LU83955A1 - Composition et procede pour dosages avec cycle enzymatique amplificateur a nad+ - Google Patents

Description

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La présente invention concerne les cycles enzymatiques amplificateurs; elle concerne également la réalisation de dosages immunochimiques, en particulier dans des fluides biologiques.

5 L'élaboration de systèmes amplificateurs enzymatiques et leur utilisation pour des dosages sont connues, notamment d’après Lowry C.H. et al., J. Biol. Chem., (1961), 2^6 (10), pp. 2746-2755, et Lowry O.H. et ai., Analytical Biochem., (1973), 52» PP. 86-97· H a également 10 été signalé que l’on a intérêt à avoir le maximum de réactions irréversibles de manière à augmenter le pouvoir amplificateur du cycle (voir j.c. Nicolas, J. Chaintreuril, B. Térouanne, b. Descamps, A. Crastes de paulet, Ann. Biol, clin., (I978), 36, pp.205-208.

15 Plusieurs cycles enzymatiques amplifica teurs permettant des dosages de faibles quantités de NAÜ+ ou de NADP+ ont ainsi été décrits. Les cycles enzymatiques amplificateurs de NAD+ reposent sur le schéma suivant:

E

20 S1 + NAD+ --—> P1 + NADH + H+ E (1) S2 + NADH + H+ --—»» P2 + NAD+ où E^ et E2 sont les deux enzymes respectivement mises en 25 oeuvre, et S1 et S2 les substrats correspondants.

* Les produits p^ et P2 sont accumulés et peuvent ensuite

être dosés à l’aide d’une réaction spécifique de p^ ou de P , telle que : E

Ρχ + NADH + H+ --2-> p3 + NAD (2) 3° ou .

P2 + NAD+ --—> P4 + NADH + H+ (3) où E^ et E^ sont les enzymes utilisées, qui conduisent aux produits P^ ou respectivement avec formation de NAD+ ou 35 de NADH mesuré par fluorimétrie.

pour la bonne marche de ce type d’amplification, plusieurs éléments doivent être pris en considération : 2 - les étapes du cycle (1) doivent être, autant que possible, irréversibles; comme il s'agit d'étapes faisant intervenir des déshydrogénases, on a intérêt à les faire fonctionner dans le sens le plus favorable; 5 - il parait judicieux, pour rendre ces réactions irréversi^ blés, de piéger les produits p^ et p^. Cependant, il ne faut pas perdre de vue que l’un au moins des deux produits p^ ou P2 doit encore pouvoir être dosé; - l’étape de révélation (2) ou (3) doit également présenter '10 le maximum d’irréversibilité; - la mesure finale de NACH peut se faire directement par fluorescence, par contre, pour NAD+, il convient de se ; trouver en milieu alcalin concentré. On a donc intérêt à terminer un dosage de NACH (3) de manière à limiter le blanc 15 et les interférences.

A ce jour, aucun cycle connu pour NAD+ n’utilise des réactions enzymatiques totalement irréversibles. C’est le cas des cycles LDH-GlDH et ADH-MDH connus, rappelés ci-après, 20 1. Cycle LDH-GlDH.

Ce cycle a été décrit par Lowry O.H. et al. dans J. Biol. Chem.(l961), op. cité.

Il repose sur le principe suivant : ~ gj. Lactate + NAD+ —£22—^ Pyruvate + NACH + H+ -cétoglutarate + NACH + NH^* —> Glutamate + NAD+, la réaction de révélation pouvant être :

Pyruvate + NADH + H+ —> Lactate + NAD+.

30 Ce cycle permet de doser 1.10-^ mole de NAD+, soit une solution de départ de 10-¾ (sur 10 yul d'échantillon): mais il présente de nombreux désavantages : - aucune étape n'est irréversible; - la LDH intervenant dans le cycle fonctionne dans le sens 35 défavorable. Il faut alors utiliser une très forte concentration en lactate qui donne des blancs très élevés (contamination du lactate par du pyruvate); - la lecture' finale est réalisée en milieu NaOH 4M. Les 3 blancs sont élevés et les interférences sont difficilement maîtrisables; - l’amplification de cycle varie avec la concentration en NAD+ et on obtient une courbe fluorescence/concentration 5 qui n’est pas linéaire.

2. Cycle ADH-MDH -

Ce cycle, décrit par Lowry O.H. et al. dans Ann. Biochem. (1973), op. cité, est le suivant :

^ ADH

10 NAD+ + Ethanol -> Acétaldéhyde + NADH + H (4)

MDH

Oxaloacétate + NACH + H' -»· Malate + MAD4" (5) - Trois réactions de révélation sont possibles :

Malate + NADP4" _» Pyruvate + CO + NAÜPH + H+(6) •*5 malique d

Malate + NAD+ —_> Oxaloacétate + NACH + H+ ΤΓΟ f(7)

Oxaloacétate + Glutamate —►Aspartate + o6-Cétoglutaratej 20 Malate + NAD+ ——s* Oxaloacétate + NADH + K+ (8)

Oxaloacétate + Hydrazine ->Oxaloacétate nydrazone,

La réaction (4) présente un certain caractère d’irréversibilité dû à la formation d’acétaldéhyde 2^ volatil.

Mais la réaction (5) n’est que relativement favorable. Le dosage final est un dosage de NAü(P)K, pour lequel les blancs sont faibles et les interférences peu importantes.

^ On a maintenant trouvé un cycle enzymatique original, reposant sur une réaction totalement irréversible. Ce cycle enzymatique amplificateur à : NAD+ selon l’invention est le suivant ;

Glucose-6-Phosphate + MAD4" 6-phosphoglucoaate (9) 35 + NADH + H+

EgOg + NADH + H+ NADK~pQP- .y 2 H20 + NAD+ (10)

Lors du fonctionnement du cycle, il y a accumulation de 6-phosphogluconate, qu’on peut doser selon 4 la réaction classique : β-phosphogluconate + NADP+ Ribulose-5-phosp:;ate|(li) + C02 + NAOPH + H+ , L’invention a pour premier objet une 5 composition pour la réalisation d’un cycle enzymatiaue amplificateur à NAD+, caractérisée en ce qu’elle comprend, associés en des proportions appropriées,-les composés réalisant les réactions (9) et (10) ci-dessus.

La réaction (10) est totalement irréversi-10 ble. Toutefois, pour la bonne marche du cycle, il convient de favoriser thermodynamiquement la réaction (9) qui est réversible.

Ceci est obtenu en choisissant pour la réalisation du cycle une zone de pK où la réaction inverse 15 (6-phosphogluôonate -> glucose-6-phosphate) a une constan te d’équilibre très défavorable, d’autant plus que l’on se trouve en présence d’un grand excès de glucose-6-phosphate par rapport au 6-phosphogluconate formé lors de 1’incucation.

20 /”6-phosphoglueonate_7/~NAÜH_7/~K*7

7”NA0^7^”slucose-6-phosphate J

La réaction de révélation est également irréversible, ce «qui la rend très sensible. La mesure fina.le consiste en une mesure de la fluorescence du NAOPH formé -' 25 i voir l’ouvrage intitulé "Methods of Enzymatic Analysis”, H.V. Bergmeyer, (1976), pp. 2059-2072, Verlag Chemie GmbH (2è éd. anglaise}7·

On a pu établir que l’utilisation de ce cycle selon l’invention permet de doser 25 femtomoles de 30 ITAD+ ou de NACH ou d’un dérivé d’une de ces deux substances. Ce cycle a, de plus, une linéarité qui s’étend sur une zone de concentrations allant de 25 à 1000 x IO“15 moles de NAO+.

L’invention concerne donc en outre l’application du cycle amplificateur susdit à des dosages immuno-35 chimiques de substances présentes dans des liquides biologiques, comme par exemple les substances connues sous les abréviations (dont la signification sera rappelée plus loin) • t 5

Ty T^, E]/ S2* Ey Testo et autres.

Les dosages mettant en oeuvre un tel système de cycle enzymatique amplificateur i ITAD+ présentent pour avantages de ne nécessiter .· 5 - ni radioisotopes pour marquer la substance à doser ; le "marqueur" est alors une substance stable; - ni séparation "libre-lié".

En pratique, on réalise le cycle amplificateur décrit en laissant incuber les différents réactifs Ί0 et enzymes mis en oeuvre et dans les proportions appropriées. Etant donné les caractéristiques thermodynamiques des deux enzymes utilisées, une zone de pH proche du pH optimum de la G-6-PDH est souhaitable, mais non indispensable.

Après un temps que l'homme de l'art se 15 fixe (temps qui est celui au bout duquel l'accumulation de β-phosphogluconate est au moins égale au minimum décelable et qui peut être aisément déterminé après quelques essais de routine, si nécessaire), les réactions enzymatiques sont bloquées par tout moyen approprié et on ajoute les 20 réactifs permettant la révélation ou le dosage du 6-phospno-glueonate formé. Lorsque cette réaction est terminée, on mesure la fluorescence des solutions contre un blanc.

L'invention a par conséquent pour second objet un procédé pour la réalisation de dosages immunochi-25 miques, en particulier dans des fluides biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre de la composition susdite, apte à réaliser un cycle enzymatique, le NAÜ+ à doser étant contenu dans le fluide biologique, avec incubation des différents réactifs et enzymes à un pH inter-30 médiaire entre les pH optimaux des deux enzymes utilisées, et pendant un temps suffisant pour former du β-phosphogluconate en une quantité dépassant le minimum décelable, et ensuite le blocage du cycle et la révélation ou le dosage du 6-pnosphogluconate formé.

35 En variante, on peut appliquer le cycle enzymatique amplificateur (9-10) à des dosages immunoenzymatiques. Pour réaliser de tels dosages, on ajoute, à un liquide biologique contenant la substance à doser, une 6 quantité constante de la même substance, mais liée de manière covalente au NAD+; on met les deux substances en compétition avec une quantité constante d’anticorps dirigés contre la substance à doser. Les réactions de compétition 5 peuvent avoir lieu et il suffit alors de doser le NAü+ qui est resté litre ou le NAD+ fixé à l’anticorps. Il n’est pas impérativement nécessaire de prévoir une étape intermédiaire de séparation "libre-lié", car le NAD+ peut être inactivé lorsqu’il est lié à l’anticorps par 1’intermédiai-10 re de la substance à doser.

Pour la mise en oeuvre du cycle enzymatique amplificateur de NAD+ selon l'invention, on préconise la NAüH-peroxydese de Streptococcus faecalis {EC 1.11.1.1) ou tout autre enzyme catalysant la réaction entre NADH et 15 et donnant lieu à la formation de NAD+ utilisable dans la seconde réaction. De manière générale, on choisira une glucose-6-phosphate déshydrogénase NAÜ-dépendante afin d’éviter l’interférence avec toute enzyme NADP-dépendante présente dans le milieu contenant la substance à doser 20 (e'n pratique, le plus souvent un sérum), comme par exemple la glucose-6-phosphate déshydrogénase de Leuconostoc mesenteroides (EC 1.1.1Λ9).

Il convient d’autre part de rendre le blanc le-plus faible possible pour améliorer les dosages. Ce blanc 25 représente en fait le NAD+ présent dans les enzymes utilisées; la quantité de NAD+ "endogène" doit donc être, dans toute la mesure du possible, rendue minimale, cela s’obtient classiquement par traitement des enzymes avec du charbon de bois, qui entraîne malheureusement des pertes importantes 50 d’enzymes.

On est maintenant parvenu à améliorer considérablement cette purification au moyen d’une chromatographie par filtration sur gel. Les blancs fournis par une telle méthode sont semblables à ceux que procure la méthode 35 au charoon de bois, mais le mode opératoire est beaucoup plus simple et surtout la perte d’enzyme est presque nulle.

Les exemples suivants illustrent plus concrètement l’invention, sans en limiter la portée.

* t 7

Les abréviations utilisées dans le présent texte, tant dans ce qui précède que dans les exemples ci-après, ont les significations suivantes : ADH : alcool-déshydrogénase 5 G1DH ·* glutamate déshydrogénase LDH : lactate déshydrogénase MDH : malate déshydrogénase NAD+; nicotinamide-adénine-dinucléotide NACH : idem, forme réduite «10 NADH-POD : NADH-peroxydase NADP+: nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate NADPH : idem, forme réduite G-β-ΡΟΗ : glucose-6-phosphate-déshydrogénase 6-PC-DH : 6-phosphoglpconate-déshydrogénase 15 : triiodothyronine : thyroxine E^ : oestrone E^ : oestradiol E_ : oestriol 3 20 F : cortisol

Testo : testostérone EXEMPLE 1

Cet exemple concerne la réalisation d’un cycle conforme à l’invention. On a préparé un tampon Tris 25 0,1 M et KAc (où Ac désigne le groupement acétate) 0,14 M à pH 8,5 contenant du glucose-6-phosphate 1 mM et du 1 mM.

Avant la réalisation du cycle, on a ajouté à ce tampon 100 ^ug/ml de NADH-POD (Ec 1.11.1.1) et 100 ^ug/ml de G-β-ΡΟΗ (Ec 1.1.1.49); ces ^eux enzymes avaient 30 au préalable été débarrassées du NAD+ ou du NAOH qu’elles pouvaient contenir par filtration sur gel.

A 100 yUl du réactif de cycle ainsi réalisé, on a ajouté lO^ul de la solution contenant le NAD+ à doser. On a laissé incuber pendant 1 heure à 37°C. On a 35 ensuite bloqué les réactions en chauffant pendant 5 minutes à 100°C environ. Après refroidissement, on a ajouté 1 ml du réactif de révélation, dont la composition était la suivante; tampon Tris 20 mM et NH^Ac 30 mM (pH 7,7) contenant de 8 lf EDTA 0,1 mM, de la sérumalbumine bovine 0,02 fô, du NAÜP 20 ^uM et 0,45 ^ug/ml de 6-PGDH. On a laissé la réaction se dérouler pendant 30 minutes à température ambiante, après quoi, on a lu la fluorescence contre un blanc obtenu 5 conformément au mode opératoire ci-dessus, mais avec addition, au départ de 10 ^ul de solution dépourvue de NAÜ+ au lieu des 10 ^ul de la solution contenant le NAD+ à doser.

On a ainsi pu doser 25 fM (femtomoles) de NAD+ ou de dérivé de NAD+. Il convient de noter que l’ampli-10 fioation du cycle ainsi réalisé est linéaire dans un grand domaine de concentration, qui va d1environ 25 à 1000 femtomoles.

EXEMPLE 2

Cet exemple concerne la purification préala-15 ble des enzymes utilisées. Les enzymes utilisées dans le cycle amplificateur selon 1Tinvention doivent contenir le moins possible de NAD+ ou de NASH; on a donc purifié les préparations commercialement disponibles de NADH-POD et de G-6-PDH mises en oeuvre ensuite conformément au mode opéra-20 toire décrit dans l’exemple 1.

On a procédé à une filtration sur gel des enzymes concernées, en pratique sur du gel de Sephadex G 25, dans un tampon Tris 0,1 M, pH 8,5.

Les pertes en activité enzymatique sont 25 nulles et on peut conserver les enzymes ainsi purifiées à + 4°C et les utiliser ensuite directement dans un cycle tel que celui décrit dans l’exemple l. Les blancs obtenus par cette méthode sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus par la méthode classique de purification au charbon de 30 bois.

EXEMPLE 3.

Cet exemple concerne le calcul de l’amplification du cycle, par référence aux signaux donnés en fluorescence par des quantités connues de 6-phosphogluconate révé-35 lées selon l’exemple 1.

On a pu ainsi doser 0,9 nM/ml de 6-phosphogluconate. ceci permet de calculer l’amplification du cycle, qui est alors de 6.000 par heure suivant l’exemple l.

9

4 J

Μ

Lors de la réalisation d’un cycle en vue de doser du NAD+ dans des milieux biologiques, il nTest pas nécessaire de réaliser une courbe de révélation du 6-phos-phogluconate. χι suffit de réaliser quelques standards 5 MAD qui serviront ^ tracer une courbe dTétalonnage. Le choix de la valeur et du nombre de ces standards dépend de la précision à obtenir et de la zone de concentration explorée. Il est conseillé également dTinclure un blanc, comme décrit ci-dessus, dans chaque série.

A '

V

X

Claims (7)

1. Composition pour la réalisation d’un cycle enzymatique amplificateur a NAD+ utilisant une réaction irréversible, en vue d’un dosage, caractérisée en ce qu'elle comprend, asso- 5 ciés en des proportions appropriées, les composés permettant de réaliser les réactions : Glucose-6-phosphate + NAD+ 6-phosphogluconate + NADH + H+ H202 + NADH + H+ NA.?S.TJL9P..> 2 H20 + NAD+, 10 où G-6-PDH et NADH-POD désignent respectivement une glucose-6-phosphat'e-dëshydrogënase et une NADH-peroxydase, et fait accumuler du 6-phosphogluconate qui est la substance dosable.

2. Procédé pour la réalisation de dosages immunochimiques, en particulier dans des fluides biologiques, caractérisé en ce 15 qu’il comprend la mise en oeuvre de la composition apte à réaliser un cycle enzymatique selon la revendication 1, le NAD+ étant celui contenu dans le milieu â doser, l’incubation des diffë- .. rents réactifs et enzymes à un pH intermédiaire entre les pH optimaux des deux enzymes utilisées, et pendant un temps suffi- 20 sant pour former du 6-phosphogluconate en une quantité dépassant le minimum décelable, et ensuite le blocage du cycle et la révélation ou le dosage du 6-phosphogluconate formé.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu’il met en oeuvre une NADH-peroxydase de Streptococcus faeca- 2. lis (EC 1.11.1.1) et une glucose-6-phosphate déshydrogénase NAD-dêpendante et n’interférant pas avec toute enzyme NADP-dé-pendante présente dans le milieu contenant la substance à doser.

4. Procédé selon la revendication 3", caractérisé en ce 30 qu’on utilise de la glucose-6-phosphate-dëshydrogênase de Leuconostoc mésentêroïdes (EC 1.1.1.49).

5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu’on purifie au préalable les enzymes en les soumettant à une chromatographie de filtration sur gel,

6. Procédé de dosage immunoenzymatique, caractérisé en ce qu’il comprend l’addition, à un liquide biologique conte- i) ‘ . ' - 'Il nant la substance à doser, d’une quantité constante de la même substance, mais liée de manière covalente à du NAD+, la mise en compétition des deux substances avec une quantité constante d'anticorps dirigés contrela substance à doser, et la mi-4 se en oeuvre du procédé de dosage immunochimique selon l’une quelconque des revendications 2 à 5.

7. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la révélation du 6-phosphogluconate met en oeuvre une con-version en nbulose-5-phosphate au moyen de NADP et en présen-10 ce de ô-phosphogluconate-dëshydroginase. t r