인성 인자 VII 를 가지고 있어, 혈류로부터 젖으로 혈청 단백질의 일부 수동적인 유출이 발생하기 때문에, 토끼 FVII 로부터 인간의 것을 분리하기 위한 정제 과정의 능력을 평가하였다. 정제 생성물 중의 이러한 잠재적인 동반 단백질의 존재를 조사하기 위해 특이적 ELISA 를 사내에서 개발하였다. 결과는 LLOQ 미만이었다 (모든 분석된 제제에 대해 45 pg/ml 미만).
실시예 5: Tg FVIIa 특이적 리간드 상에서의 친화성 크로마토그래피의 단계를 수행한 후 외피보유 바이러스 (MLV, Murine Leukemia Virus) 에 대한 바이러스 소거율 연구
쥣과 백혈병 바이러스 (MLV) 의 특징을 하기에 기재한다:
바이러스 MLV
명칭 쥣과 백혈병 바이러스 (Murine Leukemia Virus)
과 레트로비리다에 (Retroviridae)
아과/속 오르토레트로비리나에 감마레트로비루스
(Orthoretrovirinae Gammaretrovirus)
자연 숙주 마우스
게놈 RNA
외피 외피보유
크기 (직경) 80-110 nm
5.1 감염력 적정 어세이
5.1.1 감염력 적정의 원리
적정 방법은 바이러스 역가 측정이 특이적 세포변성 효과의 관찰에 의한, 감염된 세포에서의 바이러스 생성 검출을 기반으로 하는 정량 어세이이다.
적정 어세이는 하기에 기재되는 바와 같이 2 개의 상이한 96-웰 플레이트 상에서 수행될 것이다:
ㆍ 시험 샘플을 96-웰 플레이트 ("샘플 희석 플레이트") 를 교차하여 연속 3 배 희석 (각각의 희석에 대해 8 회의 반복실험을 수행한다) 에 의해 배양 배지로 희석한다.
ㆍ 이후 "샘플 희석 플레이트" 로부터의 각각의 웰을 신규 96-웰 플레이트 ("샘플 적정 플레이트") 의 상응하는 웰 상에 접종한다.
세포 현탁액을 "샘플 적정 플레이트" 의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 (바이러스에 따라) CO2 분위기와 함께 또는 없이 적합한 온도에서 인큐베이션한다.
바이러스에 따라, 인접 세포의 바이러스 복제 및 감염을 허용하는 인큐베이션 기간 후에,
ㆍ 군집물 (foci) 이 생긴 웰을 도립 광학 현미경 하에서 관찰하여 감염 후 계수하였다.
ㆍ 또는 얼룩 오버레이 (overlay) (크리스탈 바이올렛 1p-갈락토시다아제) 를 첨가하고, 웰을 세포변성 효과에 대해 검사한다. 감염된 웰은 맑은 영역으로서 보이는 반면, 비-감염된 웰은 얼룩이 생겼다 (또는 바이러스에 따라 반대로 나타남).
밀리리터 당 50% 조직 배양 감염성 투여량 (TCID50/mL) 으로서 표현되는 감염 역가를 적합한 식을 사용하여 계산한다.
5.1.2 적정 대조군
* 음성 대조군
각각의 적정 어세이 동안, 세포를 세포 참조 대조군으로서 준비한다. 상기 세포는 예비 어세이 동안 생성되는 샘플 적정에 사용되는 조건과 동일한 조건으로 제조되지만, 단 이들은 미첨가 배양 배지 (각각의 96 웰 플레이트 중 4 - 8 개의 웰) 로 접종된다.
* 양성 적정 대조군 (바이러스 참조 대조군)
각각의 적정 어세이 동안, 대략 103 - 105 TCID50/mL 의 바이러스 참조 대조군을 예비 어세이 동안 생성되는 샘플 적정에 사용되는 조건과 동일한 조건으로 적정한다.
5.1.3 적정 어세이의 허용 기준
적정 어세이는 하기와 같은 시기에 유지되고 입증된다:
ㆍ 각각의 적정 플레이트에 대한 바이러스 참조 대조군은 예상되는 결과에 따르기 위한 것이다,
ㆍ 수득되는 바이러스 참조 대조군의 감염력 적정은 예상되는 범위 내에 있다.
5.1.4. 바이러스 역가의 측정
바이러스 역가는 하기 문헌에 따라 측정된다: Schwartz D., 1993 (Schwartz D., "Methodes statistiques a l'usage des medecins et des biologistes", Flammarion Medecine-Sciences, 제 4 판, 1993); Kaplan M. and Koprowski H., "Laboratory techniques in rabies, 제 3 판, 편집 World Health Organization, Geneva, 1973.
Spearman Karber 식을 사용하여 TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose) 을 계산한다. TCID50 은 퀀탈 (quantal) 어세이에 의해 평가되고, 접종된 배양물의 50% 를 감염시킬 수 있는 바이러스 투여량으로서 정의된다.
5.2 실험 프로토콜
공정에서 실행되는 단계는 다음과 같다:
- 정화된 공급원 물질의 해동;
- 해동된 정화된 공급원 물질의 1% 의 외피보유 바이러스 MLV 로의 감염;
- 필터 0.2 ㎛ 로의 예비여과;
- FVII Select 컬럼 상의 로딩;
- 컬럼 세정;
- 용리.
표 9 는 Affinity FVII Select 크로마토그래피 단계 동안 실행된 공정 조건을 제공한다.
작동 파라미터 전체 규모 조건 바이러스 소거 조건
컬럼 특징
컬럼 유형 방사상 방사상
겔 (수지) 참조 Affinity Select VII* Affinity Select VII*
크로마토그래피 파라미터
로딩 부피 846 L
(56.4 L/L 의 겔)		 0.282 L
(56.4 L/L 의 겔)
단백질 로딩
Figure pct00009
39.6 g
(
Figure pct00010
5.1 g/L 의 겔)
Figure pct00011
5.1 g/L 의 겔
크로마토그래피 유속 480 L/h 0.16 L/h
* Affinity Select VII 겔은 실시예 2.4 에서 사용된 친화성 겔과 일치함
5.3 결과
바이러스 소거율을 예비여과 단계 후 (샘플 이름: 로딩 2) 및 Affinity FVII Select 크로마토그래피 상의 용리 후 (샘플 이름: 용리액) 해동되고 정화된 공급원 물질의 샘플 중에서 측정하였다. 결과를 표 10 에 제시한다.
Affinity FVII Select 크로마토그래피 전 (로딩 2) 및 후 (용리액) 바이러스 소거율의 측정
바이러스 로딩 2 용리액 감소 인자
(log10)
역가 (log10 TCID50/ml) 부피 (ml) 총 투입 (log10 TCID50) 역가 (log10 TCID50/ml) 부피 (ml) 총 산출 (log10 TCID50)
MLV 5.48 282 7.93 <1.84 52 <3.56 >4.37
TCID50: 50% 조직 배양 감염성 투여량
표 10 의 결과는 Affinity FVII Select 크로마토그래피 단계가 4.37 log10 초과의 감소 인자 (RF) 의 바이러스 역가를 감소시킨 것을 보여준다.
실시예 6: Tg FVIIa 특이적 리간드 상의 친화성 크로마토그래피의 단계 실행 후 비-외피보유 바이러스 (PPV, Porcine ParvoVirus) 에 대한 바이러스 소거 연구.
돼지 파르보바이러스 (PPV) 의 특징을 하기 표에 기재한다:
바이러스 PPV
균주 NADL-2 균주
명칭 돼지 파르보바이러스
과 파르보비리다에 (Parvoviridae)
아과/속 파르보비리나에/파르보바이러스
(Parvovirinae/Parvovirus)
자연 숙주 돼지
게놈 단일-가닥 DNA
외피 없음
직경 크기 18-24 nm
6.1 실험 프로토콜
공정에서 실행되는 단계는 다음과 같다:
- 정화된 공급원 물질의 해동;
- 해동된 정화된 공급원 물질의 1% 의 비-외피보유 바이러스 PPV 로의 감염;
- 필터 0.65/0.45 ㎛ 및 0.45/0.2 ㎛ 로의 예비여과;
- 용매/세제 처리 (1 시간);
- FVII Select 컬럼 상의 로딩;
- 세정;
- 용리.
표 11 은 Affinity FVII Select 크로마토그래피 단계 동안 실행된 공정 조건을 제공한다.
작동 파라미터 전체 규모 조건 바이러스 소거 조건
컬럼 특징
컬럼 유형 방사상 방사상
겔 (수지) 참조 Affinity Select VII* Affinity Select VII*
크로마토그래피 파라미터
로딩 부피
Figure pct00012
918 L
(
Figure pct00013
61 L/L 의 겔)		 0.31 L
(62 L/L 의 겔)
단백질 로딩
Figure pct00014
5.3 g/L 의 겔)
Figure pct00015
5.3 g/L 의 겔
크로마토그래피 유속 480 L/h 0.16 L/h
* Affinity Select VII 겔은 실시예 2.4 에서 사용된 친화성 겔과 일치함
6.2 결과
바이러스 소거율은 예비여과 및 용매/세제 처리 단계 (초기 로딩이라고 명명된 샘플) 및 Affinity FVII Select 크로마토그래피 상의 용리 (용리액 A 라고 명명된 샘플) 후 해동되고 정화된 공급원 물질의 샘플 중에서 측정되었다. 결과는 도 5 에 막대그래프 형태로 제시된다.
도 5 의 막대그래프는 도 5 의 막대그래프는 Affinity FVII Select 크로마토그래피 단계가 3.8 log10 초과의 감소 인자 (RF) 의 바이러스 역가를 감소시킨 것을 보여준다.
실시예 7: 크기 배제 크로마토그래피 Superdex S200 분취 구배의 단계 실행 후 외피보유 바이러스 (MLV) 및 비-외피보유 바이러스 (PPV) 에 대한 바이러스 소거 연구
7.1 실험 프로토콜
공정에서 실행되는 단계는 다음과 같다:
- 임상 배치로부터 샘플링된 출발 물질의 해동 (세라믹 히드록시아파타이트-1 (CHT-1) 용리액);
- 1% 의 스파이크 (spike) (1% MLV 또는 1% 의 PPV) 와 함께 출발 물질의 주입;
- 필터 0.2 ㎛ (MLV) 또는 필터 0.1 ㎛ (PPV) 로의 예비여과;
- S200 컬럼 상에 2.3% 컬럼 부피 (CV) 의 로딩;
- S200 용리액 (FVII 에 상응하는 분획) 의 수집.
표 12 는 크기 배제 크로마토그래피 Superdex S200 분취 구배의 단계 동안 실행된 공정 조건을 제공한다
작동 파라미터 전체 규모 조건 1X 전체 규모 조건 4X 바이러스 소거 조건
컬럼 특징
컬럼 유형 BPG300 Axichrom450 Valichrom 11 - Atoll
겔 (수지) 참조 Superdex S200* Superdex S200* Superdex S200*
크로마토그래피 파라미터
로딩 부피 2.3% CV (1.57 L (평균), [1.47 - 1.65]) 2.3% CV (3.5 L) 2.3% CV (2.3 mL)
크로마토그래피 유속 16 L/h 36 L/h 0.16 L/h
** Superdex S200 겔은 실시예 2.10 에서 사용된 친화성 겔과 일치함
7.2 결과
바이러스 소거율은 필터 0.2 ㎛ (MLV 바이러스의 경우) 또는 필터 0.1 ㎛ (PPV 바이러스의 경우) (로딩 2 라고 명명된 샘플) 상의 예비여과 단계 후, 및 크기 배제 크로마토그래피 Superdex S200 (용리액이라고 명명된 샘플) 상의 용리 후 CHT-1 용리액의 샘플에서 측정되었다. 결과는 표 13 에 제시된다.
크기 배제 크로마토그래피 Superdex S200 전 (로딩 2) 및 후 (용리액) 바이러스 소거율의 측정
바이러스 로딩 2 용리액 감소 인자 (log10)
역가 (log10 TCID50/ml) 부피 (ml) 총 투입 (log10 TCID50) 역가 (log10 TCID50/ml) 부피 (ml) 총 산출 (log10 TCID50)
MLV 5.48 2.3 5.84 1.84* 9.80 2.83 3.01
PPV 6.01 2.3 6.37 2.52** 7.17 3.38 3.00
TCID50: 50% 조직 배양 감염성 투여량
표 13 의 결과는 크기 배제 크로마토그래피 Superdex S200 크로마토그래피가 외피보유 바이러스 (MLV) 의 경우 3.01 log10 과 동일한 감소 인자 및 비-외피보유 바이러스 (PPV) 의 경우 3.00 log10 과 동일한 감소 인자의 바이러스 역가를 감소시킨 것을 보여준다.
요약하자면:
- 바이러스 소거율의 높은 감소 인자는 Affinity FVII Select 크로마토그래피로 수득되며, 외피보유 바이러스 (MLV) 의 경우 4.37 log10 초과이고, 비-외피보유 바이러스 (PPV) 의 경우 3.8 log10 과 동일하다;
- 바이러스 소거율의 중간 감소 인자는 크기 배제 크로마토그래피 Superdex S200 으로 수득되며, 외피보유 바이러스 (MLV) 및 비-외피보유 바이러스 (PPV) 의 경우 3.0 log10 과 동일하다; Affinity FVII Select 크로마토그래피는 외피보유 및 비-외피보유 바이러스의 바이러스 역가를 감소시키는데 크기 배제 크로마토그래피 Superdex S200 보다 더욱 효과적이다.
실시예 8: 여러 기법을 실행한 후 외피보유 바이러스 및 비-외피보유 바이러스에 대한 바이러스 소거 연구
8.1 실험 프로토콜
FVII Select 친화성 크로마토그래피, 나노여과 및 Q Sepharose XL 바이러스 확인 연구는 각각의 정제 단위 작업에 대해 출발 물질 중의 다양한 바이러스의 1% 스파이킹 (spiking) 및 관심의 분획 중의 스파이크 바이러스의 적정 (FVII 이 회수된 것이었음) 과 함께 개별적으로 수행되었다. 각각의 정제 단위 작업에 대해 수득된 Log10 감소 인자가 각각의 바이러스에 대해 더해지고, 전반적인 감소 인자는 바이러스 마다 추정되었다.
8.2 결과
결과를 표 14 에 제시한다.
스파이크 바이러스 외피보유 바이러스 비-외피보유 바이러스
MLV BVDV PRV FCV PPV
이에 대한 모델 레트로-바이러스 EV 중의 내성 종 헤르페스 바이러스, 엡스테인 바르 바이러스 HEV, RHDV, 다른 중간-크기 NEV 파르보바이러스, 내성인 매우 작은 NEV
FVII Select 크로마토그래피 > 4.4 NA NA NA 3.8
용매/세제 처리 > 5.2 > 4.5 > 5.9 NE NE
나노여과 ≥ 4.0 ≥ 4.4 NA ≥ 4.6 6.0
용매/세제 처리 + 나노여과 ≥ 9.2 ≥ 8.9 NA ≥ 4.6 6.0
QSXL 크로마토그래피* ≥ 4.9 2.9 ≥ 5.1 5.3 6.7
추청되는 전반적인 감소 인자 (RF) > 18.5 > 11.8 > 11.0 > 9.9 16.5
* 실시예 2.8 의 이온 교환 크로마토그래피 단계와 동일함
NA: 측정불가
NE: 효과 없음. 용매-세제 처리는 비-외피보유 바이러스에 대해 효과가 없다.
표 14 는 하기를 보여준다:
- 과정 중에 FVII Select 크로마토그래피 단계와 나노여과와 Q Sepharose XL 이온 교환 크로마토그래피 단계를 실행하여 9.3 log10 까지 바이러스 감소를 증가시켜, PPV 바이러스 모델의 경우 18.5 log10 초과의 비-외피보유 바이러스에 대한 전반적인 감소 인자를 야기하였음.
- 과정 중에 FVII Select 크로마토그래피 단계와 나노여과와 Q Sepharose XL 이온 교환 크로마토그래피 단계를 실행하여 10.5 log10 까지 바이러스 감소를 증가시켜, MLV 바이러스 모델의 경우 16.5 log10 과 동일한 외피보유 바이러스에 대한 전반적인 감소 인자를 야기하였음.
<110> LFB BIOTECHNOLOGIES <120> Method for purifying transgenic Factor VII <130> 32511EP LFB <160> 41 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(22) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 1 domain" /organism="artificial sequences" <400> 1 Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ile 1 5 10 15 Ser Gly Leu Thr Phe Asp 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(22) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 1 domain" /organism="artificial sequences" <400> 2 Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val 1 5 10 15 Ser Gly Phe Ser Phe Ser 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(22) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 1 domain" /organism="artificial sequences" <400> 3 Gly Gly Ser Glu Gln Gly Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile 1 5 10 15 Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(22) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 1 domain" /organism="artificial sequences" <400> 4 Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Val 1 5 10 15 Ser Gly Ala Thr Tyr Ser 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(22) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 1 domain" /organism="artificial sequences" <400> 5 Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Gly Phe Pro Tyr Ser 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(21) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 1 domain" /organism="artificial sequences" <400> 6 Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala 1 5 10 15 Gly Phe Gly Thr Ser 20 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(21) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 1 domain" /organism="artificial sequences" <400> 7 Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ser 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ser Ser 20 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(11) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 4 domain" /organism="artificial sequences" <400> 8 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(11) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 4 domain" /organism="artificial sequences" <400> 9 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(11) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 4 domain" /organism="artificial sequences" <400> 10 Trp Gly Gln Gly Ala Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(11) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 4 domain" /organism="artificial sequences" <400> 11 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Ala Ser Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(11) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Framework 4 domain" /organism="artificial sequences" <400> 12 Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(14) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 13 Ala Leu Gln Pro Gly Gly Tyr Cys Gly Tyr Gly Xaa Cys Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(12) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 14 Val Ser Leu Met Asp Arg Ile Ser Gln His Gly Cys 1 5 10 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(18) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 15 Val Pro Ala His Leu Gly Pro Gly Ala Ile Leu Asp Leu Lys Lys Tyr 1 5 10 15 Lys Tyr <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(15) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 16 Phe Cys Tyr Ser Thr Ala Gly Asp Gly Gly Ser Gly Glu Met Tyr 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(15) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 17 Glu Leu Ser Gly Gly Ser Cys Glu Leu Pro Leu Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(17) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 18 Asp Trp Lys Tyr Trp Thr Cys Gly Ala Gln Thr Gly Gly Tyr Phe Gly 1 5 10 15 Gln <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(24) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 19 Arg Leu Thr Glu Met Gly Ala Cys Asp Ala Arg Trp Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Phe Ala Tyr Asn Tyr 20 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(16) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 20 Gln Lys Lys Asp Arg Thr Arg Trp Ala Glu Pro Arg Glu Trp Asn Asn 1 5 10 15 <210> 21 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(21) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" 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Ser Ser Phe Tyr Trp Tyr Cys Thr Thr Ala Pro Tyr Asn Val 1 5 10 15 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(16) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 25 Thr Glu Ile Glu Trp Tyr Gly Cys Asn Leu Arg Thr Thr Phe Thr Arg 1 5 10 15 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(22) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 26 Asn Gln Leu Ala Gly Gly Trp Tyr Leu Asp Pro Asn Tyr Trp Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Ala Tyr Ala Ile 20 <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(24) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CDR3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 27 Arg Leu Thr Glu Met Gly Ala Cys Asp Ala Arg Trp Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Phe Ala Tyr Asn Tyr 20 <210> 28 <211> 24 <212> PRT <213> artificial 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Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Leu Thr Pro 20 25 <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(27) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CH2 domain" /organism="artificial sequences" <400> 32 Ala Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Val Phe Pro Thr Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro 20 25 <210> 33 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(27) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CH2 domain" /organism="artificial sequences" <400> 33 Ala Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Val Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro 20 25 <210> 34 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(27) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CH2 domain" /organism="artificial sequences" <400> 34 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro 20 25 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(12) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CH3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 35 Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(18) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CH3 domain" /organism="artificial sequences" <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 36 Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ala Pro Xaa Arg Leu 1 5 10 15 Glu Leu <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(18) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CH3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 37 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(18) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CH3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 38 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(18) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein CH3 domain" /organism="artificial sequences" <400> 39 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(12) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Hinge domain" /organism="artificial sequences" <400> 40 Gly Thr Asn Glu Val Cys Lys Cys Pro Lys Cys Pro 1 5 10 <210> 41 <211> 35 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SITE <222> (1)..(35) <223> /mol_type="protein" /note="Antigen-Binding protein Hinge domain" /organism="artificial sequences" <400> 41 Glu Pro Lys Ile Pro Gln Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln 1 5 10 15 Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Lys Pro Glu Pro Glu Cys Thr Cys Pro 20 25 30 Lys Cys Pro 35

Claims (19)

  1. 하기 단계를 포함하는 친화성 크로마토그래피의 단계를 포함하는, 생물학적 공급원 물질로부터 형질전환 인자 VII (TgFVII) 및/또는 형질전환 활성화 인자 VII (TgFVIIa) 을 정제하는 방법:
    (a) TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 함유하는 생물학적 공급원 물질과 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 에 특이적인 리간드를, TgFVII 및/또는 TgFVIIa 가 리간드에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 리간드와의 상호작용을 비-파괴적 방식으로 방해함으로써 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 회수하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 리간드가 TgFVII 또는 TgFVIIa 에피토프 중 하나 이상, 또는 이의 기능성 절편 또는 유도체에 대한 항원-결합 단백질인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 리간드가 2 개의 완전한 항원 결합 부위를 형성하는 2 개의 폴리펩티드 중쇄를 포함하고 폴리펩티드 경쇄는 결여된 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 낙타과 (Camelidae) 의 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 가 리간드로부터 TgFVII 또는 TgFVIIa 를 용리하기 전에 미결합된 물질을 제거하기 위한 하나 이상의 세정 단계를 포함하고, 추가로, 약하게 결합된 물질을 제거하기 위한 제 2 세정 단계를 임의로 포함하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 공급원 물질이 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 생성하는 형질전환 동물로부터 수득되는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 동물이 포유동물 암컷, 바람직하게는 토끼 암컷이고, 생물학적 공급원 물질이 젖인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 단계 (a) 전에, 젖을 수집하고 정화하는 예비 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 젖 정화 단계가 시트레이트 염 첨가 후, 여과에 의해 수행되는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, TgFVII 및/또는 TgFVIIa 가 이온 교환기 상에 체류되는 조건 하에서, 이온 교환기 상에서의, 바람직하게는 음이온 교환기 상에서의 용리된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 크로마토그래피 정제의 단계 c) 를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, TgFVII 및/또는 TgFVIIa 가 유사-친화성 수지 상에 체류되는 조건 하에서, 유사-친화성 수지 상에서의, 바람직하게는 히드록시아파타이트 상에서의 용리된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 크로마토그래피 분리의 단계 d) 를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 크기 배제 지지체 상에서의 용리된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 크로마토그래피 분리의 단계 e) 를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 나노여과에 의한 및/또는 용매/세제 처리에 의한, 바이러스의 제거 및/또는 비활성화의 하나 이상의 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 의 제형화, 멸균 및 동결건조의 최종 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 정의된 리간드가 고정화된 크로마토그래피 수지 상에, 리간드가 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서, 재조합으로 생성된 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 함유하는 형질전환 암컷 토끼 유래의 젖을 로딩하는 단계;
    (b1) 미결합된 물질을 세정하는 단계;
    (b2) 약하게 결합된 물질을 세정하는 단계; 및
    (b3) 수지로부터 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 용리하는 단계.
  16. 제 5 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 단계 동안, 약하게 결합된 물질의 제거를 위한 상기 제 2 세정 단계가 소수성제를 10% 내지 50% 포함하고 그의 이온 강도가 200 내지 600 mM 의 범위인 완충제를 이용하여 수행되는 방법.
  17. 제 5 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 단계 동안, 수지로부터 TgFVII 및/또는 TgFVIIa 를 용리하기 위한 상기 용리 단계가 소수성제를 20% 내지 70% 포함하고 그의 이온 강도가 500 내지 2500 mM 의 범위인 완충제를 이용하여 수행되는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 산출된 정제된 형질전환 FVII 가 분해된, 단백질분해된 또는 산화된 형태를 낮은 비율로 포함하는, 거의 완전히 활성화된 고순도 FVII 인 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 단계 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 단계 및/또는 크기 배제 크로마토그래피 단계가 3 log10 초과의, 바람직하게는 4 log10 초과의, 더욱 바람직하게는 5 log10 초과의 바이러스 감소 인자를 수득하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
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