CZ341192A3 - Způsob přípravy imunoglobulinu IgG pro intravenózní aplikaci - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy imunoglobulinu třídy IgG, který je vhodný pro intravenózní aplikaci, v kombinaci postupů směřujících k odstranění některých nízkomolekulárních látek, například etanolu, dialýzou nebo diafiltrací ve vhodnémopracování molekuly imunoglobulinu pepsinem při pH 4,0 až 4,5, oddělení nežádoucích bílkovin, včetně pepsinu, dělením pomocí iontoměničové chromatografie na anexu a ve využití nespecifické sorpce, například na amorfní kysličník křemičitý. Roztok takto purifikovaněho a enzymaticky opracovaného imunoglobulinu IgG, který je stabilizován vhodným cukrem, například glukózou nebo směsí glukózy a polovičního množství glycinu, lze usušit šetrně provedenou lyofilizací.

Description

Název: Způsob přípravy aplikaci.

imunoglobulinu IgG pro intravenózní

Oblast techniky: : Farmaceutická výroba.

Dosavadní stav: V průběhu posledních dvou desetiletí se projevuje výrazná snaha připravit z imunoglobulinové frakce krevní plazmy takový preparát, který by bylo možné bez rizika pro pacienta podávat terapeutický preparát, i těžkých imunodeíicientních preparáty spočívá především v ve velkých dávkách určený ke zvládnutí stavů. Rozdíl kvalitě, která intravenózně jako rozmanitých a to mezi jednotlivými je reprezentována čistotou imunoglobulinové frakce. Dobrý intravenozní preparát musí zaručovat maximální snášenlivost u pacienta a to i po podání vysoké dávky. Současně musí být bezpečný z hlediska možného přenosu virové nákazy. Jeho hlavní vlastností musí být dostatečná protilátková aktivita. Původní etanolová frakcionační metoda dle Cohna (E.J.Cohn a spolupracovníci:J. Amer. Chem. Soc. 72, 465 (1950) je vhodná pouze pro přípravu intramuskulárního preparátu.Z této metody vycházel Kistler (P.Kistler,Hs.Nitschmann: Vox Sang.7, 414 /1962/), když navrhl postup pro izolaci imunoglobulinové frakce ve výrobním měřítku. Takto připravená imunoglobulinová frakce je po další puriíikaci vhodná pro přípravu intravenózního přípravku.

Způsobů, kterými lze z této surové imunoglobulinové frakce získat preparát v kvalitě, umožňující připravit roztok vhodný pro aplikaci do žíly, je známo několik. Spočívají především ve snížení antikomplementární aktivity roztoku imunoglobulinu a odstranění agregátů IgG. Tím je dosaženo snížení rizika vzniku anafylaktické reakce u pacienta na minimum (H. Isliker, P. Kistler: Švýcarský patent 392780 (W. Schneider, D. Wolter, L. J, z 15 Sang.

10.65), 31,

11.1987) .6.87) , 11.1987),

Mc Carty: Vox 141 /1976/),(I.Štěpánek: Čs.~ A.O. 244306 , (I. Banda a spolupracovníci: Čs. A.O. 239828 (A. Stachy a spolupracovníci:Čs. A.O. 239313 (W. Guddat, K.Hillger: DDE patent 208918 A 61

39395). Předností postupu frakcionace etanolem je to, že dochází k podstatnému snížení rizika přenosu virové nákazy. Toto nebezpečí vzniká u imunoglobulinové frakce izolované chromatografickou metodou. Naopak preparáty připravené za pomoci iontoměničové chromatografie vykazují v závislosti na způsobu provedení vysokou elektroforetickou čistotu imunoglobulinu, mají minimální obsah agregovaných molekul IgG a štěpů. Neobsahují nežádoucí biologicky aktivní látky, na Příklad hemaglutininy A a B (R.M.Condie: US patent 4296027

- 811020 z	roku 1981),	(J. Varták, A.	Stejskal:	: Čs. A.O.
220725), (H.	D.	Friesen,	J. M. Borwan,	W.Ch. Bees	v souboru
Separation	of	Plasma	Proteins 17th	Congress	of the
Inter.Soc.	of	Blood	T r ans í us i on,	Budapest,	1.8.1982
ed.J.Curiing.	str.	118), (J.	H.Bergloff,

S. Eriksson Inter.Soc Tayot a 15(1986).

v souboru přednášek 18th

Congress of the of Blood Transfusion, Munich, 22.6.1984), (J.T.

spolupracovníci:Developments in Biol.Stand. 67, Za účelem zajištění maximálního snížení rizika virové nákazy preparátem, vyrobeným z lidské krevní přenosu.

plazmy, jsou do frakcionačního postupu zařazovány kroky, které bariérovým způsobem zvyšují bezpečnost přípravku (B. Horowitz: Developments ín Biol. Stand. 75, 43 /1991/ ). Průběžně se zvyšující požadavky na celkovou kvalitu preparátu a na vlastnosti krevních derivátů se promítají do deklarovaných norem jednotlivých národních lékopisů (Francouzský lékopis X. edice). Z toho důvodu je nezbytné doplňovat výrobní postupy o další puriíikační kroky. Výrobek, který nesplňuje současně požadovaná kriteria, se stává pro íarmaceutické účely neupotřebitelný.

Vynález se týká způsobu přípravy nativního imunoglobulinu třídy IgG, vhodného pro intravenózní aplikaci. Metoda je založena na vhodné kombinaci postupů, které ve svém souhrnu poskytují preparát, jehož vlastnosti odpovídají současným požadavkům, kladeným na přípravky, určené k léčbě imunodeíicientních stavů.

teplotu 35 až 37 st. pH na 7,0 až 7,4.

Podstata vynálezu: Navržený způsob přípravy imunoglobulinu třídy IgG pro intravenózní aplikaci spočívá v tom, že se v roztoku o nízké koncentraci stabilizujících látek, která odpovídá 0,005 až 0,03 jejich molárním koncentracím, rozpouští surová imunoglobulinová frakce izolovaná z krevní plazmy,s výho- dou na 5 až 10 % roztok bílkovin, hodnota pH se upraví na 4,0 až 4,5 a přidá se pepsin v množství od 50 do 200 mg na každý litr roztoku. Takto připravený roztok se zahřívá na C po dobu 3 až 20 hodin, načež se upraví Po úpravě pH se roztok nechá protékat sloupcem anexu, který byl před tím stabilizován v roztoku stabilizační látky nebo látek o nízké koncentraci, odpovídající 0,01 až 0,03 M roztoku. Puriíikovaný IgG se jímá jako nezachycený podíl bílkoviny protékající sloupcem. K takto získanému roztoku IgG se přidá chlorid sodný do konečné koncentrace 0,4 až 0,9 % a přidá se stabilizující cukr, s výhodou glukóza, sacharóza nebo maltóza do koncentrace, která nepřevyšuje obsah celkové bílkoviny. Před přidáním stabilizační složky nebo po jejím přidání se upraví koncentrace bílkoviny na 5 až 6 % Nakonec se takto připravený roztok sterilně přefiltruje a rozplní podle požadovaných dávek IgG, případně se za šetrných podmínek během dosušování, kdy teplota nepřesáhne 35 st. C, usuší lyofilizací tak, aby konečný obsah vlhkosti byl nižší než 3 % . Podle navrženého způsobu přípravy, uvedeného výše, lze k přípravě výchozího roztoku užít immunoglobulinovou frakci, získanou při etanolové frakcionaci v lyofi 1izované formě. Vlastní postup spočívá v tom, že sušený imunoglobulín se rozpustí v 0,005 M až 0,030 M roztoku glycinu nebo fosforečnanu nebo octanu či chloridu sodného, načež se upraví pH na hodnotu 4,0 až 4,5 a tento roztok se dále zpracuje podle předchozího postupu.

V jiném případě lze k přípravě výchozího roztoku užít vlhký sediment imunoglobulinové frakce, který vzniká při etanolové frakcionaci a obsahuje ještě zbytek etanolu. Vlastní postup spočívá v tom, že se sediment rozpustí ve vychlazeném 0,005 až 0,03 M roztoku stabilizující látky, nejlépe v glycinu. Teplota roztoku je mezi 0 až +4 st.C. Takto připravený, maximálně £8?» 10 % roztok bílkoviny se potom dialyzuje nebo diaíil- truje proti vychlazenému vodnému 0,005 až 0,03 M roztoku stabilizující látky, na..-příklad chloridu sodného, nebo íosíorečnanu, případné octanu sodného tak dlouho, až koncentrace zbytkového etanolu poklesne pod 0,5 % . Potom se provede úprava pH na 4,0 až 4,5 a v dalším postupu se pokračuje tak, jak bylo výše uvedeno.

Při přípravě imunoglobulinu třídy IgG podle výše uvedeného postupu je výhodné užít jako iontoměniče dietylaminoetyl anexu a to ve íormě diety1aminoety1 derivátu sférické celulózy. Další postup je shodný se způsobem přípravy, jak byl uveden výše.

Před konečnou úpravou koncentrace obsahu IgG v roztoku lze odstranit nízkomolekulární látky, na^přiklad produkty enzymatického opracování, nebo nadbytečné soli dialýzou, diaíiltrací, ultraíi1trací spojenou s opakovaným nařeďováním, případně dělením na molekulárním sítu. Další postup je shodný s předchozím.

Podle navrženého způsobu přípravy, jak byl výše uveden, lze k roztoku puriíikovaného IgG před konečnou sterilní filtrací, před nebo po přidání stabilizátoru, přidat do roztoku amorfní kysličník křemičitý nebo fosforečnan vápenatý, případně hydroxid hlinitý, který se po důkladném promíchání oddělí, na příklad čeřící filtrací nebo centrifugací.

Podle navrženého způsobu přípravy, uvedeného v předchozím,je možné k roztoku puriíikovaného IgG přidat jako stabilizátor glycin, případně směs glycinu a cukru.

Výchozí roztok surového imunoglobulinu je možné připravit rozpouštěním imunoglobulinové frakce krevní plazmy, připravené libovolným způsobem, který lze užit pro přípravu preparátu v kvalitě, vhodné pro intramuskulární aplikaci. Lze vycházet z lyofilizovaného meziproduktu, sedimentu vzniklého při etanolové frakcionaci nebo z jinak připraveného roztoku, který má tomuto odpovídající vlastnosti. Nízký obsah stabilizující látky, kterou může být na příklad glycin nebo některá vhodná sodná sůl, je výhodný jednak z toho důvodu, že některé euoglobuliny a lipoproteiny se za těchto podmínek nerozpouštěji a proto je lze snadno odstranit, jednak se vytváří vhodná iontová síla k puriíikaci imunoglobulinu při dělení na sloupci iontoměniče, v případě, že postup vychází ze sedimentu, který obsahuje zbytkový etanol, je nutné jej odstranit, aby nedošlo k denaturaci bílkovin během relativně dlouhého zahřívání v dosti extrémních hodnotách pH. Působením proteolytického enzymu při pH 4,0 až 4,5 dochází k nepatrnému naštěpení molekuly IgG v místech, která jsou náchylná k tvorbě agregátů. Tím se zabrání jejich tvorbě, a pokud jsou zvoleny správné podmínky, k podstatnější změně velikosti molekuly IgG. V takovém případě si produkt uchovává všechny vlastnosti monoméru, případně diméru IgG, včetně protilátkové aktivity a biologického poločasu odbourávání. Pokud jsou zvoleny krajní podmínky pro enzymatické opracování, t.j. vysoké množství přidaného pepsinu , pH upraveno na hodnotu 4,0 a zahřívání trvalo po dobu 20 hodin, lze si již povšimnout při dělení produktu na HPLC sloupci Superozy 12 pozorovatelný posun v retenčním času. imunoglobulinové frakce. Při opracováni pepsinen při uvedeném pH dochází kromě uvedeného ke snížení antikomplementářarní aktivity, narušení účinnosti dalších biologicky aktivních látek a k ínaktívaci případné přítomných virů. Následnou chromatografií na sloupci anexu podle podmínek, uvedených ve vynálezu, dochází k zachycení nežádoucích bílkovin včetně přítomného pepsinu, přičemž volně protéká pouze tímto puriíikovaná imunoglobulinová frakce IgG. Dělením na sloupci iontoměniče je dosaženo vysoké elektroíoretické čistoty produktu. Pro tento účel se ukázal být mimořádně vhodný dietylaminoety1 derivát sférické celulózy a to z důvodů funkčních, technologických a cenových. K roztoku purifikovaného imunoglobulinu po dělení na iontoměniči se přidá chlorid sodný do fyziologické koncentrace. Toto lze výhodně provést diafiltrací, dialýzou nebo opakovanou ultraíi1traci proti příslušně koncentrovanému roztoku soli. Současně s vyrovnáním obsahu solí se tak dosáhne odstranění nežádoucích nízkomolekulárních látek, na příklad produktů enzymatického štěpení. Závěrem ee roztok zahustí ultrafiltraci na koncentraci asi 5 až 6 bílkoviny , což je výhodná koncentrace pro následné rozplnění do jednotlivých dávek. Do takto připraveného roztoku se přidá cukr jako stabilizátor. Z cukrů je nejvýhodnější glukóza, sacharóza, případně maltóza. Stabilizace je potřebná především z důvodů možných změn během dlouhodobého skladování. Přidáním nespecifického sorbentu, jakým je porézní kysličník křemičitý, fosforečnan vápenatý nebo hydroxid hlinitý, se docílí odstranění stopových zbytků agregovaných, částečně denaturovaných bílkovin, lipoproteinů, látek vyvolávajících pyrogenní reakce a dalších zbytkových látek, které lze jinak těžko oddělit a které mohou svými koloidními vlastnostmi nepříznivě ovlivňovat vzhled a celkovou kvalitu připraveného roztoku. Přidání nespecifického sorbentu je nutné zejména v případech, kdy výchozí surový imunoglobulín obsahoval vyšší množství lipoproteinů a euoglobulinů. Preparát je sice možné po sterilní filtraci a sterilním rozplnění do požadovaných dávek aplikovat v původním roztoku, ale výhodnější je z hlediska delší doby skladování a praktické manipulace preparát po rozplnění za šetrných podmínek usušit lyofilizací. Důležitým požadavkem je dodržení nízké konečné vlhkosti, neboť tato by se nepříznivě uplatnila během dlouhodobého skladování .

Základní ukazatele kvality vzorků i.v.IgG, vyrobených za podmínek vyznačených v patentových nárocích spolu s požadavky, jaké klade francouzská farmakopea, dokládá přiložená tabulka. Tyto vlastnosti potvrdily zkoušky, provedené ve Státním ústavu pro kontrolu léčiv. Preparát, vyrobený uvedeným postupem, vyhovuje svými vlastnostmi i u klinických zkoušek.

Příklad 1 : 1 kg sedimentu surové imunoglobulinové frakce vzniklé při etanolové frakcionaci za chladu, bylo rozpuštěno ve 2,5 1 roztoku 0,01 M glycinu. Tento roztok byl dialyzován proti 0,01 M roztoku chloridu sodného tak, až obsah přítomného zbytkového etanolu poklesl na 0,5 % . Potom byla v roztoku upravena hodnota pH na 4,3 a bylo přidáno 150 mg pepsinu na každý litr vzniklého roztoku. Po úpravě pH byl roztok zahříván na teplotu 35 st.C po dobu 16 hodin. Když inkubace byla ukončena, bylo upraveno pH na hodnotu 7.0. Roztok byl sterilně přefiltrován a aplikován na sloupec dietylaminoetyl derivátu sférické celulózy. Sloupec anexu byl předtím stabilizován 0.01 M roztokem fosforečnanového pufru pH 7.2. Po ukončení aplikace byl sloupec anexu ještě promýván pufrem 0.01 M fosforečnanu pH 7.2 tak dlouho. pokud vytékala nezachycená bílkovina. Celá tato spojená frakce nezachyceného imunoglobulinu IgG byla dále zahuštěna ultrafiltrací zhruba na 1/5 výchozího objemu, znovu naředěna na výchozí objem roztokem 0.5 % chloridu sodného a znovu zahuštěna tak. že vzniklý roztok obsahoval 5.5 % bílkoviny. K takto připravenému roztoku bylo přidáno 0.5 g amorfního kysličníku křemičitého na každý litr. Po důkladném rozmíchání byl kysličník křemičitý oddělen čeřící a sterilizační filtrací. K filtrátu bylo přidáno 130 g glukózy a 65 g glycinu. Po rozpuštění stabilizačních složek byl roztok ještě sterilně přefiltrován přes membránový filtr a sterilně rozplněn do lahviček tak. aby v každé dávce bylo 1000 mg účinné látky IgG. Rozplněný roztok byl zmražen a usušen lyoíilizací za takových podmínek, při kterých teplota při dosoušení nepřesáhla 30 st.C a vlhkost konečného produktu byla 2.0 % . Celkový výtěžek puriíikovaného i.v.IgG byl 130 g.

Příklad 2: 100 g lyofilizovaného imunoglobulinu. vhodného svou kvalitou pouze pro přípravu intramuskulárního preparátu, bylo rozpuštěno v 1 litru 0.02 M roztoku chloridu sodného. Po rozpuštění byla hodnota pH roztoku upravena na 4,1 a bylo přidáno 100 mg pepsinu. Tento roztok byl zahříván na teplotu 37 st.C po dobu 8 hodin. Potom bylo upraveno pH na 7,4 a roztok byl aplikován na sloupec hydrofobního dietylaminoetyl anexu, který byl předtím stabilizován v 0,02 M fosíorečnanovém pufru pH 7,4. Po ukončení aplikace byl ještě sloupec promýván týmž pufrem, v jakém byl stabilizován, tak dlouho, pokud vytékala bílkovina. Tím byl získán celý podíl purifikovaného IgG. Balastní bílkoviny zůstaly zachyceny na sloupci iontoměniče. Získaná frakce purifikovaného imunoglobulinu byla dále diafiltrována proti 0,5 * roztoku chloridu sodného tak dlouho, až se obsah soli vyrovnal. Potom byl roztok zahuštěn ultrafiltrací na koncentraci 5,6 bílkovin. Do roztoku byla přidána glukóza do téže koncentrace. Po provedení sterilní filtrace přes membránový filtr byl roztok za sterilních podmínek rozplněn podle požadovaného obsahu účinné látky IgG. Celkový výtěžek purifikovaného IgG byl 65 g.

Příklad 3: 1 kg žlutě zabarveného sedimentu surové imunoglobul inové frakce, vzniklé při etanolové frakcionaci za chladu, bylo suspendováno v 0,005 M roztoku fosforečnanu sodného o objemu 4 litrů. Teplota roztoku byla 0,5 st.C, hodnota pH po rozpuštění sedimentu byla upravena na 4, 5 . Po čeřící filtraci byl roztok diafiltrován proti roztoku 0,01 M chloridu sodného tak dlouho, až bylo dosaženo snížení zbytkového etanolu pod 0,5 % a iontová síla se vyrovnala proti roztoku soli. Na každý litr takto získaného roztoku bylo přidáno 200 mg pepsinu. Potom byl roztok zahříván na teplotu 35 st.C po dobu 20 hodin. Po ukončené inkubaci bylo upraveno pH na hodnotu 7,2, roztok byl přefiltrován a čirý filtrát byl aplikován na sloupec slabého anexu, stabilizovaného v 0,03 M roztoku pufru pH 7,1. Potom, co přes sloupec protekl celý objem nezachycné bílkoviny, takto získaný roztok purí£ikovaného IgG byl dialyzován proti roztoku 0,5 % chloridu sodného a zahuStěn ultraíiltrací na koncentraci 6 % bílkoviny. K tomuto roztoku byla přidána suspenze hydroxidu hlinitého v poměru 100 : 5 dílům. Po rozmíchání byl hydroxid po 30 minutách oddělen centriíugací. K takto připravenému roztoku, který obsahoval 5 36 bílkoviny, byla přidána sacharóza do koncentrace 5 % , provedena sterilní filtrace a za sterilních podmínek byl roztok rozplněn po 20 ml do 50 ml lahviček, zmražen a usuSen lyoíilizací během 50 hodin tak, že teplota při dosouSení nepřesáhla 29,5 st.C. Celkový výtěžek purifikovaného i.v. IgG byl 120 <3.

Takto připravený intravenózní imunoglobulin třídy G může sloužit k substituční léčbě stavů primární i sekundární imunodeíicience a léčbě některých autoimunních onemocnění. Dále je indikován při léčbě a profylaxi některých virových a akutních i chronických bakteriálních onemocnění.

2711M2.

Claims (7)

1. Patentové nároky i ntravenózní roztok, s

   Způsob přípravy imunoglobulinu třídy IgG, pro aplikaci, vyznačený tim, že vodný výhodou 5 až 10 hmotnostních % surové imunoglobulinové frakce, který dále obsahuje nízkomolekulární stabilizující látky v nízké koncentraci, odpovídající 0,005 až 0,030 M roztokům, s- se upraví naÉří4,0 až 4,5, přidá se pepsin v množství 50 až 200 mg na každý litr tohoto roztoku a zahřívá se na teplotu 35 až 37 st.C po dobu 3 až 20 hodin, po této době se upraví pH na 7,0 až 7,4 a iontová síla na 0,01 až 0,03 M stabilizující látky, načež se tento roztok nechá protékat, nejlépe jako sterilní filtrát, sloupcem anexu, který byl předtím stabilizován 0,01 až 0,03 M roztokem stabilizující látky, přičemž se jímá podíl na sloupci nezachyceného purifikovaného IgG, u tohoto roztoku se zvýší iontová síla přidáním chloridu sodného na koncentraci 0,4 až 0,9 % a obsah bílkovin se podle potřeby upraví, na^zpříklad pomocí ultrafiltrace, na 5 až 6 9S, přidá se cukr, s výhodou glukóza, nebo sacharóza, nebo maltóza do koncentrace, která nepřevyšuje obsah přítomné bílkoviny, roztok se sterilně přefiltruje, za sterilních podmínek se rozplní podle požadovaných dávek IgG a případně se za šetrných podmínek, kde teplota při dosoušení nepřesáhne 35 st.C, lyofilizuje tak dlouho, až je obsah vlhkosti preparátu nižší než 3 % .
2. 2. Způsob přípravy podle bodu 1 vyznačený tím, že se k přípravě výchozího roztoku užije surová imunoglobulinová frakce, získaná etanolovou frakcionací, v lyofilizované formě, která se rozpustí v 0,005 až 0,03 M vodném roztoku glycinu nebo fosforečnanu nebo octanu nebo chloridu sodného, případně jejich vhodné směsi, načež se pH upraví na hodnotu 4,0 až 4,5 a dále se postupuje podle bodu 1.
3. 3. Způsob přípravy podle bodu 1 vyznačený tím, že se vlhký sediment imunoglobulinové frakce, vzniklý při etanolové írakcionaci, která obsahuje zbytkový etanol, rozpustí ve vodném roztoku 0,005 až 0,03 M vychlazen na teplotu 0 až +5 % roztok bílkoviny, tento stabilizující látky, který byl st.C tak, aby vznikl maximálně 10 roztok se dále dialyzuje nebo diaíiltruje či opakovaně diafiltruje proti vychlazenému 0,005

   M až 0,030 M vodnému roztoku fosforečnanu nebo octanu nebo chloridu sodného,přípádně jejich vhodné směsi tak dlouho, až koncentrace zbytkového etanolu poklesne pod 0,5 % , načež se provede úprava pH na hodnotu 4,0 až 4,5 a dále se pokračuje postupem podle bodu 1.
4. 4. Způsob přípravy podle bodu 1 vyznačený tím, že se užije k purifikaci IgG diety1aminoety1 anexu, s výhodou dietylaminoetyl derivátu sférické celulózy.
5. 5. Způsob přípravy podle bodu 1 vyznačený tím, že se před konečným zahuštěním purifikovaného IgG odstraní nízkomolekulární balastni nežádoucí látky, na příklad produkty proteolytického štěpeni dialýzou nebo diaíiltrací nebo opakovaným postupným zahušťováním a nařeďováním roztoku při ultrafiltraci proti 0,5 až 0,9 % roztoku chloridu sodného,přípádně dělením na molekulárním sítu.
6. 6. Způsob přípravy podle bodu 1 vyznačený tím, že se k roztoku puriíikovaného IgG přidá amoríní kysličník křemičitý nebo hydroxid hlinitý nebo fosforečnan vápenatý, který se po promíchání oddělí nejlépe čeřící filtrací nebo centrifugací.
7. 7. Způsob přípravy podle bodu 1 vyznačený tím, že se kromě stabilizujícího cukru přidá glycin, nejlépe v poloviční koncentraci při porovnání s obsahem bílkoviny.