RU2326689C1 - Способ получения концентрата viii фактора свертывания крови человека и продукт его содержащий - Google Patents
Способ получения концентрата viii фактора свертывания крови человека и продукт его содержащий Download PDFInfo
- Publication number
- RU2326689C1 RU2326689C1 RU2007108925/15A RU2007108925A RU2326689C1 RU 2326689 C1 RU2326689 C1 RU 2326689C1 RU 2007108925/15 A RU2007108925/15 A RU 2007108925/15A RU 2007108925 A RU2007108925 A RU 2007108925A RU 2326689 C1 RU2326689 C1 RU 2326689C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- added
- final concentration
- factor
- factor viii
- concentrate
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области препаративной биохимии, фармации и медицины и касается способа получения концентрата VIII фактора свертывания крови и продукта его содержащего. Способ включает использование в качестве источника криопреципитата плазмы крови, добавление гепарина, ПЭГ-4000, центрифугирование, к супернатанту добавляют трибутилфосфат и твин 80, повторное центрифугирование, осадок, отмытый хлористым натрием, растворяют в трис-HCl буфере с добавками, пропускают через колонку, заполненную гелем с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда, элюцию фактора VIII, диализ. Полученный концентрат не содержит фактора Виллебранда и имеет активность не менее 300 МЕ/мг белка с чистотой не менее 98%, и содержит альбумин до концентрации 0,1%. Продукт лиофилизован с последующей термообработкой. Изобретение позволяет получить продукт, который является апирогенным, не проявляет токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывает аллергических реакций и может быть использован в медицине, в ветеренарии, в научно-исследовательских целях. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области препаративной биохимии, фармации и медицины и касается способа получения концентрата VIII фактора свертывания крови и продукта его содержащего.
Фактор VIII играет важную роль в системе свертывания крови и является основным компонентом лекарственных средств, предназначенных для лечения гемофилии. В плазме крови его содержание невелико и составляет десятитысячные доли процента по отношению к общему белку. Это и определяет главную проблему в создании препаратов, содержащих данный фактор - необходимость в высокой эффективности технологических процессов их получения, учитывая главную составляющую себестоимости - стоимость плазмы крови человека. Все препараты, содержащие данный фактор, делятся по способу их получения на генно-инженерные и препараты, полученные из плазмы крови человека. Последняя группа представляет собой концентраты разной степени очистки. Максимальная очистка достигается с использованием моноклональных антител, пришитых к тому или иному носителю, минимальная - заключается в двух-трех нехроматографических стадиях очистки криопреципитата. Препараты промежуточной степени очистки получают с использованием комбинации тех или иных хроматографических методов. Такое разнообразие препаратов, содержащих фактор VIII, объясняется отсутствием единого мнения о необходимой и достаточной степени очистки от других компонентов плазмы крови.
Принципиальное различие технологий базируется на разном подходе к спектру белков, находящихся в конечной готовой лекарственной форме фактора VIII. Прежде всего это касается вопроса о необходимости очистки от фактора Виллебранда. Дело в том, что с одной стороны, фактор Виллебранда, находясь в комплексе с фактором VIII, стабилизирует последний, с другой, субъединицы фактора Виллебранда образуют огромные комплексы между собой. Поэтому, даже если очиститься от всех остальных белков плазмы крови, удельная активность фактора VIII в таком препарате будет далека от оптимальной (когда фактора Виллебранда в препарате нет вообще или молярное отношение фактор VIII: фактор Виллебранда 1:1) и будет определяться соотношением факторов. Известно, что такое отношение in vitro может достигать 1:100. А, учитывая еще и большую молекулярную массу фактора Виллебранда по отношению к фактору VIII, становится очевидной необходимость разрушения такого надмолекулярного комплекса фактора Виллебранда. В этом случае независимо от использования других технологических приемов можно ожидать больший выход и большую удельную активность фактора VIII в конечном препарате как высокой, так и низкой степени очистки.
Вопрос о том, как и на каком этапе выделения фактора VIII необходимо разрушить агрегат фактора Виллебранда, тесно связан с проблемой поддержания стабильности фактора VIII в процессе его выделения и очистки. После удаления факторов, понижающих стабильность фактора VIII, таких как протромбин и тромбин, наибольшее инактивирующее воздействие на него могут оказать процедуры вирусной инактивации. Дело в том, что это довольно жесткие процедуры и их проведение тем или иным способом требует наличия стабилизирующих факторов. Отчасти сам комплекс фактора VIII и фактора Виллебранда выполняет такую функцию. Поэтому разрушение надмолекулярных агрегатов фактора Виллебранда надо проводить либо после процедуры вирусной инактивации, либо искусственно вводить дополнительные стабилизаторы.
Известны способы получения концентрата фактора VIII, в частности, описанные в патентах RU 2025129, RU 2148411, RU 2055593.
Наиболее близким является способ, описанный в патенте RU 2253475.
Суть настоящего изобретения заключается в том, что разработан способ получения препаратов, содержащих фактор VIII, отличающийся тем, что с помощью тиол-дисульфидного обмена разрушались надмолекулярные комплексы фактора Виллебранда, активность фактора VIII при этом не затрагивалась. Предлагаемый способ позволил разработать метод получения препаратов, содержащих фактор VIII, отличающийся большей эффективностью и удельным содержанием по сравнению с аналогичными методами, но не включающими эту стадию.
Другим аспектом заявленного изобретения является продукт для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях, содержащий концентрат активного VIII фактора свертывания крови человека с удельной активностью не менее 300 МЕ/мг и 0,1% альбумина, и чистотой более 98%, полученный способом, приведенным в описании и в формуле.
Продукт может быть представлять собой раствор или лиофилизированный порошок (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом). В случае необходимости он может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного - струйно или инфузией, внутримышечного, интраназального) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам. Наполнителями являются, например, сахара (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза или их смеси), восстановительные сахара (эритрол, маннитол и др.) в физиологически приемлемых концентрациях, в случае необходимости - антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций. Дополнительно продукт может содержать неорганические и/или органические соли и их сочетания для поддержания приемлемых значений рН.
Растворителями для лиофилизированного продукта могут служить дистиллированная апирогенная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор.
Также можно лиофилизировать готовый продукт, содержащий концентрат VIII фактора и любой из перечисленных, вспомогательных веществ, в частности альбумин или их сочетание.
Продукт может иметь соответствующую упаковку и, необязательно, инструкцию по применению.
Осуществление способа поясняется следующими примерами.
Пример 1.
1 кг криопреципитата плазмы крови растворяли в течение 1 часа в воде, содержащей гепарин (3 ед./мл) при температуре 25°С. Добавляли гидроокись алюминия, доводили рН до 7,0 и после 15 минутной инкубации центрифугировали. К полученному супернатанту добавляли гепарин до конечной концентрации 3 ед./мл, после этого добавляли 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 2 мМ и инкубировали в течение часа, затем добавляли полиэтиленгликоль - 4000 до конечной концентрации 2%. После доведения рН до 6,6 инкубировали в течение 15 минут и центрифугировали. Осадок отбрасывали, а супернатант диализовали против воды, содержащей гепарин (3 ед./мл), добавляли глицин до конечной концентрации 13% и инкубировали в течение часа. Затем центрифугировали, осадок отбрасывали. К супернатанту добавляли трибутилфосфат до конечной концентрации 0,3% и твин 80 до конечной концентрации 1%, подводили рН до 7,2 и инкубировали при комнатной температуре в течение 6 часов. После этого добавляли хлорид натрия до конечной концентрации 14%, инкубировали в течение часа и центрифугировали. Осадок отмывали раствором хлорида натрия и диализовали против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина. Удельная активность составляла около 60 МЕ/мг общего белка. Добавляли альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтровали и подвергали лиофилизации в сочетании с последующей термообработкой. Выход процесса по активности фактора VIII составлял около 60%.
Пример 2. Предпочтительный вариант осуществления способа.
Осадок концентрата фактора VIII получали, как в примере 1. После отмывания осадка раствором хлорида натрия его растворяли в 10 мМ трис HCl буфере, содержащем 100 мМ хлорид натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 10 мМ лизин и 5 ед./мл гепарина. Раствор пропускали через аффинную колонку, содержащую 1 л геля с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда (anti-vWF gel, Immunotech, France). Элюцию фактора VIII проводили после промывки 8 колоночными объемами уравновешивающего буфера. В состав элюирующего буфера входили 10 мМ трис HCl, 250 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, 2,5 мМ хлорида кальция, 250 мМ сульфата аммония, 2,55% глицерина. Полученный раствор диализовали против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина. Удельная активность составляла около 300 МЕ/мг. Добавляли альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтровали и подвергали лиофилизации в сочетании с последующей термообработкой. Выход процесса по активности фактора VIII составлял около 70%.
Чистота продукта не менее 98%.
Полученный продукт является апирогенным, не проявляет токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывает аллергических реакций и может быть использован в медицине, в ветеренарии, в научно-исследовательских целях.
Claims (6)
1. Способ получения концентрата VIII фактора свертывания крови человека, характеризующийся тем, что криопреципитат плазмы крови растворяют в воде, содержащей 3 ед./мл гепарина при температуре 25°С, добавляют гидроокись алюминия, доводят рН до 7,0, инкубируют, центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют гепарин, затем 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 3 ед./мл и 2 мМ соответственно, инкубируют в течение часа, добавляют полиэтиленгликоль - 4000 до конечной концентрации 2%, доводят рН до 6,6, инкубируют 15 мин, центрифугируют, супернатант диализуют против воды, содержащей гепарин 3 ед./мл, далее добавляют глицин до конечной концентрации 13%, инкубируют в течение часа, центрифугируют, к супернатанту добавляют трибутилфосфат до конечной концентрации 0,3% и твин 80 до конечной концентрации 1%, доводят рН до 7,2, инкубируют при комнатной температуре в течение 6 ч, после этого добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 14%, инкубируют в течение часа, центрифугируют, осадок отмывают раствором хлорида натрия, растворяют в 10 мМ трис HCl буфере, содержащем 100 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 10 мМ лизина и 5 ед./мл гепарина, раствор пропускают через колонку, заполненную гелем с пришитыми к нему антителами к фактору Виллебранда, элюируют буфером, состоящим из 10 мМ трис HCl, 250 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, 2,5 мМ хлорида кальция, 250 мМ сульфата аммония, 2,55% глицерина, полученный раствор диализируют против раствора, содержащего 200 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида кальция, 20 мМ цитрата натрия, 10 мМ лизина и 100 мМ глицина, к полученному концентрату, имеющему удельную активность не менее 300 МЕ/мг белка, добавляют альбумин до концентрации 0,1%, стерильно фильтруют, лиофилизируют и подвергают термообработке.
2. Продукт, представляющий собой концентрат VIII фактора свертывания крови, характеризующийся тем, что получен способом по п.1, имеет удельную активность не менее 300 МЕ/мг белка с чистотой не менее 98% и содержит альбумин до концентрации 0,1%.
3. Продукт по п.2, характеризующийся тем, что представляет собой раствор или лиофилизированный порошок.
4. Продукт по п.2, характеризующийся тем, что дополнительно содержит фармацевтические наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального введения.
5. Продукт по любому из пп.2-4 для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях.
6. Продукт по п.5 для лечения или предупреждения состояний, связанных с недостатком VIII фактора.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007108925/15A RU2326689C1 (ru) | 2007-03-13 | 2007-03-13 | Способ получения концентрата viii фактора свертывания крови человека и продукт его содержащий |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007108925/15A RU2326689C1 (ru) | 2007-03-13 | 2007-03-13 | Способ получения концентрата viii фактора свертывания крови человека и продукт его содержащий |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2326689C1 true RU2326689C1 (ru) | 2008-06-20 |
Family
ID=39637287
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007108925/15A RU2326689C1 (ru) | 2007-03-13 | 2007-03-13 | Способ получения концентрата viii фактора свертывания крови человека и продукт его содержащий |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2326689C1 (ru) |
-
2007
- 2007-03-13 RU RU2007108925/15A patent/RU2326689C1/ru not_active IP Right Cessation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4877608A (en) | Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media | |
FI106721B (fi) | Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi | |
EP0317376B2 (fr) | Préparation de concentré de facteur IX humain de haute pureté et d'autres protéines plasmatiques | |
JP2544968B2 (ja) | 高イオン性濃度媒体中の血漿及び組換え蛋白処方物 | |
US4297344A (en) | Blood coagulation factors and process for their manufacture | |
US7816495B2 (en) | Processes for the preparation of fibrinogen | |
JPS62174023A (ja) | 抗血液凝固物質、その製法及びそれを有効成分とする抗血液凝固剤 | |
JP3650937B2 (ja) | 治療に使用するためのインター−α−トリプシンインヒビター濃縮物の調製方法、およびそのようにして得られる濃縮物 | |
EP0410207A2 (en) | Stabilization of highly purified proteins | |
US8809510B2 (en) | Method for purification of complement factor H | |
CN106349387A (zh) | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法 | |
JP2532535B2 (ja) | 組織タンパクpp4含有医薬 | |
JP2955211B2 (ja) | ウイルスに関して安全なヒト免疫グロブリンa単量体及びその製造方法 | |
MXPA02010017A (es) | Preparacion activa hemostaticamente, que contiene el factor de von willebrand y metodo para la produccion de la misma. | |
NZ224740A (en) | Stabilisation of proteinaceous products during thermal inactivation of viral and bacterial compounds | |
KR20040030369A (ko) | Viii:c 인자 함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물 및이의 제조방법 | |
JP2601675B2 (ja) | ヒト血漿よりα▲下1▼−アンチトリプシン濃縮物を得る方法及び医薬品としてのその利用 | |
RU2326689C1 (ru) | Способ получения концентрата viii фактора свертывания крови человека и продукт его содержащий | |
RU2256464C1 (ru) | Способ получения с1-эстеразного ингибитора человека и продукт для использования в медицине | |
JPH03218399A (ja) | 尿由来の抗血液疑固物質、その製法およびそれを含有する医薬組成物 | |
RU2445974C2 (ru) | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека | |
RU2257224C1 (ru) | Способ получения концентрата плазмина человека и продукт для использования в медицине | |
RU2357742C1 (ru) | Способ получения препарата антитромбина iii из плазмы крови человека | |
RU2123009C1 (ru) | Способ получения препарата альфа-фетопротеина | |
Ng et al. | Preparation of high purity factor VIII concentrates |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190314 |