JPH10327896A - 共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法および特定物質の測定方法 - Google Patents
共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法および特定物質の測定方法Info
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- JPH10327896A JPH10327896A JP33289097A JP33289097A JPH10327896A JP H10327896 A JPH10327896 A JP H10327896A JP 33289097 A JP33289097 A JP 33289097A JP 33289097 A JP33289097 A JP 33289097A JP H10327896 A JPH10327896 A JP H10327896A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中の特定物質を測定する系において、前
処理によって生成したＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
に変換するために利用した基質に対する親和性の高いＧ
６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨなどの共役脱水素酵
素の反応を、効果的に止めるのに用いる停止剤を提供す
ること。 【解決手段】 界面活性剤を含むことを特徴とする共役
脱水素酵素反応の停止剤。
処理によって生成したＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
に変換するために利用した基質に対する親和性の高いＧ
６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨなどの共役脱水素酵
素の反応を、効果的に止めるのに用いる停止剤を提供す
ること。 【解決手段】 界面活性剤を含むことを特徴とする共役
脱水素酵素反応の停止剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、共役脱水素酵素反
応の停止剤、停止方法、特定物質の測定方法およびそれ
に用いるキットに関する。さらに詳しくは、本発明は試
料中の特定物質を測定する系において、試料の前処理に
よって生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型（以下、ＮＡＤ+と略記する）またはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ＮＡ
ＤＰ+と略記する）を、それぞれニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと略記する）
またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還
元型（以下、ＮＡＤＰＨと略記する）に変換（還元）す
るために利用した共役脱水素酵素反応、特にグルコース
−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略記す
る）反応、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下、６
−ＰＧＤＨと略記する）反応又はＬ−フコース脱水素酵
素（以下、ＦＣＤＨと略記する）反応を止めるのに用い
る停止剤およびこの反応を停止させる方法に関するもの
である。
応の停止剤、停止方法、特定物質の測定方法およびそれ
に用いるキットに関する。さらに詳しくは、本発明は試
料中の特定物質を測定する系において、試料の前処理に
よって生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型（以下、ＮＡＤ+と略記する）またはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ＮＡ
ＤＰ+と略記する）を、それぞれニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと略記する）
またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還
元型（以下、ＮＡＤＰＨと略記する）に変換（還元）す
るために利用した共役脱水素酵素反応、特にグルコース
−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略記す
る）反応、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下、６
−ＰＧＤＨと略記する）反応又はＬ−フコース脱水素酵
素（以下、ＦＣＤＨと略記する）反応を止めるのに用い
る停止剤およびこの反応を停止させる方法に関するもの
である。
【０００２】さらに、本発明は、試料中の特定物質から
アンモニアを発生させて、そのアンモニアに基づいて特
定物質を測定するに際し、試料中に最初から存在する内
因性アンモニアをあらかじめ消去し、特定物質を正確に
測定する方法、およびそれに用いるキットに関するもの
である。
アンモニアを発生させて、そのアンモニアに基づいて特
定物質を測定するに際し、試料中に最初から存在する内
因性アンモニアをあらかじめ消去し、特定物質を正確に
測定する方法、およびそれに用いるキットに関するもの
である。
【０００３】
【従来の技術】近年、病態の診断、治療効果の判定を行
う上で、臨床検査は不可欠な要素となっている。この臨
床検査は、生体機能の検査が目的で、（１）生体内を対
象とし、直接的な生体情報を調べる検査（生理検査）
と、（２）血液、尿、組織などの生体構成成分の一部を
採取して、生体内変化を調べる検査（検体検査）に大別
することができる。そして、後者の検体検査において
は、酵素試薬が広く利用されている。
う上で、臨床検査は不可欠な要素となっている。この臨
床検査は、生体機能の検査が目的で、（１）生体内を対
象とし、直接的な生体情報を調べる検査（生理検査）
と、（２）血液、尿、組織などの生体構成成分の一部を
採取して、生体内変化を調べる検査（検体検査）に大別
することができる。そして、後者の検体検査において
は、酵素試薬が広く利用されている。
【０００４】このように、臨床検査分野において、酵素
法が広く用いられているのは、（ａ）酵素は基質特異性
が高く、測定精度及び測定感度に優れている、（ｂ）測
定条件が温和である、（ｃ）迅速測定が可能である、
（ｄ）検体量が少なくてすむ、（ｅ）安価な検出機器
（比色計または分光光度計）を利用できる、などの長所
を有しているからである。
法が広く用いられているのは、（ａ）酵素は基質特異性
が高く、測定精度及び測定感度に優れている、（ｂ）測
定条件が温和である、（ｃ）迅速測定が可能である、
（ｄ）検体量が少なくてすむ、（ｅ）安価な検出機器
（比色計または分光光度計）を利用できる、などの長所
を有しているからである。
【０００５】このような酵素法による検体検査において
は、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
Ｈを意味する）が波長３４０ｎｍに吸収をもつことに着
目し、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）+（ＮＡＤ+また
はＮＡＤＰ+を意味する）への変換反応の反応速度ある
いは反応量を、波長３４０ｎｍにおける吸光度の変化か
ら測定することにより、検体中に含まれる特定物質や、
これらに関与する各種酵素の活性を測定することが、日
常的に行われている。
は、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
Ｈを意味する）が波長３４０ｎｍに吸収をもつことに着
目し、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）+（ＮＡＤ+また
はＮＡＤＰ+を意味する）への変換反応の反応速度ある
いは反応量を、波長３４０ｎｍにおける吸光度の変化か
ら測定することにより、検体中に含まれる特定物質や、
これらに関与する各種酵素の活性を測定することが、日
常的に行われている。
【０００６】例えば、試料中の特定物質として、尿素窒
素を測定する場合、反応式
素を測定する場合、反応式
【化１】 で示されるように、尿素を酵素ウレアーゼで加水分解し
てアンモニアを生成させ、生成したアンモニアをα−ケ
トグルタル酸（α−ＫＧ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡ
ＤＨまたはＮＡＤＰＨを意味する）の存在下、グルタミ
ン酸脱水素酵素（以下、ＧＬＤＨと略記する）を作用さ
せ、その作用によりＮＡＤ（Ｐ）ＨがＮＡＤ（Ｐ）+に
変換するので、該ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度あるいは減
少量を測定することにより、試料中の尿素窒素を定量す
る方法が、一般的に行われている。
てアンモニアを生成させ、生成したアンモニアをα−ケ
トグルタル酸（α−ＫＧ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡ
ＤＨまたはＮＡＤＰＨを意味する）の存在下、グルタミ
ン酸脱水素酵素（以下、ＧＬＤＨと略記する）を作用さ
せ、その作用によりＮＡＤ（Ｐ）ＨがＮＡＤ（Ｐ）+に
変換するので、該ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度あるいは減
少量を測定することにより、試料中の尿素窒素を定量す
る方法が、一般的に行われている。
【０００７】ところが、この場合、中間産生物質である
アンモニアが試料中にすでに存在していることがあるた
め、予めこのアンモニアを前処理によって消去しておく
必要がある。この消去は、通常α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）
ＨおよびＧＬＤＨによって行われるが、使用するＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ量が多いと、特定物質の測定に問題を起こす。
そこで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を少量にして効果的
にアンモニアを消去する場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが不足す
るおそれがある。このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補うた
め、共役脱水素酵素としてイソクエン酸脱水素酵素（Ｉ
ＣＤＨ）を共存させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成したＮＡ
Ｄ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生する方法が知られて
いる。そして、この後、特定物質の測定系において、上
記ＩＣＤＨ反応をＡＴＰ（アデノシン５′−三リン酸）
やキレート剤を添加することで停止させることにより、
特定物質を正確に測定できる方法が開示されている（特
公平６−７３４７５号公報、特公平６−７３４７６号公
報、特公平６−７５５１６号公報）。
アンモニアが試料中にすでに存在していることがあるた
め、予めこのアンモニアを前処理によって消去しておく
必要がある。この消去は、通常α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）
ＨおよびＧＬＤＨによって行われるが、使用するＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ量が多いと、特定物質の測定に問題を起こす。
そこで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を少量にして効果的
にアンモニアを消去する場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが不足す
るおそれがある。このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補うた
め、共役脱水素酵素としてイソクエン酸脱水素酵素（Ｉ
ＣＤＨ）を共存させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成したＮＡ
Ｄ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生する方法が知られて
いる。そして、この後、特定物質の測定系において、上
記ＩＣＤＨ反応をＡＴＰ（アデノシン５′−三リン酸）
やキレート剤を添加することで停止させることにより、
特定物質を正確に測定できる方法が開示されている（特
公平６−７３４７５号公報、特公平６−７３４７６号公
報、特公平６−７５５１６号公報）。
【０００８】しかしながら、これらの方法においては、
特定物質を測定する際、ＡＴＰを生成するような反応系
においては、ＡＴＰの添加は不都合が生じるおそれがあ
るし、また、キレート剤を添加して反応を停止させる場
合、特定物質の測定系において、金属要求性酵素が係わ
っている場合には、該酵素が大きく阻害されるおそれが
ある。したがって、上記方法においては、適用できる特
定物質の測定系が制限されるのを免れないなどの欠点を
有している。
特定物質を測定する際、ＡＴＰを生成するような反応系
においては、ＡＴＰの添加は不都合が生じるおそれがあ
るし、また、キレート剤を添加して反応を停止させる場
合、特定物質の測定系において、金属要求性酵素が係わ
っている場合には、該酵素が大きく阻害されるおそれが
ある。したがって、上記方法においては、適用できる特
定物質の測定系が制限されるのを免れないなどの欠点を
有している。
【０００９】また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補う方法と
して、グルコースおよびグルコース脱水素酵素を用いる
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生方法も提案されている（特開平５
−１０３６９７号公報）。しかしながら、この方法にお
いては、グルコース脱水素酵素のグルコースに対するＫ
m（ミカエリス定数）が１０-2モル／リットル程度と比
較的大きいため、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応速度が十分
ではないという欠点がある。
して、グルコースおよびグルコース脱水素酵素を用いる
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生方法も提案されている（特開平５
−１０３６９７号公報）。しかしながら、この方法にお
いては、グルコース脱水素酵素のグルコースに対するＫ
m（ミカエリス定数）が１０-2モル／リットル程度と比
較的大きいため、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応速度が十分
ではないという欠点がある。
【００１０】さらに、上記方法と同様に、不足したＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈを補う目的で、Ｇ６ＰＤＨ反応や６−ＰＧＤ
Ｈ反応やＦＣＤＨ反応を利用する方法も考えられるが、
その場合、Ｇ６ＰＤＨ阻害剤や６−ＰＧＤＨ阻害剤やＦ
ＣＤＨ阻害剤として通常知られているＡＴＰやＡＤＰ
（アデノシン５′−二リン酸）などでは、これらの反応
を完全に停止することは困難である。
Ｄ（Ｐ）Ｈを補う目的で、Ｇ６ＰＤＨ反応や６−ＰＧＤ
Ｈ反応やＦＣＤＨ反応を利用する方法も考えられるが、
その場合、Ｇ６ＰＤＨ阻害剤や６−ＰＧＤＨ阻害剤やＦ
ＣＤＨ阻害剤として通常知られているＡＴＰやＡＤＰ
（アデノシン５′−二リン酸）などでは、これらの反応
を完全に停止することは困難である。
【００１１】そのため、試料中に最初から含まれている
アンモニアを、ＧＬＤＨ、α−ＫＧ、共役脱水素酵素及
びその基質を用いて消去した後、該共役脱水素酵素を効
果的に阻害し、さらに、特定物質に、特定物質からアン
モニアを発生させる成分を作用させることにより、試料
中の特定物質を正確に測定できる新規な方法が望まれて
いるのが現状である。
アンモニアを、ＧＬＤＨ、α−ＫＧ、共役脱水素酵素及
びその基質を用いて消去した後、該共役脱水素酵素を効
果的に阻害し、さらに、特定物質に、特定物質からアン
モニアを発生させる成分を作用させることにより、試料
中の特定物質を正確に測定できる新規な方法が望まれて
いるのが現状である。
【００１２】さらに、近年、臨床検査は、医療現場の要
求により、ますます微量・迅速の方向に向っており、高
感度・短時間測定は検査薬としての必須の条件となって
いる。反応時間の短縮のためには、酵素濃度（Ｖmax）
の増加かＫm値の小さい酵素を選ぶ必要があるが、酵素
濃度を高めることはコスト面から限度があり、したがっ
て基質に対して親和性の高い酵素を使用する方向にあ
り、低Ｋm酵素の使用が望まれている。
求により、ますます微量・迅速の方向に向っており、高
感度・短時間測定は検査薬としての必須の条件となって
いる。反応時間の短縮のためには、酵素濃度（Ｖmax）
の増加かＫm値の小さい酵素を選ぶ必要があるが、酵素
濃度を高めることはコスト面から限度があり、したがっ
て基質に対して親和性の高い酵素を使用する方向にあ
り、低Ｋm酵素の使用が望まれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
事情のもとで、特に試料中の特定物質を測定する系にお
いて、前処理によって生成したＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換するために利用した基質に対する親和性
の高いＧ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨなどの共役
脱水素酵素の反応を、効果的に止めるのに用いる停止
剤、および該共役脱水素酵素の反応を停止する方法を提
供することを目的とするものである。さらに、特定物質
からアンモニアを発生させ、その発生したアンモニアに
基づいて特定物質を測定する場合、測定の誤差の原因と
なる試料中のアンモニアをあらかじめ消去することによ
り、試料中の特定物質を正確に測定する方法及びそれに
用いるキットを提供することを目的とするものである。
事情のもとで、特に試料中の特定物質を測定する系にお
いて、前処理によって生成したＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換するために利用した基質に対する親和性
の高いＧ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨなどの共役
脱水素酵素の反応を、効果的に止めるのに用いる停止
剤、および該共役脱水素酵素の反応を停止する方法を提
供することを目的とするものである。さらに、特定物質
からアンモニアを発生させ、その発生したアンモニアに
基づいて特定物質を測定する場合、測定の誤差の原因と
なる試料中のアンモニアをあらかじめ消去することによ
り、試料中の特定物質を正確に測定する方法及びそれに
用いるキットを提供することを目的とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、共役
脱水素酵素反応を停止するには、界面活性剤が極めて有
用であることを見出した。さらに、内因性アンモニアに
α−ＫＧとＧＬＤＨとを作用させて内因性アンモニアを
グルタミン酸に変換させる際、共役脱水素酵素とその基
質を共存させて該アンモニアを消去し、その消去反応後
に、界面活性剤の添加により共役脱水素酵素反応を停止
し、その停止と同時もしくはその後に、酵素作用により
試料中の特定物質からアンモニアを生成させ、生成する
アンモニアにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
作用させ、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を測定することに
より、試料中の特定物質を極めて精度よく測定できるこ
とを見い出した。本発明はかかる知見に基づいて完成し
たものである。
上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、共役
脱水素酵素反応を停止するには、界面活性剤が極めて有
用であることを見出した。さらに、内因性アンモニアに
α−ＫＧとＧＬＤＨとを作用させて内因性アンモニアを
グルタミン酸に変換させる際、共役脱水素酵素とその基
質を共存させて該アンモニアを消去し、その消去反応後
に、界面活性剤の添加により共役脱水素酵素反応を停止
し、その停止と同時もしくはその後に、酵素作用により
試料中の特定物質からアンモニアを生成させ、生成する
アンモニアにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
作用させ、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を測定することに
より、試料中の特定物質を極めて精度よく測定できるこ
とを見い出した。本発明はかかる知見に基づいて完成し
たものである。
【００１５】すなわち、本発明は、（１）界面活性剤を
含むことを特徴とする共役脱水素酵素反応の停止剤、
（２）共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質
の作用により、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を、それぞれＮ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換させ、次いで界面活性剤
を作用させることにより、この反応を停止させることを
特徴とする共役脱水素反応の停止方法、（３）試料中の
特定物質からアンモニアを発生させ、そのアンモニアを
測定することにより、該特定物質を定量する方法におい
て、あらかじめ、試料中に存在するアンモニアを、グル
タミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨま
たはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素
酵素の基質の作用により消去し、次いで界面活性剤の作
用により共役脱水素酵素反応を停止させ、その作用と同
時か後に、該特定物質からアンモニアを発生させる成分
を作用させ、発生するアンモニアを測定することを特徴
とする特定物質の測定方法、および（４）特定物質測定
用キットであって、（Ａ）グルタミン酸脱水素酵素、α
−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱
水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質を含む試薬、
並びに（Ｂ）特定物質からアンモニアを発生させる成分
および界面活性剤を含む試薬を必須構成試薬とするキッ
ト、を提供するものである。
含むことを特徴とする共役脱水素酵素反応の停止剤、
（２）共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質
の作用により、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を、それぞれＮ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換させ、次いで界面活性剤
を作用させることにより、この反応を停止させることを
特徴とする共役脱水素反応の停止方法、（３）試料中の
特定物質からアンモニアを発生させ、そのアンモニアを
測定することにより、該特定物質を定量する方法におい
て、あらかじめ、試料中に存在するアンモニアを、グル
タミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨま
たはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素
酵素の基質の作用により消去し、次いで界面活性剤の作
用により共役脱水素酵素反応を停止させ、その作用と同
時か後に、該特定物質からアンモニアを発生させる成分
を作用させ、発生するアンモニアを測定することを特徴
とする特定物質の測定方法、および（４）特定物質測定
用キットであって、（Ａ）グルタミン酸脱水素酵素、α
−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱
水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質を含む試薬、
並びに（Ｂ）特定物質からアンモニアを発生させる成分
および界面活性剤を含む試薬を必須構成試薬とするキッ
ト、を提供するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】まず、本発明の共役脱水素酵素反
応の停止剤について説明する。本発明の反応停止剤は界
面活性剤を含むものであって、特に共役脱水素酵素反応
が、Ｇ６ＰＤＨ反応、６−ＰＧＤＨ反応またはＦＣＤＨ
反応である場合に有効である。
応の停止剤について説明する。本発明の反応停止剤は界
面活性剤を含むものであって、特に共役脱水素酵素反応
が、Ｇ６ＰＤＨ反応、６−ＰＧＤＨ反応またはＦＣＤＨ
反応である場合に有効である。
【００１７】本発明において用いられるＧ６ＰＤＨは、
反応式（ａ） グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤＰ+ → ６−ホスホグルコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ （ａ） で示される反応を触媒するペントースリン酸回路（グル
コース代謝経路の一つ）の酵素であり、細菌由来のもの
および酵母由来のものなどが知られている。細菌由来の
ものはＮＡＤＰ+以外に、ＮＡＤ+も補酵素として、反応
式（ｂ） グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ+ → ６−ホスホグルコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ （ｂ） で示される反応を触媒するが、酵母由来のものは、上記
（ｂ）の反応は触媒しない。
反応式（ａ） グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤＰ+ → ６−ホスホグルコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ （ａ） で示される反応を触媒するペントースリン酸回路（グル
コース代謝経路の一つ）の酵素であり、細菌由来のもの
および酵母由来のものなどが知られている。細菌由来の
ものはＮＡＤＰ+以外に、ＮＡＤ+も補酵素として、反応
式（ｂ） グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ+ → ６−ホスホグルコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ （ｂ） で示される反応を触媒するが、酵母由来のものは、上記
（ｂ）の反応は触媒しない。
【００１８】このＧ６ＰＤＨは基質親和性が高く、Ｋm
は３．５×１０-5モル／リットル（グルコース−６−リ
ン酸）、４．２×１０-6モル／リットル（ＮＡＤＰ+）
である。このＧ６ＰＤＨとしては、細菌由来のものは、
カチオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が
阻害され、酵母由来のものは、アニオン系界面活性剤に
より、比較的容易に酵素活性が阻害される点から、いず
れも好ましい。
は３．５×１０-5モル／リットル（グルコース−６−リ
ン酸）、４．２×１０-6モル／リットル（ＮＡＤＰ+）
である。このＧ６ＰＤＨとしては、細菌由来のものは、
カチオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が
阻害され、酵母由来のものは、アニオン系界面活性剤に
より、比較的容易に酵素活性が阻害される点から、いず
れも好ましい。
【００１９】また、本発明において用いられる６−ＰＧ
ＤＨは、反応式（ｃ）または（ｄ） ６−ホスホグルコン酸＋ＮＡＤＰ+ → リブロース−５−リン酸＋ＣＯ2＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ （ｃ） ６−ホスホグルコン酸＋ＮＡＤ+ → リブロース−５−リン酸＋ＣＯ2＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ （ｄ） で示される反応を触媒するペントースリン酸回路（グル
コース代謝経路の一つ）の酵素であり、動物肝、ヒト赤
血球、細菌および酵母由来のものなどが知られている。
酵母由来のものは上記（ｃ）の反応は触媒するが、
（ｄ）の反応は触媒しない。また、細菌由来のものに
は、上記（ｃ）の反応のみを触媒するもの、（ｄ）の反
応のみを触媒するもの、および（ｃ）と（ｄ）の反応の
両方を触媒するものがある。
ＤＨは、反応式（ｃ）または（ｄ） ６−ホスホグルコン酸＋ＮＡＤＰ+ → リブロース−５−リン酸＋ＣＯ2＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ （ｃ） ６−ホスホグルコン酸＋ＮＡＤ+ → リブロース−５−リン酸＋ＣＯ2＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ （ｄ） で示される反応を触媒するペントースリン酸回路（グル
コース代謝経路の一つ）の酵素であり、動物肝、ヒト赤
血球、細菌および酵母由来のものなどが知られている。
酵母由来のものは上記（ｃ）の反応は触媒するが、
（ｄ）の反応は触媒しない。また、細菌由来のものに
は、上記（ｃ）の反応のみを触媒するもの、（ｄ）の反
応のみを触媒するもの、および（ｃ）と（ｄ）の反応の
両方を触媒するものがある。
【００２０】この６−ＰＧＤＨは基質親和性が高く、Ｋ
mは５．４×１０-5モル／リットル（６−ホスホグルコ
ン酸）、２．０×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）
である。この６−ＰＧＤＨとしては、カチオン系界面活
性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害される点か
ら、酵母由来のものが好ましい。
mは５．４×１０-5モル／リットル（６−ホスホグルコ
ン酸）、２．０×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）
である。この６−ＰＧＤＨとしては、カチオン系界面活
性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害される点か
ら、酵母由来のものが好ましい。
【００２１】一方、本発明において用いられるＦＣＤＨ
は、反応式（ｅ）または（ｆ） Ｌ−フコース＋ＮＡＤＰ+ → Ｌ−フコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ （ｅ） Ｌ−フコース＋ＮＡＤ+ → Ｌ−フコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ （ｆ） で示される反応を触媒する酵素であり、動物肝、細菌由
来のものなどが知られている。このＦＣＤＨは、基質親
和性が比較的高く、Ｋmは１．９×１０-3モル／リット
ル（Ｌ−フコース）、１．６×１０-5モル／リットル
（ＮＡＤＰ+）である。このＦＣＤＨとしては、カチオ
ン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害さ
れる点から、細菌由来のものが好ましい。
は、反応式（ｅ）または（ｆ） Ｌ−フコース＋ＮＡＤＰ+ → Ｌ−フコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ （ｅ） Ｌ−フコース＋ＮＡＤ+ → Ｌ−フコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ （ｆ） で示される反応を触媒する酵素であり、動物肝、細菌由
来のものなどが知られている。このＦＣＤＨは、基質親
和性が比較的高く、Ｋmは１．９×１０-3モル／リット
ル（Ｌ−フコース）、１．６×１０-5モル／リットル
（ＮＡＤＰ+）である。このＦＣＤＨとしては、カチオ
ン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害さ
れる点から、細菌由来のものが好ましい。
【００２２】前記カチオン系界面活性剤としては、細菌
由来のＧ６ＰＤＨの反応や酵母由来の６−ＰＧＤＨの反
応、あるいは細菌由来のＦＣＤＨ反応を効果的に停止し
うるものであればよく、特に制限はないが、試料中の特
定物質を測定する系において、該Ｇ６ＰＤＨや６−ＰＧ
ＤＨ、ＦＣＤＨを実質上失活させる以外は、他に実質上
影響を及ぼさないものが好適である。このようなカチオ
ン系界面活性剤としては、例えば一般式（Ｉ）
由来のＧ６ＰＤＨの反応や酵母由来の６−ＰＧＤＨの反
応、あるいは細菌由来のＦＣＤＨ反応を効果的に停止し
うるものであればよく、特に制限はないが、試料中の特
定物質を測定する系において、該Ｇ６ＰＤＨや６−ＰＧ
ＤＨ、ＦＣＤＨを実質上失活させる以外は、他に実質上
影響を及ぼさないものが好適である。このようなカチオ
ン系界面活性剤としては、例えば一般式（Ｉ）
【化２】 （式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立に炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数５〜１０のシクロアルキ
ル基、炭素数６〜１０のアリール基または炭素数７〜１
０のアラルキル基、Ｘm-はｍ価の陰イオン、ｍは１また
は２、ｎは９〜１７の整数を示す。）で表される第四級
アンモニウム塩、あるいは一般式（II）
１〜１０のアルキル基、炭素数５〜１０のシクロアルキ
ル基、炭素数６〜１０のアリール基または炭素数７〜１
０のアラルキル基、Ｘm-はｍ価の陰イオン、ｍは１また
は２、ｎは９〜１７の整数を示す。）で表される第四級
アンモニウム塩、あるいは一般式（II）
【化３】 （式中、Ｘq-はｑ価の陰イオン、ｑは１または２、ｐは
９〜１７の整数を示す。）で表される第四級アンモニウ
ム塩を、Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨの阻害能
や溶解性などの点から、好ましく挙げることができる。
９〜１７の整数を示す。）で表される第四級アンモニウ
ム塩を、Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨの阻害能
や溶解性などの点から、好ましく挙げることができる。
【００２３】上記一般式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2およ
びＲ3で示される炭素数１〜１０のアルキル基として
は、直鎖状、分岐状のいずれであってもよく、例えばメ
チル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、
ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅ
ｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基
などが、炭素数５〜１０のシクロアルキル基としては、
例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基などが、炭
素数６〜１０のアリール基としては、例えばフェニル
基、トリル基、キシリル基、ナフチル基などが、炭素数
７〜１０のアラルキル基としては、例えばベンジル基、
フェネチル基などが挙げられる。Ｒ1、Ｒ2およびＲ
3は、たがいに同一であってもよいし、異なっていても
よい。
びＲ3で示される炭素数１〜１０のアルキル基として
は、直鎖状、分岐状のいずれであってもよく、例えばメ
チル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、
ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅ
ｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基
などが、炭素数５〜１０のシクロアルキル基としては、
例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基などが、炭
素数６〜１０のアリール基としては、例えばフェニル
基、トリル基、キシリル基、ナフチル基などが、炭素数
７〜１０のアラルキル基としては、例えばベンジル基、
フェネチル基などが挙げられる。Ｒ1、Ｒ2およびＲ
3は、たがいに同一であってもよいし、異なっていても
よい。
【００２４】また、一般式（Ｉ）における１／ｍＸm-、
一般式（II）における１／ｑＸq-の例としては、Ｆ-、
Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-のハロゲンイオン、ＮＯ3 -、１／２
ＳＯ4 2 -、１／２ＣＯ3 2-、ＣＨ3ＳＯ4 -、ｐ−トルエン
スルホン酸イオンなどが挙げられる。
一般式（II）における１／ｑＸq-の例としては、Ｆ-、
Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-のハロゲンイオン、ＮＯ3 -、１／２
ＳＯ4 2 -、１／２ＣＯ3 2-、ＣＨ3ＳＯ4 -、ｐ−トルエン
スルホン酸イオンなどが挙げられる。
【００２５】さらに、一般式（Ｉ）におけるｎ、一般式
（II）におけるｐが８以下ではＧ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤ
Ｈ、ＦＣＤＨの阻害能が十分でない場合があるし、１８
以上では溶解性が悪くなることがあり、ｎおよびｐは９
〜１７の範囲がよい。ＣＨ3（ＣＨ2）n-、ＣＨ3（Ｃ
Ｈ2）p-で示される基としては、例えば、デシル基、ド
デシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデ
シル基などが挙げられる。
（II）におけるｐが８以下ではＧ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤ
Ｈ、ＦＣＤＨの阻害能が十分でない場合があるし、１８
以上では溶解性が悪くなることがあり、ｎおよびｐは９
〜１７の範囲がよい。ＣＨ3（ＣＨ2）n-、ＣＨ3（Ｃ
Ｈ2）p-で示される基としては、例えば、デシル基、ド
デシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデ
シル基などが挙げられる。
【００２６】上記一般式（Ｉ）、（II）で表される第四
級アンモニウム塩の例としては、ドデシルトリメチルア
ンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニ
ウムクロリド、ドデシルトリエチルアンモニウムクロリ
ド、テトラデシルトリエチルアンモニウムクロリド、ド
デシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、テトラ
デシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ドデシ
ルジエチルベンジルアンモニウムクロリド、テトラデシ
ルジエチルベンジルアンモニウムクロリド、デシルピリ
ジニウムクロリド、ドデシルピリジニウムクロリド、テ
トラデシルピリジニウムクロリドなど、およびこれらに
対応するブロミド類やヨージド類などが好ましく挙げら
れる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み
合わせて用いてもよい。
級アンモニウム塩の例としては、ドデシルトリメチルア
ンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニ
ウムクロリド、ドデシルトリエチルアンモニウムクロリ
ド、テトラデシルトリエチルアンモニウムクロリド、ド
デシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、テトラ
デシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ドデシ
ルジエチルベンジルアンモニウムクロリド、テトラデシ
ルジエチルベンジルアンモニウムクロリド、デシルピリ
ジニウムクロリド、ドデシルピリジニウムクロリド、テ
トラデシルピリジニウムクロリドなど、およびこれらに
対応するブロミド類やヨージド類などが好ましく挙げら
れる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み
合わせて用いてもよい。
【００２７】前記カチオン系界面活性剤を含有する本発
明の反応停止剤は、特に細菌由来のＧ６ＰＤＨ、酵母由
来の６−ＰＧＤＨまたは細菌由来のＦＣＤＨの活性を効
果的に阻害して、該Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨまたはＦ
ＣＤＨの反応を効率よく停止させるものが好適である。
したがって、このようなカチオン系界面活性剤として
は、例えば０．０１Ｕ／ｍｌの細菌由来のＧ６ＰＤＨ、
酵母由来の６−ＰＧＤＨまたは細菌由来のＦＣＤＨを含
有する試料液に、カチオン系界面活性剤を０．６ｇ／１
００ｍｌ濃度になるように加え、３７℃で４分間加温処
理した後の該Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨまたはＦＣＤＨ
の活性が、１０％以下になるようなカチオン系界面活性
剤を選ぶのが有利である。本発明の反応停止剤には、こ
のようなカチオン系界面活性剤以外に、本発明の目的が
損なわれない範囲で、所望により、他のＧ６ＰＤＨ阻害
剤、６−ＰＧＤＨ阻害剤またはＦＣＤＨ阻害剤を含有さ
せてもよい。
明の反応停止剤は、特に細菌由来のＧ６ＰＤＨ、酵母由
来の６−ＰＧＤＨまたは細菌由来のＦＣＤＨの活性を効
果的に阻害して、該Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨまたはＦ
ＣＤＨの反応を効率よく停止させるものが好適である。
したがって、このようなカチオン系界面活性剤として
は、例えば０．０１Ｕ／ｍｌの細菌由来のＧ６ＰＤＨ、
酵母由来の６−ＰＧＤＨまたは細菌由来のＦＣＤＨを含
有する試料液に、カチオン系界面活性剤を０．６ｇ／１
００ｍｌ濃度になるように加え、３７℃で４分間加温処
理した後の該Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨまたはＦＣＤＨ
の活性が、１０％以下になるようなカチオン系界面活性
剤を選ぶのが有利である。本発明の反応停止剤には、こ
のようなカチオン系界面活性剤以外に、本発明の目的が
損なわれない範囲で、所望により、他のＧ６ＰＤＨ阻害
剤、６−ＰＧＤＨ阻害剤またはＦＣＤＨ阻害剤を含有さ
せてもよい。
【００２８】一方、前記アニオン系界面活性剤として
は、酵母由来のＧ６ＰＤＨの反応を効果的に停止しうる
ものであればよく、特に制限はないが、試料中の特定物
質を測定する系において、該Ｇ６ＰＤＨを実質上失活さ
せる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが好適で
ある。このようなアニオン系界面活性剤としては、例え
ば一般式（III） Ｒ4ＳＯ3 -・１／ａ（Ｍ1）a+ （III） （式中、Ｒ4は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状
のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ1）a+はａ価の
陽イオン、ａは１または２を示す。）で表されるアルキ
ル（またはアルケニル）スルホン酸塩、一般式（IV）
は、酵母由来のＧ６ＰＤＨの反応を効果的に停止しうる
ものであればよく、特に制限はないが、試料中の特定物
質を測定する系において、該Ｇ６ＰＤＨを実質上失活さ
せる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが好適で
ある。このようなアニオン系界面活性剤としては、例え
ば一般式（III） Ｒ4ＳＯ3 -・１／ａ（Ｍ1）a+ （III） （式中、Ｒ4は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状
のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ1）a+はａ価の
陽イオン、ａは１または２を示す。）で表されるアルキ
ル（またはアルケニル）スルホン酸塩、一般式（IV）
【化４】 （式中、Ｒ5は炭素数６〜１５の直鎖状若しくは分岐状
アルキル基、（Ｍ2）b+はｂ価の陽イオン、ｂは１また
は２を示す。）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸
塩、一般式（Ｖ） Ｒ6Ｏ−（Ｃ2Ｈ4Ｏ）c−ＳＯ3 -・１／ｋ（Ｍ3）k+ （Ｖ） （式中、Ｒ6は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状
のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ3）k+はｋ価の
陽イオン、ｋは１または２、ｃは１以上の整数を示
す。）で表されるポリオキシエチレンアルキル（または
アルケニル）エーテル硫酸塩などを好ましく挙げること
ができる。
アルキル基、（Ｍ2）b+はｂ価の陽イオン、ｂは１また
は２を示す。）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸
塩、一般式（Ｖ） Ｒ6Ｏ−（Ｃ2Ｈ4Ｏ）c−ＳＯ3 -・１／ｋ（Ｍ3）k+ （Ｖ） （式中、Ｒ6は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状
のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ3）k+はｋ価の
陽イオン、ｋは１または２、ｃは１以上の整数を示
す。）で表されるポリオキシエチレンアルキル（または
アルケニル）エーテル硫酸塩などを好ましく挙げること
ができる。
【００２９】前記一般式（III）において、Ｒ4で示され
る炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基
またはアルケニル基の例としては、オクチル基、デシル
基、ドデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、オ
レイル基などが挙げられ、また、（Ｍ1）a+の例として
は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイ
オン、などが挙げられる。
る炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基
またはアルケニル基の例としては、オクチル基、デシル
基、ドデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、オ
レイル基などが挙げられ、また、（Ｍ1）a+の例として
は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイ
オン、などが挙げられる。
【００３０】この一般式（III）で表されるアルキル
（またはアルケニル）スルホン酸塩の具体例としては、
デカンスルホン酸ナトリウム、ドデカンスルホン酸ナト
リウム、デカンスルホン酸カリウム、ドデカンスルホン
酸カリウムなどが挙げられる。
（またはアルケニル）スルホン酸塩の具体例としては、
デカンスルホン酸ナトリウム、ドデカンスルホン酸ナト
リウム、デカンスルホン酸カリウム、ドデカンスルホン
酸カリウムなどが挙げられる。
【００３１】また、前記一般式（IV）において、Ｒ5で
示される炭素数６〜１５の直鎖状若しくは分岐状のアル
キル基の例としては、オクチル基、ノニル基、デシル
基、ドデシル基などが挙げられ、また、（Ｍ2）b+の例
としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシ
ウムイオンなどが挙げられる。
示される炭素数６〜１５の直鎖状若しくは分岐状のアル
キル基の例としては、オクチル基、ノニル基、デシル
基、ドデシル基などが挙げられ、また、（Ｍ2）b+の例
としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシ
ウムイオンなどが挙げられる。
【００３２】この一般式（IV）で表されるアルキルベン
ゼンスルホン酸塩の具体例としては、オクチルベンゼン
スルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム、オクチルベンゼンスルホン酸カリウム、ドデ
シルベンゼンスルホン酸カリウムなどが挙げられる。
ゼンスルホン酸塩の具体例としては、オクチルベンゼン
スルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム、オクチルベンゼンスルホン酸カリウム、ドデ
シルベンゼンスルホン酸カリウムなどが挙げられる。
【００３３】さらに、前記一般式（Ｖ）において、Ｒ6
で示される炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のア
ルキル基またはアルケニル基の例としては、オクチル
基、デシル基、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル
基、ステアリル基、オレイル基などが挙げられ、また、
（Ｍ3）k+の例としては、ナトリウムイオン、カリウム
イオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。
で示される炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のア
ルキル基またはアルケニル基の例としては、オクチル
基、デシル基、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル
基、ステアリル基、オレイル基などが挙げられ、また、
（Ｍ3）k+の例としては、ナトリウムイオン、カリウム
イオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。
【００３４】この一般式（Ｖ）で表されるポリオキシエ
チレンアルキル（またはアルケニル）エーテル硫酸塩の
具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル
硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテ
ル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル硫酸カリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテ
ル硫酸カリウム、ポリオキシエチレンオレイルエーテル
硫酸カリウムなどが挙げられる。
チレンアルキル（またはアルケニル）エーテル硫酸塩の
具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル
硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテ
ル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル硫酸カリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテ
ル硫酸カリウム、ポリオキシエチレンオレイルエーテル
硫酸カリウムなどが挙げられる。
【００３５】本発明においては、これらのアニオン系界
面活性剤は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わ
せて用いてもよい。前記アニオン系界面活性剤を含有す
る本発明の反応停止剤は、特に酵母由来のＧ６ＰＤＨの
活性を効果的に阻害して、該Ｇ６ＰＤＨの反応を効率よ
く停止させるものが好適である。したがって、酵母由来
のＧ６ＰＤＨの活性を効果的に阻害するアニオン系界面
活性剤としては、例えば０．０１Ｕ／ｍｌの酵母由来の
Ｇ６ＰＤＨを含有する試料液に、アニオン系界面活性剤
を０．３ｇ／１００ｍｌ濃度になるように加え、３７℃
で４分間加温処理した後の該Ｇ６ＰＤＨの活性が、１０
％以下になるようなアニオン系界面活性剤を選ぶのが有
利である。本発明の反応停止剤には、このようなアニオ
ン系界面活性剤以外に、本発明の目的が損なわれない範
囲で、所望により、他のＧ６ＰＤＨ阻害剤を含有させて
もよい。
面活性剤は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わ
せて用いてもよい。前記アニオン系界面活性剤を含有す
る本発明の反応停止剤は、特に酵母由来のＧ６ＰＤＨの
活性を効果的に阻害して、該Ｇ６ＰＤＨの反応を効率よ
く停止させるものが好適である。したがって、酵母由来
のＧ６ＰＤＨの活性を効果的に阻害するアニオン系界面
活性剤としては、例えば０．０１Ｕ／ｍｌの酵母由来の
Ｇ６ＰＤＨを含有する試料液に、アニオン系界面活性剤
を０．３ｇ／１００ｍｌ濃度になるように加え、３７℃
で４分間加温処理した後の該Ｇ６ＰＤＨの活性が、１０
％以下になるようなアニオン系界面活性剤を選ぶのが有
利である。本発明の反応停止剤には、このようなアニオ
ン系界面活性剤以外に、本発明の目的が損なわれない範
囲で、所望により、他のＧ６ＰＤＨ阻害剤を含有させて
もよい。
【００３６】次に、本発明の共役脱水素酵素反応の停止
方法について説明する。本発明の共役脱水素酵素反応の
停止方法は、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素
の基質の作用により、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を、それ
ぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換させ、次いで界面
活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる
方法である。
方法について説明する。本発明の共役脱水素酵素反応の
停止方法は、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素
の基質の作用により、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を、それ
ぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換させ、次いで界面
活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる
方法である。
【００３７】この方法においては、上記ＮＡＤ（Ｐ）+
の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質
を測定する系において、該試料の前処理により生成した
ものが好ましく、また界面活性剤としては、試料中の特
定物質を測定する系において、共役脱水素酵素を実質上
失活させる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが
好ましい。
の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質
を測定する系において、該試料の前処理により生成した
ものが好ましく、また界面活性剤としては、試料中の特
定物質を測定する系において、共役脱水素酵素を実質上
失活させる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが
好ましい。
【００３８】本発明の共役脱水素酵素反応の停止方法に
は、（１）Ｇ６ＰＤＨ反応の停止方法と、（２）６−Ｐ
ＧＤＨ反応の停止方法と、（３）ＦＣＤＨ反応の停止方
法の３つの態様がある。
は、（１）Ｇ６ＰＤＨ反応の停止方法と、（２）６−Ｐ
ＧＤＨ反応の停止方法と、（３）ＦＣＤＨ反応の停止方
法の３つの態様がある。
【００３９】上記（１）のＧ６ＰＤＨ反応の停止方法
は、Ｇ６ＰＤＨおよびグルコース−６−リン酸の作用に
より、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次
いでカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤
を作用させることにより、この反応を停止させる方法で
あって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限
はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該
試料の前処理により生成したものが好適である。
は、Ｇ６ＰＤＨおよびグルコース−６−リン酸の作用に
より、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次
いでカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤
を作用させることにより、この反応を停止させる方法で
あって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限
はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該
試料の前処理により生成したものが好適である。
【００４０】ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の
特定物質を測定する系において、該試料の前処理により
生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性
剤またはアニオン系界面活性剤は、Ｇ６ＰＤＨを実質上
失活させる以外は、該系における他のものに実質上影響
を及ぼさないものが好適である。なお、用いるＧ６ＰＤ
Ｈが細菌由来のものである場合には、カチオン系界面活
性剤を使用し、Ｇ６ＰＤＨが酵母由来のものである場合
には、アニオン系界面活性剤を使用するのが肝要であ
る。
特定物質を測定する系において、該試料の前処理により
生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性
剤またはアニオン系界面活性剤は、Ｇ６ＰＤＨを実質上
失活させる以外は、該系における他のものに実質上影響
を及ぼさないものが好適である。なお、用いるＧ６ＰＤ
Ｈが細菌由来のものである場合には、カチオン系界面活
性剤を使用し、Ｇ６ＰＤＨが酵母由来のものである場合
には、アニオン系界面活性剤を使用するのが肝要であ
る。
【００４１】このカチオン系界面活性剤またはアニオン
系界面活性剤の添加量としては、Ｇ６ＰＤＨ反応を停止
させるのに十分な量であり、かつ測定系における他のも
のに実質上影響を及ぼさない濃度範囲であればよく、特
に制限はないが、例えばカチオン系界面活性剤を使用す
る場合には、Ｇ６ＰＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃
度が、通常０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好まし
くは、０．０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好まし
くは０．１〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶの
がよく、アニオン系界面活性剤を使用する場合にはＧ６
ＰＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０
１〜１．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜
０．５０ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．
３ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２
種以上のカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活
性剤を組み合わせて使用する場合、その合計量が上記濃
度範囲にあればよい。この界面活性剤の濃度が低すぎる
とＧ６ＰＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくない
し、また必要以上に添加すると測定系における他のもの
に悪影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。
系界面活性剤の添加量としては、Ｇ６ＰＤＨ反応を停止
させるのに十分な量であり、かつ測定系における他のも
のに実質上影響を及ぼさない濃度範囲であればよく、特
に制限はないが、例えばカチオン系界面活性剤を使用す
る場合には、Ｇ６ＰＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃
度が、通常０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好まし
くは、０．０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好まし
くは０．１〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶの
がよく、アニオン系界面活性剤を使用する場合にはＧ６
ＰＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０
１〜１．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜
０．５０ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．
３ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２
種以上のカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活
性剤を組み合わせて使用する場合、その合計量が上記濃
度範囲にあればよい。この界面活性剤の濃度が低すぎる
とＧ６ＰＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくない
し、また必要以上に添加すると測定系における他のもの
に悪影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。
【００４２】本発明における現象は、カチオン系界面活
性剤またはアニオン系界面活性剤と酵素との相互作用に
より、説明しうるものと考えられる。すなわち、カチオ
ン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤は、タンパ
ク質変性作用を有し、これにより酵素は変性失活を来た
す。Ｇ６ＰＤＨが失活しうる反応条件で、他に使用する
共役酵素が実質上変性を受けにくい場合、Ｇ６ＰＤＨを
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生に使用しうるものである。
性剤またはアニオン系界面活性剤と酵素との相互作用に
より、説明しうるものと考えられる。すなわち、カチオ
ン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤は、タンパ
ク質変性作用を有し、これにより酵素は変性失活を来た
す。Ｇ６ＰＤＨが失活しうる反応条件で、他に使用する
共役酵素が実質上変性を受けにくい場合、Ｇ６ＰＤＨを
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生に使用しうるものである。
【００４３】このような本発明の停止方法における反応
を式で示すと次のように表すことができる。
を式で示すと次のように表すことができる。
【００４４】
【化５】 グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）
+は、Ｇ６ＰＤＨの作用により、それぞれ６−ホスホグ
ルコノ−δ−ラクトンおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換され
るが、界面活性剤を作用させることにより、この反応が
停止する。
+は、Ｇ６ＰＤＨの作用により、それぞれ６−ホスホグ
ルコノ−δ−ラクトンおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換され
るが、界面活性剤を作用させることにより、この反応が
停止する。
【００４５】一方、前記（２）の６−ＰＧＤＨ反応の停
止方法は、６−ＰＧＤＨおよび６−ホスホグルコン酸の
作用により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換さ
せ、次いでカチオン系界面活性剤を作用させることによ
り、この反応を停止させる方法であって、上記ＮＡＤ
（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の
特定物質を測定する系において、該試料の前処理により
生成したものが好適である。
止方法は、６−ＰＧＤＨおよび６−ホスホグルコン酸の
作用により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換さ
せ、次いでカチオン系界面活性剤を作用させることによ
り、この反応を停止させる方法であって、上記ＮＡＤ
（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の
特定物質を測定する系において、該試料の前処理により
生成したものが好適である。
【００４６】ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の
特定物質を測定する系において、該試料の前処理により
生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性
剤は、６−ＰＧＤＨを実質上失活させる以外は、該系に
おける他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適で
ある。
特定物質を測定する系において、該試料の前処理により
生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性
剤は、６−ＰＧＤＨを実質上失活させる以外は、該系に
おける他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適で
ある。
【００４７】このカチオン系界面活性剤の添加量として
は、６−ＰＧＤＨ反応を停止させるのに十分な量であ
り、かつ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさ
ない濃度範囲であればよく、特に制限はないが、例えば
６−ＰＧＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常
０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．
０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１
〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。ま
た、２種以上のカチオン系界面活性剤を組み合わせて使
用する場合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。
このカチオン系界面活性剤の濃度が低すぎると６−ＰＧ
ＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくないし、また
必要以上に添加すると測定系における他のものに悪影響
を及ぼすおそれがあり、好ましくない。このような本発
明の停止方法における反応を式で示すと次のように表す
ことができる。
は、６−ＰＧＤＨ反応を停止させるのに十分な量であ
り、かつ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさ
ない濃度範囲であればよく、特に制限はないが、例えば
６−ＰＧＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常
０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．
０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１
〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。ま
た、２種以上のカチオン系界面活性剤を組み合わせて使
用する場合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。
このカチオン系界面活性剤の濃度が低すぎると６−ＰＧ
ＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくないし、また
必要以上に添加すると測定系における他のものに悪影響
を及ぼすおそれがあり、好ましくない。このような本発
明の停止方法における反応を式で示すと次のように表す
ことができる。
【００４８】
【化６】 ６−ホスホグルコン酸（６−ＰＧ）およびＮＡＤ（Ｐ）
+は、６−ＰＧＤＨの作用により、それぞれリブロース
−５−リン酸、ＣＯ2およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換され
るが、カチオン系界面活性剤を作用させることにより、
この反応が停止する。
+は、６−ＰＧＤＨの作用により、それぞれリブロース
−５−リン酸、ＣＯ2およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換され
るが、カチオン系界面活性剤を作用させることにより、
この反応が停止する。
【００４９】さらに、前記（３）のＦＣＤＨ反応の停止
方法は、ＦＣＤＨおよびＬ−フコースの作用により、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次いでカチ
オン系界面活性剤を作用させることにより、この反応を
停止させる方法であって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来に
ついては特に制限はないが、試料中の特定物質を測定す
る系において、該試料の前処理により生成したものが好
適である。
方法は、ＦＣＤＨおよびＬ−フコースの作用により、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次いでカチ
オン系界面活性剤を作用させることにより、この反応を
停止させる方法であって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来に
ついては特に制限はないが、試料中の特定物質を測定す
る系において、該試料の前処理により生成したものが好
適である。
【００５０】ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の
特定物質を測定する系において、該試料の前処理により
生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性
剤は、ＦＣＤＨを実質上失活させる以外は、該系におけ
る他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適であ
る。
特定物質を測定する系において、該試料の前処理により
生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性
剤は、ＦＣＤＨを実質上失活させる以外は、該系におけ
る他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適であ
る。
【００５１】このカチオン系界面活性剤の添加量として
は、ＦＣＤＨ反応を停止させるのに十分な量であり、か
つ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさない濃
度範囲であればよく、特に制限はないが、例えばＦＣＤ
Ｈ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜
２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜１．
００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．５ｇ
／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２種以
上のカチオン系界面活性剤を組み合わせて使用する場
合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。このカチ
オン系界面活性剤の濃度が低すぎるとＦＣＤＨ反応の停
止が不十分となり、好ましくないし、また必要以上に添
加すると測定系における他のものに悪影響を及ぼすおそ
れがあり、好ましくない。
は、ＦＣＤＨ反応を停止させるのに十分な量であり、か
つ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさない濃
度範囲であればよく、特に制限はないが、例えばＦＣＤ
Ｈ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜
２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜１．
００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．５ｇ
／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２種以
上のカチオン系界面活性剤を組み合わせて使用する場
合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。このカチ
オン系界面活性剤の濃度が低すぎるとＦＣＤＨ反応の停
止が不十分となり、好ましくないし、また必要以上に添
加すると測定系における他のものに悪影響を及ぼすおそ
れがあり、好ましくない。
【００５２】このような本発明の停止方法における反応
を式で示すと次のように表すことができる。
を式で示すと次のように表すことができる。
【００５３】
【化７】 Ｌ−フコース（ＦＣ）およびＮＡＤ（Ｐ）+は、ＦＣＤ
Ｈの作用により、それぞれＬ−フコノ−δ−ラクトンお
よびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されるが、カチオン系界面活
性剤を作用させることにより、この反応が停止する。
Ｈの作用により、それぞれＬ−フコノ−δ−ラクトンお
よびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されるが、カチオン系界面活
性剤を作用させることにより、この反応が停止する。
【００５４】本発明では、用いる界面活性剤が前記のよ
うに共役脱水素酵素反応を選択的に阻害することが重要
である。この界面活性剤が共役脱水素酵素を阻害する理
由は、現在のところ、はっきりしていないが、以下のよ
うに推察できる。共役脱水素酵素にある種の界面活性剤
を作用させると、共役脱水素酵素にその界面活性剤のい
くつかが結合して複合体ができる。そのようになった共
役脱水素酵素は、界面活性剤のもつ荷電により本来の共
役脱水素酵素の荷電と異なる状態になる。一方、共役脱
水素酵素は、イオンを有するＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈにする点で、酵素反応のときは、イオン状態が
特に重要と考えられる。そのため、界面活性剤に結合さ
れた共役脱水素酵素の荷電状態は、本来の共役脱水素酵
素のものと異なるので、イオン状態が重要なこの酵素反
応を起こしにくいと考えられる。その結果、用いる界面
活性剤が共役脱水素酵素反応を選択的に阻害できると考
えられる。この根拠として、界面活性剤として非イオン
系界面活性剤を用いても共役脱水素酵素反応を阻害しに
くいことからも支持される。
うに共役脱水素酵素反応を選択的に阻害することが重要
である。この界面活性剤が共役脱水素酵素を阻害する理
由は、現在のところ、はっきりしていないが、以下のよ
うに推察できる。共役脱水素酵素にある種の界面活性剤
を作用させると、共役脱水素酵素にその界面活性剤のい
くつかが結合して複合体ができる。そのようになった共
役脱水素酵素は、界面活性剤のもつ荷電により本来の共
役脱水素酵素の荷電と異なる状態になる。一方、共役脱
水素酵素は、イオンを有するＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈにする点で、酵素反応のときは、イオン状態が
特に重要と考えられる。そのため、界面活性剤に結合さ
れた共役脱水素酵素の荷電状態は、本来の共役脱水素酵
素のものと異なるので、イオン状態が重要なこの酵素反
応を起こしにくいと考えられる。その結果、用いる界面
活性剤が共役脱水素酵素反応を選択的に阻害できると考
えられる。この根拠として、界面活性剤として非イオン
系界面活性剤を用いても共役脱水素酵素反応を阻害しに
くいことからも支持される。
【００５５】次に、本発明の特定物質の測定方法につい
て説明する。一般に、試料中の特定物質からアンモニア
を発生させて、そのアンモニアを測定することにより、
該特定物質を定量する方法として、発生したアンモニア
に、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）およびＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの存在下にＧＬＤＨを作用させて、反応式
（ｊ）
て説明する。一般に、試料中の特定物質からアンモニア
を発生させて、そのアンモニアを測定することにより、
該特定物質を定量する方法として、発生したアンモニア
に、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）およびＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの存在下にＧＬＤＨを作用させて、反応式
（ｊ）
【化８】 における反応Ａで示されるＧＬＤＨ反応を起こさせ、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量を、波長３４０ｎｍの吸光度の減
少速度として測定することにより、特定物質を定量する
方法が知られている。
ＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量を、波長３４０ｎｍの吸光度の減
少速度として測定することにより、特定物質を定量する
方法が知られている。
【００５６】上記反応式（ｊ）において、共役脱水素酵
素としてＧ６ＰＤＨを用いた場合には、反応式（ｊ）
は、下記の反応式（ｊ−１）
素としてＧ６ＰＤＨを用いた場合には、反応式（ｊ）
は、下記の反応式（ｊ−１）
【化９】 で表され、共役脱水素酵素として６−ＰＧＤＨを用いた
場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−２）
場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−２）
【化１０】 で表される。
【００５７】また、共役脱水素酵素としてＦＣＤＨを用
いた場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−
３）
いた場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−
３）
【化１１】 で表される。
【００５８】しかし、この方法においては、試料中にア
ンモニアが最初から存在する場合には、予めこのアンモ
ニアを消去しておかなければ、正確に特定物質を測定す
ることができない。そこで、前処理として、上記反応式
（ｊ）における反応ＡのＧＬＤＨ反応を適用し、試料中
に最初から存在するアンモニアを消去すればよい。そし
て、このＧＬＤＨ反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ →
ＮＡＤ（Ｐ）+の変換を伴うため、ＮＡＤ（Ｐ）+ → Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応を行えば、少量のＮＡＤ（Ｐ）
Ｈの使用量で効率よくアンモニアを消去することができ
る。この際、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを多量に使用すると、最初
から存在するアンモニアを消去した後で特定物質を測定
する際に、波長３４０ｎｍ［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量を
測定する波長］での反応液の吸光度が大きくなりすぎ
て、特定物質の測定ができなくなるおそれがある。
ンモニアが最初から存在する場合には、予めこのアンモ
ニアを消去しておかなければ、正確に特定物質を測定す
ることができない。そこで、前処理として、上記反応式
（ｊ）における反応ＡのＧＬＤＨ反応を適用し、試料中
に最初から存在するアンモニアを消去すればよい。そし
て、このＧＬＤＨ反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ →
ＮＡＤ（Ｐ）+の変換を伴うため、ＮＡＤ（Ｐ）+ → Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応を行えば、少量のＮＡＤ（Ｐ）
Ｈの使用量で効率よくアンモニアを消去することができ
る。この際、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを多量に使用すると、最初
から存在するアンモニアを消去した後で特定物質を測定
する際に、波長３４０ｎｍ［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量を
測定する波長］での反応液の吸光度が大きくなりすぎ
て、特定物質の測定ができなくなるおそれがある。
【００５９】本発明においては、ＮＡＤ（Ｐ）+ → Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応は、前記反応式（ｊ）における
反応Ｂで示されるように、共役脱水素酵素とその基質を
作用させることにより誘起される。具体的には、上記再
生反応は、反応式（ｊ−１）における反応Ｂで示される
ように、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）とＧ６ＰＤ
Ｈを作用させることにより誘起され、また、反応式（ｊ
−２）における反応Ｂで示されるように、６−ホスホグ
ルコン酸（６−ＰＧ）と６−ＰＧＤＨを作用させること
により誘起される。さらに、反応式（ｊ−３）における
反応Ｂで示されるように、Ｌ−フコース（ＦＣ）とＦＣ
ＤＨを作用させることにより誘起される。
ＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応は、前記反応式（ｊ）における
反応Ｂで示されるように、共役脱水素酵素とその基質を
作用させることにより誘起される。具体的には、上記再
生反応は、反応式（ｊ−１）における反応Ｂで示される
ように、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）とＧ６ＰＤ
Ｈを作用させることにより誘起され、また、反応式（ｊ
−２）における反応Ｂで示されるように、６−ホスホグ
ルコン酸（６−ＰＧ）と６−ＰＧＤＨを作用させること
により誘起される。さらに、反応式（ｊ−３）における
反応Ｂで示されるように、Ｌ−フコース（ＦＣ）とＦＣ
ＤＨを作用させることにより誘起される。
【００６０】このようにして、試料中に最初から存在す
るアンモニアを消去した後で、特定物質からアンモニア
を発生させて、該特定物質を定量するが、その際に、測
定系内に共役脱水素酵素およびその基質が存在すると、
特定物質から発生したアンモニアにより、ＮＡＤ（Ｐ）
ＨがＮＡＤ（Ｐ）+に変換しても、共役脱水素酵素反応
によってＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈが再生され
るため、特定物質由来のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量を正確
に測定することができない。そこで、本発明では、共役
脱水素酵素に界面活性剤を作用させて、共役脱水素酵素
反応を停止することにより、前記反応式（ｊ）における
反応Ｂが起こらず、その結果、ＮＡＤ（Ｐ）+はＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換されないため、反応系のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の変化量は、特定物質から発生するアンモニアのみに依
存し、特定物質を正確に定量することができる。
るアンモニアを消去した後で、特定物質からアンモニア
を発生させて、該特定物質を定量するが、その際に、測
定系内に共役脱水素酵素およびその基質が存在すると、
特定物質から発生したアンモニアにより、ＮＡＤ（Ｐ）
ＨがＮＡＤ（Ｐ）+に変換しても、共役脱水素酵素反応
によってＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈが再生され
るため、特定物質由来のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量を正確
に測定することができない。そこで、本発明では、共役
脱水素酵素に界面活性剤を作用させて、共役脱水素酵素
反応を停止することにより、前記反応式（ｊ）における
反応Ｂが起こらず、その結果、ＮＡＤ（Ｐ）+はＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換されないため、反応系のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の変化量は、特定物質から発生するアンモニアのみに依
存し、特定物質を正確に定量することができる。
【００６１】このような試料中の特定物質を定量する具
体的な方法としては、まず、ＧＬＤＨ、α−ケトグルタ
ル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およ
びこの共役脱水素酵素の基質を第一試薬、並びに特定物
質からアンモニアを発生させる成分および該共役脱水素
酵素の反応を阻害する界面活性剤を含有する第二試薬を
調製する。なお第二試薬には、所望により、α−ＫＧ、
ＧＬＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）+などのアンモニアを測定する
ための成分を加えてもよい。また、第一試薬、第二試薬
はアルブミン、金属イオン、糖類などを併存させて液状
試薬として保存してもよい。
体的な方法としては、まず、ＧＬＤＨ、α−ケトグルタ
ル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およ
びこの共役脱水素酵素の基質を第一試薬、並びに特定物
質からアンモニアを発生させる成分および該共役脱水素
酵素の反応を阻害する界面活性剤を含有する第二試薬を
調製する。なお第二試薬には、所望により、α−ＫＧ、
ＧＬＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）+などのアンモニアを測定する
ための成分を加えてもよい。また、第一試薬、第二試薬
はアルブミン、金属イオン、糖類などを併存させて液状
試薬として保存してもよい。
【００６２】次に試料に、上記第一試薬を加えて、試料
中に予め存在するアンモニアを消去したのち、これに第
二試薬を加え、共役脱水素酵素反応を停止させるととも
に、特定物質からアンモニアを発生させ、このアンモニ
アを測定することにより、特定物質を定量するといった
方法を用いることができる。なお、第二試薬を加える代
わりに、界面活性剤のみを添加して共役脱水素酵素反応
を停止させた後で、特定物質からアンモニアを発生させ
る成分を添加してもよい。
中に予め存在するアンモニアを消去したのち、これに第
二試薬を加え、共役脱水素酵素反応を停止させるととも
に、特定物質からアンモニアを発生させ、このアンモニ
アを測定することにより、特定物質を定量するといった
方法を用いることができる。なお、第二試薬を加える代
わりに、界面活性剤のみを添加して共役脱水素酵素反応
を停止させた後で、特定物質からアンモニアを発生させ
る成分を添加してもよい。
【００６３】前記特定物質の測定方法および試薬におい
て、共役脱水素酵素およびその基質として、Ｇ６ＰＤＨ
とグルコース−６−リン酸を用いた場合には、前述のよ
うに界面活性剤として、カチオン系界面活性剤（Ｇ６Ｐ
ＤＨが細菌由来の場合）またはアニオン系界面活性剤
（Ｇ６ＰＤＨが酵母由来の場合）が好ましく用いられ、
一方、６−ＰＧＤＨと６−ホスホグルコン酸を用いた場
合には、前述のように界面活性剤として、カチオン系界
面活性剤が好ましく用いられる。また、ＦＣＤＨとＬ−
フコースを用いた場合には、前述のように界面活性剤と
して、カチオン系界面活性剤が好ましく用いられる。
て、共役脱水素酵素およびその基質として、Ｇ６ＰＤＨ
とグルコース−６−リン酸を用いた場合には、前述のよ
うに界面活性剤として、カチオン系界面活性剤（Ｇ６Ｐ
ＤＨが細菌由来の場合）またはアニオン系界面活性剤
（Ｇ６ＰＤＨが酵母由来の場合）が好ましく用いられ、
一方、６−ＰＧＤＨと６−ホスホグルコン酸を用いた場
合には、前述のように界面活性剤として、カチオン系界
面活性剤が好ましく用いられる。また、ＦＣＤＨとＬ−
フコースを用いた場合には、前述のように界面活性剤と
して、カチオン系界面活性剤が好ましく用いられる。
【００６４】本発明はまた、特定物質測定用のキットを
も提供するものであり、このキットは、前記第一試薬お
よび第二試薬を必須試薬として構成されている。前記試
料中のアンモニアを発生しうる特定物質の定量方法にお
いて、特定物質からアンモニアを発生させる方法として
は、通常酵素反応を利用する方法が用いられる。その例
として、下記の特定物質について説明する。
も提供するものであり、このキットは、前記第一試薬お
よび第二試薬を必須試薬として構成されている。前記試
料中のアンモニアを発生しうる特定物質の定量方法にお
いて、特定物質からアンモニアを発生させる方法として
は、通常酵素反応を利用する方法が用いられる。その例
として、下記の特定物質について説明する。
【００６５】（１）尿素 前述のように、ウレアーゼを作用させ、加水分解するこ
とにより、アンモニアが生成する。尿素を測定する際、
チオグリセロールなどのＳＨ基含有化合物をウレアーゼ
と共に併用すると、ウレアーゼの活性が調整され好まし
い。
とにより、アンモニアが生成する。尿素を測定する際、
チオグリセロールなどのＳＨ基含有化合物をウレアーゼ
と共に併用すると、ウレアーゼの活性が調整され好まし
い。
【００６６】（２）クレアチン
【化１２】 クレアチンは、まずクレアチナーゼを作用させ、加水分
解してザルコシンと尿素を得、次いで尿素をウレアーゼ
で加水分解すれば、アンモニアが生成する。
解してザルコシンと尿素を得、次いで尿素をウレアーゼ
で加水分解すれば、アンモニアが生成する。
【００６７】（３）クレアチニン
【化１３】 クレアチニンは、クレアチニンデイミナーゼを作用させ
て、加水分解することによりアンモニアが生成する。ま
た、下記のように、クレアチニナーゼで加水分解してク
レアチンに誘導したのち、上記（２）と同様な操作によ
り、アンモニアが生成する。
て、加水分解することによりアンモニアが生成する。ま
た、下記のように、クレアチニナーゼで加水分解してク
レアチンに誘導したのち、上記（２）と同様な操作によ
り、アンモニアが生成する。
【００６８】
【化１４】 （４）ロイシンアミノペプチダーゼ
【化１５】 ロイシンアミノペプチダーゼは、Ｌ−ロイシンアミドに
作用してアンモニアを発生する。
作用してアンモニアを発生する。
【００６９】（５）Ｃａ2+
【化１６】 Ｃａ2+はａｐｏ−トランスグルタミナーゼに作用してｈ
ｏｌｏ−トランスグルタミナーゼに変換し、このものは
Ｚ−グルタミン（Ｚ−Ｇｌｎ）を加水分解して、Ｚ−グ
ルタミン酸（Ｚ−Ｇｌｕ）とアンモニアを生成する。
ｏｌｏ−トランスグルタミナーゼに変換し、このものは
Ｚ−グルタミン（Ｚ−Ｇｌｎ）を加水分解して、Ｚ−グ
ルタミン酸（Ｚ−Ｇｌｕ）とアンモニアを生成する。
【００７０】本発明の試料中の特定物質を定量する方法
は、上記特定物質の中で、特に尿素窒素を定量するのに
適している。また、この定量方法においては、共役脱水
素酵素反応を停止するために用いる界面活性剤として
は、共役脱水素酵素の活性を実質上阻害するが、ＧＬＤ
Ｈおよび特定物質からアンモニアを生成するのに関与す
る酵素の活性を実質上阻害しないものを選択して使用す
ることが肝要である。
は、上記特定物質の中で、特に尿素窒素を定量するのに
適している。また、この定量方法においては、共役脱水
素酵素反応を停止するために用いる界面活性剤として
は、共役脱水素酵素の活性を実質上阻害するが、ＧＬＤ
Ｈおよび特定物質からアンモニアを生成するのに関与す
る酵素の活性を実質上阻害しないものを選択して使用す
ることが肝要である。
【００７１】本発明は以下のような特徴を有する。
【００７２】（１）試料中にアンモニアが多量にあって
も、共役脱水素酵素反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈに変換しやすく、さらに、界面活性剤が共役
脱水素酵素反応を速やかに停止するので、そのアンモニ
アを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、
その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことがで
きる。
も、共役脱水素酵素反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈに変換しやすく、さらに、界面活性剤が共役
脱水素酵素反応を速やかに停止するので、そのアンモニ
アを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、
その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことがで
きる。
【００７３】例えば共役脱水素酵素として、Ｇ６ＰＤＨ
を使用する場合、このＧ６ＰＤＨは、Ｋmが３．５×１
０-5モル／リットル（グルコース−６−リン酸）、４．
２×１０-6モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と小さいの
で、Ｇ６ＰＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤また
はアニオン系界面活性剤がＧ６ＰＤＨ反応を速やかに停
止する。したがって、試料中に最初から存在するアンモ
ニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去で
き、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うこと
ができる。
を使用する場合、このＧ６ＰＤＨは、Ｋmが３．５×１
０-5モル／リットル（グルコース−６−リン酸）、４．
２×１０-6モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と小さいの
で、Ｇ６ＰＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤また
はアニオン系界面活性剤がＧ６ＰＤＨ反応を速やかに停
止する。したがって、試料中に最初から存在するアンモ
ニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去で
き、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うこと
ができる。
【００７４】また、共役脱水素酵素として、６−ＰＧＤ
Ｈを使用する場合、６−ＰＧＤＨは、Ｋmが５．４×１
０-5モル／リットル（６−ホスホグルコン酸）、２．０
×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と小さいので、
６−ＰＧＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤が６
−ＰＧＤＨ反応を速やかに停止する。したがって、試料
中に最初から存在するアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物
質の測定を正確に行うことができる。
Ｈを使用する場合、６−ＰＧＤＨは、Ｋmが５．４×１
０-5モル／リットル（６−ホスホグルコン酸）、２．０
×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と小さいので、
６−ＰＧＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤が６
−ＰＧＤＨ反応を速やかに停止する。したがって、試料
中に最初から存在するアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物
質の測定を正確に行うことができる。
【００７５】さらに、共役脱水素酵素として、ＦＣＤＨ
を使用する場合、ＦＣＤＨは、Ｋmが１．９×１０-3モ
ル／リットル（Ｌ−フコース）、１．６×１０-5モル／
リットル（ＮＡＤＰ+）と比較的小さいので、ＦＣＤＨ
反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換し
やすい上、カチオン系界面活性剤がＦＣＤＨ反応を速や
かに停止する。したがって、試料中に最初から存在する
アンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消
去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行う
ことができる。
を使用する場合、ＦＣＤＨは、Ｋmが１．９×１０-3モ
ル／リットル（Ｌ−フコース）、１．６×１０-5モル／
リットル（ＮＡＤＰ+）と比較的小さいので、ＦＣＤＨ
反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換し
やすい上、カチオン系界面活性剤がＦＣＤＨ反応を速や
かに停止する。したがって、試料中に最初から存在する
アンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消
去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行う
ことができる。
【００７６】（２）特定物質測定系がＡＴＰを生成する
反応系である場合でも、測定原理上、特に不都合が生じ
ない。 （３）特定物質測定系が、金属要求性酵素を含んでいて
も、特に不都合が生じない。
反応系である場合でも、測定原理上、特に不都合が生じ
ない。 （３）特定物質測定系が、金属要求性酵素を含んでいて
も、特に不都合が生じない。
【００７７】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定さ
れるものではない。
明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定さ
れるものではない。
【００７８】実施例１ 以下のように試料および試薬を調製した。 試料：細菌由来のＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても、同様に調製した。
薬についても、同様に調製した。
【００７９】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、Ｇ６Ｐ
ＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、Ｇ６Ｐ
ＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８０】実施例２ 以下のようにして試料および試薬を調製した。 試料：ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 塩化アンモニウム ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
薬についても同様に調製した。
【００８１】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤ
Ｈ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤ
Ｈ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８２】実施例３ 以下のようにして試料および試薬を調製した。 試料：ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水
溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 尿素 ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 尿素 ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
【００８３】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレア
ーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレア
ーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８４】比較例１ 実施例１における第二試薬において、カチオン系界面活
性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍ
Ｍ用いた以外は、実施例１と同様にして実施した。結果
を表１に示す。
性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍ
Ｍ用いた以外は、実施例１と同様にして実施した。結果
を表１に示す。
【００８５】比較例２ 実施例２における第二試薬において、カチオン系界面活
性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍ
Ｍ用いた以外は、実施例２と同様にして実施した。結果
を表１に示す。
性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍ
Ｍ用いた以外は、実施例２と同様にして実施した。結果
を表１に示す。
【００８６】比較例３ 実施例３における第二試薬において、カチオン系界面活
性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍ
Ｍ用いた以外は、実施例３と同様にして実施した。結果
を表１に示す。
性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍ
Ｍ用いた以外は、実施例３と同様にして実施した。結果
を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】表１の結果から、Ｇ６ＰＤＨ（細菌由来）
活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害される
が、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素である
ＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、Ｇ６ＰＤＨに比してあ
まり阻害させず、高い残存活性を示すことが分かる。ま
た、ＡＴＰまたはＡＤＰは、Ｇ６ＰＤＨの阻害剤として
不適当であることが分かる。
活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害される
が、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素である
ＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、Ｇ６ＰＤＨに比してあ
まり阻害させず、高い残存活性を示すことが分かる。ま
た、ＡＴＰまたはＡＤＰは、Ｇ６ＰＤＨの阻害剤として
不適当であることが分かる。
【００８９】以上の結果から、細菌由来のＧ６ＰＤＨに
よりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保
持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆され
た。
よりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保
持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆され
た。
【００９０】以下に、細菌由来のＧ６ＰＤＨを試薬とし
て用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における
尿素窒素測定を例に挙げ、本発明の効果を具体的に説明
する。
て用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における
尿素窒素測定を例に挙げ、本発明の効果を具体的に説明
する。
【００９１】実施例４ 以下のように試料および試薬を調製した。 試料：尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニア
を含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、
アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製し
た。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそ
れぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであ
り、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、
それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
を含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、
アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製し
た。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそ
れぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであ
り、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、
それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
【００９２】 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ Ｇ６ＰＤＨ（細菌由来） ３Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ チオグリセロール ４００ｍＭ 上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μ
ｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５
μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度
変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成し
ておいた検量線より求めた。なお、吸光度測定は、日立
７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表２
に示す。
ｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５
μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度
変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成し
ておいた検量線より求めた。なお、吸光度測定は、日立
７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表２
に示す。
【００９３】
【表２】
【００９４】表２の結果から分かるように、第一試薬を
添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消
去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、Ｇ６ＰＤＨの
働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、
第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒
素を測定することが可能となった。この際、本発明の効
果でＧ６ＰＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するア
ンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反
応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消
去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、Ｇ６ＰＤＨの
働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、
第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒
素を測定することが可能となった。この際、本発明の効
果でＧ６ＰＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するア
ンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反
応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【００９５】実施例５ 血清を試料とし、実施例４に準拠した方法（本発明に係
る方法）で尿素窒素を測定するとともに、従来のＩＣＤ
Ｈ法により尿素窒素を測定した。なお、ＩＣＤＨ法は、
ニットーボーメディカル（株） Ｎ−アッセイ ＢＵＮ
−Ｌ（Ｄタイプ）を用いた。その結果を図１に示す。横
軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸
は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄ
ｌ）である。図１から分かるように、本発明に係る方法
は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
る方法）で尿素窒素を測定するとともに、従来のＩＣＤ
Ｈ法により尿素窒素を測定した。なお、ＩＣＤＨ法は、
ニットーボーメディカル（株） Ｎ−アッセイ ＢＵＮ
−Ｌ（Ｄタイプ）を用いた。その結果を図１に示す。横
軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸
は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄ
ｌ）である。図１から分かるように、本発明に係る方法
は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【００９６】実施例６ 以下のように試料および試薬を調製した。 試料：酵母由来のＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ １−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても、同様に調製した。
薬についても、同様に調製した。
【００９７】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、Ｇ６Ｐ
ＤＨ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、Ｇ６Ｐ
ＤＨ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【００９８】実施例７ 以下のようにして試料および試薬を調製した。 試料：ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 塩化アンモニウム ３ｍＭ １−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
薬についても同様に調製した。
【００９９】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤ
Ｈ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤ
Ｈ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【０１００】実施例８ 以下のようにして試料および試薬を調製した。 試料：ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水
溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 尿素 ３ｍＭ １−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 尿素 ３ｍＭ １−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
【０１０１】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレア
ーゼ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレア
ーゼ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【０１０２】比較例４ 実施例６における第二試薬において、１−デカンスルホ
ン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれ
ぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例６と同様にして実施
した。結果を表３に示す。
ン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれ
ぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例６と同様にして実施
した。結果を表３に示す。
【０１０３】比較例５ 実施例７における第二試薬において、１−デカンスルホ
ン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれ
ぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例７と同様にして実施
した。結果を表３に示す。
ン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれ
ぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例７と同様にして実施
した。結果を表３に示す。
【０１０４】比較例６ 実施例８における第二試薬において、１−デカンスルホ
ン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれ
ぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例８と同様にして実施
した。結果を表３に示す。
ン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれ
ぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例８と同様にして実施
した。結果を表３に示す。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】表３の結果から、特に酵母由来のＧ６ＰＤ
Ｈ活性は、アニオン系界面活性剤により大きく阻害され
るが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であ
るＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、Ｇ６ＰＤＨに比して
あまり阻害させず、高い残存活性を示すことがわかる。
Ｈ活性は、アニオン系界面活性剤により大きく阻害され
るが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であ
るＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、Ｇ６ＰＤＨに比して
あまり阻害させず、高い残存活性を示すことがわかる。
【０１０７】一方、阻害剤としてＡＴＰまたはＡＤＰを
使用した場合、ＧＬＤＨの活性およびウレアーゼの活性
を阻害しないだけでなくＧ６ＰＤＨの活性をも阻害しな
いことがわかる。この事実により、酵母由来のＧ６ＰＤ
Ｈにより、ＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベ
ルに保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆
された。
使用した場合、ＧＬＤＨの活性およびウレアーゼの活性
を阻害しないだけでなくＧ６ＰＤＨの活性をも阻害しな
いことがわかる。この事実により、酵母由来のＧ６ＰＤ
Ｈにより、ＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベ
ルに保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆
された。
【０１０８】以下に、酵母由来のＧ６ＰＤＨを試薬とし
て用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における
尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明
する。
て用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における
尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明
する。
【０１０９】実施例９ 以下のように試料および試薬を調製した。 試料：尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニア
を含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、
アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製し
た。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそ
れぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであ
り、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、
それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ Ｇ６ＰＤＨ（酵母由来） ３Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ １−デカンスルホン酸ナトリウム １５ｍｇ／ｍｌ チオグリセロール ４００ｍＭ 上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μ
ｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５
μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度
変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成し
ておいた検量線より求めた。なお、吸光度測定は、日立
７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表４
に示す。
を含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、
アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製し
た。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそ
れぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであ
り、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、
それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ Ｇ６ＰＤＨ（酵母由来） ３Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ １−デカンスルホン酸ナトリウム １５ｍｇ／ｍｌ チオグリセロール ４００ｍＭ 上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μ
ｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５
μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度
変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成し
ておいた検量線より求めた。なお、吸光度測定は、日立
７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表４
に示す。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】表４の結果から分かるように、第一試薬を
添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消
去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、Ｇ６ＰＤＨの
働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、
第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒
素を測定することが可能となった。この際、本発明の効
果でＧ６ＰＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するア
ンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反
応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消
去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、Ｇ６ＰＤＨの
働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、
第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒
素を測定することが可能となった。この際、本発明の効
果でＧ６ＰＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するア
ンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反
応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【０１１２】実施例１０ 血清を試料とし、実施例９に準拠した方法（本発明に係
る方法）で尿素窒素を測定するとともに、市販のイソク
エン酸脱水素酵素法（ニットーボーメディカル株式会社
より販売されているＮ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ Ｄタイ
プを使用）で尿素窒素を測定した。その結果を図２に示
す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄ
ｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度
（ｍｇ／ｄｌ）である。図２から分かるように、本発明
に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められ
た。
る方法）で尿素窒素を測定するとともに、市販のイソク
エン酸脱水素酵素法（ニットーボーメディカル株式会社
より販売されているＮ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ Ｄタイ
プを使用）で尿素窒素を測定した。その結果を図２に示
す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄ
ｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度
（ｍｇ／ｄｌ）である。図２から分かるように、本発明
に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められ
た。
【０１１３】実施例１１ 以下のように試料および試薬を調製した。 試料：酵母由来の６−ＰＧＤＨをそれぞれ１Ｕ／ｍｌ含
む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ６−ホスホグルコン酸 ２０ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても、同様に調製した。
む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ６−ホスホグルコン酸 ２０ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても、同様に調製した。
【０１１４】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、６−Ｐ
ＧＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸
光度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示
す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、６−Ｐ
ＧＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸
光度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示
す。
【０１１５】実施例１２ 以下のようにして試料および試薬を調製した。 試料：ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 塩化アンモニウム ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
薬についても同様に調製した。
【０１１６】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤ
Ｈ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤ
Ｈ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
【０１１７】実施例１３ 以下のようにして試料および試薬を調製した。 試料：ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水
溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 尿素 ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 尿素 ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
【０１１８】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレア
ーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレア
ーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
【０１１９】比較例７ 実施例１１における第二試薬において、カチオン系界面
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１１と同様にして実施した。
結果を表５に示す。
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１１と同様にして実施した。
結果を表５に示す。
【０１２０】比較例８ 実施例１２における第二試薬において、カチオン系界面
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１２と同様にして実施した。
結果を表５に示す。
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１２と同様にして実施した。
結果を表５に示す。
【０１２１】比較例９ 実施例１３における第二試薬において、カチオン系界面
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１３と同様にして実施した。
結果を表５に示す。
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１３と同様にして実施した。
結果を表５に示す。
【０１２２】
【表５】
【０１２３】表５の結果から、６−ＰＧＤＨ（酵母由
来）活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害さ
れるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素で
あるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、６−ＰＧＤＨに比
してあまり阻害されず、高い残存活性を示すことが分か
る。また、ＡＴＰまたはＡＤＰは、６−ＰＧＤＨの阻害
剤として不適当であることが分かる。
来）活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害さ
れるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素で
あるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、６−ＰＧＤＨに比
してあまり阻害されず、高い残存活性を示すことが分か
る。また、ＡＴＰまたはＡＤＰは、６−ＰＧＤＨの阻害
剤として不適当であることが分かる。
【０１２４】以上の結果から、酵母由来の６−ＰＧＤＨ
によりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに
保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆され
た。
によりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに
保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆され
た。
【０１２５】以下に、酵母由来の６−ＰＧＤＨを試薬と
して用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合におけ
る尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説
明する。
して用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合におけ
る尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説
明する。
【０１２６】実施例１４ 以下のように試料および試薬を調製した。 試料：尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニア
を含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、
アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製し
た。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそ
れぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであ
り、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、
それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
を含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、
アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製し
た。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそ
れぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであ
り、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、
それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
【０１２７】 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ ６−ホスホグルコン酸 ２０ｍＭ ６−ＰＧＤＨ（酵母由来） ３Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ チオグリセロール ４００ｍＭ 上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μ
ｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５
μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度
変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成し
ておいた検量線より求めた。なお、これらの測定は、日
立７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表
６に示す。
ｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５
μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度
変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成し
ておいた検量線より求めた。なお、これらの測定は、日
立７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表
６に示す。
【０１２８】
【表６】
【０１２９】表６の結果から分かるように、第一試薬を
添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消
去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、６−ＰＧＤＨ
の働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消さ
れ、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿
素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明
の効果で６−ＰＧＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成
するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への
変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られ
た。
添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消
去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、６−ＰＧＤＨ
の働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消さ
れ、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿
素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明
の効果で６−ＰＧＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成
するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への
変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られ
た。
【０１３０】実施例１５ 血清を試料とし、実施例１４に準拠した方法（本発明に
係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、６−ＰＧＤ
Ｈを組込まない市販のイソクエン酸脱水素酵素法（ニッ
トーボーメディカル（株）より販売されているＮ−アッ
セイ ＢＵＮ−Ｌ Ｄタイプを使用）で尿素窒素を測定
した。その結果を図３に示す。横軸は従来法による尿素
窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法に
よる尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。図３から分
かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意
な相関図が認められた。
係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、６−ＰＧＤ
Ｈを組込まない市販のイソクエン酸脱水素酵素法（ニッ
トーボーメディカル（株）より販売されているＮ−アッ
セイ ＢＵＮ−Ｌ Ｄタイプを使用）で尿素窒素を測定
した。その結果を図３に示す。横軸は従来法による尿素
窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法に
よる尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。図３から分
かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意
な相関図が認められた。
【０１３１】実施例１６ 以下のように試料および試薬を調製した。 試料：細菌由来のＦＣＤＨ（Ｌ−フコース脱水素酵素）
を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ Ｌ−フコース ２０ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても、同様に調製した。
を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ Ｌ−フコース ２０ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても、同様に調製した。
【０１３２】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＦＣＤ
Ｈ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＦＣＤ
Ｈ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３３】実施例１７ 以下のようにして試料および試薬を調製した。 試料：ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 塩化アンモニウム ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
薬についても同様に調製した。
【０１３４】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤ
Ｈ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤ
Ｈ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度
変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３５】実施例１８ 以下のようにして試料および試薬を調製した。 試料：ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水
溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 尿素 ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
溶液。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ 尿素 ３ｍＭ 各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試
薬についても同様に調製した。
【０１３６】試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレア
ーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、
３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で
１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレア
ーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光
度変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３７】比較例１０ 実施例１６における第二試薬において、カチオン系界面
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１６と同様にして実施した。
結果を表７に示す。
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１６と同様にして実施した。
結果を表７に示す。
【０１３８】比較例１１ 実施例１７における第二試薬において、カチオン系界面
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１７と同様にして実施した。
結果を表７に示す。
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１７と同様にして実施した。
結果を表７に示す。
【０１３９】比較例１２ 実施例１８における第二試薬において、カチオン系界面
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１８と同様にして実施した。
結果を表７に示す。
活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０
ｍＭ用いた以外は、実施例１８と同様にして実施した。
結果を表７に示す。
【０１４０】
【表７】
【０１４１】表７の結果から、ＦＣＤＨ（細菌由来）活
性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害される
が、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素である
ＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、ＦＣＤＨに比してあま
り阻害されず、高い残存活性を示すことが分かる。ま
た、ＡＴＰおよびＡＤＰは、ＦＣＤＨの阻害剤として不
適当であることが分かる。以上の結果から、細菌由来の
ＦＣＤＨによりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期
レベルに保持した状態で測定反応を行い得ることが強く
示唆された。
性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害される
が、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素である
ＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、ＦＣＤＨに比してあま
り阻害されず、高い残存活性を示すことが分かる。ま
た、ＡＴＰおよびＡＤＰは、ＦＣＤＨの阻害剤として不
適当であることが分かる。以上の結果から、細菌由来の
ＦＣＤＨによりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期
レベルに保持した状態で測定反応を行い得ることが強く
示唆された。
【０１４２】以下に、細菌由来のＦＣＤＨを試薬として
用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿
素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明す
る。
用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿
素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明す
る。
【０１４３】実施例１９ 以下のように試料および試薬を調製した。 試料：試料として実施例４で調製したＡ0〜Ａ5と同じも
のを用いた。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ Ｌ−フコース ２０ｍＭ ＦＣＤＨ（細菌由来） ３Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ チオグリセロール ４００ｍＭ 上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μ
ｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５
μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度
変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成し
ておいた検量線より求めた。なお、これらの測定は、日
立７１５０型自動分析装置を使用して行った。結果を表
８に示す。
のを用いた。 第一試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ Ｌ−フコース ２０ｍＭ ＦＣＤＨ（細菌由来） ３Ｕ／ｍｌ 第二試薬： トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ α−ＫＧ １０ｍＭ ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ チオグリセロール ４００ｍＭ 上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μ
ｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５
μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度
変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成し
ておいた検量線より求めた。なお、これらの測定は、日
立７１５０型自動分析装置を使用して行った。結果を表
８に示す。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】表８の結果から分かるように、第一試薬を
添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消
去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、ＦＣＤＨの働
きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第
二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素
を測定することが可能となった。この際、本発明の効果
でＦＣＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモ
ニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応の
みが進行するので、正確な測定結果が得られた。
添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消
去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、ＦＣＤＨの働
きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第
二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素
を測定することが可能となった。この際、本発明の効果
でＦＣＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモ
ニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応の
みが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【０１４６】実施例２０ 血清を試料とし、実施例１９に準拠した方法（本発明に
係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、従来のＩＣ
ＤＨ法により尿素窒素を測定した。なお、ＩＣＤＨ法
は、ニットーボーメディカル（株） Ｎ−アッセイ Ｂ
ＵＮ−Ｌ（Ｄタイプ）を用いた。
係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、従来のＩＣ
ＤＨ法により尿素窒素を測定した。なお、ＩＣＤＨ法
は、ニットーボーメディカル（株） Ｎ−アッセイ Ｂ
ＵＮ−Ｌ（Ｄタイプ）を用いた。
【０１４７】その結果を図４に示す。横軸は従来法によ
る尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る
方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。図４
から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極め
て有意な相関図が認められた。
る尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る
方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。図４
から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極め
て有意な相関図が認められた。
【図１】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素とし
てＧ６ＰＤＨ（細菌由来）を用いた本発明の方法と市販
キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図であ
る。
てＧ６ＰＤＨ（細菌由来）を用いた本発明の方法と市販
キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図であ
る。
【図２】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素とし
てＧ６ＰＤＨ（酵母由来）を用いた本発明の方法と市販
キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図であ
る。
てＧ６ＰＤＨ（酵母由来）を用いた本発明の方法と市販
キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図であ
る。
【図３】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素とし
て６−ＰＧＤＨ（酵母由来）を用いた本発明の方法と市
販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図であ
る。
て６−ＰＧＤＨ（酵母由来）を用いた本発明の方法と市
販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図であ
る。
【図４】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素とし
てＦＣＤＨ（細菌由来）を用いた本発明の方法と市販キ
ットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
てＦＣＤＨ（細菌由来）を用いた本発明の方法と市販キ
ットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願平9−83972 (32)優先日 平９(1997)４月２日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ）
Claims (8)
- 【請求項１】 界面活性剤を含むことを特徴とする共役
脱水素酵素反応の停止剤。 - 【請求項２】 共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵
素の基質の作用により、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド酸化型またはニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸酸化型を、それぞれニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸還元型に変換させ、次いで界面活
性剤を作用させることにより、この反応を停止させるこ
とを特徴とする共役脱水素酵素反応の停止方法。 - 【請求項３】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸酸化型が、試料中の特定物質を測定する系におい
て、該試料の前処理により生成したものである請求項２
に記載の共役脱水素酵素反応の停止方法。 - 【請求項４】 界面活性剤が、試料中の特定物質を測定
する系において、共役脱水素酵素を実質上失活させる以
外は、他に実質上影響を及ぼさないものである請求項２
に記載の共役脱水素酵素反応の停止方法。 - 【請求項５】 試料中の特定物質からアンモニアを発生
させ、このアンモニアを測定することにより、該特定物
質を定量する方法において、あらかじめ、試料中に存在
するアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケト
グルタル酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還
元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸還元型、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の
基質の作用により消去し、次いで界面活性剤の作用によ
り共役脱水素酵素反応を停止させ、その作用と同時か後
に、該特定物質からアンモニアを発生させる成分を作用
させ、発生するアンモニアを測定することを特徴とする
特定物質の測定方法。 - 【請求項６】 特定物質が尿素であり、かつ、特定物質
からアンモニアを発生させる成分がウレアーゼである請
求項５に記載の特定物質の測定方法。 - 【請求項７】 特定物質測定用キットであって、（Ａ）
グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型、共役脱水
素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質を含む試薬、並
びに（Ｂ）特定物質からアンモニアを発生させる成分お
よび界面活性剤を含む試薬を必須構成試薬とするキッ
ト。 - 【請求項８】 特定物質が尿素であり、かつ、特定物質
からアンモニアを発生させる成分がウレアーゼである請
求項７に記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33289097A JP3674018B2 (ja) | 1996-12-26 | 1997-12-03 | 共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法および特定物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34790996 | 1996-12-26 | ||
| JP1872697 | 1997-01-31 | ||
| JP4346097 | 1997-02-27 | ||
| JP8397297 | 1997-04-02 | ||
| JP8-347909 | 1997-04-02 | ||
| JP9-18726 | 1997-04-02 | ||
| JP9-43460 | 1997-04-02 | ||
| JP9-83972 | 1997-04-02 | ||
| JP33289097A JP3674018B2 (ja) | 1996-12-26 | 1997-12-03 | 共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法および特定物質の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10327896A true JPH10327896A (ja) | 1998-12-15 |
| JP3674018B2 JP3674018B2 (ja) | 2005-07-20 |
Family
ID=27520070
Family Applications (1)
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| JP33289097A Expired - Fee Related JP3674018B2 (ja) | 1996-12-26 | 1997-12-03 | 共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法および特定物質の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3674018B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002064819A1 (en) * | 2001-02-14 | 2002-08-22 | International Reagents Corporation | Novel assay method |
-
1997
- 1997-12-03 JP JP33289097A patent/JP3674018B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002064819A1 (en) * | 2001-02-14 | 2002-08-22 | International Reagents Corporation | Novel assay method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3674018B2 (ja) | 2005-07-20 |
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