SK283630B6 - Spôsob separácie lipoproteínov z roztoku krvného gamaglobulínu - Google Patents

Abstract

Bielkovinný materiál obsahujúci purifikovaný ľudský alebo zvierací gamaglobulín sa suspenduje za aseptických podmienok v takom množstve destilovanej apyrogénnej vody s teplotou 0 °C až 6 °C, aby sa koncentrácia bielkovín nachádzala v rozmedzí 5 až 180 g/l. Z roztoku sa lipoproteíny vyzrážajú pridaním polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou 4 000 až 10 000, pričom vzniknutý preparát sa mieša alebo necháva stáť minimálne 2 hodiny a maximálne 24 hodín pri teplote 0 °C až 6 °C. Precipitát lipoproteínov sa z roztoku gamaglobulínov oddelí centrifugáciou a roztok sa vyčíri filtráciou alebo inou vhodnou fyzikálnou metódou. Následne sa uskutoční oddelenie balastných zlúčenín do molekulovej hmotnosti 150 000 v prostredí apyrogénnej destilovanej vody alebo vo vodnom roztoku NaCl v destilovanej apyrogénnej vode v koncentrácii do 30 g/l pri teplote 0 °C až 6 °C pri pH 4,0 až 8,0. Takto získaná forma monoméru IgG sa zakoncentrováva, sterilizuje a pred komorou lyofilizáciou sa roztok stabilizuje pridávaním NaCl, glukózy, maltózy alebo iných cukrov. Roztok sa rozplní, vykoná sa jeho namrazenie a lyofilizácia, v prípade potreby sa roztok gamaglobulínu pred lyofilizáciou alebo po nej podrobí ďalšiemu spracovaniu pomocou iontomennej alebo afinitnej chromatografie kvôli získaniu kvalitatívnych parametrov IgG. ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy purifikovaného krvného gamaglobulínu ľudského alebo zvieracieho pôvodu s vysokým obsahom monoméru, z normálnej alebo hyperimúnnej plazmy, prípadne z normálneho alebo retroplacentarného, prípadne hyperimunného séra, ktorý je určený na terapeutické účely.

Doterajší stav techniky

Na precipitáciu krvného gamaglobulínu zo zmesi plazmatických alebo sérových bielkovín sa v celosvetovom meradle najčastejšie používa etanol / Cohn E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D. M., Bames B. A., Brown R. K., Derouaux G., Gillespie J. M., Kahnt F. W., Lewe W. F., Liu C. H., Mittelman D., Mouton R. F., Schmid K., Uroma Z.: J. Am. Chem. Soc.72, 465, 1950: Deutsch H. F., Costling G. L., Alberty R. A., Williams J. W.: J. Biol. Chem. 164, 109, 1946: Oncley J. L., Melin M., Rickert D. A., Cameron J. W., Gross P. M. J. Am. Chem. Soc. 71, 541, 1949: Nitschman H. S., Kistler P., Largier W.: Helv. Chim. Acta 37, 866 ,1954; Kistler P., Nitschman H. S.: Vox Sang. 7, 414, 1962; Taylor H. L., Bloom F. C., McCall K. B., Hyndman L. A., Anderson H. D.: J. Am. Chem. Soc. 78, 1356,19567 a frakcia II je najčastejšie používaným východiskovým materiálom na prípravu gamaglobulínu na terapeutické účcly či už na i. m., tak aj na i. v. podanie.

Podľa imunoelektroforetických analýz gamaglobulínového roztoku, izolovaného ako frakcia II podľa Cohna a Oncleya, je zrejme, že táto frakcia obsahuje:

IgA s molekulovou hmotnosťou 160 000 (Franklin E. C.: Náture 195,393, 1962),

3]a - globulín s molekulovou hmotnosťou 160 000 3_1C - globulín s molekulovou hmotnosťou 250 000 (Muller

- Eberhard H. J., Nilsson J. N., Aronsson T.: J. Exptl. Med. 111,201, 1960), albumín - s molekulovou hmotnosťou 69 000 (Cohn EJ., Hughes W. L., Weare J. H.: J. Am. Chem. Soc. 69, 1753, 1947), transferín - s molekulovou hmotnosťou 90 000 (Koechlin B. A.: J. Am. Chem. Soc. 74,2649, 1952),

IgM - s molekulovou hmotnosťou 1 000 000 (Schultze H. E., Haupt H., Heide K., Môschlin G., Schimdtberger R., Schwick G.: Naturforsch. 17b, 313,1962), alfa - I lipoproteín, v ktorom rozoznávame HDL₂ (high -

- density lipoproteins) s molekulovou hmotnosťou 435 000 a HDL₃ s molekulovou hmotnosťou 195 000, alfa -2 lipoproteín, ktorého molekulovej hmotnosť sa pohybuje v rozmedzí od 5.10⁶ do 20.10⁶ beta - lipoproteín, ktorého molekulová hmotnosť je 3,2.10⁶ (Shore B.: Árch Biochem. Biophys. 71, 1, 1957).

Na izoláciu alfa - 1, alfa -2 a beta lipoproteinov sa používa samotná ultracentrifugácia (DeLalla O. F., Gofman J. W.: Methoda Biochem. Anál. 1, 459, 1954; Lindren F.T, Nichols A.V.: v knihe Putnam F. W.„The Plasma Proteins Vol. II“ Academic Press New York 1960 str. 1 (alebo ultracentrifugácia kombinovaná so škrobovou elektroforézou) Kunkel H. G., Trautman R.: J. Clin. Invest. 35, 641, 1956). Beta -lipoproteíny je možné z roztoku vyzrážať kombinovaným účinkom dextransulfatu a chloridu vápenatého (Burstein M., Samaille J.: Rev. Franc. Etudes Clin. Biol. 3, 624, 1658).

Spomínané metódy izolácie lipoproteinov neboli zavedené do technologickej praxe. V minulosti sa na separáciu lipoproteinov z roztoku krvného gamaglobulínu používal prevažne chloroform (Kúska J., Kremer J.: Čsl. patent č. 89170/56; Rejnek J., Rybák M., Škvaril R: Čs. Epidem. 42, 223, 1959).

Novšie poznatky o účinkoch chloroformu jeho používanie pri separácii lipoproteinov neodporúčajú. Chloroform sa vyskytuje v pitnej vode, kde pri chlórovaní účinkom chlóru na vo vode rozpustný metán vzniká v stopových množstvách a je považovaný za zlúčeninu vyvolávajúcu mutagénny účinok (Chem. A. M., Skochdopole J., Koski P., Cóle.: Science 207, 90, 1980). Hoci v nedávnej minulosti použitie chloroformu v anestézii bolo bežné, v súčasnosti sa to neodporúča (Jones I. W.: Anaesthesia 38, 578, 1983). Účinok chloroformu na bielkoviny ľudskej krvnej plazmy je veľmi konkrétny a ovplyvňuje vlastnosti týchto bielkovín, ako aj imunitný systém ľudského a zvieracieho organizmu v širokom rozsahu, t. j. aj vlastnosti samotných imunoglobulínov, pričom najviac pôsobí hepatotoxicky a kancerogenózne. (Štefanovič J., Staršia Z., Murgašova L, Absolónova O.: J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. 31, 1, 1987; Štefanovič J., Murgašova I., Absolónova O., Žalkovičová M.: Bratisl. lek. listy 89, č. 3, 160, 1988).

Na úrovni r. 1964 Polson a spol. (Polson A., Potgieter G. M., Largier J. F., Mears G. E. F., Jouber F. J.: Biochim. Biophys. Acta 82, 463, 1964) a neskôr Zeppezauer s Brishammarom (Zeppezauer M., Brishammar S.: Biochim. Biophys. Acta 94, 581, 1965) ďalej Iverius s Laurentom (Iverius P. H., Laurent T. C.: Biochim. Biophys. Acta 133, 371, 1967) ako aj Chesebro so Svehagom (Chesebro B., Svehag S. E.: Clin. Chim. Acta 20, 527, 1968) dokázali že polymérmi etylénglykolu je možné vykonávať selektívnu frakcionáciu plazmatických bielkovín pri teplote v rozmedzí 0 °C až +20 °C. Polson a Ruis -Bravo (Polson A., Ruiz -Bravo C.: Vox Sang. 23, 107, 1972) zistili, že polyetylénglykol (PEG) na rozdiel od etylalkoholu pri pridávaní nezvyšuje teplotu roztoku a má na plazmatické bielkoviny aj stabilizačné účinky v malých koncentráciách. Napríklad roztok i. v. gamaglobulínu fy. Immuno Ag. Vicnna po rozpustení obsahuje 0,5 %-ný roztok PEG-u a roztok i. v. gamaglobulínu fy Ilyland - Travenol Glendale po rozpustení obsahuje 0,2 %-ný roztok PEG-u (Lundblad J. L., Londeree N., Mitra G.: J. Infect. 15, Suppl. 1, 3, 1987).

Čím väčšia koncentrácia PEG-u sa na precipitáciu použije, tým väčšie množstvo PEG-u zostáva v bielkovinovom roztoku či už vo forme voľnej alebo viazanej. V prípade precipitácie albumínu 23 % pri pH 7,0 je potrebné počítať s nežiaducimi vedľajšími účinkami (Smyth H. F. Jr., Carpenter C. P., Weil C. S.: J. Am. pharm. Ass. 39, 349, 1950).

Súčasná technologická prax na jednej strane síce oddeľuje gamaglobulín od zmesi iných krvných bielkovín, ale na druhej strane zanáša do roztoku nízkomolekuláme anorganické alebo organické zlúčeniny. Technologický postup môže taktiež časť niektorých zlúčenín s biochemickofyziologickou aktivitou v roztoku gamaglobulínu koncentrovať, t. j. obohacovať vzhľadom na ich pôvodnú koncentráciu vo východiskovej surovine, z ktorej bol gamaglobulín izolovaný.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je spôsob separácie lipoproteinov z roztoku krvného gamaglobulínu, vyznačujúci sa tým, že bielkovinový materiál obsahujúci purifíkovaný gamaglobulín sa suspenduje za aseptických podmienok v takom množstve destilovanej apyrogennej vody s teplotou 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrácie bielkovín sa nachádzala v rozmedzí 5 až 180 gramov na liter. Precipitácia lipoproteí2 nov z gamaglobulínového roztoku sa vykonáva pridávaním polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou od 4000 do 10 000, s optimom 6000, ktorý sa pridáva v podobe suchých vločiek alebo šupín postupne do roztoku v takom množstve, aby sa jeho koncentrácia pohybovala v rozmedzí 20 až 120 gramov na liter, s optimom 30 až 50 gramov na liter, pri hodnote pH 4,0 až 8,0, s optimom 5,0 až 7,0.

Lipoproteínový precipitát vzniknutý účinkom polyetylénglykolu sa mieša alebo necháva stáť minimálne 2 hodiny a maximálne 24 hodín pri teplote 0 °C až +6 °C a po tomto čase sa precipitát lipoproteínov z roztoku gamaglobulínu odstráni, napr. centrifugáciou a roztok gamaglobulínu sa vyčíri, napr. filtráciou. Z takto pripraveného filtrátu gamaglobulínového roztoku sa oddelenie balastných zlúčenín do molekulovej hmotnosti 150 000 uskutočňuje v prostredí destilovanej apyrogennej vody, alebo vo vodnom roztoku chloridu sodného v destilovanej apyrogennej vode s koncentráciou do 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až +6 °C pri pH 4,0 až 8,0, pričom optimálne zloženie je 0,01 M Na₂HPO₄ - NaH₂PO₄ - 0,15 M NaCl s hodnotou pH 7,3 ±0,1.

Oddeľovanie balastných zlúčenín s molekulovou hmotnosťou do 150 000 sa robí pomocou gélovej filtrácie, dialýzy, diafiltrácie a ultrafiltrácie.

Po oddelení balastných zlúčenín do 150 000 sa gamaglobulínový roztok zakoncentrováva ultrafiltráciou, vákuovou destiláciou, vymrazovaním alebo inými metódami, potom sa sterilizuje, napr. filtráciou, pred koncovou lyofilizáciou sa roztok stabilizuje, napr. pridávaním chloridu sodného, glukózy, maltózy alebo iných cukrov. Roztok sa rozplní, urobí sa jeho namrazenie a lyofilizácia, pričom v prípade potreby sa roztok gamaglobulínu pred lyofilizáciou alebo po lyofilizácii podrobí ďalšiemu spracovaniu, napr. ionexovej alebo afinitnej chromatografii.

Bielkovinový materiál, z ktorého sa frakcia obsahujúca polyvalentný alebo špecifický gamaglobulin izoluje, môže byť normálna alebo hyperimunná plazma, prípadne normálne retroplacentáme alebo hyperimunné sérum ľudského alebo zvieracieho pôvodu s definovanou antibakteriálnou, antitoxickou alebo antivírusovou protilátkovou aktivitou.

Vynález je ďalej objasnený na príkladoch uskutočnenia vynálezu, ktorými jeho rozsah nie je ani obmedzený ani vyčerpaný.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1:

Východiskovou surovinou, z ktorej sa frakcia obsahujúca polyvalentný alebo špecifický gamaglobulin izoluje môže byť normálna alebo hyperimúnna plazma, pripadne normálne, retroplacentáme alebo hyperimúnne sérum ľudského alebo zvieracieho pôvodu s definovanou antibakteriálnou, antitoxickou alebo antivírusovou protilátkovou aktivitou. Bielkovinový gamaglobulínový materiál sa suspenduje za aseptických podmienok v takom množstve destilovanej apyrogénnej vody s teplotou 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrácie bielkovín bola v rozmedzí 5 až 180 gramov na liter, s optimom 60 až 100 gramov na liter. Rozpúšťanie sa urýchľuje miešaním. V technologických postupoch sú uvedené podmienky spravidla splnené vtedy, ak rozpúšťame 1 kg gamaglobulínovej pasty frakcie II v 2000 ml destilovanej apyrogennej vody s teplotou 0 °C až +6 °C. Hodnota pH gamaglobulínového roztoku býva spravidla v rozmedzí 4,0 až 8,0 a koncentrácia bielkovín v rozmedzí 60 až 100 gramov na liter.

Po rozpustení sa lipoproteíny z gamaglobulínového roztoku vyzrážajú účinkom pridaného polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou od 4000 do 10 000, s optimom 6000, ktorý sa pridáva v podobe suchých vločiek alebo šupín postupne do roztoku v takom množstve, aby sa jeho koncentrácia pohybovala v rozmedzí 20 až 120 gramov na liter s optimom 30 až 50 gramov na liter, pri pH 4,0 až 8,0 s optimom 5,0 až 7,0.

Vzniknutý precipitát sa mieša alebo nechá stáť minimálne 2 hodiny a maximálne 24 hodín pri teplote 0 °C až +6 °C. Precipitát lipoproteínov sa z roztoku gamaglobulínov odstráni, napr. centriŕugáciou a roztok gamaglobulínov sa vyčíri, napr. filtráciou.

Separácia nizkomolekulámych a vysokomolekulárnych prímesí do molekulovej hmotnosti 150 000 sa z gamaglobulínového roztoku vykoná pomocou gélovej filtrácie, dialýzy diafiltrácie alebo ultrafiltrácie oproti destilovanej apyrogénnej vode s teplotou 0 “C až +6 °C alebo oproti roztoku chloridu sodného v destilovanej apyrogénnej vode v koncentrácii do 30 gramov na liter taktiež s teplotou 0 °C až +6 °C. Veľmi vhodným sa ukázalo použitie roztoku zloženého z 0,01 M Na₂HPO₄ - NaH₂ PO₄ - 0,15 M NaCl s hodnotou pH 7,3 ±0,1 s teplotou 0 °C až 6 °C.

Účinnosť separácie nizkomolekulámych a vysokomolekulárnych zlúčenín do molekulovej hmotnosti 150 000 z gamaglobulínového roztoku posudzujeme podľa obsahu etanolu, polyetylénglykolu a ninhydrin pozitívnych látok, ďalej podľa obsahu transferínu a albumínu v eluáte z kolóny, dialyzáte pri dialýze alebo pri diafiltrácii, alebo v retentáte pri ultrafiltrácii.

Ninhydrin pozitívne látky stanovujeme spôsobom podľa Ruhemana (Ruheman S.. J. Chem. Soc 97, 1438, 1910). Stanovenie etanolu sa robí Agulhonovou reakciou (Agulhon H.: Bull. Soc. Chim. France (4), 9 891 1911) či už v pôvodnom usporiadam alebo v novších aplikáciách podľa Kelletta (Kellett E.C.: Analyst 62, 728, 1937) alebo Webba (Webb D. A.: Sci. Proc. Roy Dublin Soc. 21, 281, 1936). Stanovenie polyetylénglykolu sa robí podľa Childsa (Childs C. E.: Microchem. J. 20, 190, 1975). Testovanie obsahu albumínu, transferínu, ďalej monoméru, diméru a polyméru IgG je výhodné prevádzať pomocou vysokotlakovej gélovej kvapalinovej chromatografie.

Gamaglobulínový roztok, z ktorého boli oddelené balastné prímesi nizkomolekulámych a vysokomolekulárnych zlúčenín do molekulovej hmotnosti 150 000 sa v prípade potreby zakoncentrováva ultrafiltráciou, vákuovou destiláciou, vymrazovaním alebo inými metódami, potom sa sterilizuje napríklad filtráciou. Pred koncovou lyofilizáciou sa upravujú v roztoku podmienky, roztok sa rozplňuje do fľaštičiek a prevedie sa jeho namrazenie. V prípade potreby sa podrobí ďalšiemu spracovaniu napríklad pomocou ionexovej alebo afinitnej chromatografie.

Pod úpravou podmienok v roztoku gamaglobulínu, kde prevažuje obsah monoméru IgG pred lyofilizáciou rozumieme pridanie chloridu sodného a glukózy do požadovanej koncentrácie, počom nasleduje úprava hodnoty pH do určitého rozmedzia. Miesto glukózy jc možné použiť aj iné cukry. Dobré stabilizačné účinky vykazuje pri gamaglobulínu pridanie maltózy do 10 %-nej koncentrácie pred lyofilizáciou (Ochs. H. D., Piforsky B., Rousel R. H., Buckley R. H., Fischer S. H., Anderson C. J., Wedgwood R. J.: Lancet ii, 1153, 1980) alebo pridanie aminooctovej kyseliny v kombinácii s kyselinou epsilon-aminokapronovou (Sváril F. v knihe; „Immunoglobulins“ National Academy of Science, Washington D. C. 1970 str. 165).

Preparáty gamaglobulínu vyrobené podľa navrhovaného postupu z cca 98,0 %-ného obsahu monoméru IgG v roztoku majú po rozpustení z lyofilizovaného stavu agregačné spektrum, ktoré sa nachádza v rozmedzí 92 - 98 % monoméru, 3 až 6 % diméru, pričom spravidla nenachádzame žiadny polymér IgG. Testovanie obsahu monoméru, diméru a polyméru IgG v lyofilizovanom stave po rozpustení bolo robené pomocou gólovej filtrácie na Sepharcryle S-300 súperíme s prietokovou registráciou denzity pri 254 nm.

Testovanie obsahu IgA a IgM v rozpustenom lyofilizovanom preparáte gamaglobulínu pomocou IDP súprav alebo Q antisér (oba výrobky fy. ÚSOL Praha) naznačuje, že obsah IgM je v rámci technológie kompletne odstránený, pričom obsah IgA zostáva prakticky nezmenený.

Príklad 2:

Východiskovou surovinou môže byť bielkovinová pasta alebo roztok gamaglobulínu v purifikovanom stave izolovaný aj pomocou precipitačných metód. Bielkovinová pasta alebo roztok gamaglobulínu sa spracováva podobne ako v príklade 1 s tým rozdielom, že sa nekladie dôraz len na stanovenie etanolu, polyetylénglykolu a ninhydrín pozitívnych látok, ale aj na stanovenie precipitačnej látky, ktorá bola použitá na precipitáciu gamaglobulínov, ako aj na stanovenie tej zlúčeniny, ktorá uvoľnila gamaglobulín z väzby na niektorom zo sorbentov ionexového alebo afinitného charakteru v rámci prípravy polyvalentného alebo špecifického IgG.

Priemyselná využiteľnosť

Terapeutický alebo diagnostický preparát na báze IgG možno využiť v odbore klinickej imunológie, humánnej a veterinárnej medicíne, imunofarmakológii a biológii. Výrobný postup umožňuje vyrobiť preparát s vysokým obsahom monoméru IgG, ktorý podľa posúdenia klinického stavu pacienta možno aplikovať či už intravenózne alebo intramuskulárne.

Claims (5)

1. Spôsob separácie lipoproteínov z roztoku krvného gamaglobulínu, vyznačujúci sa tým, že bielkovinový materiál obsahujúci purifíkovaný gamaglobulín sa suspenduje za aseptických podmienok v takom množstve destilovanej apyrogénnej vody s teplotou 0 °C až +6 °C, aby hodnota koncentrácie bielkovín sa nachádzala v rozmedzí 5 až 180 gramov na liter, lipoproteíny sa z gamaglobulínového roztoku vyprecipitujú účinkom pridaného polyetylénglykolu, pričom vzniknutý precipitát sa mieša alebo necháva stáť minimálne 2 hodiny a maximálne 24 hodín pri teplote 0 °C až +6 °C, po tomto čase sa precipitát lipoproteínov z roztoku gamaglobulínov odstráni, napríklad centrifúgáciou, roztok gamaglobulínu sa vyčíri, napríklad filtráciou a oddelia sa balastné zlúčeniny s molekulovou hmotnosťou do 150 000, potom sa gamaglobulínový roztok zakoncentrováva ultrafíltráciou, vákuovou destiláciou alebo vymrazovaním a sterilizuje, napríklad filtráciou. Pred koncovou lyofilizáciou sa roztok stabilizuje, napríklad pridávaním chloridu sodného, glukózy, maltózy alebo iných cukrov. Roztok sarozplní, vykoná sa jeho namrazenie a lyofilizácia, pričom v prípade potreby sa roztok gamaglobulínu pred lyofilizáciou alebo po lyofilizácii podrobí ďalšiemu spracovaniu, napríklad pomocou ionexovej alebo afinitnej chromatografie.

2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že oddelenie balastných zlúčenín do molekulovej hmotnosti 150 000 sa vykonáva v prostredí destilovanej apyrogénnej vody, alebo vo vodnom roztoku chloridu sod ného v destilovanej apyrogénnej vode s koncentráciou do 30 gramov na liter pri teplote 0 °C až +6 °C pri pH 4,0 až 8,0 pričom optimálne zloženie je 0,01 M Na₂HPO₄ - NaH₂PO₄ - 0,15 M NaCl s hodnotou pH 7,3 ±0,1 pri teplote 0 °C až +6 °C.

3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že precipitácia lipoproteínov z gamaglobulínového roztoku sa uskutočňuje pridávaním polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou od 4000 do 10 000, s optimom 6000, ktorý sa pridáva v podobe suchých vločiek alebo šupín postupne do roztoku v takom množstve, aby sa jeho koncentrácia pohybovala v rozmedzí 20 až 120 gramov na liter, optimálne 30 až 50 gramov na liter pri hodnote pH 4,0 až 8,0, optimálne 5,0 až 7,0.

4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že oddeľovanie balastných zlúčenín s molekulovou hmotnosťou do 150 000 sa uskutočňuje pomocou gélovej filtrácie, dialýzy, diafiltrácie a ultrafiltrácie.

5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že bielkovinový materiál, z ktorého sa frakcia obsahujúca polyvalentný alebo špecifický gamaglobulín izoluje je normálna alebo hyperimúnna plazma, prípadne normálne, retroplaccntámc alebo hyperimúnne sérum ľudského alebo zvieracieho pôvodu s definovanou antibakteriálnou, antitoxickou alebo antivírusovou protilátkovou aktivitou.