JP2001518119A

JP2001518119A - 細胞活性化の選択的阻害剤としてのブラジキニン類似体

Info

Publication number: JP2001518119A
Application number: JP54627498A
Authority: JP
Inventors: エイチシュメイヤー，アルビン; エイケイハサーン，アーメイド
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1998-04-21
Publication date: 2001-10-09
Also published as: CA2288027A1; AU7252898A; WO1998047522A1; EP1019070A4; EP1019070A1; IL132546A0; AU734935B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、トロンビン誘発性血小板及びその他の細胞活性化を阻害するブラジキニンペプチド類似体、組成物類、及び方法を提供する。ブラジキニン類似体は、単一又は複数のペプチドセグメントを含む。本発明はトロンビン誘発性血小板及びその他の細胞の活性化を選択的に阻害する化合物を確認する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞活性化の選択的阻害剤としてのブラジキニン類似体政府基金関連ここに述べる本発明は、一部、米国心、肺、血液協会による基金Ｎｏ．ＨＬ３５５５３、ＨＬ５５９０７、ＨＬ５２７７９、及びＨＬ５６４１５による後援を受けた研究において行われた。政府は本発明に若干の権利を有する。関連出願の相互参照本出願は１９９７年４月２３日提出の米国暫定特許出願第６０／０４６，０８５号の恩典を請求ずる。発明の分野本発明は、トロンビン誘発性細胞活性化の阻害、並びにトロンビン誘発性細胞活性化阻害化合物の同定に関するものである。発明の背景ブラジキニンは、カリクレイン及びその他の酵素類によって前駆体血漿キニノゲン類から遊離する血管活性ペプチドである(シルヴァ（Silva）ら、Amer．J．P hysiol.、１５６、２６１−２７４(１９４９))。ブラジキニンは、プロスタサイクリン産生(ホング(Hong,S.L.)、Thromb ．Res.、１８、７８７(１９８０)；クラチュリー（Crutchley）ら、Biochim Biophy Acta、７５１、９９(１９８３))、及びプラスミノーゲンアクチベータ類放出の刺激(スミス（Smith）ら、Blood、６６、８３５(１９８３))を含む多数の生理的機能を有することが報告されている。ブラジキニンはスーパーオキシド生成及び内皮依存性平滑筋過分極を誘発する(ホランド(Holland，J.A.)、J ．Cell Physiol.、１４３、２１(１９９０)；ナカシマ(Nakashima，M)ら、J ．Clin．Invest.、９２、２８６７(１９９３))。ブラジキニンはアセチルコリンと並んで酸化窒素形成の主要誘導剤である(パルマー（Palmer，R.M.J.）ら、Nature、３２７、５２４(１９８７))。ブラジキニンは大部分の血管床の血管拡張を起こし、冠動脈循環では血流増加をもたらすことが特徴づけられでいる(ライン（Line）ら、J ．Mol．Cell Cardiol.、２４、９０９(１９９２))。これら後者の特徴は、ブラジキニンを心臓保護剤として特徴づける何らかのものと関係する(ラインら、同上；；ゴールク（Gohlke）ら、Hyp ertension ２３、４１１(１９９４)；パラット（Parratt）ら、Cardiovascular Research ２８、１８３(１９９４)；ザンジンガー(Zanzinger)ら、Cardiovascul ar Research ２８、２０９(１９９４))。アンギオテンシン変換酵素阻害剤によるブラジキニンの増加が、これら薬剤の心不全に対する有効性のメカニズムであると考えられている。ブラジキニンの親タンパク質、高分子量キニノゲン（ＨＫ）及び低分子量（ＬＫ）キニノゲンも、ブラジキニンの運搬という役割に加えて、α−トロンビンの選択的阻害剤（インヒビター）となる能力を有し、α−トロンビンの細胞活性化能力を、その酵素活性を妨害することなく阻害する(メロニ(Meloni)ら、J ．Biol ．Chem. 、２６６、６７８６(１９９１)；プリ（Puri）ら、Blood、７７、５００ (１９９１))。この活性はキニノゲン類の固有の機能（他のタンパク質には帰せられない機能）であると考えられた。α−トロンビンのヒト天然タンパク質阻害剤の大部分は、そのプロテアーゼ活性に向けられている。ＨＫ及びＬＫは、α− トロンビンを血小板膜との結合から遮断することによる、トロンビンの血小板活性化能力の選択的阻害剤(メロニら、同上；プリら、同上)。キニノゲン類のこの活性はそれらの重鎖上のドメイン３に位置するように見えた。なぜならば分離したドメイン３がその活性を保有するからである(ジアング（Jiang）ら、J ．Biol ．Chem. 、２６７、３７１２(１９９２))。ドメイン３による血小板活性化の阻害は、血小板の、血小板中顆粒内容物の凝集及び分泌能力の著しい減少によって認められる。顆粒内容物は、止血、血栓形成、及び炎症反応に関与するタンパク質類を含む。内皮細胞活性化の阻害も同様に、組織プラスミノーゲンアクチベータ及びフォンウィルブランド因子等の内皮細胞内容物の分泌の減少によって認められる。ＬＫのトリプシン消化物から分離したドメイン３も、その親タンパク質ＨＫ及びＬＫと同様に、トロンビンとその標的細胞との結合をブロックすることによって細胞活性化を阻害するように機能する。このポリペプチドは、トロンビン誘発性血小板活性化の選択的阻害剤である。そのため、ドメイン３のin vitro（インビトロ：器内での）投与は、トロンビン以外の生理物質、例えばコラーゲン、アデノシン二リン酸、エピネフリン及び血小板活性化因子等による血小板活性化の誘発に影響を与えない。冠状動脈血栓溶解又は経皮経管冠状動脈血管形成法などの、冠動脈疾患への措置は、急性冠血管血栓症による死亡率を低下させた。しかし、溶解剤で冠動脈内血栓溶解をした後の再閉塞率は高い。再閉塞の主因は血小板性血栓である。人工的ダクロングラフトをヒト動脈に吻合する際、全患者の３０％までに手術の数時間以内に血小板性血栓症が発生する。この予期される高い合併症発生率は、合併症が付随する更なる手術を必要とすることが多い。従って、血小板性血栓による再閉塞事象を防止するための更なる治療が必要である。冠動脈血栓症を予防するための２種類の競合する抗血小板剤が考えられている。１群の薬剤は、モノクローナル抗体７Ｅ３を含み、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ(ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ)、インテグリンα_11bβ₃を阻害することによって血小板活性化の最終的な一般経路をブロックすることを目的とする。７Ｅ３は有効な薬剤であるが、それはネズミ抗体であり、ヒトでは抗原性である。第２群の抗血小板剤は、血小板活性化の推定的一次開始剤、α−トロンビンを阻害する。Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン(ＰＰＡＣＫ)、α−トロンビンのタンパク分解活性の強力な阻害剤の注入は、血小板機能のおよその尺度である出血時間を延長する(ハンソン（Hanson,S.R.）ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．８５、３１８４−３１８８(１９８８))。臨床試験段階に入る、強力なα−トロンビンのタンパク分解の阻害剤の最初の世代は、医学用ヒルから誘導される組換え生成物、ヒルジンである。分子量が小さく、抗原性はないと考えられているこの化合物は、強力な抗トロンビン作用を有する。ヒルジンの合成類似体、ヒルログは、ヒルジンのアニオンエキソサイトＩ結合特性とＰＰＡＣＫのタンパク分解阻害活性とを組合わせて有する。第ＩＩＩ相臨床試験では両薬剤共、血小板活性化の有効な阻害剤であった。しかし、有効な抗凝固効果が見られた反面、脳への出血増加があったため、３つの臨床試験が中止に至った。これらα−トロンビンの非選択的阻害剤では、抗血栓性有効量が毒性用量に近く、臨床的には耐えられないため、商業的に意味が無い。動脈血栓症を防止する理想的な抗血栓剤は、α−トロンビンのタンパク分解活性を阻害せずに血小板及び内皮細胞の活性化を阻害し、フィブリノーゲンを凝固させ、タンパク質Ｃ、因子ＸＩＩＩ、及び因子Ｖ及びＶＩＩＩを活性化するものである。２種類の公知のタンパク質、高分子量（ＨＫ）及び低分子量（ＬＫ）キニノゲンのみが、天然に存在する選択的抗トロンビン剤類である(メロニ、エフ、ジェイ(Meloni.F.J.)ら、J ．Biol．Chem.、２６６、６７８６−６７９４(１９９１)；プリ、アール、エヌ(Puri.R.N.)ら、Blood、７７、５００−５０７(１９９１))。低分子量及び高分子量キニノゲンは、共にそれらのアミノ末端から１２個のアミノ酸を介しでブラジキニンのカルボキシ末端までが同一のアミノ酸配列を有する。ＬＫ及びＨＫは共通の重鎖(６２ｋＤａ)、ブラジキニン(ＢＫ)部分( ０．９ｋＤａ)、及びＬＫ及びＨＫの“軽鎖”の各々のアミノ末端部分の最初の１２アミノ酸を共有する(タカガキ(Takagaki，Y.)ら、J ．Biol．Chem.、２６０、８６０１−８６０９(１９８５)；キタムラ(Kitamura，N.)ら、J ．Biol．Chem. 、２６０、８６１０−８６１７(１９８５))。この同一性は残基１から約残基３８３までに相当する。サルベソン（Salbeson）ら、Biochem J.、２３４、４２９ (１９８６)；ケラマン（Kellerman）ら、Eur ．J．Biochem.、１５４、４７１(１９８６)。それらは、軽鎖の大きさについて異なっている；ＬＫの軽鎖は４ｋＤａ；ＨＫのそれは５６ｋＤａである(タカガキら、同上；キタムラら、同上)。改良された同定法、並びにトロンビンによって誘発される血小板又はその他の細胞の活性化を特異的に阻害する新しい化合物の同定、及び血小板凝集を防止する化合物類が必要である。発明の概要本発明は、トロンビン誘発性の血小板又はその他の細胞活性化を阻害する方法であって、このような処置を必要とする個体に対して、トロンビンレセプターを発現する血小板又はその他の細胞のトロンビン活性化を阻害する化合物を有効量投与することを含む方法を含み、ここで前記化合物は、構造式、Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂ （Ｉ）（ここで、Ｘ₁は、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｘ₂は、Ｘ₂のＮ−末端アミノ酸がグリシンではないという条件で、０から３０個の天然叉は合成アミノ酸である）を有する。本発明の一実施態様は、構造式Ｉに従い、Ｘ₁が０から７個のアミノ酸であり、Ｘ₂が０から９個のアミノ酸である化合物を投与することを含む。本発明の好適実施態様は、構造式Ｉに従い、Ｘ₁が配列番号：１のアミノ酸１ −３０からの、０から３０個のアミノ酸である化合物を投与することを含む。本発明の最も好適な実施態様は、構造式Ｉに従い、構造式Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有する化合物を投与することを含む。本発明の他の最も好適な実施態様は、構造式Ｉに従い、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（配列番号：６）を有する化合物を投与することを含む。本発明は、トロンビン誘発性の血小板又はその他細胞の活性化を阻害する方法であって、このような処置を必要とする個体に対して、血小板又はその他の細胞のトロンビンによる活性化を阻害する化合物の有効量を投与することを含む方法を含み、ここで前記化合物は、アミノ酸配列Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂ を有するセグメントを２つ以上含み、そして、前記化合物は、構造式、Ｌ−（Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂）_n （ＩＩ）（ここで、Ｌは、共有結合又は化学的な基を含むリンカーであり；Ｘ₁は、各セグメントで同じであっても異なっていてもよく、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｘ₂は、各セグメントで同じであっても異なっていてもよく、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｘ₂のＮ−末端アミノ酸はグリシンではなく；及びｎは、２から２０までの整数である）を有する。本発明の一実施態様は、構造式ＩＩに従い、Ｘ₁が０から７のアミノ酸であり、Ｘ₂が０から９個のアミノ酸である化合物を投与することを含む。本発明の他の実施態様は、構造式ＩＩに従い、構造式、Ｌ−（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂）_n を有する化合物を投与することを含む。好適一実施態様ば、構造式ＩＩに従い、構造式、を有する化合物を投与することを含む。更に他の好適実施態様は、構造式ＩＩに従い、構造式、を有する化合物を投与することを含む。本発明は更に、血小板凝集を防止する方法であって、このような処置を必要とする個体に対して構造式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに従う化合物の有効量を投与することを含む方法を含む。本発明は更に、in vivo（インビボ：生体内）にてＡＤＰ誘発性の血小板の活性化を阻害する方法であって、このような処置を必要とする個体に、構造式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩに従う化合物の有効量を投与することを含む方法を含む。本発明は更に構迄式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩによる化合物も含む。好適実施態様において、前記化合物は、構造式、を有する。他の好適実施態様は、構造式ＩＩＩに従う化合物である。本発明は更に、薬物学的に容認される担体及び構造式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩに従う化合物を含む医薬組成物を含む。本発明は、構造式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩによる化合物を使用して、トロンビン誘発性の血小板又はその他の細胞の活性化を阻害する薬剤、又は血小板凝集を阻害する薬剤を調製することも含む。本発明は更に、トロンビン誘発性の血小板及びその他の細胞の活性化を選択的に阻害する化合物を同定する方法であって、前記化合物の、トロンビンレセプター上のトロンビン開裂部位への結合能力を測定することを含む方法も提供する。好適実施態様において、前記化合物は、コンビナトリアル（combinatorial）ライブラリーに存在する。より好適な実施態様において、上記方法は、（ａ）前記化合物のトロンビン誘発性の血小板凝集の阻害能力を測定し；(ｂ)前記化合物の線維芽細胞におけるトロンビン誘発性のカルシウム動員の阻害能力を測定することを更に含む。図の説明図１は、ＲＰＰＧＦ（配列番号：７）のin vivo（インビボ：生体内での）注入後、ex vivo（生体外での）ウサギ血小板のγ−トロンビン誘発性血小板凝集の長時間にわたる阻害を示す。図２は、γ−トロンビン単独(対照)、及びＢＫ類似体Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（５０μＭ）を加えた血小板リッチ−血漿におけるヒト血小板のγ−トロンビン誘発性凝集のアグレゴメータ（凝集検出計）曲線を示す。図３は、γ−トロンビン単独(対照)、ペプチドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ(配列番号：７、１２５μＭ)、ＲＰＰヘテロダイマーペプチド(７５ μＭ)、及びＲＰＰＭＡＰ−４ペプチド（２５μＭ）を添加したヒト血小板のγ −トロンビン誘発性凝集のアグリゴメーターの曲線を示す。図４は、ビオチニル化−ＮＡＴ１２（配列番号：２）の、ＲＰＰＧＦ(配列番号：７)、ＲＰＰＧＣ(配列番号：９)、ＲＰＰＭＡＰ−４、ＬＮＡ７(配列番号：８)、ＦＳＰＦＲ(配列番号：１０)、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する直接結合を示す。図５は、ミクロタイタープレートにおいて融合するまで増殖させた線維芽細胞上のα−トロンビン誘発性カルシウム動員(パネルＡ)、及びＨＫ（高分子量キニノゲン）(パネルＢ)、ＲＰＰＧＦ（配列番号：７、パネルＣ）及びＲＰＰ（パネルＤ）によるα−トロンビン誘発性カルシウム動員の阻害を示す。図６は、ミクロタイタープレートにおいて融合するまで増殖させたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上のα−トロンビン誘発性カルシウム動員(パネルＡ)、及びＨＫ（高分子量キニノゲン）(パネルＢ)、ＲＰＰＭＡＰ−４(パネルＣ)、及びＲＰＰＧＦＭＡＰ−４（パネルＤ）によるα−トロンビン誘発性カルシウム動員の阻害を示す。発明の詳細な説明定義 “天然アミノ酸”とは、一般にはペプチド類、ポリペプチド類及びタンパク質類を形成する２０種類の一次、天然に存在するアミノ酸類のいずれかを意味する。 “合成アミノ酸”とは、合成で調製されたか、天然源に由来するかには関係なく、その他の如何なるアミノ酸をも意味する。ここに用いる“合成アミノ酸”は、これに限定されるものではないが塩類、誘導体類（アミド等）及び置換体を含む、化学的に修飾されたアミノ酸をも包含する。 “ヒトキニノゲン”とは、特に記載のない限り、ヒト血漿、血小板、内皮細胞、顆粒球、又は皮膚又はその他の組織又は器官に由来する全ての様々な形態における、高分子量及び低分子量両方の形態の如何なるキニノゲン分子（それが体液又は組織相のどちらに見いだされるかには関係ない）をも意味する。 “軽鎖”は、ヒトキニノゲンについて或は関して用いる場合は、総キニノゲン欠乏血漿における凝固欠陥を矯正することができる、ＨＫの５６ｋＤａ中間血漿カリクレイン開裂断片を意味する。 “重鎖”は、ヒトキニノゲンについて或は関して用いる場合は、ブラジキニン及び“軽鎖”のない、ＨＫ又はＬＫの６４ｋＤａカリクレイン開裂断片を意味する。 “ドメイン３”は、キニノゲン重鎖に関する場合は、約２１ｋＤａのヒトキニノゲン重鎖のトリプシン開裂断片を意味する。 “ブラジキニン”（ＢＫ）は、配列番号：５の配列を有するノナペプチドを意味する。 “ＢＫ類似体”は、ノナペプチドであるブラジキニンの配列の全部又は一部に類似したアミノ酸配列を含む化合物を意味する。この化合物は、α−トロンビンが血小板及び他の細胞上におけるそのレセプターを開裂するのを阻害することができ、それによってそのペプチドは、トロンビンレセプター上のＳＰＡＮ１２エピトープの変化又は喪失を妨げる、トロンビンレセプター上のα−トロンビン開裂部位にわたるペプチドであるＮＡＴ１２（配列番号：２）の開裂をブロックする。 “ヘテロダイマー”とは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって結合した２つの異なる単一鎖ＢＫ類似体を含む化合物を意味する。 “ホモダイマー”とは、リンカーによって結合した２つの同一の単一鎖ＢＫ類似体を含む化合物を意味する。“対称的ホモダイマー”とは、単一鎖ＢＫ類似体類における同じ位置を占めるアミノ酸をリンカーが結合しているホモダイマーを意味する。“非対称的ホモダイマー”とは、リンカーが単一鎖ＢＫ類似体類における異なる位置を占めるアミノ酸類を結合しているホモダイマーを意味する。略語本発明の主題の命名法の幾つかは長い用語を含む。当業者はこれらの用語を当業者に公知の方法で省略することが習慣である。これらの一般的及び習慣的略語を以下に示し、この明細書の本文に使用することができる。ＡＴＡＰ１３８：トロンビンレセプター上のエピトープに特異的なモノクローナル抗体。そのエピトープは上記レセプターのα−トロンビン開裂後、保存されるＢＫ：ブラジキニンＤ３：キニノゲンのドメイン３ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate ）ＨＢＴＵ：２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３ −テトラメチルウロニウムヘキソフルオロホスフェート(2-(1-H-benzotriazole- 1-YL)-1,1,3,3-tetramethy-uroniumhexofluorophosphate) ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＨＫ：ヒト高分子量キニノゲンＬＫ：ヒト低分子量キニノゲンＮＡＴ１２：トロンビンレセプター上のα−トロンビン開裂部位にわたるペプチド配列、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ −Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：２）ＰＧＥＩ：プロスタグランジンＥ１ＳＰＡＮ１２：トロンビンレセプター上のα−トロンビン開裂部位にわたる配列、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：２）に特異的なモノクローナル抗体ＴＲＡＰ：アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ( 配列番号：４)を有するトロンビンレセプター活性化ペプチド本発明は、選択的抗トロンビンとして作用するＢＫ類似体、ブラジキニン配列関連類似ペプチド類の使用によって血栓症を予防する方法に向けられている。ＢＫ類似体は選択的抗トロンビンである。なぜならば、それらはα−トロンビンの、その種々の基質、例えばフィブリノーゲン及び因子ＸＩＩＩなどをタンパク分解する能力を妨害することなく、ヒトα−トロンビン及びγ−トロンビンが血小板及びその他の細胞類を活性化するのを阻害することができるからである。最もよく知られているトロンビン阻害剤、ヒルジン、ヒルログ及びＰＰＡＣＫは、そのタンパク分解活性の全てをブロックすることによってα−トロンビン活性を阻害する。これらのタンパク分解阻害剤類を使用してα−トロンビンの血小板活性化を阻害すると、過度の抗凝固効果及び出血がある可能性がある。本発明の方法に用いられるＢＫ類似体は、α−トロンビンのその他の基質に対する酵素活性、例えばフィブリノーゲンのタンパク質分解及び因子ＸＩＩＩの活性化等を妨害せずに、トロンビン誘発性細胞活性化（例えば血小板活性化、有糸分裂促進）を阻害することができる。ＢＫ類似体は、冠動脈血栓症及び卒中において起きる動脈閉塞の予防に用いることができる。本発明のＢＫ類似体は、１００ｍｇ／ｄｌフィブリノーゲンの存在下において、及び血小板リッチ−血漿（血小板に富む血漿：platelet-rich plasma）中において１ｎＭのγ−トロンビンによる血小板活性化をブロックする。本発明のＢＫ類似体は、無傷（intact）キニノゲン及びその分離ドメイン３と同じメカニズムによって血小板活性化を阻害するとは思われない。なぜならば、ＢＫ類似体は、¹²⁵Ｉ−α−トロンビンの血小板への結合を、過剰モルの精製ＨＫ、ＬＫ、又は分離ドメイン３のようには阻害しないからである。如何なる理論によっても束縛されることを意図するものではないが、本発明のＢＫ類似体は、α−トロンビンが、血小板及びその他の細胞上に発現するそのレセプターを開裂するのを阻害することによって、血小板及びその他の細胞の活性化を阻害すると考えられる。このように、ＢＫ類似体は、トロンビンレセプターの開裂、及びその後の、開裂されたレセプターの新しいアミノ末端の露出による血小板の活性化をブロックすることによって、トロンビン誘発性血小板活性化を阻害する能力を有する。ここに記載されるようなＢＫ類似体の投与は、血小板、内皮細胞、脳細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、又はトロンビンレセプターを発現するその他の細胞のトロンビン誘発性活性化を阻害する治療法となる。この機能は、血小板性血栓形成、及びトロンビンレセプターによって仲介されるその他の諸活性を阻害する。トロンビンレセプターペプチドＮＡＴ１２及びモノクローナル抗体ＳＰＡＮ１２及びＡＴＡＰ１３８は、例１にて説明するように、本発明の化合物、組成物及び方法を特徴づけるために役立つ。ＮＡＴ１２は配列Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：２）を有し、それはトロンビンレセプター上のα−トロンビン開裂部位にわたっている。トロンビンレセプター、ＳＰＡＮ１２及びＡＴＡＰ１３８に対するモノクローナル抗体は、ペンシルバニア大学のローレンス、エフ、ブラス博士（Dr．Lawren ce F．Brass）から得たものであり、ブラスらの方法（J ．Biol．Chem.、２６７、１３７９５(１９９２)）によって調製された。モノクローナル抗体ＳＰＡＮ１２は、トロンビンレセプター上のα−トロンビン開裂部位を架橋する１２個のアミノ酸、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：２）に対して作成された。モノクローナル抗体ＡＴＡＰ１３８は、α−トロンビンによる開裂後に保存されているトロンビンレセプター上のエピトープ、Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ− Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｃ−Ｐｈｅ（配列番号：３）を識別する。α−トロンビンがトロンビンレセプターを開裂するとき、それはＳＰＡＮ１２抗体によって識別されるエピトープを排除するが、ＡＴＡＰ１３８抗体によって識別されるエピトープを排除しない。ヒトキニノゲン重鎖の完全配列はケラーマン（Kellerman）ら、Eur ．J．Bioch em. 、１５４、４７１−４７８（１９８６）に見いだされる。その全開示は参照により、本明細書に援用する。キニノゲンアミノ酸残基３３３から３９６にわたるヒトキニノゲン親セグメントのアミノ酸配列が、本明細書では配列番号：１として記載されている。コアペプチド配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏは、キニノゲンアミノ酸残基３６３−６５に対応する。本発明にると、一般構造式、を有する天然発生又は合成アミノ酸（Ｒは水素原子又は有機側鎖である）を、コア配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを含むペプチドのカルボキシル又はアミノ末端に付加し、鎖伸長類似体を形成する。コア配列のカルボキシル又はアミノ末端に３０個までのアミノ酸を加えることができる。好適には、０から７個のアミノ酸をコア配列のアミノ末端に加え、０から９個のアミノ酸をコア配列のカルボキシル末端に加える。本発明に含まれるＢＫ類似体の例は、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅを有するＢＫ類似体、配列番号：６である。他の例は、トリペプチドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏである。本発明の一実施態様によると、ＢＫ類似体は配列Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂を有する。ここでＸ₁はキニノゲン重鎖親セグメントのアミノ末端からの０から３０個のアミノ酸（配列番号：１のアミノ酸１−３０）であり、そしてＸ。のＮ末端アミノ酸がグリシンでないという条件で、Ｘ₂は０から３０個の天然又は合成アミノ酸である。本発明の他の実施態様において、ＢＫ類似体は配列Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂を有する。ここでＸ₁はキニノゲン重鎖親セグメントのアミノ末端からの０から７個のアミノ酸（配列番号：１のアミノ酸２４−３０）であり、Ｘ₂のＮ末端アミノ酸がグリシンでないという条件で、Ｘ₂は０から９個の天然又は合成アミノ酸である。本発明の他の実施態様によると、２つ以上の単一鎖ＢＫ類似体が１つ以上のリンカー、Ｌ、によって結合し、ホモダイマー、ヘテロダイマー、トリマー又はその他のマルチマー（multimer）を形成する。上記リンカーは共有結合でも化学的な基でもよい。結合できる単一鎖ＢＫ類似体の数は２から３２である。好適には、結合するＢＫ類似体の数は２から２０、より好適には２から８であり、最も好適には２から４である。結合すべきＢＫ類似体は同じものであっても異なってもよい。ヘテロダイマーは２つの異なる単一鎖ＢＫ類似体を含み、ホモダイマーは２つの同一の単一鎖ＢＫ類似体を含む。マルチマーは対称的でも非対称的でもよい。“対称的ホモダイマー”は、リンカーが、単一鎖ＢＫ類似体における同じ位置を占めるアミノ酸を結合するホモダイマーを意味する。“非対称的ホモダイマー”とは、リンカーが、単一鎖ＢＫ類似体における異なる位置を占めるアミノ酸を結合するホモダイマーを意味する。２つの単一鎖ＢＫ類似体を結合する共有結合の例は、システインアミノ酸を含む２つの単一鎖ＢＫ類似体の酸化によって形成されるジスルフィド結合である。この場合、最初に親ペプチドを修飾して、上記ペプチドが適切な位置にＣｙｓ残基を含むようにする必要があり得る。次に述べるようにして単一鎖ＢＫ類似体上のシステイン残基を酸化してＢＫ類似体ダイマーを形成することができる。即ち、単一鎖ペプチド１ｍｇを０.１％（ｖ／ｖ）１７.５ｍＭ酢酸、ｐＨ８.４、１. ５ｍｌに溶解し、窒素を流し込み、その後０.０１ＭのＫ₂Ｆｅ（ＣＮ）₆を流し込む。室温で１時間インキュベーション後、ダイマーペプチドをＨＰＬＣによって精製する。２つの単一鎖ＢＫ類似体を結合するために適した共有結合のもう一つの例は、１つの鎖上のリジンアミノ酸残基のアミノ基と、もう一つの鎖のグルタミン酸又はアスパラギン酸のアミノ酸残基のカルボン酸基とを反応させることによって形成されるアミド結合である。或いは、架橋剤を用いて、２つの単一鎖ＢＫ類似体間の共有結合によって、結合基を形成することができる。例えば、ホモダイマー及びヘテロダイマーを合成するためには、先ずケロニス(Cheronis)らの方法、J ．Med．Chem.、３７、３４８(１９９４)、によってＳ−（−Ｎ−ヘキシルスクシンイミド）修飾ペプチドモノマー類を合成する。上記修飾ペプチドモノマーの前駆体であるＮ−ヘキシルマレイミドは、Ｎ−（メトキシカルボニル）マレイミド及びＮ−ヘキシルアミンから、これら化合物を飽和ＮａＨＣＯ₃中で０℃で、ボダンスキー及びボダンスキー（Bodanszky）の方法（“ペプチド合成の実際(The Practice of Peptide Synt hesis)”、Springer-Verlag、ニューヨーク、ｐｐ２９−３１(１９８４)）によって混合することにより合成される。生成した反応混合物を酢酸エチルに抽出し、水で洗い、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥することによって分離した後、真空中で濃縮するとＮ−ヘキシルマレイミドが淡黄色油として生成する。次に、システイン含有ペプチド（モノマー）及びＮ−ヘキシルマレイミドから、ペプチド１部とＮ−ヘキシルマレイミド１.５部をジメチルホルムアミド中で（３.３ｍｌ／ｍＭペプチド）混合した後、３０容量の０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム(重炭酸アンモニウム )、ｐＨ７.５を加えることによって、Ｓ−（Ｎ−ヘキシルスクシンイミド）−修飾ペプチドモノマー類が合成される。この方法で行われたＳ−アルキル化反応は３０分で完了する。生成Ｓ−（Ｎ−ヘキシルスクシンイミド）修飾ペプチドモノマーを分離用逆相ＨＰＬＣによって精製した後、凍結乾燥して、綿毛状の白色粉末を得る。ビススクシンイミドヘキサンペプチドダイマーは、ホモダイマー又はヘテロダイマーとして、ケロニス（Cheronis）らの方法（同上）により、それぞれ同じ又は異なる位置のシステイン置換ペプチドから調製される。ビスマレイミドヘキサン１部とペプチドモノマー２部との混合物をジメチルホルムアミド(３.３ｍｌ／ｍＭペプチド)中で調製した後、０.１Ｍ炭酸アンモニウム、ｐＨ７.５、に加える。この反応混合物を室温で撹拌し、通常３０分以内に完了する。その後、ビススクシンイミドヘキサンペプチドダイマーを分離用逆相ＨＰＬＣによって精製する。凍結乾燥した後、その物質を綿毛状の白色粉末で得る。本発明の共有結合で架橋されたＢＫ類似体ダイマーは、ホモ二官能価架橋試薬、例えばジスクシンイミジルタータレート、ジスクシンイミジルスベレート、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)、１，５−ジフルオロ− ２，４−ジニトロベンゼン(“ＤＦＮＢ”)、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン(“ＤＩＤＳ”)、及びビスマレイミドヘキサン( “ＢＭＨ”)などを用いて調製できる。架橋反応は単一鎖ＢＫ類似体間にランダムに起きる。或いは、ヘテロ二官能価架橋試薬を用いてもよい。このような試薬は、例えばＮ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(“ＳＰＤＰ ”)、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１ −３’−ジチオプロピオネート(“ＳＡＳＤ”、ピアス・ケミカル・カンパニー( Pierce Chemical Company)、ロックフォード、ＩＬ)、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル(“ＭＢＳ”)、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(“スルホ−ＭＢＳ”)、Ｎ−スクシンイミジル−(４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(“ＳＩＡＢ”)、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート(“ＳＭＣＣ”)、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート(“ＳＭＰＢ”)、スルホスクジンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート(“スルホ−ＳＩＡＢ”)、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート(“スルホ−ＳＭＣＣ”) 、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート(“ スルホ−ＳＭＰＢ”)、ブロモアセチル−ｐ−アミノベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル、ヨードアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル等を含む。ヘテロ二官能価架橋では、第一の単一鎖ＢＫ類似体を例えば二官能価試薬のＮ −ヒドロキシスクシンイミジル部分で誘導体化し、誘導体化ＢＫ類似体をゲル濾過によって精製する。次に、第二の単一鎖ＢＫ類似体（第一のＢＫ類似体と同じでも異なっていてもよい）を前記二官能価試薬の第二官能基と反応させ、ＢＫダイマーの成分間の結合の直接配列を確実にする。タンパク質−タンパク質結合体の形成のための典型的ヘテロ二官能価架橋剤は、一官能基としてアミノ反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ −エステル）と、もう一つの官能基としてスルフヒドリル反応性基を有する。先ず、単一鎖ＢＫ類似体の表面リジン残基のイプシロン−アミノ基を、上記架橋剤のＮＨＳ−エステル基でアシル化する。遊離スルフヒドリル基を有する第二の単一鎖ＢＫ類似体を架橋剤のスルフヒドリル反応性基と反応させて共有結合性架橋ダイマーを形成する。一般的チオール反応基はマレイミド類、ピリジルジスルフィド類、及び活性ハロゲンを含む。例えば、ＭＢＳはアミノ反応基としてＮＨＳ −エステルを含み、スルフヒドリル反応基としてマレイミド部分を含む。光活性ヘテロ二官能価架橋剤、例えば光反応性フェニルアジド類も使用することができる。このような試薬の一つ、ＳＡＳＤは、単一鎖ＢＫ類似体に、そのＮＨＳ−エステル基を介して結合する。結合反応は、ｐＨ７で室温において約１０分間行われる。架橋剤対ＢＫ類似体のモル比は約１から約２０の間とし得る。精製した誘導体化ＢＫ類似体を、ＢＫ類似体に親和性を有する基質(マトリックス)、例えばＢＫ類似体に対して作成されたポリクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって集める。この目的のための抗体は、１− エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）一カルボジイミド−ＨＣｌを用いて、ＢＫ類似体を、キーホールリンペットヘモシアニン(key hole limpet hemoc yanin)に連結することによって作成してもよい(グッドフレンド(Goodfriend)ら、Science、１４４、１３４４(１９６４))。生成した結合物を用いて、ミュラー − ８８)）によってウサギを免疫し、抗ＢＫ類似体抗体を作る。精製抗体をＡＦＦＩＧＥＬ１０（バイオ−ラド(Bio-Rad)、リッチモンド、ＣＡ）に結合して、アフィニティーカラムを形成する。固定化抗ＢＫ類似体抗体を、それに結合した誘導体化ＢＫ類似体と共に、０.２Ｍグリシン溶出によってそのカラムから取り出し、第二の単一鎖ＢＫ類似体溶液に懸濁させる。紫外線源（例えばミネラライトＵＶＳＬ−２５、ウルトラバイオレット・プロダクツ社(Ultra Violet Products ，Inc.)、サンガブリエル、ＣＡ）を緩やかに撹拌している懸濁液から１ｃｍの場所に置き、長波長領域で約１０分間照射する。懸濁液を抗ＢＫ類似体抗体アフィニティーカラムにもどし、０.１５ＭＮａＣｌ、０.１％ウシ血清アルブミン、０.０１％ポリソルベート８０及び２５ＫＩＵ／ｍｌアプロチニンを含む緩衝液で洗い、反応副生物を除去する。共有結合架橋ダイマーを、０.２Ｍグリシン又は５Ｍグアニジンを含む同じ緩衝系で溶出する。溶出したダイマーを緩衝液に対して透析し、カオトロピック剤を除去する。上記のように紫外線照射下におけるＢＫ類似体との反応、及びその反応混合物のクロマトグラフィーの後、共有結合した架橋ダイマーを０.２Ｍグリシン又は５Ｍグリシンで溶出ずる。上記の方法はＳＡＳＤを用いるが、β−エチル−１，３−ジチオプロポピオネート部分よりはむしろ例えばα−ヘキサノエートなどを含む開裂性架橋剤、非開裂性架橋剤を用い得る。ＭＳＢは非開裂性架橋剤の一例である。単一鎖ＢＫ類似体は自動合成を用いる一般的固相ペプチド合成法によって調製し得る。或いは、ＢＫ類似体を組換えＤＮＡ法によって調製し得る。ＢＫ類似体をコードする遺伝子を構成し、適切なクローニングベクターを用いて適切なホストに導入する。このように、本発明は、ペプチド合成法によって合成されるＢＫ類似体の使用に限らず、組換え法によって作成されるポリペプチドも含むことを理解されたい。更に、このような組換え技術の利用によって、当業者は関連ＤＮＡの部位特異的突然変異等の方法を用いてその他のＢＫ類似体を調製ことができる。その際、単一又は複数のアミノ酸変化、付加又は欠損を含むように、アミノ酸配列を変更し得る。このような配列変更は、生成した分子が実質的にトロンビン誘発性細胞活性化を阻害する能力を保有する場合、本発明の範囲内に含まれる。その他のＢＫ類似体は、複数のペプチド類似体を示すコンビナトリアルライブラリー（組合せライブラリー：combinatorial library）をスクリーニングすることによってによって確認できる。一例として、分解オリゴヌクレオチド類（de genarate oligonucleotide）を用いて微生物（例えばバクテリオファージ、細菌、酵母など）表面上に異種ペプチド類（heterologous peptide）を表させることができる。このような一方法は、ＤＮＡ配列（ＮＮＫ）_nを発現するディスプレイライブラリー（display library）を用いる。このＤＮＡは、アミノ酸配列（Ｘａａ）_n（これはｎアミノ酸を有する全てのペプチドを含む）をコードする。可能なペプチドの数（２０の天然アミノ酸を用いる）は２０ⁿである。このような微生物のライブラリーは、先ず、例２に示すように、クローン化トロンビンレセプター又はＮＡＴ１２ペプチドとの結合性についてスクリーニングされる。結合アッセイで活性を有するペプチドを、例１に記載のin vitro（インビトロ：器内での）機能アッセイの一つを用いてスクリーニングする。In vitro機能アッセイにおける活性は、例３に示すように、in vivo（インビボ：生体内での）活性を推定する。in vitro機能アッセイにおいて活性を示す新しいＢＫ類似体の安全性及び効果を動物及びヒト臨床試験で試験する。コンビナトリアルライブラリーは、固相基質支持体上に作成し、トロンビンレセプター上のトロンビン開裂部位に結合する能力をスクリーニングすることもできる。（１）トロンビン誘発性血小板凝集を阻害し、（２）トロンビンレセプター上のトロンビン開裂部位に結合し、及び（３）線維芽細胞のトロンビン誘発性カルシウム動員（mobilization）を阻害する化合物類のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーンすることが特に好都合である。このコンビネーションスクリーニング法（組合せスクリーニング：combination screening）は、トロンビン誘発性血小板及ぴその他の細胞の活性化の選択的阻害剤である化合物を確認する。コンビナトリアルライブラリーを作成し、スクリーニングするその他の方法は当業者には公知である。精製したＢＫ類似体を、トロンビン誘発性又はＡＤＰ誘発性血小板活性化又は血小板凝集の阻害が要求される場合に投与できる。ＢＫ類似体を、何らかの原因で血小板性血栓症にかかっている個体に投与し、人工的ダクロングラフト及びステントの挿入のために手術又はカテーテル挿入を受ける個体に予防的に用いて血小板血栓による再閉塞事象を防止することもできる。卒中及び脳浮腫を防止するためにＢＫ類似体を注入してもよい。ＢＫ類似体は、静脈内投与、鼻内及び経口投与、並びに皮膚パッチ又は直腸座剤などを含む、実質的に血流への供給をもたらす、如何なる一般的手段によっても投与できる。鼻内投与も用いられるとはいえ、現在のところ静脈内投与が好適投与経路と考えられている。ＢＫ類似体は水に溶けるため、それらは溶液として効果的に投与できる。実際の投与量は患者の身長及び体重、その治療の性質が予防的であるか又は治療的であるか、患者の年齢、健康及び性別、投与経路、及びその他の要因を考慮する。当業者は患者の特殊な事情及び要求に合わせて適切な用量及び投与スケジュールを導き出すことができる。本発明のＢＫ類似体に関連するＢＫ類似体を用いたin vivoクリアランス試験に基づいた活性成分の効果的１日用量は、体重７０ｋｇあたり１日約０.１から約１０ｇである。効果的１日用量は体重７０ｋｇあたり約１から約５ｇであるのが好ましい。好適実施態様において、体重７０ｋｇあたり１日約３ｇ用量を、単回（単一ボルス）注入として２.４ｇ、その後０.０２５ｇ／時間の連続注入によって投与する。投与するＢＫ類似体の量は、所望の血小板活性化又は凝集の阻害程度にも依存する。１日投与量３ｇを得るためのＢＫ類似体の注入が好都合に用いられるが、必要に応じてそれより多い又は少ないペプチドを投与してもよい。治療的終点は、凝集、分泌、血管透過性、及び出血によって血小板機能をモニターすることによって決められる。所望静脈内濃度を得るために投与するＢＫ類似体の実際量及び治療の長さは、当業者は日常的方法で容易に決められる。ＢＫ類似体は、薬物学的に容認される担体との混合物である医薬組成物の形で投与できる。医薬組成物は一般的医薬品処方技術によって配合される。担体は投与に望ましい製剤型によって様々な形をとり得る。非経口的に投与される組成物では、担体は一般的に滅菌水を含んでなる。但し、溶解を補助する、又は保存目的のその他の成分も含めることができる。適切な液体担体、懸濁剤などを用いる注射用懸濁液も調製できる。好適な非経口投与経路は静脈内投与である。静脈内投与の場合、ＢＫ類似体を、例えば生理的条件に適合する緩衝されたｐＨを有する、滅菌塩化ナトリウム等の生理的に適合する物質を含む適切な静脈内運搬担体（vehicle）に溶解する。このような静脈内運搬担体は当業者には公知である。例以下の例は本発明の実施を説明する。これらは説明のための例であり、本発明の範囲を制限するものではない。例１ in vitro機能アッセイ機能アッセイを用いて、本発明による方法及び化合物の相対的阻害効率を評価する。これらのアッセイでは、天然（native）ＢＫ(配列番号：５)、ＢＫ断片Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ(配列番号：７)、又はその他のＢＫ類似体を陽性対照ペプチドとして用いる。Ａ．血小板凝集阻害ヒト血小板凝集試験では、ヒト血液５０ｍｌを、０.０１３Ｍクエン酸ナトリウム５ｍｌを含む注射器に集めた。抗凝固血液を室温で１８０×ｇで１０分間遠心分離した。血小板リッチ−血漿が上澄液であった。血小板リッチ−血漿の血小板凝集試験をアグレゴメータ（凝集検出計）のキュベット中でγ−トロンビンを用いて行った(血液学テクノロジー、エセックスジャンクション、ＶＴ)。アグレゴメータの標準化後、“完全な血小板凝集をおこす最小濃度”と定義される、 γ−トロンビンの投与量閾値を血小板リッチ−血漿の各試料で確認した。典型的には、投与量閾値は５〜３０ｎＭの間であった。種々の濃度の被検ペプチドをアグレゴメータのキュベット中の血小板リッチ− 血漿に加えた。γ−トロンビンの添加によって血小板凝集を引き起こした。血小板凝集程度を、血小板リッチ−血漿の撹拌懸濁液を通る光透過の増加を測定する（任意の単位にて）ことによって決定した。対照実験においで、ＢＫ断片配列番号：７は、１ｍＭペプチドの濃度でγ−トロンビン誘発性（２０ｎＭ）血小板凝集を阻害した。Ｂ．血小板凝集及び分泌の阻害同時に行われる血小板凝集及び分泌試験では、新鮮な全血を集め、クエン酸ナトリウムと混合した(最終濃度０.０１３Ｍ)。血小板リッチ−血漿をメロニ（Mwl oni）らの方法（J ．Biol．Chem.、２６６、６７８６、１９９１）によって調製した。セファロース２Ｂカラム上でヘペス−タイロード（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ）の緩衝液（２０ｍＭグルコース及び０.２％ウシ血清アルブミンを含む、０.１３７ＭＮａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ、０.４ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１２ｍＭＮａＨＣＯ₃、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１４.７ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７.３５）を用いてゲル濾過することによって、洗浄済み血小板を調製した。血小板をシュマイエル (Schmaier)らの方法（Blood、５６、１０１３、１９８０）により、５−［¹⁴Ｃ］ヒドロキシトリプタミンと共に３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄済み血小板（最終濃度２×１０⁸／ｍｌ、５−［¹⁴Ｃ］ヒドロキシトリプタミンで放射標識した）をアグレゴメータ（クロノログ社(Chronolog Corp.)、ヘイバータウン、ＰＡ）のキュベットに加え、メロニらのプロトコル（同上）を用いて標準化した。ＺｎＣｌ₂の添加後、最終濃度５０μＭの精製ＨＫ（１μＭ）又は種々濃度のペプチド（０.１から３ｍＭ）又は緩衝液のみをそのキュベットに加えた。ベースラインが安定したとき、α−トロンビン［０.１２５Ｕ／ｍｌ（１ｎＭ）最終濃度］を加え、血小板活性化を開始した。撹拌下の血小板をα−トロンビン及び添加物と共に１分間インキュベートした。その他の実験において、血小板をＴＲＡＰ(０.６２５から２.５μＭ)、ＡＤＰ（１−５μＭ）(シグマ(Sigma) )、コラーゲン（１.２５μｇ／ｍｌ）(ホルム(Horm)、ミュンヘン、ドイツ)、又はＵ−４６６１９（１μＭ）(カルバイオケムベーリング(Calbiochem Behring) 、サンディエゴ、ＣＡ）で刺激した。ヒトフィブリノゲン（１００ｍｇ／ｄｌ）の存在下でγ−トロンビン（１ｎＭ）で刺激された洗浄済み血小板で追加実験を行った。γ−トロンビン及びヒトフィブリノゲンは両方共エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ(Enzyme Research Laboratories)、サウスベンド、ＩＮ、から購入した。インキュベーションの終わりに、全血小板サンプルを０.１３５ｍＭホルムアルデヒド−ＥＤＴＡ、５ｍＭＥＤＴＡ溶液（血小板懸濁液４部に対しホルムアルデヒド１部）上で１０,９００×ｇで遠心分離し、氷上に保存し、上澄液のアリコート（一部）について５−［¹⁴Ｃ］ヒドロキシトリプタミン分泌を試験した。未刺激サンプルの上澄液中の５−［¹⁴Ｃ］ヒドロキシトリプタミンのレベルを両方から差し引いた後の、未刺激血小板の血小板懸濁液中の総５−［¹⁴Ｃ］ヒドロキシトリプタミンに対する、アゴニスト処理された試料の上澄液の５−［¹⁴ Ｃ］ヒドロキシトリプタミン損失の比によって分泌パーセントを決定した。アゴニスト導入後最初の１分間に、血小板凝集を光透過性の最初の変化率として任意の単位で測定した。対照実験においで、天然（native）ＢＫ（配列番号：５）は、α−トロンビン誘発性（１ｎＭ）血小板活性化を阻害した。その際、１００％凝集及び分泌阻害に対するＩＣ₅₀はそれぞれ０.２５ｍＭ及び１.０ｍＭであった。Ｃ． α−トロンビン誘発性カルシウム動員の阻害カルシウム動員試験では、細胞質のフリーＣａ²⁺濃度（[Ｃａ²⁺]_i）を、蛍光Ｃａ²⁺インジケータフラ−２アセチルオキシメチルエステル（フラ−２（fula -2）ＡＭ、モレキュラープローブ社(Molecular Probes，Inc.)、オイゲン、ＯＲ）を用いて測定した。ラスマッセン（Rasmussen）らの方法(J ．Biol．Chem.、２６８、１４３２２、１９９３)により、１μＭフラ−２ＡＭと共に３７℃で４５分間インキュベートすることによって、ＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液中のゲル濾過した血小板にフラ−２を担持させた。標識された血小板をその後再びゲル濾過し、過剰のプローブを除去した。標識された血小板懸濁液のアリコートをマグネチックスターラー（磁気撹拌機）を備えた石英キュベットに移し、それをその後蛍光分光測定器（デュアルウエーブレングスシマヅＳＰ５０００スペクトロフルオロメーター、シマヅＵＳＡ、ピッツバーグ、ＰＡ）の、サーモスタットで３７℃に調温されたチェンバーに移した。試薬類を直接キュベットに加えた。励起波長は３４０から３８０ｎｍまでの範囲であった。蛍光は、フィッシャー（ Fisher）らが報告したように(Mol ．Pharm.、３５、１９５(１９８９))、５１０ｎｍにおける発光を記録することによって測定した。最小発光を２０ｍＭジギトニン、１０ｍＭＥＧＴＡ可溶化血小板サンプルで測定した。最大発光は、同じサンプルで１０ｍＮＣａ²⁺を加えて測定した。血小板内フリーＣａ²⁺濃度はグリキーウィツ（Grykiewicz）らの方法（J ．Biol．Chem.、２６０、３４４０、１９８５）によって計算した。蛍光の読みの比をＲ＝３４０／３８０ｎｍとして計算し、等構造式［Ｃａ²⁺］_i＝Ｋ_D（(Ｒ−Ｒ_min)／Ｒ_max−Ｒ)）(Ｓ_f2／Ｓ_b2)により処理し、血小板内フリーＣａ²⁺濃度を決定した。フラ−２のＫ_Dは２２４ｎＭと推定された。Ｒ_max及びＲ_minは、実験の最後に測定したそれぞれ最大及び最小蛍光比である。Ｓ_f2及びＳ_b2はそれぞれ飽和［Ｃａ²⁺］の存在しない場合、及び存在する場合の３８０ｎｍにおける蛍光値である。対照実験において、ＢＫ断片配列番号：７は、濃度依存的方法でα−トロンビン誘発性カルシウム動員を阻害することができた。１ｍＭ配列番号：７は、α− トロンビン誘発性カルシウム動員を８０％阻害した。これらのデータは、ＢＫ類似体が、刺激−反応連結メカニズムのレベルで血小板のα−トロンビン活性化を妨害し得ることを示す。カルシウム動員アッセイの変法は、線維芽細胞(トロンビンのための単一のレセプター、ＰＡＲ１を発現する)、臍静脈内皮細胞、又はクローン化トロンビンレセプターを発現し、プラスチック・ウェルの底部に単層として増殖するその他の細胞を用いる。トロンビンレセプターを発現し、カルシウム動員能力が阻害され得るその他の種類の細胞の例は、平滑筋細胞、星状膠細胞及び神経細胞を含む。線維芽細胞又は内皮細胞を２４−９６ウェループレートに増殖させ、ＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液中、３７℃で６０分間インキュベートすることによって蛍光Ｃａ²⁺インジケータフラ−２アセチルオキシメチルエステル（５μＭ、モレキュラープローブ社(Molecular Probes Inc.)）を担持させた。細胞を洗浄後、細胞の蛍光をサーモスタットで３７℃に調温したパッド上で１分間モニターした後、細胞をＢＫ類似体の非存在下、及び存在下でα−トロンビン（１から５ｎＭ）と共にインキュベートした。蛍光をパーキン−エルマーＬＳ−５０Ｂルミネッセンススペクトロフルオロメータによって検出した。励起は３４０及び３８０ｎｍ波長で測定し、発光は５１０ｎｍで測定した。サイトゾル（細胞質）Ｃａ²⁺レベルは上記のように決定した。Ｒ_max値を２０μＭイオノフォア（Ionophor）Ａ２３１８７の存在下で１０ｍＭＣａ²⁺を用いて測定した。Ｒ_minは２０ｍＭＥＤＴＡの存在下で測定した。Ｄ．ＳＰＡＮ１２によって認識されるエピトープの排除の阻害フローサイトメトリー試験を行い、ＢＫ類似体が、レセプターのα−トロンビンによる開裂後に失われるトロンビンレセプター上のエピトープの排除を阻害するかどうかを確認した。ＳＰＡＮ１２は、このようなエピトープに特異的な、血小板上のトロンビンレセプターに対する抗体である。フローサイトメトリー試験用の血小板を、８.７ｍｌクエン酸デキストロース（１０ｍＭクエン酸三ナトリウム、６６ｍＭクエン酸、１１１ｍＭグルコース、ｐＨ４.６）で抗凝固した新鮮血液５５.３ｍｌから調製した。血小板リッチ−血漿からの洗浄済み血小板は、室温で１８０×ｇ、１５分間遠心分離することによって調製した。血小板リッチ−血漿をＰＧＥ₁（シグマ(Sigma)）で２.８μＭにし、１Ｍクエン酸ナトリウムで１：２５（ｖｏｌ：ｖｏｌ）にした。室温で５分間インキュベーション後、血小板リッチ−血漿を室温で１２００×ｇで１０分間遠心分離した。次に、血小板ペレットを血小板洗浄緩衝液（１２８ｍＭＮａＣｌ、４.２６ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、７.４６ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、４.７７ｍＭクエン酸ナトリウム、２.３５ｍＭクエン酸、５.５ｍＭグルコース、３.５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ６.５）１０ｍｌに再懸濁した後、室温で１２００ ×ｇで５分間遠心分離した。血小板懸濁緩衝液（１３７ｍＭＮａＣｌ、２.６ｍＭＫＣｌ、１３.８ｍＭＮａＨＣＯ₃、５.５ｍＭグルコース、１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０.３６ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、３.５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７.３５）５ｍｌに再懸濁した後、血小板数を４００,０００／μｌに調節した。洗浄済み血小板１００μｌを、ＢＫ類似体の非存在下、又は存在下で５ｍｌ丸底ポリスチレンチューブに入れた後、α−トロンビン(０.１２５Ｕ／ｍｌ又は１ｎＭ）で処理した。一次抗体類を最終濃度２μｇ／ｍｌで加え、抗体類を血小板と共に４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、血小板を血小板懸濁緩衝液５００μｌで希釈し、再び室温で１２００×ｇで５分間遠心分離した。次に、血小板ペレットを血小板懸濁緩衝液１００μｌに再懸濁し、ＦＩＴＣと結合した抗マウスＩｇＧの１：４０希釈液と共にインキュベートした。更に、４℃で３０分間インキュベーションして、血小板を再び１２００×ｇで５分間遠心分離した後、血小板懸濁緩衝液５００μｌに再懸濁した。マウスＩｇＧ及びエピトープＣＤ６２に対する抗体を対照として用いた。マウスＩｇＧ（コード＃４３５０）はバイオソース（BioSource）(キャマリロ、ＣＡ )から購入した。血小板に対する結合ＦＩＴＣ−抗−ＩｇＧの蛍光をEpics-Ｃフローサイトメーター（クルタ・エレクトロニックス(Coulter Electronics)、ハイアレス、ＦＬ）でモニターした。光散乱及び蛍光チャンネルをロガリズムゲインに設定した。レーザー励起は４８８ｎｍであった。緑色蛍光を５２５ｎｍバンドパスフィルターを通して観察した。少なくとも１５,０００血小板の相対的蛍光強度を各サンプルで分析した。ＣＤ６２に対する抗体（Ｐ−セレクチン）をベクトン−ディキンソン（Becton-Dickinson）(カタログ＃５５００１４)、サンジョス、ＣＡ、から購入した。ＳＰＡＮ１２は未刺激血小板上のトロンビンレセプター上の抗原を検出した。洗浄済み血小板を１ｎＭ α−トロンビンで処理した際、モノクローナル抗体ＳＰＡＮ１２のエピトープの抗原性発現が減少した。未刺激血小板上に見られたＳＰＡＮ１２エピトーブの前方散乱（forward scatter）は、α−トロンビン活性化血小板では元の方にシフトし、対照として用いたマウスＩｇＧのパターンと同様な不在（absent）抗原検出パターンを与える。対照実験においで、１ｍＭ天然（native）ＢＫ（配列番号：５）はα−トロンビン活性化血小板上のトロンビンレセプターのエピトープの喪失を妨害した。Ｅ．ＮＡＴ１２のα−トロンビン開裂の阻害トロンビンレセプター上のα−トロンビン開裂部位のアミノ酸３５−４６にわたるペプチドＮＡＴ１２（配列番号：２）(ヴ（Vu）ら、Cell 、６４、１０５７( １９９１)）も用いて、ＢＫ類似体がクローン化レセプターのα−トロンビン開裂をブロックするかどうかを確認した。開裂試験はモリノ(Molino)らの方法（J ．Biol．Chem.、２７０、１１１６８( １９９５)）によって行った。つまり、ＮＡＴ１２（配列番号：２）を０.０１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄及び０.１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７.４の溶液に溶解した。次に、混合物を１ｍＭのＢＫ類似体の不在（対照）又は存在下で８ｎＭ α−トロンビンと共に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を０ .１％トリフルオロ酢酸中Vyadec Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムに入れ、８０％ＭｅＣＮの０％から１００％の勾配及び０.１％トリフルオロ酢酸で溶出した。分離した生成物のサイズを質量分析によって確認した。ＮＡＴ１２（配列番号：２）は、ＨＰＬＣによって分析したとき、単一ピーク（ピーク１）を生成した。ＮＡＴ１２をα−トロンビンで処理した際には、そのピーク面積は８１％に減少し、２つの新しいピークがあらわれ、その新しいピークは元のピーク面積のそれぞれ４４％（ピーク３）及び３７％（ピーク２）を占めた。付加的ピーク、ピーク３及びピーク２は、ＮＡＴ１２の開裂生成物をあらわす。対照実験においで、ＢＫ断片配列番号：７の存在下では、ＮＡＴ１２のピーク１はα−トロンビン処理後５７％だけ減少し、ＮＡＴ１２の開裂生成物(ピーク３及びピーク２)は元のピーク面積のそれぞれ３１％及び２６％に過ぎなかった。例２結合アッセイタンパク質−タンパク質相互作用を示すために結合アッセイが用いられる。そして、結合アッセイを用いてタンパク質のどのドメインが結合に関与するかを確認し、種々のドメインの相対的結合親和性を確めることができる。結合アッセイはコンビナトリアルライブラリーのペプチド類等、多数のペプチドのスクリーニングにも用いられる。それは、ペプチド類の、ＮＡＴ１２ペプチド又はトロンビンレセプターへの結合能力をスクリーニングするために特に有用である。１つ以上の結合アッセイにおいて活性を示すペプチド類を、例１に記載したような、１つ以上のin vitro機能試験によっても試験する。結合試験及び機能試験の組合わせを用いて、トロンビン誘発性血小板及びその他の細胞の活性化を選択的に阻害する化合物を確認することができる。Ａ．ＮＡＴ１２ペブチドへの結合のアッセイコンビナトリアルライブラリーからのペプチドをミクロタイタープレート（mi crotiter plate）に結合し、ウェルを１％ＢＳＡでブロックする。ビオチニル化 −ＮＡＴ１２をミクロタイタープレートと共にインキュベートする。洗浄後、ペプチドを発現する基質支持体に付着したビオチン−ＮＡＴ１２の存在を、イムノピュア（ImmunoPure）ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ結合物（ピアス・ケミカル社(Pierce Chemical Co.)、ロックヴィル、ＩＬ）とのインキュベーション、続いてペルオキシダーゼ特異的で速やかに反応する基質、ｔｕｒｂｏ−３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ、ピアス・ケミカル社(Pierce Chemical Co.)、ロックヴィル、ＩＬ）とのインキュベーションによって検出する。室温で５分間インキュベーション後、ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢのカラー反応を１Ｍリン酸の添加によって停止する。ミクロプレートオートリーダーＥＬ３１１（バイオテク・インスツルメント(BioTek Inst rument)、ウィノスキＶＴ）を用いて４５０ｎｍにおける反応混合物の吸光度を測定することによって結合ペプチドを定量する。Ｂ．トロンビンレセプターへの結合アッセイ固相基質支持体上のコンビナトリアルライブラリーからのペプチドを、ビオチニル化トロンビンレセプターと共にインキュベートする。トロンビンレセプターは、当業者には公知の方法を用いて細菌、バクロウィルス、又はその他の組換え系に発現することができる。分離したレセプターを当業者には公知の方法によってビオチニル化する。標識レセプターを基質支持体上のペプチドと共にインキュベートし、上記したＮＡＴ１２結合アッセイと同様にして検出する。例３ In vivoクリアランス及び機能：in vitro結果との相関クリアランス試験を体重２.０から２.５ｋｇのニュージーランド白ウサギで行った。ウサギにミケルソン（Michelson）らの方法（J ．Mol．Cell Cardiol.、２０、５４７(１９８８)）により、１０ｍｇ／ｋｇの１Ｍキシラジン及び１０ｍｇ／ｋｇの１Ｍケタミンを準備投薬した。気管切開、挿管、及び室内空気で行われる陽圧呼吸（ハーバード・インスツルメンツ(Harvard instruments)）後、静脈内ペントバルビタール２０ｍｇ／ｍｌで段階ＩＩＩの外科的麻酔を維持した。頸動脈及び頸静脈を露出させた。カテーテルを露出した頸動脈に挿入し、血液試料の採取及び動物血圧のモニターを行った(グールド社(Gould，Inc.)、カルジオヴァスキュラー・プロダクツ、オクスナード、ＣＡ)。同様にして、露出した頸静脈にカテーテルを挿入し、麻酔剤及びＢＫ類似体を投与した。ＢＫ類似体の単回静脈注入を行った。動物の体重から、注射するＢＫ類似体の量を血中濃度が１ｍＭペプチドになるように計算した。例えば、２.５ｋｇウサギではその体重の７％が推定血液量１７５ｍｌを与える。従って、対照ＢＫ断片配列番号：７、８９ｍｇを注射した(１７５ｍｌ血漿中１ｍＭ濃度を与える)。動物の大きさに応じて、７５から９０ｍｇのペプチドを注射した。血液試料を、注入後２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、６０、９０、及び１２０分の間隔で、０.０１３Ｍクエン酸ナトリウム抗凝固溶液に採取した。時間毎に採取した血液試料の各々から、その血液試料を１０,０００×ｇで２分間遠心分離することによって、血漿を調製した。これら血漿のアリコートについて、大日本製薬（Dainippon Pharmaceutial Co.，Ltd.）(大阪、日本)より得たＭＡＲＫＩＴ− Ｍ［１−５］ＢＫアッセイを用いて、ＥＬＩＳＡ法によりＢＫ類似体抗原の存在を試験した。機能阻害試験では、体重２.０及び２.５ｋｇのニュージーランド白ウサギを上記のように外科的に準備した。上記のように計算したＢＫ類似体の単回注射後、５ｍｌ血液試料を、注射後２、６、１０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、及び２４０分間隔で、０.０１３Ｍクエン酸ナトリウム抗凝固溶液中に採取した。採取した血液試料を室温、１８０×ｇ（１０００ｒｐｍｓ）で１５分間遠心分離した。血液の血小板リッチ−血漿（ＰＲＰ：platele-rich p lasma）部分は上澄液に含まれていた。Ｈ−１０細胞計数器（テキサス・インタ −ナショナル．ラボラトリーズ社(Texas International Laboratories，Inc.)、ヒューストン、ＴＸ）で得られるＰＲＰの血小板数が、ウサギの血小板欠乏血漿で２００,０００−２５０,０００血小板／μｌになるように調節した。ＰＲＰを用いる血小板凝集試験を４−チャンネルアグレゴメータ（バイオデーターＰＡＰ−４、バイオーデータ社(Bio Data Corp.)、ハットボロ、ＰＡ）で行った。血小板凝集程度の測定は、３７℃に維持され、撹拌されているＰＲＰ懸濁液を通過する光透過の増加を測定することによって行われた。ハーフニスト（Harfenist）らの方法（Thromb ．Haemost.、５３、１８３(１９８５)）による２０μＭＡＤＰ及びγ−トロンビンの添加によって血小板凝集をＰＲＰサンプルに誘発した。ヒト血小板のように、ウサギ血小板もγ−トロンビンに対して種々の反応を示した。ＢＫ類似体注入前に、各ウサギの血小板のγ−トロンビンに対する閾反応を調べた。ウサギ血小板は一般的には１０ｎＭから４０ｎＭγ−トロンビンに反応する。同時に行われるγ−トロンビン誘発性血小板凝集試験を１０、２０、及び４０ｎＭ γ−トロンビン及び２０μＭＡＤＰで行った。対照実験はＢＫ断片配列番号：７を用いて行われた。注入後の、ＢＫ断片配列番号：７のピーク血漿濃度はＥＬＩＳＡによって測定したところ、ウサギ３匹中２匹では６０μｇ／ｍｌ（０.１２０ｍＭ）であった。ＢＫ断片の単回（ボルス）注射後、動物には不都合な効果は認められなかった。ウサギの血圧、脈拍、及び血小板数は安定したままで、切開、挿管の手術部位に異常出血はなかった。血漿中のＢＫ断片配列番号：７抗原クリアランスの半減期は、注射後２.８分と２０分の二相を有する。しかし、ＢＫ断片配列番号：７の生物学的クリアランスは長引いた。単回注射後、１０ｎＭ γ−トロンビン誘発性血小板凝集は４時間以上にわたり１００％阻害され、２０ｎＭ γ−トロンビン誘発性血小板凝集は２.７５時間にわたり５０％以上阻害され、そして、４０ｎＭ γ−トロンビン誘発性血小板凝集は１時間にわたり５０％以上阻害された。ＡＤＰ誘発性血小板凝集の５０％以上の阻害は約４５分間であった。これらのデータは、注入の２分後にわずか０.１２０ｍＭのピークペプチド濃度を示すＢＫ類似体を単回注入した後、in vivoでのトロンビン誘発性及びＡＤＰ誘発性血小板活性化に長時間の選択的阻害効果があったことを示している。ペプチドＲＰＰＧＦ（配列番号：７）をin vivoにてウサギに注入したとき、図１に示されるように、ex vivo（生体外）にてウサギ血小板リッチ−血漿中の γ−トロンビン誘発性血小板凝集が長時間阻害された。ヒト血小板試験は、上記の白ウサギを用いる機能試験と同様であった。つまり、血液試料は正常ヒトボランティアから得た。血小板数をクルタカウンター２Ｆ型（Coulter counter Model 2F）(クルタ(Coulter)、ハイアレス、ＦＬ)で測定し、血小板数を２００,０００血小板／μｌに調節した。ベースラインにおける各人の血小板の、γ−トロンビンに対する閾反応を測定した。典型的閾値は１０ｎＭから４０ｎＭであった。ＰＲＰ中のヒト血小板を２０ｎＭγ−トロンビンで処理した。１ｍＭＢＫ断片配列番号：７を２０ｎＭ γ−トロンビンと反応させたとき、凝集曲線は破壊された。この反応の特異性は、これらの結果を非ＢＫ類似体ペプチド（配列番号：８）で得られた結果と比較することによって証明された。配列番号：８（１ｍＭ）はγ−トロンビンの血小板活性化誘発能力を阻害することができなかった。ヒト血小板をin vitroでＲＰＰＧＦ（配列番号：７）で処理した。ＲＰＰＧＦ（配列番号：７）は長時間の阻害効果を有するようである。血小板リッチ−血漿中のヒト血小板を１ｍＭＲＰＰＧＦ（配列番号：７）で処理した。３７℃で１時間インキュベーション後、血小板リッチ−血漿を遠心分離してペレットとし、血漿を除去し、上記ペレットをＲＰＰＧＦ（配列番号：７）を含まない血小板欠乏血漿に再懸濁した。血小板リッチ−血漿にＲＰＰＧＦ処理された血漿を再懸濁した後、それらのγ−トロンビンの反応力を未処理血小板リッチ−血漿と比較した。全ての試験された事例において、ＲＰＰＧＦ処理された血小板リッチ−血漿の完全血小板凝集を引き起こすための閾として用いられたγ−トロンビン濃度は、同時に行われる対照の血小板リッチ−血漿で見られるものより大きかった。更に、対照の血小板リッチ−血漿の完全凝集を引き起こしたγ−トロンビンの濃度では、ＲＰＰＧＦ処理された血小板の各々が６２％以上阻害された。これらのデータは、血小板に結合したＲＰＰＧＦ（配列番号：７）が、γ−トロンビンによって誘発される血小板凝集に対するそれらの閾値を実際に高めたことを示す。例４ＢＫ類似体の調製Ａ．ペプチド類の調製ＢＫのペプチド類似体をアプライド・バイオシステムズ４３１型合成器（Appl ied Biosystems Model 431 peptide synthesizer）で合成した。カルボキシ末端アミノ酸を固相支持体に共有結合させ、特に記載しない限り、続くアミノ酸を次々にそのアミノ末端に連結した。結合すべきアミノ酸上のカルボキシル基を、２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキソフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）で活性化した。フルオレニル−メチルオキシカルボニル部分をブロッキング基としてアミノ末端に結合させた。ペプチド類を分離用逆相ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−アミドの合成を４−（２'，４'−ジメトキシフェニル）−ｆｍｏｃ−アミノメチルフェノキシ樹脂上で開始した。ｆｍｏｃ基を除去すると、合成はプロリンの結合で進行した。ペプチド（Ｄ−Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＡｒｇ−（Ｄ−Ｐｒｏ）−Ｐｒｏは当業者には公知の標準的な方法を用いて合成した。Ｂ．ＲＰＰＭＡＰ−４の調製 “ＭＡＰ”は“マルチプル抗原性ペプチド(multiple antigenic peptide)”の略語である。本明細書において“ＲＰＰＭＡＰ−４”と呼ばれるＲＰＰの４− 分岐ＭＡＰを合成した。ＲＰＰＭＡＰ−４の構造を以下に示した：ＲＰＰＭＡＰ−４を調製するために、カルボキシル基を介してβ−アラニンが結合している樹脂コアを、β−アラニン（βＡｌａ）の遊離アミンを介してリジンの遊離カルボキシル基に結合させ、リジン−β−アラニン錯化合物を形成した。更に別の２つのリジン残基をそれらの遊離カルボキシル基を介して第一のリジンの２つの遊離アミンに結合した。それから上記のようにＨＢＴＵ及びＨＯＢｔによる活性化後、ＲＰＰの４分子が、それらのプロリン残基を介して２つのリジン残基の遊離アミノ基に結合された。ＲＰＰＭＡＰ−４を逆相ＨＰＬＣによって精製し、それから質量分析によって特徴づけた。同様な方法を用いて、“ＰＰＭＡＰ−４ペプチド”（Ｐｒｏ−Ｐｒｏの４分岐ＭＡＰ）及び“ＲＰＰＧＦＭＡＰ−４ペプチド”（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）も合成した。Ｃ．ＲＰＰヘテロダイマーの調製ＲＰＰのヘテロダイマーを製造した。リジンをアミド樹脂、４−（２'，４'ジメトキシフェニル）−ｆｍｏｃ−アミノメチルフェノキシ樹脂に結合させた。そのｆｍｏｃ基を除去した後、ＲＰＰを上記のように合成し、リジンをカルボキシ末端に結合し、ＲＰＰＫを得た。Ｃ−末端リジンをヒドラジン及びジメチルホルムアミドで処理すると遊離アミノ基が生成し、それにアスパラギン酸を結合した。次に、Ｃ−末端アスパラギン酸から標準的な方法によってＲＰＰを合成すると、下記のヘテロダイマーが生成した。例５ＢＫ類似体はin vitroヒト血小板におけるトロンビン誘発性血小板活性化を阻害する例４で合成したペプチド類について血小板リッチ−血漿におけるγ−トロンビン誘発性血小板凝集阻害能力を分析した。Ａ．ＲＰＰＧＦ及びＲＰＰＡＦの阻害活性ＢＫ類似体Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（“ＲＰＰＡＦ”、配列番号：６）及びＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（“ＲＰＰＧＦ”、天然（native）ＢＫの断片、配列番号：７）は両方共例１Ａに記載したものと同様に、凝集アッセイにおいてγ−トロンビン誘発性血小板凝集阻害を示した。Ｂ．ＲＰＰ、ＲＰＰＭＡＰ−４、及びＲＰＰヘテロダイマーの阻害活性ＢＫ類似体Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ(“ＲＰＰ”)、ＲＰＰＭＡＰ−４、及びＲＰＰヘテロダイマーは全て、例１Ａに記載したもののように凝集アッセイでγ −トロンビン−誘発性血小板凝集の阻害を示した。図２に示すように、ＲＰＰは５０μＭで２７.５ｎＭ γ−トロンビン誘発性血小板凝集を廃止することができた。３実験において、ＲＰＰは０.０８９ｍＭ± ０.０４（平均値±ＳＤ）濃度でγ−トロンビン誘発性血小板凝集を１００％阻害した。ＲＰＰは阻害剤としてＲＰＰＧＦより２.５倍以上の効果を示した。ＲＰＰＧＦは同じ条件下で濃度０.２３ｍＭ±０.１２でγ−トロンビン誘発性血小板凝集を１００％阻害した。ペプチドＲＰＰ−アミド、（Ｄ−Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＡｒｇ−（Ｄ−Ｐｒｏ）−Ｐｒｏは、ＲＰＰそのものと比較してγ−トロンビン誘発性血小板凝集阻害能力が減少した。ジペプチドＡｒｇ-Ｐｒｏはγ−トロンビン誘発性血小板凝集に阻害活性を示さなかった。図３に示すように、ＲＰＰＭＡＰ−４は、４７μＭペプチド濃度（０.０４７ｍＭ±０.０１９、５実験の平均値±ＳＤ）で、γ−トロンビン誘発性血小板凝集を１００％阻害した。ＰＰＭＡＰ−４ペプチドはγ−トロンビン誘発性血小板活性化に対して阻害効果をもたなかった。図３に示すように、ＲＰＰのヘテロダイマー（ＨＥＴＥＲＯＤＩＭＥＲ）は、７５μＭペプチド（０.０７９ｍＭ±０.０３２、５実験の平均値±ＳＤ）でγ− トロンビン誘発性血小板凝集を１００％阻害した。ヘテロダイマーの阻害活性は、ＲＰＰＧＦの阻害活性より大きく、ＲＰＰの阻害活性とは等しかった。例６ＢＫ類似体はトロンビンレセプター開裂部位（ＮＡＴ１２）に結合するビオチニル化されたＮＡＴ１２のＢＫ類似体及びその他のペプチド類との特異的結合を例２Ａに記載のように試験した。結果を図４に示す。ビオチニル化ＮＡＴ１２はＲＰＰＧＦ(配列番号：７)、ＲＰＰＧＣ(配列番号：９)、及びＲＰＰＭＡＰ−４に特異的に結合するが、ペプチドＬＮＡ７（配列番号：８）又はＦＳＰＦＲ（配列番号：１０）には結合しない。例７ＢＫ類似体は線維芽細胞及びＨＵＶＥＣ細胞において α−トロンビン誘発性カルシウム動員を阻害するＢＫ類似体の、線維芽細胞及びヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるα −トロンビン誘発性カルシウム動員阻害能力を例１Ｃに記載のように試験した。図５及び図６に示すように、ＲＰＰＧＦ（配列番号：７）及びＲＰＰは線維芽細胞におけるカルシウム動員を阻害し、ＨＫ、ＲＰＰＭＡＰ−４、及びＲＰＰＧＦＭＡＰ−４は内皮細胞におけるカルシウム動員を阻害した。例８コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングしてＢＫ類似体を同定するＡ．ＮＡＴ１２ペプチド結合能力のスクリーニングコンビナトリアルライブラリーからのペプチドをミクロタイタープレートに連結し、１％ＢＳＡでブロックした。ビオチニル化−ＮＡＴ１２をミクロタイタープレートと共にインキュベートした。洗浄後、ペプチドを発現する基質支持体に結合したビオチン−ＮＡＴ１２の存在を、イムノピュア（ImmunoPure）ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（ピアスケミカル社(Pie rce Chemical Co.)、ロックヴィルＩＬ）と共にインキュベートした後、ペルオキシダーゼー特異的で速やかに反応する基質、ｔｕｒｂｏ−３，３'，５，５'− テトラメチルベンジジン（ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ、ピアスケミカル社(Pierce Chem ical Co.)、ロックヴィル、ＩＬ）とインキュベートすることによって検出した。室温で５分間インキュベーションした後、ｔｕｒｂｏ-ＴＭＢのカラー(発色) 反応を１Ｍリン酸の添加によって停止する。ミクロプレートオートリーダーＥＬ３１１（バイオテク・インスツルメント(Bio Tek Instrument)、ウィヌースキーＶＴ）を用いて４５０ｎｍにおける反応混合物の吸収を測定することによって、結合したペプチドを定量する。ＮＡＴ１２ペプチドに結合する化合物類について、例１に記載のアッセイを用いて血小板凝集阻害能力及びカルシウム動員阻害能力をも分析試験した。Ｂ．トロンビンレセプターに結合する能力のスクリーニング組換えトロンビンレセプターをビオチニル化した後、コンビナトリアルライブラリーからのペプチドと共に固相基質支持体上でインキュベートする。標識されたレセプターの結合を上記のようにして検出する。本明細書で述べられる全ての参考資料を引用して援用する。本発明が諸目的を果たすようによく適合されていること、並びに本発明に固有の目的及び利点を実現できることを当業者は容易に理解するだろう。本発明はその精神又は重要な特性から逸脱することなくその他の特殊な形で実施することもできる。従って、本発明の範囲を示すものとして、上述の説明よりも添付の請求を参考にされたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハサーン，アーメイドエイケイアメリカ合衆国ミシガン州 48130 デクスタデクスタ―アンアーバロード 5940

Claims

【特許請求の範囲】１．トロンビン誘起性の血小板又はその他の細胞の活性化を阻害する方法であって、このような処置を必要とする個体に対して、アミノ酸配列Ｘ₁−Ａｒｇ −Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂を有する１つ以上のセグメントを含む有効量の化合物を投与することを含み、前記化合物は、Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂；及びＬ−（Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂）_n；（ここで、Ｘ₁は、各セグメントにおいて同じであっても異なっていてもよく、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｘ₂は、各セグメントにおいて同じであっても異なっていてもよく、Ｘ₂のＮ−末端アミノ酸がグリシンではないという条件で、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｌは、共有結合又は化学的な基を含むリンカーであり；及びｎは、２から２０までの整数である）を含む群から選択される構造式を有することを特徴とする方法。２．Ｘ₁は、０から７個のアミノ酸であり、Ｘ₂は、０から９個のアミノ酸であることを特徴とする請求項１記載の方法。３．Ｘ₁は、配列番号：１のアミノ酸１−３０からの、０から３０個のアミノ酸であることを特徴とする請求項１記載の方法。４．Ｘ₁は、配列番号：１のアミノ酸２４−３０からの、０から７個のアミノ酸であることを特徴とする請求項２記載の方法。５．前記化合物は２つ以上のセグメントを含み、前記セグメントの少なくとも２つが異なることを特徴とする請求項１記載の方法。６．前記化合物は２つ以上のセグメントを含み、前記セグメントの全てが同一であることを特徴とする請求項１記載の方法。７．ｎが２から４の整数であることを特徴とする請求項１記載の方法。８．前記化合物は、構造式、Ｌ−（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂）_n を有することを特徴とする請求項１記載の方法。９．前記化合物は、構造式、Ｌ−（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）_n を有することを特徴とする請求項８記載の方法。１０．前記化合物は、（ａ）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ；（ｂ）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ(配列番号：６)；を含む群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。１１． in vivoにてＡＤＰ誘発性の血小板の活性化を阻害する方法であって、このような処置を必要とする個体に対して、アミノ酸配列Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂を有する１つ以上のセグメントを含む有効量の化合物を投与することを含み、前記化合物は、Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂；及びＬ−（Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂）_n；（ここで、Ｘ₁は、各セグメントにおいて同じであっても異なっていてもよく、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｘ₂は、各セグメントにおいて同じであっても異なっていてもよく、Ｘ₂のＮ−末端アミノ酸がグリシンではないという条件で、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｌは、共有結合又は化学的な基を含むリンカーであり；及びｎは、２から２０の整数である）を含む群から選択される構造式を有することを特徴とする方法。１２．Ｘ₁は、０から７個のアミノ酸であり、Ｘ₂は、０から９個のアミノ酸であることを特徴とする請求項１１記載の方法。１３．前記化合物は、（ａ）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ；（ｂ）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ(配列番号：６)；を含む群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の方法。１４．血小板凝集を防止する方法であって、このような処置を必要とする個体に対して、アミノ酸配列Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂を有する１つ以上のセグメントを含む有効量の化合物を投与することを含み、前記化合物は、Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂；及びＬ−（Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂）_n；（ここで、Ｘ₁は、各セグメントにおいて同じであっても異なっていてもよく、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｘ₂は、各セグメントにおいて同じであっても異なっていてもよく、Ｘ₂のＮ−末端アミノ酸がグリシンではないという条件で、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｌは、共有結合又は化学的な基を含むリンカーであり；及びｎは、２から２０の整数である）を含む群から選択される構造式を有することを特徴とする方法。１５．Ｘ₁は、０から７個のアミノ酸であり、Ｘ₂は、０から９個のアミノ酸であることを特徴とする請求項１４記載の方法。１６．Ｘ₁は、配列番号：１のアミノ酸１−３０からの、０から３０個のアミノ酸であることを特徴とする請求項１４記載の方法。１７．Ｘ₁は、配列番号：１のアミノ酸２４−３０からの、０から７個のアミノ酸であることを特徴とする請求項１５記載の方法。１８．前記化合物は２つ以上セグメントを含み、前記セグメントの少なくとも２つが異なることを特徴とする請求項１４記載の方法。１９．前記化合物は２つ以上のセグメントを含み、前記セグメントの全てが同一であることを特徴とする請求項１４記載の方法。２０．ｎが２から４までの整数であることを特徴とする請求項１４記載の方法。２１．前記化合物は、構造式、Ｌ−（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂）_n を有することを特徴とする請求項１４記載の方法。２２．前記化合物は、構造式、Ｌ−（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）_n を有することを特徴とする請求項２１記載の方法。２３．前記化合物は、（ａ）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ；（ｂ）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ(配列番号：６)；を含む群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。２４．薬物学的に容認される担体と、アミノ酸配列Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ− Ｐｒｏ−Ｘ₂を有する１つ以上のセグメントを含む化合物と、を含む医薬組成物でって、前記化合物は、Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂；及びＬ−（Ｘ₁−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ₂）_n；（ここで、Ｘ₁は、各セグメントにおいて同じであっても異なっていてもよく、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｘ₂は、各セグメントにおいて同じであっても異なっていてもよく、Ｘ２のＮ−末端アミノ酸がグリシンではないという条件で、０から３０個の天然又は合成アミノ酸であり；Ｌは、共有結合又は化学的な基を含むリンカーであり；及びｎは、２から２０の整数である）を含む群から選択される構造式を有することを特徴とする医薬組成物。２５．薬物学的に容認される担体と、（ａ）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ；（ｂ）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ(配列番号：６)；を含む群から選択される構造式を有する化合物と、を含むことを特徴とする請求項２４記載の医薬組成物。２６．トロンビン誘発性の血小板及びその他の細胞の活性化を選択的に阻害する化合物を確認する方法であって、前記化合物の、トロンビンレセプター上のトロンビン開裂部位へ結合する能力を測定することを含むことを特徴とする方法。２７．前記化合物は、コンビナトリアルライブラリーに存在することを特徴とする請求項２６記載の方法。２８．更に、（ａ）前記化合物の、トロンビン誘発性の血小板凝集を阻害する能力を測定し；及び（ｂ）前記化合物の、線維芽細胞におけるトロンビン誘発性のカルシウム動員を阻害する能力を測定する、ことを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。