JP2001204478A - 新規蛋白質およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】マウス由来の特定のアミノ酸配列を有する
新規蛋白質、該蛋白質遺伝子を含むＤＮＡ、該蛋白質の
製造法、及び該ＤＮＡ並びに該蛋白質の用途の提供。 【効果】本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定、
抗体及び血清の入手、組換え型蛋白質の発現系の構
築、発現系を用いた結合アッセイ系及びｔｗｏ−ｈｙ
ｂｒｉｄ法を用いたアッセイ系の開発と医薬品侯補化合
物のスクリーニング、構造的に類似したリガンド・レ
セプターとの比較に基づいたドラッグデザインの実施、
遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマーの作
成等における試薬として用いることができ、又、遺伝
子治療等の薬物として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定のアミノ酸配
列を有する新規蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ領
域を含有するＤＮＡ、該蛋白質の製造方法および該蛋白
質ならびにＤＮＡの用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、多数の生理活性物質が単離・同定
され、その機能が解明されつつある。そのなかには、種
々の臓器あるいは細胞で多様な活性を示すものもあるこ
とが知られている。種々の臓器あるいは細胞における多
様な生理活性は、通常、該生理活性物質が結合する受容
体を介して具現化しているが、その受容体に結合する生
理活性物質の組み合わせがすべての臓器・細胞において
同一なのか、あるいは各臓器・細胞に特異的なのかは、
解明されていない例が多い。生理活性蛋白質の中にはＰ
ＤＺドメインを持つものがあり、そのＰＤＺドメインは
比較的最近見いだされた蛋白質結合ドメインモジュール
である。そのため、ＰＤＺドメインを持つ蛋白質の生体
内での分布、機能、制御機構などはまだ多くが不明であ
るが、その蛋白質結合の機能を介して、細胞膜の裏打ち
構造や細胞骨格のネットワーク形成、さらに細胞内表層
に発達した細胞内シグナル伝達のネットワーク形成など
に重要な役割を担っていると考えられる。神経系におい
ては、神経伝達物質受容体やイオンチャンネルなどの複
合体形成に係わるなど、シナプス部位の蛋白質クラスタ
ーのアセンブリーに欠かせない。また、最近、シナプス
可塑性に伴い発現が調節されるＰＤＺ蛋白質が見出さ
れ、ＰＤＺ蛋白質が受容体の再配置などを通じて可塑性
に伴うシナプスの形態変化に係わっている可能性があ
り、発生段階の神経ネットワークの構築や生体の脳の高
次機能にも関与していると考えられる。ＰＤＺドメイン
は既知のペプチド結合ドメインとの共通点もあるが、明
らかな特徴的な点も有している。ＰＤＺドメインは細菌
から高等植物、動物にまで広く保存されたドメインであ
り、多くの場合、ＰＤＺドメインが認識するのは標的蛋
白質の最もＣ末端の短いアミノ酸配列で、これらの標的
蛋白質は膜貫通型受容体やチャンネルであることが多
い。ＰＤＺドメインは同一蛋白質中に２から６回程度繰
り返された形で見いだされることが多く、また、ほかの
ドメインモジュールとは異なり、そのいくつかはホモダ
イマーを形成する。これらは、ＰＤＺドメインがシナプ
スなどの細胞表面構造やタイトジャンクションなど、細
胞間接着における蛋白質架橋ネットワークやマイクロド
メインの形成などに係わるための重要な特徴である。ア
クチビンは、初期胚の中胚葉誘導や神経誘導の制御、脳
下垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌促
進に関わる調節因子であり、ＴＧＦ−βスーパーファミ
リーの一員である。ＴＧＦ−βファミリーの受容体に
は、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するＩ型とII
型の２種類が存在する。リガンド刺激がII型によるＩ型
の活性化を惹起し、活性化されたＩ型からアクチビン細
胞内情報伝達分子であるＳｍａｄ等を介して情報伝達が
行われる。アクチビン受容体II型にはIIＡ、IIＢの２種
類の遺伝子から選択的にスプライシングにより生産され
る多様な分子が存在し、Ｉ型の活性化以外に重要な役割
を持つ可能性が考えられているが、未だ明らかとなって
いない。また、従来、脳下垂体からの性腺刺激ホルモン
の分泌調節は、生殖腺で生産されるステロイドホルモン
が主であると考えられていたが、アクチビンおよびこれ
と相反する作用をもつインヒビンの発見により視床下部
−脳下垂体−生殖器官系の新しいホルモン分泌調節機構
として関心を集めている。アクチビンの生理活性の解析
が進むにつれて、この系は、ＦＳＨ分泌調節以外に血球
系や生殖器官の細胞の分化誘導あるいは阻害活性、神経
細胞生存維持活性などの多様な生理活性を有することが
解ったが、その詳細な機構については未だ解明されてい
ない点が多い。

【０００３】

【発明の解決しようとする課題】本発明は、ＰＤＺドメ
インを持つ蛋白質および該蛋白質に対する結合能を有す
る受容体（例えば、アクチビン受容体）の生理活性の解
明、およびアクチビン−アクチビン受容体系の組織での
細胞分化阻害および神経栄養因子様活性などの生理活性
発現の詳細な分子機構等を解明する手段として、新規な
該蛋白質の単離法ならびに検出法、該新規蛋白質遺伝子
を含むＤＮＡ、該新規蛋白質遺伝子がコードする蛋白質
の製造法、および該ＤＮＡならびに該蛋白質の用途を提
供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、鋭意研究を行った結果、配列番号：
１で表されるマウスアクチビンＩＩＡ受容体蛋白質の細
胞内領域をベイト（ｂａｉｔ）とした酵母ツーハイブリ
ッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用い、マウス脳ｃＤ
ＮＡライブラリーより結合蛋白質の探索を行い、ＣＯＳ
７細胞内でもアクチビンＩＩＡ受容体との結合が確認で
きるｃＤＮＡクローンを単離し、解析したところ、1個
のＰＤＺドメインをコードする領域を含む遺伝子である
ことを見いだした。この遺伝子にコードされる該蛋白質
は、蛋白質−蛋白質相互作用ドメインを持つ蛋白質因子
であり、そのドメインを介してアクチビン受容体の細胞
内領域と結合するが、アクチビンのシグナル伝達を抑制
しないことを見いだした。さらに、本発明者らは、マウ
スの各種臓器からｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを抽出し、配
列番号：４に示すＤＮＡをプローブとして用い、ノーザ
ンハイブリダイゼーション法にて本発明の新規蛋白質の
発現を調べたところ、図２に示すように、心臓、脳、肝
臓、骨格筋、腎臓、精巣などの種々の臓器で広範囲にそ
の発現が見られることを見いだした。このことから、該
新規蛋白質は種々の臓器でのアクチビン−アクチビン受
容体情報伝達系において重要な役割（例えば、アクチビ
ン受容体の細胞膜上への運搬など）を果たすことが示唆
され、アクチビン受容体の機能異常に関連する疾患の診
断、治療等へ応用できることを見いだした。本発明者ら
は、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結
果、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）配列番号：２
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を有する蛋白質またはその塩、（２）第
（１）項記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
（３）第（１）項記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含
有する組換えＤＮＡ、（４）配列番号：３で表される塩
基配列またはそれとハイストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズする塩基配列を有する第（３）項記載のＤ
ＮＡ、（５）第（２）項記載の部分ペプチドをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
（６）第（３）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクタ
ー、（７）第（６）項記載の組換えベクターを保持する
形質転換体、（８）第（７）項記載の形質転換体を培養
し、第（１）項記載の蛋白質を生成・蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする、第（１）項記載の蛋白質
またはその塩の製造方法、（９）第（１）項記載の蛋白
質、第（２）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に
対する抗体、（１０）第（９）項記載の抗体に対して、
第（１）項記載の蛋白質、第（２）項記載の部分ペプチ
ドまたはそれらの塩を含有する被検液および標識化され
た第（１）項記載の蛋白質、第（２）項記載の部分ペプ
チドまたはそれらの塩を競合的に反応させることを特徴
とする、第（１）項記載の蛋白質、第（２）項記載の部
分ペプチドまたはそれらの塩の定量方法、（１１）第
（１）項記載の蛋白質、第（２）項記載の部分ペプチド
またはそれらの塩を用いることを特徴とする、第（１）
項記載の蛋白質、第（２）項記載の部分ペプチドまたは
それらの塩と結合する蛋白質の決定方法、（１２）第
（１１）項記載の方法により得られる、第（１）項記載
の蛋白質、第（２）項記載の部分ペプチドまたはそれら
の塩と結合する蛋白質またはその塩、（１３）第（１）
項記載の蛋白質、第（２）項記載の部分ペプチドまたは
それらの塩と、第（１２）項記載の蛋白質またはその塩
あるいはアクチビン受容体蛋白質またはその塩との結合
を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法、（１４）ツーハイブリッド法を用いることを
特徴とする、第（１１）項記載の蛋白質の決定方法また
は第（１３）項記載のスクリーニング方法、（１５）第
（１）項記載の蛋白質、第（２）項記載の部分ペプチド
またはそれらの塩を含有することを特徴とする、第
（１）項記載の蛋白質、第（２）項記載の部分ペプチド
またはそれらの塩と、第（１２）項記載の蛋白質または
その塩あるいはアクチビン受容体蛋白質またはその塩と
の結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスク
リーニング用キット、（１６）第（１３）項記載のスク
リーニング方法または第（１５）項記載のスクリーニン
グ用キットを用いて得られる、第（１）項記載の蛋白
質、第（２）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩
と、第（１２）項記載の蛋白質またはその塩あるいはア
クチビン受容体蛋白質またはその塩との結合を阻害また
は促進する化合物またはその塩、（１７）第（１２）項
記載の蛋白質、第（１６）項記載の化合物またはそれら
の塩を含有してなる医薬、および（１８）第（１２）項
記載の蛋白質もしくはその塩、アクチビン受容体または
アクチビン細胞内情報伝達分子に関連した神経細胞異常
または脳疾患の予防・治療剤である第（１７）項記載の
医薬を提供する。

【０００６】より具体的には、本発明は、（１９）蛋白
質がＰＤＺドメインを有する蛋白質である第（１）項記
載の蛋白質、（２０）蛋白質が心臓、脳、肝臓、骨格
筋、腎臓、精巣、肺、脾臓で発現する蛋白質である第
（１９）項記載の蛋白質、（２１）蛋白質がアクチビン
受容体に対する結合能を有する蛋白質である第（２０）
項記載の蛋白質、（２２）蛋白質がアクチビンのシグナ
ル伝達を抑制しない蛋白質である第（２１）項記載の蛋
白質、（２３）蛋白質が、配列番号：２で表されるアミ
ノ酸配列、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１
または２個以上（好ましくは、２個以上１０個以下）の
アミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２で
表されるアミノ酸配列中に１または２個以上（好ましく
は、２個以上１０個以下）のアミノ酸配列が付加または
挿入されたアミノ酸配列、あるいは配列番号：２で表さ
れるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、
２個以上１０個以下）のアミノ酸配列が他のアミノ酸と
置換されたアミノ酸配列を含有する第（１）項記載の蛋
白質およびその塩、（２４）酵母を用いる第（１４）項
記載のツーハイブリッド法、（２５）標識した第（１）
項記載の蛋白質またはその塩をアクチビン受容体に接触
させた場合と、標識した第（１）項記載の蛋白質または
その塩および被験化合物をアクチビン受容体に接触させ
た場合における、標識した第（１）項記載の蛋白質また
はその塩のアクチビン受容体に対する結合量を測定し、
比較することを特徴とする、第（１）項記載の蛋白質ま
たはその塩とアクチビン受容体との結合を阻害または促
進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、

【０００７】（２６）標識した第（１）項記載の蛋白質
またはその塩を第（１２）項記載の蛋白質またはその塩
に接触させた場合と、標識した第（１）項記載の蛋白質
またはその塩および被験化合物を、第（１２）項記載の
蛋白質またはその塩に接触させた場合における、標識し
た第（１）項記載の蛋白質またはその塩の第（１２）項
記載の蛋白質またはその塩に対する結合量を測定し、比
較することを特徴とする、第（１）項記載の蛋白質また
はその塩と第（１２）項記載の蛋白質またはその塩との
結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、（２７）アクチビン受容体を発現した細
胞に第（１）項記載の蛋白質またはその塩を導入した場
合と、アクチビン受容体を発現した細胞に第（１）項記
載の蛋白質またはその塩および被験化合物を導入した場
合における、第（１）項記載の蛋白質またはその塩の該
細胞内におけるアクチビン受容体に対する結合量を測定
し、比較することを特徴とする、第（１）項記載の蛋白
質またはその塩とアクチビン受容体との結合を阻害また
は促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２８）標識した第（１）項記載の蛋白質またはその塩
をアクチビン受容体を発現した細胞の膜画分に接触させ
た場合と、標識した第（１）項記載の蛋白質またはその
塩および被験化合物をアクチビン受容体を発現した細胞
の膜画分に接触させた場合における、標識した第（１）
項記載の蛋白質またはその塩の該細胞の膜画分に対する
結合量を測定し、比較することを特徴とする、標識した
第（１）項記載の蛋白質またはその塩とアクチビン受容
体との結合を阻害または促進する化合物またはその塩の
スクリーニング方法、（２９）アクチビン受容体を発現
した細胞に第（１）項記載の蛋白質またはその塩を導入
した場合と、アクチビン受容体を発現した細胞に第
（１）項記載の蛋白質またはその塩および被験化合物を
導入した場合における、アクチビン受容体を介した細胞
刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、第
（１）項記載の蛋白質またはその塩とアクチビン受容体
との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のス
クリーニング方法、（３０）第（２５）項〜第（２９）
項のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られ
る化合物またはその塩、（３１）第（３０）項記載の化
合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬組成
物、（３２）第（１２）項記載の蛋白質もしくはその
塩、アクチビン受容体またはアクチビン細胞内情報伝達
分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予防・治療
剤である第（３１）項記載の医薬、（３３）哺乳動物に
対して第（１２）項記載の蛋白質、第（１６）項記載の
化合物またはその塩を有効量投与することを特徴とす
る、第（１２）項記載の蛋白質もしくはその塩、アクチ
ビン受容体またはアクチビン細胞内情報伝達分子に関連
した神経細胞異常または脳疾患の予防・治療方法、およ
び（３４）第（１２）項記載の蛋白質もしくはその塩、
アクチビン受容体またはアクチビン細胞内情報伝達分子
に関連した神経細胞異常または脳疾患の予防・治療剤を
製造するための第（１２）項記載の蛋白質、第（１６）
項記載の化合物またはその塩の使用に関する。

【０００８】さらに、本発明は、（３５）外来性の第
（３）項記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非
ヒト哺乳動物、（３６）非ヒト哺乳動物がげっ歯類動物
である第（３５）項記載の非ヒト哺乳動物、（３７）げ
っ歯類動物がマウスである第（３６）項記載の非ヒト哺
乳動物、（３８）げっ歯類動物がラットである第（３
６）項記載の非ヒト哺乳動物、および（３９）外来性の
第（３）項記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有
し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供
する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の配列番号：２で表される
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
蛋白質としては、例えば、ヒトや温血動物（例えば、モ
ルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、
ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾
細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、
メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上
皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂
肪細胞、免疫細胞（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、
Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好
塩基球、好酸球、単球など）、巨核球、滑膜細胞、軟骨
細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしく
は間質細胞、またはこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞も
しくはガン化細胞など］もしくはそれらの細胞が存在す
るあらゆる組識［例えば、脳、脳の各部位（例えば、嗅
球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳
皮質、延髄、小脳など）脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎
臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮
膚、筋肉、肺、消化管（例えば、大腸、小腸など）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾
丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など］または
血球系の細胞もしくはその培養細胞株など（特に脳）に
由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であっても
よい。

【００１０】配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質とは、配列
番号：２で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ま
しくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最
も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配
列を有する蛋白質などが挙げられる。本発明の配列番
号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を含有する蛋白質とは、例えば、前記の配列番
号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を有し、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を
含有する蛋白質と実質的に同一の生理活性を有する蛋白
質などが好ましい。 実質的に同一の生理活性としては、例えば、受容体親和
性、シグナル情報伝達能、臓器発現分布などの質的要素
が挙げられる。実質的に同一とは、それらの生理活性が
生物学的または生理学的に同質であることを示す。した
がって、受容体親和性の強さなどの活性が同等（例え
ば、約０．１〜２０倍、好ましくは約０．５〜２倍）で
あることが好ましいが、これらの活性の強弱、蛋白質の
分子量などの量的要素は異なっていてもよい。例えば、
受容体親和性の測定は、自体公知の方法に準じて行うこ
とができるが、例えば、後述するスクリーニング方法に
従って測定することができる。また、本発明の蛋白質と
しては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１から１０個程
度、より好ましくは１から５個程度、さらに好ましくは
１から３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１から１０個程度、より好ましくは１か
ら５個程度、さらに好ましくは１から３個）のアミノ酸
が付加または挿入されたアミノ酸配列、配列番号：２で
表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好まし
くは、１から１０個程度、より好ましくは１から５個程
度、さらに好ましくは１から３個）のアミノ酸が他のア
ミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み
合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆる
ムテインも含まれる。

【００１１】本明細書における蛋白質は、ペプチド表記
の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ
末端（カルボキシル末端）である。配列番号：２で表さ
れるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本
発明の蛋白質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯ
ＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ^-）である
が、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル
（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけ
るＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アル
キル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなど
のＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナ
フチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベンジル、フ
ェネチル、α−ナフチルメチルなどのＣ_6-12アリール−
Ｃ_1-2アルキル基のほか、経口用エステルとして汎用さ
れるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられ
る。本発明の蛋白質がＣ末端以外にカルボキシル基（ま
たはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシ
ル基がアミド化またはエステル化されているものも本発
明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、
例えば、上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ末端のメチオニン残基
のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、生
体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン酸残基が
ピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上
にある、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ₂、ＳＨなどが
適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などの
Ｃ_1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは
糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質など
も含まれる。本発明の蛋白質の具体例としては、配列番
号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質などが
用いられる。

【００１２】本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、
前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであって、本発
明の蛋白質が有する生理活性、例えば、受容体親和性、
シグナル情報伝達能などの活性、臓器発現分布などを有
するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発
明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち２０個以上、好ま
しくは５０個以上、さらに好ましくは８０個以上、より
好ましくは１００個以上、最も好ましくは１２０個以上
のアミノ酸配列を有し、受容体親和性、シグナル情報伝
達能などを有するペプチドなどが用いられる。また、本
発明の部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または
２個以上（好ましくは１から１０個程度、さらに好まし
くは１から３個）のアミノ酸が欠失し、または、そのア
ミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１から１
０個程度、より好ましくは１から５個程度、さらに好ま
しくは１から３個）のアミノ酸が付加し、または、その
アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１か
ら１０個程度、より好ましくは１から５個程度、さらに
好ましくは１から３個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸
で置換されていてもよい。また、本発明の部分ペプチド
はＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカ
ルボキシレート（−ＣＯＯ^-）であるが、前記した本発
明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）
またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さら
に、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白
質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護
基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断されて
生成したグルタミル基がピログルタミン化したもの、分
子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護
されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペ
プチドなどの複合ペプチドなども含まれる。

【００１３】本発明の蛋白質またはその部分ペプチドの
塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が
好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例え
ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるい
は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル
酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ
酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼン
スルホン酸）との塩などが用いられる。また、無機塩基
（例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、
カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、ア
ルミニウムまたはアンモニウムなど）との塩、有機塩基
（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリ
ジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミ
ン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シク
ロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’
−ジベンジルエチレンジアミンなど）との塩なども用い
られる。本発明の蛋白質またはその塩は、前述したヒト
や温血動物の細胞または組織から自体公知の方法によっ
ても製造することもできるし、後述する該蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによ
っても製造することができる。また、後述のペプチド合
成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の
組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組
織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組合せる
ことにより単離精製することができる。

【００１４】本発明の蛋白質、その部分ペプチドもしく
はそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、通常
市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのよ
うな樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロ
キシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメ
チル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹
脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹
脂、４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル
樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジ
メトキシフェニルヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、
４−（２' ，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミ
ノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。
このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適
当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通り
に、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させ
る。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各
種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスル
フィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分
ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した
保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用でき
る各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カル
ボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣ
Ｃ、Ｎ，Ｎ' −ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エ
チル−Ｎ' −（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセ
ミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とと
もに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対
称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔ
エステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行っ
た後に樹脂に添加することができる。保護アミノ酸の活
性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質
縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜
選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリ
ドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムな
どのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールな
どのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホ
キシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン
などのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル
などのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエス
テル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられ
る。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ること
が知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃
から５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたア
ミノ酸誘導体は通常１．５から４倍過剰で用いられる。
ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分
な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り
返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を
繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢
酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸
をアセチル化することができる。

【００１５】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒ
ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロ
ヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直
鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラ
ルキルエステル化、（例えば、ベンジルエステル、４−
ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステ
ル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルヒ
ドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護す
ることができる。セリンの水酸基は、例えば、エステル
化またはエーテル化によって保護することができる。こ
のエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基
などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイ
ル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニ
ル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。ま
た、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル
基、テトラヒドロピラニル基、ｔｅｒｔ−ブチル基など
である。チロシンのフェノール性水酸基の保護基として
は、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベン
ジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔｅｒｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕ
ｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。原料
のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例え
ば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコ
ール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−
トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、
シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯ
ＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、ＨＯＢｔ）とのエス
テル］などが用いられる。原料のアミノ基の活性化され
たものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用い
られる。

【００１６】保護基の除去（脱離）方法としては、例え
ば、Ｐｄ黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での
水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メ
タンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリ
フルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理
や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、
ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また、液
体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられ
る。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃か
ら４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例え
ば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタク
レゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，
４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなど
のようなカチオン補足剤の添加が有効である。また、ヒ
スチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４
−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去
され、トリプトファンのインドール保護基として用いら
れるホルミル基は上記１，２−エタンジチオール、１，
４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保
護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなど
によるアルカリ処理によっても除去される。原料の反応
に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およ
びその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化な
どは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。蛋
白質またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法
としては、例えば、まず、カルボキシル末端アミノ酸の
α−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ
基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした
後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみ
を除いた蛋白質（部分ペプチド）とＣ末端のカルボキシ
ル基の保護基のみを除去した蛋白質（部分ペプチド）と
を製造し、この両蛋白質（部分ペプチド）を上記したよ
うな混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細について
は上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を
精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、
所望の粗蛋白質（部分ペプチド）を得ることができる。
この粗蛋白質（部分ペプチド）は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
蛋白質（部分ペプチド）のアミド体を得ることができ
る。蛋白質またはその部分ペプチドのエステル体を得る
には、例えば、カルボキシル末端アミノ酸のα―カルボ
キシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステ
ルとした後、蛋白質（部分ペプチド）のアミド体と同様
にして、所望の蛋白質（部分ペプチド）のエステル体を
得ることができる。

【００１７】本発明の部分ペプチドまたはそれらの塩
は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本
発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによ
って製造することができる。ペプチドの合成法として
は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによって
もよい。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部分ペ
プチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成
物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより
目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方
法や保護基の脱離としては、例えば、以下のからに
記載された方法が挙げられる。 Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔ
ｉ、ペプチド シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年） ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ ペプチ
ド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年） 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）
（１９７５年） 矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパ
ク質の化学IV、２０５、（１９７７年） 矢島治明監修、続医薬品の開発 第１４巻 ペプチド合
成 広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸
留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィ
ー、再結晶などを組合せて本発明の蛋白質またはその部
分ペプチドを単離精製することができる。上記方法で得
られる該蛋白質またはその部分ペプチドが遊離体である
場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することが
できるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によっ
て遊離体に変換することができる。

【００１８】本発明の蛋白質をコードするＤＮＡとして
は、前述した本発明の蛋白質をコードする塩基配列を含
有するものであればいかなるものであってもよい。ま
た、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記し
た細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来
のｃＤＮＡライブラリーより自体公知の方法により単離
されたもの、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリ
ーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラス
ミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画
分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接Ｒ
ｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ
−ＰＣＲ法と略称する）によって単離することもでき
る。本発明の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮ
Ａ、または配列番号：３で表される塩基配列を有する
ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡを有し、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有する蛋白質と同質の生理活性、例えば、受容体
親和性、シグナル情報伝達能などの活性、臓器発現分布
などを有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれ
のものでもよい。配列番号：３で表される塩基配列を有
するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３で
表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％
以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは
約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮ
Ａなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体
公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行うことがで
きる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付
の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って
行うことができる。ハイストリンジェントな条件とは、
例えば、ナトリウム濃度が約１９から４０ｍＭ、好まし
くは約１９から２０ｍＭで、温度が約５０から７０℃、
好ましくは約６０から６５℃の条件を示す。特に、ナト
リウム濃度が約１９ｍＭで、温度が約６５℃の場合が最
も好ましい。より具体的には、配列番号：２のアミノ酸
配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配
列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡなどが用
いられる。

【００１９】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリーより自体公知の方法
により単離されたもの、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例
えば、配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤ
ＮＡ、または配列番号：３で表される塩基配列を有す
るＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡを有し、配列番号：２で表されるアミノ
酸配列を有する蛋白質と同質の活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用
いられる。ハイブリダイゼーションの方法およびハイス
トリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられ
る。

【００２０】本発明の蛋白質またはその部分ペプチド
（以下、本発明の蛋白質と略記する）をコードするＤＮ
Ａのクローニングの手段としては、本発明の蛋白質の部
分配列をコードする塩基配列を有する合成ＤＮＡプライ
マーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当
なベクターに組み込んだＤＮＡ、また、ゲノムＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来の
ｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラ
リーより自体公知の方法により単離されたものを本発明
の蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片
もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリ
ダイゼーションによって単離することができる。ハイブ
リダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー ク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２
ｎｄ （ Ｊ.Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ.ａｌ., Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ.Ｐｒｅｓｓ，１９
８９）に記載の方法などに従って行うことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行うことができる。ＤＮＡの
塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ
ｔ^TM−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造
（株））、Ｍｕｔａｎｔ^TM−Ｋ（宝酒造（株））などを
用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇｕｐｐｅｄ ｄｕｐ
ｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるい
はそれらに準じる方法に従って行うことができる。

【００２１】クローン化された本発明の蛋白質をコード
するＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制
限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用す
ることができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始
コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳
終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有し
ていてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加すること
もできる。本発明の蛋白質の発現ベクターは、例えば、
（イ）本発明の蛋白質をコードするＤＮＡから目的とす
るＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な
発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することに
より製造することができる。べクターとしては、大腸菌
由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，
ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド
（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由
来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファ
ージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワク
シニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルス
などの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、
ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられ
る。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子
の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであ
ればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主と
して用いる場合は、ＳＶ４０由来のプロモーター、レト
ロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイ
ルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、サイトメガロウイルスプロモータ
ー、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿
主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ
_Lプロモーター、ｌｐｐプロモータなどが、宿主がバチ
ルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０
２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵
母である場合は、ｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモ
ーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなど
が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合には、ポリヘド
リンプロモーター、Ｐ１０プロモ−ターなどが好まし
い。

【００２２】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子［メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性］、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
などが挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を
用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場
合、目的遺伝子を含有する形質転換体をチミジンを含ま
ない培地によっても選択することができる。また、必要
に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の蛋白
質のＮ末端側に付加することもできる。宿主がエシェリ
ヒア属菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シ
グナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバ
チルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配
列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母で
ある場合は、メイテイングファクターα・シグナル配
列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細
胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配
列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・
シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにし
て構築された本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有
するベクターを用いて、形質転換体を製造することがで
きる。

【００２３】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓ
ｃｉ. ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ
１０３〔ヌクイレックアシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９
（１９８１）, ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０巻，５１７
（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレ
キユラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６
９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられ
る。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４
〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２
２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻．
８７（１９８４）〕などが用いられる。酵母としては、
例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１
９１３、ＮＣＹＣ２０３６、サッカロマイセス ピキア
パストリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｉｃｊ
ｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。昆虫細胞
としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜
盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈ
ｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉ
ｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ
^TM細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の
細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞
などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕
由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ細胞；ＢｍＮ
細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例え
ば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２
１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィ
ボ（ｉｎ ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，１９７
７）などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコ
の幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。動物細胞
としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チ
ャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ＣＨＯ
細胞），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミ
エローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用い
られる。

【００２４】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳ
Ａ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎ
ｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に
従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換する
には、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１６８巻，１１１（１９７９）な
どに記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質
転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），
１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ−（Ｐｒｏｃ. Ｎａ
ｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ）７５巻，１９２９
（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができ
る。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、
バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に
従って行うことができる。動物細胞を形質転換するに
は、例えば、細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロト
コール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、
ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６
（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
このようにして、蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることが
できる。

【００２５】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、
酵母抽出物、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。培地のｐＨは約５から８が望ましい。エシェリ
ヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコ
ース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅ
ｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹ
ｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロ
モーターを効率よく働かせるために、例えば、３β-イ
ンドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができ
る。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５
から４３℃で約３から２４時間行い、必要により、通気
や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場
合、培養は通常約３０から４０℃で約６から２４時間行
い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿
主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、例えば、バークホ−ルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、プロシー
ジングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ.
Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳ
Ｄ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．らプロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカテミー・オブ・サイエンシ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ.
Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９
８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５から８に調整
するのが好ましい。培養は通常約２０℃から３５℃で約
２４から７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。

【００２６】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎ
ｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ.Ｃ.Ｃ.,ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５巻，７８８（１９６
２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加
えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２から
６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で
約３から５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培
地としては、例えば、約５から２０％の胎児牛血清を含
むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２
巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジ
ー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻．３９６（１９５
９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・
ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻．５１９（１
９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・
ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディス
ン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔ
ｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。
ｐＨは約６から８であるのが好ましい。培養は通常約３
０℃から４０℃で約１５から６０時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。以上のようにして、本発明の蛋
白質を培養培地中あるいは形質転換体中に生成せしめる
ことができる。

【００２７】上記培養物から本発明の蛋白質を分離精製
するには、例えば、下記の方法により行うことができ
る。本発明の蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞
を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチ
ームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは
細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗
抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に
尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトン
Ｘ−１００（商品名）などの界面活性剤が含まれていて
もよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養
終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清
とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培
養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、
自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうこ
とができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩
析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、
限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用
いられる。かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた
場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に
よって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合
には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、
遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組
換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に適当
な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を
加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもでき
る。蛋白修飾酵素としては、例えばトリプシン、キモト
リプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテイン
キナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして
生成する本発明の蛋白質またはその塩の活性は、標識し
たリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイなどにより測定することができる。

【００２８】本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたは
それらの塩に対する抗体は、本発明の蛋白質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであっ
てもよい。本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩（以下、本発明の蛋白質と略記する）に対する
抗体は、本発明の蛋白質を抗原として用い、自体公知の
抗体または抗血清の製造法に従って製造することができ
る。 ［モノクローナル抗体の作製］ （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明の蛋白質は、温血動物に対して投与することによ
り抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈
剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高め
るため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイン
トアジュバントを投与してもよい。投与は通常２から６
週毎に１回づつ、計２から１０回程度行われる。用いら
れる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、
モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ
などが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用
いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際して
は、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗
体価の認められた個体を選択し最終免疫の２から５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
蛋白質と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識
剤の活性を測定することにより行うことができる。融合
操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの
方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２５６，４９５
（１９７５）］に従い実施できる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などが挙げられるが、
Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細
胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は
１：１から２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰ
ＥＧ１０００からＰＥＧ６０００）が１０から８０％程
度の濃度で添加され、２０から４０℃、好ましくは３０
から３７℃で１から１０分間インキュベートすることに
より効率よく細胞融合を実施できる。抗蛋白質抗体産生
ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用
できるが、例えば、蛋白質抗原を直接あるいは担体とと
もに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素
などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用い
られる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗
体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結
合した抗蛋白質モノクローナル抗体を検出する方法、抗
免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固
相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵
素などで標識した該蛋白質を加え、固相に結合した抗蛋
白質モノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられ
る。抗蛋白質モノクローナル抗体の選別は、自体公知あ
るいはそれに準じる方法に従って行うことができる。通
常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。選
別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育で
きるものならばどのような培地を用いてもよい。例え
ば、１から２０％、好ましくは１０から２０％の牛胎児
血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１から１０％の牛
胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））ある
いはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０
１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養
温度は、通常２０から４０℃、好ましくは約３７℃であ
る。培養時間は、通常５日から３週間、好ましくは１週
間から２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行
うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、
上記の抗血清中の抗蛋白質抗体価の測定と同様にして測
定できる。

【００２９】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 抗蛋白質モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の
方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例えば、
塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動
法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロ
テインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により
抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的
精製法］に従って行うことができる。

【００３０】［ポリクローナル抗体の作製］本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗
原（蛋白質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体を作
り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動
物に免疫を行い、該免疫動物から本発明の蛋白質に対す
る抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことに
より製造できる。温血動物を免疫するために用いられる
免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリ
アー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合
比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対し
て抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのよう
な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブ
ミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニンなどを重量
比でハプテン１に対し、約０．１から２０、好ましくは
約１から５の割合でカップルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々
の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド
やカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール
基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬など
が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体
産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とと
もに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２から６
週毎に１回づつ、計約３から１０回程度行われる。ポリ
クローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の
血液、腹水など、好ましくは血液から採取することがで
きる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記
の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポ
リクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル
抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に
従って行うことができる。本発明の蛋白質または部分ペ
プチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相
補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、
本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ
またはｍＲＮＡの塩基配列またはその一部の塩基配列に
実質的に相補的な塩基配列を有し、該蛋白質または部分
ペプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレ
オチドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセン
スＤＮＡであってもよい。

【００３１】該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的
な塩基配列とは、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに相
補的な塩基配列（すなわち、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの
相補鎖）の全塩基配列または部分塩基配列と約７０％以
上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％
以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する
塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡまた
はｍＲＮＡの相補鎖の全塩基配列のうち、本発明の蛋白
質などのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例え
ば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０
％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９
０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有
するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチ
センスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製
造することができる。

【００３２】本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたは
それらの塩（以下、本発明の蛋白質と略記する場合があ
る）、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコード
するＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合があ
る）、本発明の蛋白質に対する抗体（以下、本発明の抗
体と略記する場合がある）およびアンチセンスＤＮＡ
は、本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定方法、
組換え型蛋白質の発現系の構築、ｔｗｏ−ｈｙｂｒ
ｉｄ法を用いたアッセイ系の開発と医薬品侯補化合物の
スクリーニング、構造的に類似したリガンド・レセプ
ターとの比較に基づいたドラッグデザインの実施、遺
伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマーの作成等
における試薬として用いることができ、また、遺伝子
治療等の薬物として用いることができる。特に、ｔｗｏ
−ｈｙｂｒｉｄ法を用いた本発明の蛋白質に対する結合
蛋白質の取得、さらに、本発明の蛋白質とアクチビン受
容体または取得した他の受容体を用いた結合アッセイ系
によって、ヒトなどの温血動物に特異的な情報伝達系の
促進薬または阻害薬をスクリーニングすることができ、
該促進薬または阻害薬を各種疾病の予防・治療剤などと
して使用することができ、以下により具体的に説明す
る。

【００３３】（１）本発明の蛋白質に対する結合蛋白質
の決定方法 本発明の蛋白質は、本発明の蛋白質に対する結合蛋白質
を探索し、または決定するための試薬として有用であ
る。すなわち、本発明は、本発明の蛋白質と相互作用す
る結合蛋白質をスクリーニングすることを特徴とする本
発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定方法を提供す
る。具体的には、本発明の結合蛋白質の決定方法は、宿
主細胞発現ベクター上に転写因子のＤＮＡ結合領域に本
発明の蛋白質を融合させたベクターと被験蛋白質と転写
活性化領域融合ライブラリーとを該転写因子結合領域を
プロモーター上に保持しているレポーター遺伝子を持つ
宿主細胞に導入し、２種の蛋白の結合により上昇するレ
ポーター遺伝子の発現量の変化により、該蛋白質と相互
作用する蛋白質またはその塩を決定する方法である。本
発明の結合蛋白質決定方法においては、本発明の蛋白質
と被験蛋白質との相互作用を特定のレポーター遺伝子の
発現に変換することにより検出するｔｗｏ−ｈｙｂｒｉ
ｄ法を用いることを特徴とする。本発明の結合蛋白質決
定方法の具体的な説明を以下にする。まず、結合蛋白質
決定方法に用いる本発明の蛋白質をコードするＤＮＡと
しては、本発明の配列番号：２で表されるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコー
ドする塩基配列またはその部分ペプチドをコードする塩
基配列を含有するものであればいかなるものであっても
よい。また、温血動物(例、ヒトなど）のゲノムＤＮ
Ａ、温血動物(例、ヒトなど）のゲノムＤＮＡライブラ
リー、温血動物(例、ヒトなど）の組織・細胞由来のｃ
ＤＮＡ、温血動物(例、ヒトなど）の組織・細胞由来の
ｃＤＮＡライブラリーより自体公知の方法により単離さ
れたＤＮＡ、合成または半合成ＤＮＡのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファ
ージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどのいず
れであってもよい。一方、組織・細胞よりｍＲＮＡ画分
を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって単
離することもでき、あるいは、部分的な塩基配列をそれ
ぞれ化学的に合成し、それらを連結させることによって
製造することもできる。

【００３４】スクリーニングする被験蛋白質ライブラリ
ーとしては、市販の各種動物の種々臓器由来のｃＤＮＡ
ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製 ＭＡＴＣＨＭＡ
ＫＥＲ ｃＤＮＡなど）などが用いられる。ＤＮＡ結合
領域と被験蛋白質の融合蛋白質を発現させるベクターと
しては、ｐＡＳ２−１、ｐＧＢＴ９、ｐＫＡＤ−０９、
ｐＳＤ０９、ｐＥＧ２０２、ｐＢＴＭ１１６などが用い
られる。転写因子の活性化領域と蛋白質の融合蛋白質を
発現させるベクターとしては、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣ
Ｔ２、ｐＫＴ１０Ｇａｌ−ＶＰ、ｐＪＧ４−５、ｐＶＰ
１６などが用いられる。転写因子としては、ＧＡＬ４、
ＬｅｘＡ、ＳＲＦなどが用いられる。レポーター遺伝子
としては、b−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、
ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）、ルシフェラーゼ遺伝
子、クロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子など
が用いられる。宿主細胞としては、酵母（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌など
が用いられ、その中でもＣＧ−１９４５、Ｙ１９０、Ｙ
１８７、ＨＦ７ｃ、ＳＦＹ５２６、Ｌ４０、ＥＧＹ４
８、ＨＩＳ／Ｌ１、６２Ｌ酵母株などが用いられる。具
体的には、該蛋白質に結合する蛋白質の決定方法は、ま
ず該蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片とプ
ラスミド（例えば、ｐＡＳ２−１）上のＤＮＡ結合領域
をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片と同じ続き枠に
結合したプラスミド、およびプラスミド（例えば、ｐＡ
ＣＴ２）上の転写因子（例えば、ＧＡＬ４）の転写活性
化領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片と結合
し、融合蛋白質の形で発現されるｃＤＮＡライブラリー
を、例えば、モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ （ Ｊ.Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ.ａｌ., Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂ.Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに
従って作成することができる。

【００３５】上記の２種のプラスミドを宿主細胞（例え
ば、サッカロミマイセス セレビシエ Ｙ１９０）に導
入するには、これらで同時に形質転換してもよいし、ま
たは一方のプラスミドを先に導入した後に他方を逐次導
入してもよく、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），
１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ−（Ｐｒｏｃ. Ｎａ
ｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ）７５巻，１９２９
（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができ
る。形質転換体のレポーター遺伝子の発現、レポーター
酵素の発色物質、蛍光物質の生成量あるいは発光量等に
変換して検出できる。より具体的には、宿主細胞が酵母
の場合、レポーター遺伝子の発現（例えば、β−ガラク
トシダーゼ活性）は、レプリカプレート法またはフィル
ター法を、好ましくはフィルター法を用いて青／白の呈
色スクリーニングにより検出することができる。フィル
ター法で呈色（例えば、青色）したコロニーは、例え
ば、ア・プラクチカル・アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．
ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；１５３−１７９，１９９３
ａ）などに記載の方法に従い処理されることにより、ポ
ジティブクローンの単一コロニーを分離することができ
る。分離した単一の形質転換体より、例えば、ジーン
（Ｇｅｎｅ），５７巻，２６７（１９８７）、バイオ・
テクニクス（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），１４
巻，５５２（１９９３）などに記載の方法に従い、プラ
スミドＤＮＡを回収し、そのＤＮＡの塩基配列の決定に
より、本発明の蛋白質に対する受容体を決定することが
できる。また、市販のキット、例えば、ＭＡＴＣＨＭＡ
ＫＥＲ ＧＡＬ４ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを使用しても本発明の
蛋白質に対する結合蛋白質を決定することができ、その
場合は、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うこ
とができる。

【００３６】（２）本発明の蛋白質欠乏症の予防・治療
剤 上記（１）の方法において、本発明の蛋白質に対する結
合蛋白質が明らかになれば、該結合蛋白質の発現部位お
よび該結合蛋白質を介した本発明の蛋白質が有する作用
などを明らかにすることができる。これらの知見を基
に、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、該結合蛋白
質を介した疾患の予防・治療剤として使用することがで
きる。また、本発明の蛋白質はアクチビン受容体への結
合活性を示すことより、アクチビン受容体を介した疾患
の予防・治療剤として使用することができる。例えば、
本発明の蛋白質の遺伝子が心臓、脳、肝臓、骨格筋、腎
臓、精巣、肺、脾臓などに発現することから、これら臓
器において、該結合蛋白質またはアクチビン受容体に関
連した疾患を発症している患者がいる場合に（イ）本発
明の蛋白質をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現さ
せることによって、あるいは（ロ）これら臓器の細胞な
どに本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入し発現さ
せた後に、該細胞を該患者の臓器に移植することなどに
よって、該患者のこれら臓器における本発明の蛋白質の
作用を充分に発揮させることができる。従って、本発明
の蛋白質をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明
の蛋白質に対する結合蛋白質を介した疾患の予防・治療
剤として使用することができる。本発明のＤＮＡを上記
治療剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいは
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ア
デノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの
適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施す
ることができる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明
のＤＮＡを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形
剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一
般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混
和することによって製造することができる。これら製剤
における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得
られるようにするものである。

【００３７】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたが
って処方するとができる。注射用の水性液としては生理
食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコー
ル（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベ
ート８０（商品名）、ＨＣＯ−５０）などと併用しても
よい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、
溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコー
ルなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン
酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど）に対し
て投与することができる。該ＤＮＡの投与量は、症状な
どにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人
（６０Ｋｇとして）においては、一日につき約０．１か
ら１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より
好ましくは約１．０から２０ｍｇである。非経口的に投
与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、
症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤
の形では通常成人（６０Ｋｇとして）においては、一日
につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．
１から２０ｍｇ程度、より好ましくは０．１から１０ｍ
ｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他
の動物の場合も、６０Ｋｇ当たりに換算した量を投与す
ることができる。

【００３８】（３）本発明の蛋白質とその結合蛋白質と
の結合を阻害あるいは促進する化合物のスクリーニング
方法 本発明の蛋白質またはその塩を用いるか、または組換え
型結合蛋白質の発現系を構築し、該発現系を用いた蛋白
質競合的結合アッセイ系を用いることによって本発明の
蛋白質と結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化
合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスク
リーニングすることができる。さらに、本発明の蛋白質
をコードするＤＮＡを導入した形質転換体での２種の蛋
白質の相互作用によるレポーター遺伝子の発現系（ｔｗ
ｏ−ｈｙｂｒｉｄ法）を用いることによっても、本発明
の蛋白質と結合蛋白質（例えば、アクチビン受容体）と
の結合を阻害あるいは促進する化合物（例えば、ペプチ
ド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生
産物など）またはその塩をスクリーニングすることがで
きる。このような化合物には、結合蛋白質を介して細胞
刺激活性（例えば、増殖促進、細胞内蛋白質のリン酸化
などを促進あるいは抑制する活性など）を有する化合物
（いわゆる本発明の蛋白質に対するアゴニスト）と該細
胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる本発明の蛋白質
に対するアンタゴニスト）などが含まれる。

【００３９】すなわち、本発明は、１）（ｉ）本発明の
蛋白質に対する結合蛋白質に、本発明の蛋白質またはそ
の塩を接触させた場合と（ii）本発明の蛋白質に対する
結合蛋白質に、本発明の蛋白質またはその塩および被験
化合物を接触させた場合との比較を行なうこと、また
は、２）（ｉ）本発明の蛋白質および本発明の蛋白質に
対する結合蛋白質（例えば、アクチビン受容体）をコー
ドするＤＮＡを導入した形質転換体と（ii）被験化合物
を接触させた場合の該形質転換体との比較を行なうこと
を特徴とする、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対す
る結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明の
スクリーニング方法においては、１）（ｉ）本発明の蛋
白質に対する結合蛋白質に、本発明の蛋白質またはその
塩を接触させた場合と（ii）本発明の蛋白質に対する結
合蛋白質に、本発明の蛋白質またはその塩および被験化
合物を接触させた場合における、例えば、本発明の蛋白
質の結合蛋白質に対する、該蛋白質またはその塩の結合
量、細胞刺激活性などを測定して比較すること、また
は、２）（ｉ）本発明の蛋白質および本発明の蛋白質に
対する結合蛋白質（例えば、アクチビン受容体）をコー
ドするＤＮＡを導入した形質転換体と（ii）試験化合物
を接触させた該形質転換体における、例えば、呈色度な
どによるレポーター遺伝子の発現の程度を比較すること
を特徴とする。

【００４０】より具体的には、本発明は、 標識した本発明の蛋白質またはその塩を、本発明の蛋
白質に対する結合蛋白質に接触させた場合と、標識した
本発明の蛋白質またはその塩および被験化合物を本発明
の蛋白質に対する結合蛋白質に接触させた場合におけ
る、標識した本発明の蛋白質またはその塩の該結合蛋白
質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とす
る、本発明の蛋白質またはその塩と該結合蛋白質との結
合を阻害あるいは促進する化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質が膜結合型の蛋白
質（例えば、膜貫通型受容体、チャンネル等）の場合、
標識した本発明の蛋白質またはその塩を、本発明の蛋白
質に対する結合蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合と、標識した本発明の蛋白質また
はその塩および被験化合物を本発明の蛋白質に対する結
合蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触さ
せた場合における、標識した本発明の蛋白質またはその
塩の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比
較することを特徴とする、本発明の蛋白質またはその塩
と該結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物
またはその塩のスクリーニング方法、 標識した本発明の蛋白質またはその塩を、本発明の蛋
白質に対する結合蛋白質（例えば、アクチビン受容体）
をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養するこ
とによって細胞内に発現した結合蛋白質に接触させた場
合と、標識した本発明の蛋白質またはその塩および被験
化合物を本発明の蛋白質に対する結合蛋白質をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することにより細
胞内に発現した結合蛋白質に接触させた場合における、
標識した本発明の蛋白質またはその塩の該結合蛋白質に
対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本
発明の蛋白質またはその塩と該結合蛋白質との結合を阻
害あるいは促進する化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、および 本発明の蛋白質の遺伝子を発現せしめるプラスミドと
本発明の蛋白質に対する結合蛋白質（例えば、アクチビ
ン受容体）の遺伝子を発現せしめるプラスミドとを導入
された宿主細胞と、該宿主細胞を被験化合物に接触させ
た場合における、該宿主細胞内での本発明の蛋白質およ
び本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の相互作用により
発現が制御されている遺伝子群の発現、あるいは生理学
的反応（例えば、該結合蛋白質がアクチビン受容体の場
合、ＦＳＨの分泌等）を比較することを特徴とする本発
明の蛋白質またはその塩と該結合蛋白質との結合を阻害
あるいは促進する化合物またはその塩のスクリーニング
方法を提供する。

【００４１】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に
用いる結合蛋白質（例えば、アクチビン受容体）として
は、該結合蛋白質またはそれらの塩を含有するものであ
れば何れのものであってもよいが、温血動物の臓器の抽
出物が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手
が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられる
ものとしては、遺伝子組換技術を用いて大量発現させた
結合蛋白質またはその塩が適している。結合蛋白質を製
造するには、前述の方法が用いられるが、例えば、該蛋
白質をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発
現することにより行うことができる。目的部分をコード
するＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずし
もこれに制約されるものではなく、例えば、遺伝子断片
や合成ＤＮＡを用いてもよい。該結合蛋白質をコードす
るＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よ
く発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とす
るバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕ
ｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；Ｎ
ＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプ
ロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、ヒト・ヒートショツクプロモー
ター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロ
モターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現した結
合蛋白質の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うこ
とができる。例えば、文献〔Ｎａｍｂｉ．Ｐ．ら、ザ・
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６７巻，１９５５５
〜１９５５９頁，１９９２年〕に記載の方法に従って行
うことができる。したがって、本発明のスクリーニング
方法において、結合蛋白質またはその塩を含有するもの
としては、それ自体公知の方法に従って精製した結合蛋
白質またはその塩であってもよいし、該蛋白質を含有す
る細胞を用いてもよく、また該蛋白質が膜結合蛋白質の
場合、それを含有する細胞の膜画分を用いてもよい。本
発明のスクリーニング方法において、結合蛋白質を含有
する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、
ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ
自体公知の方法に従って行うことができる。

【００４２】結合蛋白質を含有する細胞としては、結合
蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞として
は、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが
挙げられる。膜画分としては、細胞を破砕した後、それ
自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分の
ことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−
Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方
法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｌｌ
ｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フ
レンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから
噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の
分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの
遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細
胞破砕液を低速（５００から３０００ｒｐｍ）で短時間
（通常、約１から１０分）遠心し、上清をさらに高速
（１５０００から３００００ｒｐｍ）で通常３０分から
２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分
中には、発現した結合蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜
蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該結合蛋白質を含
有する細胞や膜画分中の結合蛋白質の量は、１細胞当た
り１０²から１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵から
１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多い
ほど細胞抽出物あるいは膜画分当たりの本発明の蛋白質
との結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリー
ニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロット
で大量の試料を測定できるようになる。本発明の蛋白質
と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害す
る化合物をスクリーニングする前記の〜を実施する
ためには、適当な結合蛋白質画分と、標識した本発明の
蛋白質が必要である。該結合蛋白質画分としては、天然
型の結合蛋白質画分か、またはそれと同等の活性を有す
る組換え型結合蛋白質画分などが望ましい。ここで、同
等の活性とは、本発明の蛋白質に対する同等の結合活性
などを示す。

【００４３】標識した本発明の蛋白質としては、標識し
た本発明の蛋白質、標識した本発明の蛋白質アナログ化
合物などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔
¹⁴Ｃ〕、〔¹³⁵Ｓ〕など標識された本発明の蛋白質など
を利用することができる。具体的には、本発明の蛋白質
と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害す
る化合物のスクリーニングを行うには、まず、該結合蛋
白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニ
ングに適した緩衝液に懸濁することにより結合蛋白質標
品を調製する。緩衝液には、ｐＨ４から１０（望ましく
はｐＨ６から８）のリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液
などの本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋
白質との結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよ
い。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰ
Ｓ、Ｔｗｅｅｎ−８０（商品名）（花王−アトラス社
製）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
を緩衝液に加えることもできる。さらに、プロテアーゼ
による結合蛋白質や本発明の蛋白質の分解を抑える目的
でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所
製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加す
ることもできる。０．０１から１０ｍｌの該結合蛋白質
溶液に、一定量（５０００から５０００００ｃｐｍ）の
標識した本発明の蛋白質を添加し、同時に１０^-4から１
０^-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量
（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明の蛋白
質を加えた反応チューブも用意する。反応は０から５０
℃、望ましくは４から３７℃で２０分から２４時間、望
ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾
紙等で濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊
維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウ
ンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質
がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（Ｎ
ＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０―ＮＳＢ）を１００％と
した時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以
下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質とし
て選択することができ、一方、特異的結合量（Ｂ−ＮＳ
Ｂ）が例えば１５０％以上になる被験化合物を結合促進
能力のある候補化合物として選択することができる。

【００４４】本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する
結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物スク
リーニングする前記のの方法を実施するためには、本
発明の蛋白質の遺伝子を発現せしめるプラスミドと本発
明の蛋白質に対する結合蛋白質（例えば、アクチビン受
容体）の遺伝子を発現せしめるプラスミドとを導入され
た宿主細胞内での、本発明の蛋白質および本発明の蛋白
質に対する結合蛋白質の相互作用により発現が制御され
ている遺伝子群の発現、あるいは生理学的反応（例え
ば、該結合蛋白質がアクチビン受容体の場合、ＦＳＨの
分泌等）を公知の方法を用いて測定することができる。
具体的には、宿主細胞が酵母の場合、まず、酵母細胞に
本発明の蛋白質と転写制御因子のＤＮＡ結合領域とを融
合させた蛋白質を発現せしめるプラスミドと本発明の蛋
白質に対する結合蛋白質（例えば、アクチビン受容体）
と転写制御因子の活性化領域とを融合させた蛋白質を発
現せしめるプラスミドとを導入した形質転換体を前述と
同様の方法にて作製する。スクリーニングを行なうにあ
たっては、この形質転換体を１０^-4から１０^-10Ｍの被
験化合物を含む寒天培地上で３０℃で２から４日間培養
する。寒天培地としては、トリプトファン／ロイシン／
ヒスチジン欠損ＳＤ培地、トリプトファン／ロイシン欠
損ＳＤ培地などが用いられる。その後、レポーター遺伝
子の発現をβ−ガラクトシダーゼ活性によるコロニーの
呈色として検出するために、フィルター法などを用いて
検出する。検出は、形質転換体が付着したフィルター上
に、Ｚ緩衝液／Ｘ−ｇａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）で湿
らせたワットマン＃５フィルターまたはＶＷＲグレード
４１０フィルターを置き、３０℃で３０分から８時間保
温した後、フィルター上のコロニーの呈色を、被験化合
物を含まないコントロールとしての形質転換体との呈色
の度合いを比較する。この時、コントロールと比して、
より濃い呈色を示すコロニーの培養培地に加えた被験化
合物を結合促進能力のある候補化合物として、また、よ
り薄い呈色を示すコロニーの培養培地に加えた被験化合
物を結合阻害能力のある候補化合物として選択すること
ができる。また、レポーター遺伝子の発現をβ−ガラク
トシダーゼ活性として、基質の分解により生成するｏ−
ニトロフェノール量を測定することにより定量すること
もできる。まず、形質転換体を１０^-4から１０^-10Ｍの
被験化合物を含む液体培地上で３０℃で８から２４時間
振盪培養する。液体培地としては、トリプトファン／ロ
イシン／ヒスチジン欠損ＳＤ培地、トリプトファン／ロ
イシン欠損ＳＤ培地などが用いられる。好ましくは一夜
培養した後、培養液の一部をＹＰＤ培地に植菌し、ＯＤ
₆₀₀が０．５から１．０となるように３０℃で３から５
時間振盪培養する。その培養液の一部を遠心した残渣の
Ｚ緩衝液／β−メルカプトエタノール混合物中にｏ−ニ
トロフェニルガラクトシド溶液（Ｓｉｇｍａ社）を加え
反応させる。反応は、０から５０℃で、３分から２４時
間、望ましくは、３０℃で、３０分から１５時間行い、
黄色に着色した上清の４２０ｎｍの吸光度（ＯＤ₄₂₀）
を測定する。β−ガラクトシダーゼ活性は、得られた吸
光度（ＯＤ₄₂₀）より以下の計算式を用いて、ミラー単
位（Ｍｉｌｌｅｒ ｕｎｉｔ）として算出する。

【００４５】被験化合物を培地に添加することにより、
β−ガラクトシダーゼ活性値が約１０％以上、好ましく
は約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、最も好
ましくは約５０％以上増加した場合、該被験化合物を本
発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との
結合を促進する能力のある候補化合物として選択するこ
とができる。一方、被験化合物を培地に添加することに
より、β−ガラクトシダーゼ活性値が約１０％以上、好
ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、
最も好ましくは約５０％以上低下した場合、該被験化合
物を本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白
質との結合を阻害する能力のある候補化合物として選択
することができる。レポーター遺伝子の発現活性を測定
してスクリーニングを行なうには、本発明の蛋白質に対
する結合蛋白質（例えば、アクチビン受容体）をコード
するＤＮＡが必要である。本発明の蛋白質に対する結合
蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該ＤＮＡを含有す
るＤＮＡまたはそれらとハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡなどが望ましい。被験化合
物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド
性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物
抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物
は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっ
てもよい。

【００４６】本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する
結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物また
はその塩のスクリーニング用キットは、本発明の蛋白質
またはその塩、その部分ペプチドまたはその塩、本発明
の蛋白質に対する結合蛋白質を含有する細胞、本発明の
蛋白質に対する結合蛋白質を含有する細胞の抽出画分、
あるいは本発明の蛋白質と転写制御因子のＤＮＡ結合領
域を融合させた蛋白質を発現せしめるプラスミドと本発
明の蛋白質に対する結合蛋白質と転写制御因子の活性化
領域を融合させた蛋白質を発現せしめるプラスミドとを
導入した形質転換体を含有するものである。本発明のス
クリーニング用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 １．スクリーニング用試薬 形質転換体 本発明の蛋白質と転写制御因子のＤＮＡ結合領域を融合
した蛋白質を発現せしめるプラスミドとアクチビンIIＡ
受容体蛋白質と転写制御因子の活性化領域を融合した蛋
白質を発現せしめるプラスミドとを導入し、形質転換し
た酵母Ｙ１９０株 液体培養培地 トリプトファン／ロイシン／ヒスチジン欠損ＳＤ培地：
酵母窒素源（Ｄｉｆｃｏ社）水溶液をオートクレーブで
滅菌後、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アデニン
ヘミ硫酸塩、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−リジン塩酸
塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレ
オニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ウラシルよりなるオートク
レーブで滅菌し４℃で保存したドロップアウト溶液を加
える。さらに、フィルターで濾過滅菌した４０％デキス
トロース／ストック溶液（Ｓｉｇｍａ社）を加え、２％
になるように調整し、４℃で保存するか、あるいは用時
調製してもよい。ＹＰＤ培地：Ｄｉｆｃｏ ペプトンに
酵母抽出物の水溶液をオートクレーブで滅菌後、フィル
ターで濾過滅菌した４０％デキストロースを加え最終濃
度を２％に調整し、４℃で保存するか、あるいは用時調
製してもよい。 緩衝液 Ｚ緩衝液：Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂
Ｏ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含み、ｐＨを７付近
に調整後、オートクレーブで滅菌し、４℃で保存する
か、あるいは用時調製してもよい。Ｚ緩衝液／β−メル
カプトエタノール：Ｚ緩衝液１００に対してβ−メルカ
プトエタノールを０．２７の割合で加えたもの。 β−ガラクトシダーゼの基質 ｏ−ニトロフェニルガラクトシド溶液（Ｓｉｇｍａ社）
をＺ緩衝液に溶解し、４ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したも
ので用時調製する。 反応停止液 ４℃で保存した１Ｍ 炭酸ナトリウム溶液を用いるか、
あるいは用時調製してもよい。

【００４７】２．測定法 １０^-3から１０^-10Ｍの被験化合物溶液を5μｌ加えた
１ｍｌのトリプトファン／ロイシン欠損ＳＤ培地で酵母
形質転換体を３０℃で一夜振盪培養する。 培養液０．４ｍｌを１．６ｍｌのＹＰＤ培地中に加
え、ＯＤ₆₀₀が０．５から１．０となるように３０℃で
３から５時間振盪培養する。 ０．３ｍｌの培養液を１４０００ｒｐｍで３０秒間遠
心し、残渣を０．３ｍｌのＺ緩衝液に懸濁し、再度遠心
後、沈殿を０．１ｍｌのＺ緩衝液に懸濁する。 液体窒素にて一旦凍結後、３７℃で３０秒から１分間
かけて溶解する。０．７ｍｌのＺ緩衝液／β−メルカプ
トエタノール混液と０．１６ｍｌのｏ−ニトロフェニル
ガラクトシド溶液を加え、３０℃で溶液が黄色になるま
で保温し、この後０．４ｍｌの１Ｍ 炭酸ナトリウム溶
液を加える。 １４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清の４２
０ｎｍにおける吸光度を測定し、β−ガラクトシダーゼ
活性をミラー単位（Ｍｉｌｌｅｒ ｕｎｉｔ）として次
の式〔数１〕で求める。

【００４８】〔数１〕 β−ガラクトシダーゼ活性＝１０００×ＯＤ₄₂₀／（ｔ
×Ｖ×ＯＤ₆₀₀） ＯＤ４２０：４２０ｎｍにおける吸光度 ｔ：反応時間（分） Ｖ：反応に用いた、形質転換体のＺ緩衝液の懸濁液量×
希釈倍率

【００４９】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、本発明の蛋白質（なかでもＰＤＺドメインを有し、
心臓、脳、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、肺、脾臓で発現
する蛋白質）と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質（例
えば、アクチビン受容体）との結合を阻害する化合物ま
たは促進する化合物（以下、促進化合物）である。本発
明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質（例え
ば、アクチビン受容体）との結合を阻害する化合物に
は、本発明の蛋白質に対する結合蛋白に結合すること
によって、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結
合蛋白との結合を阻害し、それ自体が結合蛋白質を介し
て細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる
アゴニスト）、本発明の蛋白質に対する結合蛋白に結
合することによって、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質
に対する結合蛋白との結合を阻害するが、それ自体は結
合蛋白質を介した細胞刺激活性を有しない化合物または
その塩（いわゆるアンタゴニスト）、本発明の蛋白質
に対する結合蛋白に結合することなく、本発明の蛋白質
と本発明の蛋白質に対する結合蛋白との結合を阻害する
化合物（以下、阻害化合物と略記）またはその塩などが
含まれる。本発明のスクリーニング方法またはスクリー
ニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩と
本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合性の有無
は、上記した結合活性の測定法に従って確認することが
できる。結合蛋白質を介した細胞刺激活性は、それ自体
公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定する
ことができる。

【００５０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物としては、ペ
プチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、
発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合
物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。該
アゴニストおよび促進化合物は、本発明の蛋白質が有す
る生理活性と同様の作用を有するか、あるいはその生理
活性を増強する作用を有しているので、該蛋白質活性に
応じて安全で低毒性な医薬組成物、特に心臓、脳、肝
臓、骨格筋、腎臓、精巣、肺、脾臓などにおける、該結
合蛋白質またはアクチビン受容体に関連した疾患（例え
ば、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん症、
ハンチントン舞踏症などの神経細胞異常または脳疾患な
ど）の予防・治療薬の予防治療薬として有用である。逆
に、該アンタゴニストまたは阻害化合物は、本発明の蛋
白質が有する生理活性を抑制することができるので、該
蛋白質活性を抑制する安全で低毒性な医薬組成物、特に
心臓、脳、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、肺、脾臓におけ
る、該結合蛋白質またはアクチビン受容体に関連した疾
患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、てん
かん症、ハンチントン舞踏症などの神経細胞異常または
脳疾患など）の予防治療薬として有用である。本発明の
スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用
いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬組成物と
して使用する場合、常套手段に従って実施することがで
きる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセ
ル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経
口的に、あるいは水もしくは、それ以外の薬学的に許容
し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤
の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物または
その塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、
ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に
認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和す
ることによって製造することができる。これら製剤にお
ける有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られ
るようにするものである。

【００５１】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材科にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたが
って処方するとができる。注射用の水性液としては、例
えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等
張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、
塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助
剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリ
アルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチ
レングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用
してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげ
られ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルア
ルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例え
ば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調整された注射液は通常、適当なアンプルに充
填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウ
サギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトな
ど）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に成人（６０Ｋｇとして）において
は、通常、一日につき約０．１から１００ｍｇ、好まし
くは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０か
ら２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１
回投与量は投与対象、対象臓器、症状投与方法などによ
っても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（６
０Ｋｇとして）においては、通常、一日につき約０．０
１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ
程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。ヒト以外の動物
の場合も、６０Ｋｇ当たりに換算した時に同等となるよ
うな量を投与することができる。

【００５２】（４）本発明の蛋白質、その部分ペプチド
またはそれらの塩の定量 本発明の蛋白質抗体は、本発明の蛋白質等を特異的に認
識することができるので、被検液中の本発明の蛋白質等
の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに
使用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）本
発明の蛋白質等に反応する抗体と、被検液および標識化
された本発明の蛋白質等とを競合的に反応させ、該抗体
に結合した標識化された本発明の蛋白質等の割合を測定
することを特徴とする、被検液中の本発明の蛋白質等の
定量法、（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗
体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連
続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を
測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質等
の定量法において、一方の抗体が本発明の蛋白質等のＮ
端部あるいはＣ端部を認識する抗体で、他方の抗体が配
列番号：２のアミノ酸配列に反応する抗体であることを
特徴とする、被検液中の本発明の蛋白質等の定量法を提
供する。本発明の蛋白質等を認識するモノクローナル抗
体（以下、抗蛋白質抗体と称する場合がある）を用いて
本発明の蛋白質等の測定を行なえるほか、組織染色等に
よる検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗
体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ
（ａｂ’）²、Ｆａｂ’あるいはＦａｂ画分を用いても
よい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の測定法
は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗
原量（例えば本発明の蛋白質量）に対応した抗体、抗原
もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手
段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用
いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、い
ずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリ
ー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法
が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述する
サンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。

【００５３】標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質などが挙げられる．放射性同位元素としては、例えば
〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが、上
記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好まし
く、例えばβ-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ
酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが発光物質
としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリ
ン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗
体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン
系を用いることもできる。抗原あるいは抗体の不溶化に
当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あ
るいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学
結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法に
おいては不溶化した抗蛋白質抗体に被検液を反応させ
（１次反応）、さらに標識化した抗蛋白質抗体を反応さ
せ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を
測定することにより被検液中の本発明の蛋白質量を定量
することができる．１次反応と２次反応は逆の順序に行
っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして
行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記の
それらに準じることができる。また、サンドイッチ法に
よる免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗
体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はな
く、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体
の混合物を用いてもよい。本発明のサンドイッチ法によ
る本発明の蛋白質等の測定法においては１次反応と２次
反応に用いられる抗蛋白質抗体は本発明の蛋白質等の結
合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即
ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例え
ば、２次反応で用いられる抗体が、本発明の蛋白質等の
Ｃ端部あるいはＮ端部を認識する場合、１次反応で用い
られる抗体は、好ましくは配列番号：２で表されるアミ
ノ酸配列を認識する抗体が用いられる。

【００５４】本発明の蛋白質等に対する抗体をサンドイ
ッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメ
トリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることが
できる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗
体に対して競合的に反応させたのち、末反応の標識抗原
と（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第1抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００５５】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明
の蛋白質等の測定系を構築すればよい。これらの一般的
な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照す
ることができる〔例えば、入江寛編「ラジオイムノアッ
セイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジ
オイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら縞「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）「Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．７０
（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
（Ｐａｒｔ Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ
Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、同書Ｖ
ｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙｓ（Ｐａｒｔ Ｄ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎ
ｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐ
ａｒｔ Ｅ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ））（以
上、アカデミックプレス社発行）など参照〕。以上のよ
うに、本発明の蛋白質等に対する抗体を用いることによ
って本発明の蛋白質等を感度良く定量することができ
る。さらには、本発明の蛋白質等に対する抗体を用いて
本発明の蛋白質等の濃度を定量することによって、例え
ば、本発明の蛋白質等が関与する疾病の診断を行うこと
ができる。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被
験体中に存在する本発明の蛋白質等を検出するために使
用することができる。また、本発明の蛋白質等を精製す
るために使用する抗体カラムの作製、精製時の各画分中
の本発明の蛋白質等の検出、被験細胞内における本発明
の蛋白質等の挙動の分析などのために使用することがで
きる。

【００５６】（５）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする遺
伝子異常を検出することができるので、例えば、該ＤＮ
Ａの突然変異あるいはｍＲＮＡの異常蓄積あるいは異常
減少などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤ
ＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知の
ノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法
（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４
〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏ
ｆ Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０
頁（１９８９年））などにより実施することができる。

【００５７】（６）アンチセンスＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ 本発明の蛋白質等をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに
相補的に結合し、該ｍＲＮＡの転写あるいは翻訳を抑制
することができるアンチセンスＤＮＡは、本発明の蛋白
質等をコードする遺伝子の異常発現を抑制することがで
きる。従って、該アンチセンスＤＮＡは、例えば、本発
明の蛋白質等をコードする遺伝子の異常発現に起因する
疾病の予防・治療剤として使用することができる。該ア
ンチセンスＤＮＡを上記の予防・治療剤として使用する
場合、前記した本発明のＤＮＡを含有する医薬と同様に
して製造することができる。例えば、該アンチセンスＤ
ＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイ
ルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套
手段に従ってヒトまたは温血動物に投与することができ
る。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂
食促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体
とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル
のようなカテーテルによって投与できる。さらに、該ア
ンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮ
Ａの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌ
クレオチドプローブとして使用することもできる。

【００５８】（７）ＤＮＡ転移動物の作製 本発明は、外来性の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ
（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその
変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合
がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。すなわ
ち、本発明は、（ｉ）本発明の外来性ＤＮＡまたはその
変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（ii）非ヒト哺乳
動物がげっ歯類動物である第（ｉ）記載の非ヒト哺乳動
物、（iii）げっ歯類動物がマウスである第（ii）記載
の非ヒト哺乳動物、（iv）げっ歯類動物がラットである
第（ii）記載の非ヒト哺乳動物、および（ｖ）本発明の
外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物
において発現しうる組換えベクターを提供するものであ
る。本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有す
る非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略
記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細
胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺
乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましく
は、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞
期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポ
フェクション法、凝集法、マイクロインジェクション
法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、
レトロウイルス法などにより目的とするＤＮＡを転移す
ることによって作出することができる。また、該ＤＮＡ
転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに
目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、
組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細
胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合
させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出するこ
ともできる。

【００５９】非ヒト哺乳動物としては、例えば、ラッ
ト、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌなどが用いられる。なかで
も、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生
物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なげっ歯動
物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ
／６系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３
Ｆ₁系統、ＢＤＦ₁系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ₁系統、ＢＡＬＢ／
ｃ系統、ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉ
ｓｔｅｒ，ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動物におい
て発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」とし
ては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられ
る。本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来
有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物
から単離・抽出された本発明の蛋白質をコードするＤＮ
Ａをいう。本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明の
ＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生
じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基へ
の置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常
ＤＮＡも含まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発
明の蛋白質を発現させる遺伝子を含有するＤＮＡを意味
し、例えば、正常な本発明の蛋白質の機能を抑制する蛋
白質を発現させる遺伝子を含有するＤＮＡなどが用いら
れる。本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種
あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであっても
よい。本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを対象動物に
転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現さ
せうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラ
クトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発
明のＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発
明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イ
ヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスな
ど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下
流に、本発明のＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト
（例えば、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例
えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションするこ
とによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳
動物を作出することができる。

【００６０】該コンストラクトを保持するベクターとし
ては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイ
ルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ま
しく用いられる。上記ＤＮＡ発現調節を行うプロモータ
ーとしては、例えば、ウイルス（例えば、シミアヌイル
ス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、
ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に
由来するプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、
イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス
など）由来のものとしては、アルブミン、インスリンI
I、ウロプラキンII、エラスターゼ、エリスロポエチ
ン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維
性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、
血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１、Ｋ１０およびＫ
１４、コラーゲンＩ型およびII型、サイクリックＡＭＰ
依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィ
ン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナト
リウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ
（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムア
デノシン３リン酸酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓ
ｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ
およびIIＡ、メタロプロテイナーゼ１組織インヒビタ
ー、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レ
ニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダ
ーゼ、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、β
アクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１お
よび２、ミエリン基礎蛋白質、チオグロブリン、Ｔｈｙ
−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清ア
ミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニン
Ｃ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バ
ソプレシンなどのプロモーターなどが用いられるが、好
ましくは全身で高発現することが可能なサイトメガロウ
イルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α
（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβ
アクチンプロモーターなどを用いることができる。

【００６１】上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物にお
いて目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般に
ターミネーターと呼ばれる）を有していることが好まし
く、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各
ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミア
ンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられ
る。その他、目的ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各
ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、
真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域
の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻
訳領域の３’下流に連結することも目的により可能であ
る。正常な本発明の蛋白質の翻訳領域は、各種哺乳動物
（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスタ
ー、ラット、マウス、ヒトなど）由来の肝臓、腎臓、甲
状腺細胞、線維芽細胞由来ゲノムＤＮＡおよび市販の各
種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡのすべて
あるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、
線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された
相補ＤＮＡを原料として、自体公知の方法で取得するこ
とができる。また、外来性の異常ＤＮＡは、本発明の蛋
白質の変異を起因とする疾病を発症した上記の細胞また
は組織より得ることができる。また、上記の細胞または
組織より得られた正常な蛋白質の翻訳領域を点突然変異
誘発法により変異した翻訳領域を作製することができ
る。該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコ
ンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および
所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮ
Ａ工学的手法により作製することができる。受精卵細胞
段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳
動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように
確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞におい
て、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物
の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに
本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発
明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はそ
の胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明のＤＮＡを有
する。

【００６２】本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非
ヒト哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持するこ
とを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境
で継代飼育することができる。受精卵細胞段階における
本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細
胞および体細胞のすべてに過剰に存在するように確保さ
れる。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発
明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の
子孫がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発
明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発
明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はそ
の胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮ
Ａを過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持
つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配
することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有する
ように繁殖継代することができる。本発明の正常ＤＮＡ
を有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発
現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進す
ることにより最終的に本発明の蛋白質の機能亢進症を発
症することがあり、その病態モデル動物として利用する
ことができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を
用いて、本発明の蛋白質の機能亢進症や、本発明の蛋白
質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患
の治療方法の検討を行うことが可能である。また、本発
明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明
の蛋白質の増加症状を有することから、本発明の蛋白質
に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験に
も利用可能である。一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを
有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安
定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通
常の飼育環境で継代飼育することができる。さらに、目
的とする外来性ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで
原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮ
Ａコンストラクトは、通常の遺伝子工学的手法によって
作製することができる。受精卵細胞段階における本発明
の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および
体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転
移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡ
が存在することは、作出動物の子孫がすべてその胚芽細
胞および体細胞のすべてに本発明の異常ＤＮＡを有する
ことを意味する。ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子
孫は、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の異
常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持
つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配
することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように
繁殖継代することができる。

【００６３】本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動
物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内
在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に
本発明の蛋白質の機能不活性型不応症となることがあ
り、その病態モデル動物として利用することができる。
例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明
の蛋白質の機能不活性型不応症の病態機序の解明および
この疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。ま
た、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ
高発現動物は、本発明の蛋白質の機能不活性型不応症に
おける本発明の異常蛋白質による正常蛋白質の機能阻害
（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明す
るモデルとなる。また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移
させた哺乳動物は、本発明の蛋白質の増加症状を有する
ことから、本発明の蛋白質の機能不活性型不応症に対す
る治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。ま
た、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利
用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ転移哺乳動物の組織中のｍＲＮＡを直
接分析するか、発現した蛋白質組織を分析することによ
る、本発明の蛋白質により特異的に発現あるいは活性化
する蛋白質との関連性についての解析、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるあるいは抑制するような薬剤のスクリーニング、お
よび 本発明の変異蛋白質を単離精製およびその抗体作製な
どが考えられる。 さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の蛋
白質の機能不活性型不応症を含む、本発明の蛋白質に関
連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発
明の蛋白質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより
詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、
さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に
貢献することができる。また、本発明のＤＮＡ転移動物
から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白
質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、そ
の培養またはその培養細胞の系統化を行うことが可能で
ある。さらに、本発明の蛋白質産生細胞の特定化、分化
あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナ
ル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどがで
き、本発明の蛋白質およびその作用解明のための有効な
研究材料となる。さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用
いて、本発明の蛋白質の機能不活性型不応症を含む、本
発明の蛋白質に関連する疾患の治療薬の開発を行うため
に、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅
速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが
可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発
明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明の蛋白
質が関連する疾患の遺伝子治療法を検討、開発すること
が可能である。

【００６４】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎ
ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基

【００６５】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルホニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ₂Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １，２，３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボジ イミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００６６】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法に用いるｂａ
ｉｔプラスミドとしてのアクチビンIIＡ受容体蛋白質の
細胞内ドメインをコードするＤＮＡフラグメントの塩基
配列を示す。 〔配列番号：２〕本発明の蛋白質のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：３〕本発明の配列番号：２で表されるアミ
ノ酸配列を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：４〕ノーザンハイブリダイゼーションに用
いるプローブとしてのＤＮＡの塩基配列を示す。後述の
実施例１で得られた形質転換体エシャリヒア コリ（Es
cherichia coli）ＨＢ１０１／ｐＡＣＴ２ＹＡ１は、平
成１１年１１月１日から通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−６９２７として、平成１１年１０月１４日から財団法
人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６３２
５として寄託されている。

【００６７】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、酵母を用いたｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法の操作
法は市販のキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に添付の説
明書に記載されている方法に、また、大腸菌を用いての
遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法
に従った。

【００６８】

【実施例１】本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡのク
ローニング （１）ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法によるアクチビンIIＡ受
容体蛋白質と相互作用する蛋白質のスクリーニング 以下の、ｃＤＮＡライブラリーからアクチビンIIＡ受容
体蛋白質と相互作用する蛋白質のスクリーニングには、
キットとしてＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ^TMＴｗｏ−Ｈｙｂｒ
ｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２（Ｃａｔ．Ｎｏ． Ｋ１６０４−
１：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。上記方法に従い、
ＤＮＡ結合用ベクターｐＡＳ２−１のＥｃｏＲ Ｉ部位
とＢａｍＨ Ｉ部位を適切な制限酵素で切断し、アルカ
リフォスファターゼ処理した後精製した。その後、配列
番号：１で表されるアクチビンIIＡ受容体蛋白質の細胞
内ドメインをコードするＤＮＡフラグメントをライゲー
ションし、目的とするＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインと
アクチビンIIＡ受容体細胞内ドメイン全体を融合蛋白質
として発現するプラスミド（ｐＡＳ−IIＡ）を得た。Ｇ
ＡＬ４転写活性化領域融合ライブラリープラスミドとし
ては、市販のマウス脳ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｃＤＮＡ
ｌｉｂｒａｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。酵母
菌株Ｙ１９０の単一コロニー（直径２から３ｍｍ）を２
０ｍｌのトリプトファン欠損ＳＤ培地に植菌し、１８時
間３０℃で振盪培養した。この培養液の１０ｍｌを３０
０ｍｌのＹＰＤ培地にＯＤ₆₀₀＝０．２から０．３なる
ように植え、３０℃で３時間振盪培養した。培養液を滅
菌した遠心管に移し、１０００×ｇで５分間室温で遠心
した。上清を捨て、細胞を２５ｍｌの滅菌水に懸濁し、
再度、１０００×ｇで５分間室温で遠心した。上清を捨
て、細胞を１．５ｍｌのＴＥ緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ７．５）／０．
１Ｍ酢酸リチウム溶液（ｐＨ ７．５）の混合液に懸濁
して次の形質転換に用いた。先に作製した１０μｇのプ
ラスミド（ｐＡＳ−IIＡ）と２ｍｇのニシン精巣キャリ
アーＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に上記で作製した細
胞懸濁液１ｍｌを加え、よく混合した。さらに、６ｍｌ
のＰＥＧ（４０％ＰＥＧ ４０００）／ＴＥ緩衝液／
０．１Ｍ酢酸リチウム溶液の混合液を加え、ボルテック
スミキサーで混合した。３０℃、２００ｒｐｍで３０分
間振盪後、７００μｌのＤＭＳＯ（最終濃度１０％）を
加えて穏やかに攪拌した。その後、時々振りながら、４
２℃で１５分間加熱し、容器を氷冷後、１０００×ｇで
５分間遠心した。上清を捨て、細胞を０．５ｍｌのＴＥ
緩衝液に懸濁した。得られた細胞懸濁液１００μｌをト
リプトファン欠損ＳＤ培地上にスプレッドし、３０℃で
４日間培養し、前記プラスミドを安定に保持する株を得
た。続いて、ＧＡＬ４転写活性化領域融合ライブラリー
プラスミドも同様の方法にて前記酵母株に導入した。得
られた形質転換体０．２ｍｌをトリプトファン／ロイシ
ン／ヒスチジン欠損ＳＤ培地上にまき、３０℃で８日間
培養した後、Ｈｉｓ⁺コロニーをトリプトファン／ロイ
シン／ヒスチジン欠損寒天プレート上にストリークし
た。

【００６９】シャーレに５ｍｌのＺ緩衝液（Ｎａ₂ＨＰ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ，ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ，ＫＣｌ，ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ，ｐＨ ７）／Ｘ−ｇａｌ溶液（５−ブロ
モ−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
の２％ＤＭＦ溶液）／β−メルカプトエタノール混合液
を入れ、滅菌したワットマン＃５フィルターを湿らせ
た。別のフィルターを前記形質転換体コロニーがある寒
天プレート上に置いた後、このフィルターを取り上げ、
コロニー面を上にして液体窒素で凍結させた。液体窒素
中からフィルターを取り出し、室温で融解した後、先の
湿らせたフィルター上にコロニー面を上にして置いた。
シャーレの蓋を閉めて３０℃で１時間保温し、青くなっ
た約１００個のポジティブコロニーを分離した。得られ
たそれぞれのポジティブクローンを３ｍｌのロイシン欠
損ＳＤ液体培地に植え、２日間培養した後、この培養液
を１００００倍に希釈し、ロイシン欠損ＳＤプレートに
まき、３０℃で３日間保温した。２０から３０個のコロ
ニーを滅菌した楊枝で拾い、トリプトファン／ロイシン
欠損ＳＤプレートとロイシン欠損ＳＤプレートにレプリ
カした。ここで、先のポジティブコロニーよりトリプト
ファン栄養要求性を示すコロニーを選択し、そのβ−ガ
ラクトシダーゼ活性の検定を行い、さらに活性を示さな
い２個のコロニーを選択した。得られた真のポジティブ
コロニーを２ｍｌのＹＰＤ液体培地に植え、３０℃で一
夜培養した。培養液を５秒間室温で遠心し、上清を捨て
た後、０．２ｍｌの酵母溶解液（２％トリトンＸ−１０
０，１％ＳＤＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加
え、懸濁させた。０．２ｍｌのフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）と酸で洗
ったガラスビーズを加え、２分間ボルテックスミキサー
で攪拌した。１４０００ｒｐｍで５分間室温で遠心した
後、分離した上清に１／１０量の３Ｍ 酢酸ナトリウム
溶液（ｐＨ ５．２）と２．５倍量のエタノールを加え
た。得られた沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、
２０μｌの滅菌水に溶解した。このうちの１μｌを大腸
菌ＨＢ１０１株にエレクトロポレーション法により導入
した後、通常のミニプレップ法でプラスミドＤＮＡを精
製し、目的とするｃＤＮＡ（ｐＡＣＴ２ＹＡ１）を得、
その塩基配列を決定した。本発明の蛋白質の全長ｃＤＮ
Ａは８８８ｂｐで、配列番号：２で表される１５３個の
アミノ酸からなるポリペプチド［図１］をコードしてい
た。配列番号：２で表されるアミノ酸からなるポリペプ
チドをコードする全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＣ
Ｔ２ＹＡ１を大腸菌ＨＢ１０１に形質転換し、形質転換
体：大腸菌ＨＢ１０１／ｐＡＣＴ２ＹＡ１を得た。

【００７０】

【実施例２】マウスの各種臓器由来ｐｏｌｙ（Ａ）⁺Ｒ
ＮＡを用いたノーザンハイブリダイゼーション法による
発現の検出 配列番号：４で表されるＤＮＡを、ＤＩＧ−ＰＣＲ プ
ローブ合成キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）を用いジ
ゴキシゲニンで標識し、プローブとして用いた。また、
Ｂａｌｂ／ｃマウスより脳、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心
臓、精巣、骨格筋を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢ
ＣＯ ＢＲＬ社）によりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。
その後、ＰｏｌｙＡＴ ｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌ
ａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い
て、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを精製した。各ｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ＲＮＡを１μｇづつ用い、ホルマリンゲル法に
より１％アガロースゲル電気泳動を行い、ブロッティン
グ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を
用いたバキュームブロッティング法により、Ｈｙｂｏｎ
ｄＮ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にブ
ロットした。これを先に作製したプローブＤＮＡの各５
ｎｇ／ｍｌを含むハイブリダイゼーション緩衝液（５×
ＳＳＣ，０．１％Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎ
ｅ，０．０２％ＳＤＳ，０．５％ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒ
ｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社），１００μｇ
／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ）にて、６５℃で一夜保温した。
その後、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用い、
６５℃、２０分で３回洗浄した。さらに、アルカリホス
ファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ社）を含む溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ ７．５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５０ｍＵ／ｍｌ抗
体）中で保持した後、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ ７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ ２０を用い、１５分で３回洗浄した。最後に、
Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ ５３０（和光純薬工業社製）を基
質とした化学発光を行い、Ｘ線フィルムに露光して検出
した結果、本発明の蛋白質が心臓、脳、肝臓、骨格筋、
腎臓、精巣などで多く発現していることが確認された
［図２］。

【００７１】

【発明の効果】本発明の蛋白質、その部分ペプチドまた
はそれらの塩（以下、本発明の蛋白質と略記する場合が
ある）、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合が
ある）、本発明の蛋白質に対する抗体（以下、本発明の
抗体と略記する場合がある）およびアンチセンスＤＮＡ
は、本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定、抗
体および血清の入手、組換え型蛋白質の発現系の構
築、発現系を用いた結合アッセイ系およびｔｗｏ−ｈ
ｙｂｒｉｄ法を用いたアッセイ系の開発と医薬品侯補化
合物のスクリーニング、構造的に類似したリガンド・
レセプターとの比較に基づいたドラッグデザインの実
施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマー
の作成等における試薬として用いることができ、また、
遺伝子治療等の薬物として用いることができる。特
に、本発明の蛋白質の構造・性質の解明は、これらの系
に作用するユニークな医薬品の開発につながる。

【００７２】

【配列表】 ［SEQUENCE LISTING］ <110>Takeda Chemical Industries, Ltd. <120>Novel Protein And Its Use <130>B00304 <150>JP 11-305187 <151>1999-10-27 <150>JP 11-313453 <151>1999-11-04 <160>4 <210>1 <211>1442 <212>DNA <213>Mouse <400>1 AGACATCACA AGATGGCCTA CCCTCCTGTA CTTGTTCCTA CTCAAGACCC AGGACCACCC 60 CCACCTTCCC CATTACTAGG GTTGAAGCCA TTGCAGCTGT TAGAAGTGAA AGCAAGGGGA 120 AGATTTGGTT GTGTCTGGAA AGCCCAGTTG CTCAATGAAT ATGTGGCTGT CAAAATATTT 180 CCAATACAGG ACAAACAGTC CTGGCAGAAT GAATATGAAG TCTATAGTCT ACCTGGAATG 240 AAGCATGAGA ACATACTACA GTTCATTGGT GCAGAGAAAA GAGGCACCAG TGTGGATGTG 300 GACCTGTGGC TAATCACAGC ATTTCATGAA AAGGGCTCAC TGTCAGACTT TCTTAAGGCT 360 AATGTGGTCT CTTGGAATGA ACTTTGTCAT ATTGCAGAAA CCATGGCTAG AGGATTGGCA 420 TATTTACATG AGGATATACC TGGCTTAAAA GATGGCCACA AGCCTGCAAT CTCTCACAGG 480 GACATCAAAA GTAAAAATGT GCTGTTGAAA AACAATCTGA CAGCTTGCAT TGCTGACTTT 540 GGGTTGGCCT TAAAGTTCGA GGCTGGCAAG TCTGCAGGTG ACACCCATGG GCAGGTTGGT 600 ACCCGGAGGT ATATGGCTCC AGAGGTGTTG GAGGGTGCTA TAAACTTCCA AAGGGACGCA 660 TTTCTGAGGA TAGATATGTA CGCCATGGGA TTAGTCCTAT GGGAATTGGC TTCTCGTTGC 720 ACTGCTGCAG ATGGACCCGT AGATGAGTAC ATGTTACCAT TTGAGGAAGA AATTGGCCAG 780 CATCCATCTC TTGAAGATAT GCAGGAAGTT GTTGTGCATA AAAAAAAGAG GCCTGTTTTA 840 AGAGATTATT GGCAGAAACA TGCAGGAATG GCAATGCTCT GTGAAACGAT AGAAGAATGT 900 TGGGATCATG ATGCAGAAGC CAGGTTATCA GCTGGATGTG TAGGTGAAAG AATTACTCAG 960 ATGCAAAGAC TAACAAATAT CATTACTACA GAGGACATTG TAACAGTGGT CACAATGGTG 1020 ACAAATGTTG ACTTTCCTCC CAAAGAATCT AGTCTATGAT GGTGGCACCG TCTGTACACA 1080 CTGAGGACTG GGACTCTGAA CTGGAGCTGC TAAGCTAAGG AAAGTGCTTA GTTGATTTTC 1140 TGTGTGAAAT GAGTAGGATG CCTCCAGGAC ATGTACGCAA GCAGCCCCTT GTGGAAAGCA 1200 TGGATCTGGG AGATGGATCT GGGAAACTTA CTGCATCGTC TGCAGCACAG ATATGAAGAG 1260 GAGTCTAAGG GAAAAGCTGC AAACTGTAAA GAACTTCTGA AAATGTACTC GAAGAATGTG 1320 GCCCTCTCCA AATCAAGGAT CTTTTGGACC TGGCTAATCA AGTATTTGCA AAACTGACAT 1380 CAGATTTCTT AATGTCTGTC AGAAGACACT AATTCCTTAA ATGAACTACT GCTATTTTTT 1440 TT 1442 <210>2 <211>153 <212>PRT <213>Mouse <400>2 Met Asn Gly Arg Val Asp Tyr Leu Val Thr Glu Glu Glu IlE Asn Leu 1 5 10 15 Thr Arg Gly Pro Ser Gly Leu Gly Phe Asn Ile Val Gly Gly Thr Asp 20 25 30 Gln Gln Tyr Val Ser Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Val Ser Arg Ile Lys 35 40 45 Glu Asp Gly Ala Ala Ala Gln Asp Gly Arg Leu Gln Glu Gly Asp Lys 50 55 60 Ile Leu Ser Val Asn Gly Gln Asp Leu Lys Asn Leu Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Ala Val Asp Leu Phe Arg Asn Ala Gly Cys Ala Val Ser Leu Arg Val 85 90 95 Gln His Arg Leu Leu Val Val Gly Gly Ser Phe Gly Leu Arg Glu Phe 100 105 110 Ser Gln Ile Arg Tyr Asp Ala Val Thr Ile Lys Ile Asp Pro Glu Leu 115 120 125 Glu Lys Lys Leu Lys Val Asn Lys Ile Thr Leu Glu Ser Glu Tyr Glu 130 135 140 Arg Leu Leu Cys Leu Leu Cys Arg Gln 145 150 153 <210>3 <211>459 <212>DNA <213>Mouse <400>3 ATGAACGGAC GGGTGGATTA TTTAGTCACG GAGGAAGAGA TCAACCTGAC GAGAGGACCT 60 TCGGGGCTGG GCTTCAACAT CGTCGGTGGG ACAGATCAAC AGTATGTCTC CAACGACAGT 120 GGCATCTACG TCAGCCGTAT CAAAGAGGAT GGGGCTGCGG CCCAGGATGG GCGGCTCCAG 180 GAGGGTGATA AGATCCTCTC GGTAAATGGC CAAGATCTGA AGAACCTGCT GCACCAAGAT 240 GCTGTAGACC TCTTCCGTAA TGCGGGATGT GCTGTGTCCC TGAGAGTACA GCACAGGTTG 300 CTGGTTGTTG GAGGTTCTTT TGGTCTTCGT GAATTTTCAC AAATCCGGTA CGATGCTGTG 360 ACAATTAAGA TTGATCCTGA ATTGGAGAAA AAATTGAAAG TGAATAAAAT AACTTTAGAG 420 TCAGAGTATG AGAGGCTGTT ATGTTTATTG TGCAGACAA 459 <210>4 <211>888 <212>DNA <213>Mouse <400>4 AACTGTAAAA GCTATGCTGG GGAGGCAGCG CGGAGCTTGA TTCACCTTCA CCTGCTCTGG 60 CCACCCGCTG ACCCGGGGTT TCCGGCCGGA GAGCAGTCAG ATATGAACGG ACGGGTGGAT 120 TATTTAGTCA CGGAGGAAGA GATCAACCTG ACGAGAGGAC CTTCGGGGCT GGGCTTCAAC 180 ATCGTCGGTG GGACAGATCA ACAGTATGTC TCCAACGACA GTGGCATCTA CGTCAGCCGT 240 ATCAAAGAGG ATGGGGCTGC GGCCCAGGAT GGGCGGCTCC AGGAGGGTGA TAAGATCCTC 300 TCGGTAAATG GCCAAGATCT GAAGAACCTG CTGCACCAAG ATGCTGTAGA CCTCTTCCGT 360 AATGCGGGAT GTGCTGTGTC CCTGAGAGTA CAGCACAGGT TGCTGGTTGT TGGAGGTTCT 420 TTTGGTCTTC GTGAATTTTC ACAAATCCGG TACGATGCTG TGACAATTAA GATTGATCCT 480 GAATTGGAGA AAAAATTGAA AGTGAATAAA ATAACTTTAG AGTCAGAGTA TGAGAGGCTG 540 TTATGTTTAT TGTGCAGACA ATGATAATCC ACCAGAGAAG TATTGCCACA AGCAAGCCGT 600 CCAAGTACAA TCACAGACAG CGACTTTACA CAAGGAACAG AGAATGAAGT CAGAGGGCAC 660 ACAAAGGAAC AGGGAGAAAG TCAGTTTCAG TTAATCATTT TGATTTTGAT AAGTTTTTCC 720 TGCAAGCACA ATTAGCTTTC AGAAATGGTA GAGAAGTTAG ATGTCCAGTT TTAATTAGCG 780 GTGACCAACA ACAGTAAAAA ACAGTTTTAT AAAATTTGTT TCCCACAAAA ATAAACTATA 840 TATATAAAAA TGTTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 888

【００７３】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の新規蛋白質をコードするｃＤＮＡの全
塩基配列とそれにコードされるアミノ酸配列（配列番
号：２）を示す。

【図２】ノーザンハイブリダイゼーションによる発現の
解析結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/14 Ａ６１Ｐ 25/28 25/16 Ｃ０７Ｋ 14/47 25/28 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ０１Ｋ 67/027 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ａ０１Ｋ 67/027 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同
   一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質
   またはその塩。
2. 【請求項２】請求項１記載の蛋白質の部分ペプチドまた
   はその塩。
3. 【請求項３】請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
   を含有する組換えＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列番号：３で表される塩基配列またはそ
   れとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
   る塩基配列を有する請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】請求項２記載の部分ペプチドをコードする
   ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】請求項３記載のＤＮＡを含有する組換えベ
   クター。
7. 【請求項７】請求項６記載の組換えベクターを保持する
   形質転換体。
8. 【請求項８】請求項７記載の形質転換体を培養し、請求
   項１記載の蛋白質を生成・蓄積せしめ、これを採取する
   ことを特徴とする請求項１記載の蛋白質またはその塩の
   製造方法。
9. 【請求項９】請求項１記載の蛋白質、請求項２記載の部
   分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体。
10. 【請求項１０】請求項９記載の抗体に対して、請求項１
    記載の蛋白質、請求項２記載の部分ペプチドまたはそれ
    らの塩を含有する被検液および標識化された請求項１記
    載の蛋白質、請求項２記載の部分ペプチドまたはそれら
    の塩を競合的に反応させることを特徴とする請求項１記
    載の蛋白質、請求項２記載の部分ペプチドまたはそれら
    の塩の定量方法。
11. 【請求項１１】請求項１記載の蛋白質、請求項２記載の
    部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とす
    る、請求項１記載の蛋白質、請求項２記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩と結合する蛋白質の決定方法。
12. 【請求項１２】請求項１１記載の方法により得られる、
    請求項１記載の蛋白質、請求項２記載の部分ペプチドま
    たはそれらの塩と結合する蛋白質またはその塩。
13. 【請求項１３】請求項１記載の蛋白質、請求項２記載の
    部分ペプチドまたはそれらの塩と、請求項１２記載の蛋
    白質またはその塩あるいはアクチビン受容体蛋白質また
    はその塩との結合を阻害または促進する化合物またはそ
    の塩のスクリーニング方法。
14. 【請求項１４】ツー ハイブリッド(ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉ
    ｄ)法を用いることを特徴とする請求項１１記載の蛋白
    質の決定方法または請求項１３記載のスクリーニング方
    法。
15. 【請求項１５】請求項１記載の蛋白質、請求項２記載の
    部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴と
    する、請求項１記載の蛋白質、請求項２記載の部分ペプ
    チドまたはそれらの塩と、請求項１２記載の蛋白質また
    はその塩あるいはアクチビン受容体蛋白質またはその塩
    との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のス
    クリーニング用キット。
16. 【請求項１６】請求項１３記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項１５記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項１記載の蛋白質、請求項２記載の部分
    ペプチドまたはそれらの塩と、請求項１２記載の蛋白質
    またはその塩あるいはアクチビン受容体蛋白質またはそ
    の塩との結合を阻害または促進する化合物またはその
    塩。
17. 【請求項１７】請求項１２記載の蛋白質、請求項１６記
    載の化合物またはそれらの塩を含有してなる医薬。
18. 【請求項１８】請求項１２記載の蛋白質もしくはその
    塩、アクチビン受容体またはアクチビン細胞内情報伝達
    分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予防・治療
    剤である請求項１７記載の医薬。