JPS58175488A - シユ−ドモナス属菌からのコレステリンエステラ−ゼの水溶液の安定化法 - Google Patents
シユ−ドモナス属菌からのコレステリンエステラ−ゼの水溶液の安定化法Info
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- JPS58175488A JPS58175488A JP58000568A JP56883A JPS58175488A JP S58175488 A JPS58175488 A JP S58175488A JP 58000568 A JP58000568 A JP 58000568A JP 56883 A JP56883 A JP 56883A JP S58175488 A JPS58175488 A JP S58175488A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、場合によって界面活性剤を含有する水溶液中
のシュードモナス属隋からのコレステリンエステラーゼ
−ヒドロラーゼ（コレステリンエステラーゼ、１．ｃ、
３．１．１．１３）を安定化する方法に関する。
のシュードモナス属隋からのコレステリンエステラーゼ
−ヒドロラーゼ（コレステリンエステラーゼ、１．ｃ、
３．１．１．１３）を安定化する方法に関する。
コレステリンエステラーゼは、コレステリンエステル含
有溶液殊に診断学における血清の酵素的分析用の試薬中
１かなり多く使用されているＯ この際、この酵素は、長鎖状の脂肪酸を有するそのエス
テルからコレステリンを遊離させる作用をし、このコレ
ステリンは、引続き、適当な検出法で通例コレステリン
−オキシダーゼ（１！ｉ１．１．１．３．６．）により
接触される反応の使用上に酵素的に測定される。
有溶液殊に診断学における血清の酵素的分析用の試薬中
１かなり多く使用されているＯ この際、この酵素は、長鎖状の脂肪酸を有するそのエス
テルからコレステリンを遊離させる作用をし、このコレ
ステリンは、引続き、適当な検出法で通例コレステリン
−オキシダーゼ（１！ｉ１．１．１．３．６．）により
接触される反応の使用上に酵素的に測定される。
血清中のこのエステル化されたコレステリンの測定のた
めに、殊に、シュードモナス属菌からのコレステリンエ
ステラーゼは、それがリンぞ−ゼ活性をも有するの〒１
好適〒ある。この特性を有する酵素は、例えば、西ドイ
ツ特許出願公告＠２８１９３８４号明細書に記載されて
いる。この神の酵素は、屡々、反応ノ々ツチ中の試料の
トリグリセリド含分により惹起される濁りを除く（澄明
化する）能力があり、従って例えば光学的測定法におけ
る障害を取除く能力がある０ ＋７ ＩＩ！−セ活性を有するこの種のコレステリンエ
ステラーゼは、遊離するグリセリンを適当な構出反応に
供する際に、試料中のトリグリセリＰの検出のためにも
使用することができる○更に、この棟の酵素は、一般に
、それを用いてはコレステリンエステルもトリグリセリ
ドも測定されないが、測定技術的理由から、試料からの
トリグリセリドによる滴りを除くことが望ましい血清分
析用試薬中１使用１きる。
めに、殊に、シュードモナス属菌からのコレステリンエ
ステラーゼは、それがリンぞ−ゼ活性をも有するの〒１
好適〒ある。この特性を有する酵素は、例えば、西ドイ
ツ特許出願公告＠２８１９３８４号明細書に記載されて
いる。この神の酵素は、屡々、反応ノ々ツチ中の試料の
トリグリセリド含分により惹起される濁りを除く（澄明
化する）能力があり、従って例えば光学的測定法におけ
る障害を取除く能力がある０ ＋７ ＩＩ！−セ活性を有するこの種のコレステリンエ
ステラーゼは、遊離するグリセリンを適当な構出反応に
供する際に、試料中のトリグリセリＰの検出のためにも
使用することができる○更に、この棟の酵素は、一般に
、それを用いてはコレステリンエステルもトリグリセリ
ドも測定されないが、測定技術的理由から、試料からの
トリグリセリドによる滴りを除くことが望ましい血清分
析用試薬中１使用１きる。
ところ〒１コレステリンエステラーゼは、他の成分を含
有しない緩衝媒体中１は、その基質に対して加水分解活
性水さないか又は非常に僅かにのみ加水分解活性を示す
ことが公知１ある。従って、反応混合物に、活性化剤を
添加することが必４Ｉｉ４ある。
有しない緩衝媒体中１は、その基質に対して加水分解活
性水さないか又は非常に僅かにのみ加水分解活性を示す
ことが公知１ある。従って、反応混合物に、活性化剤を
添加することが必４Ｉｉ４ある。
活性化剤としては、多くの界面活性剤（Ｄｅｔθ−ｒｇ
ｅｎｔｉｅｎ）例えば、非イオン性界面活性剤例えばア
ルキル−もしくはアリール−及びアラルキル−アルコー
ル−、ｆｒ ＩＪ ／ ！Ｊコールエーテル〔トリトｙ
Ｘ １００ （？’ｒ１ｔｏｎｘ−１００■）、テサイ
ト（Ｔｈｅｓｉｔ）、ルチンツル（Ｌｕｔｅｎｓｏｌ■
）ＯＲ１４もしくは７０、イントリデシルエーテル〕及
び／又はアニオン性界面活性剤例えば、没食子酸又はそ
の共役物の塩が好適１ある。
ｅｎｔｉｅｎ）例えば、非イオン性界面活性剤例えばア
ルキル−もしくはアリール−及びアラルキル−アルコー
ル−、ｆｒ ＩＪ ／ ！Ｊコールエーテル〔トリトｙ
Ｘ １００ （？’ｒ１ｔｏｎｘ−１００■）、テサイ
ト（Ｔｈｅｓｉｔ）、ルチンツル（Ｌｕｔｅｎｓｏｌ■
）ＯＲ１４もしくは７０、イントリデシルエーテル〕及
び／又はアニオン性界面活性剤例えば、没食子酸又はそ
の共役物の塩が好適１ある。
その活性化作用は、屡々、反応媒体中の筒いイオン濃度
により支えられ、この際、最適イオン＃度は、最も簡単
に、緩衝物質の過肖な配食により得ることができる。
により支えられ、この際、最適イオン＃度は、最も簡単
に、緩衝物質の過肖な配食により得ることができる。
緩衝剤としては、コレステリンエステラーゼの最適活性
の範囲で、大抵はｐＥＩ ｓ〜９で最大作用をするも
のが好適である。特に、コレステリンエステラーゼに関
する文献から明らかなように燐酸塩緩衝液が有利である
。
の範囲で、大抵はｐＥＩ ｓ〜９で最大作用をするも
のが好適である。特に、コレステリンエステラーゼに関
する文献から明らかなように燐酸塩緩衝液が有利である
。
コレステリンエステラーゼとしては、多く、動物又は微
生物起源の酵素が使用され、この際、いずれＣ−せよ異
なる酵素の間で、血清中に生じるコレステリン−脂肪酸
−エステルのルッ） （ｐａｌｅｔｔθ）に対する作用
スペクトルにおケル部分的に著るしいちがいが生じうる
。／９ホウニイ（Ｖａｈｏｕｎ７ ）、ウェアジング（
Ｗｅ＠ｒｓｉｎｇ）及びトレートウｘ ｓｔ （Ｔｒｅ
ａｄｗｅｌｌ） ｉｊ、ムｒｃｈ、 Ｂｉｒｃｈｅｎ。
生物起源の酵素が使用され、この際、いずれＣ−せよ異
なる酵素の間で、血清中に生じるコレステリン−脂肪酸
−エステルのルッ） （ｐａｌｅｔｔθ）に対する作用
スペクトルにおケル部分的に著るしいちがいが生じうる
。／９ホウニイ（Ｖａｈｏｕｎ７ ）、ウェアジング（
Ｗｅ＠ｒｓｉｎｇ）及びトレートウｘ ｓｔ （Ｔｒｅ
ａｄｗｅｌｌ） ｉｊ、ムｒｃｈ、 Ｂｉｒｃｈｅｎ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 １９６４年１０７巻、７〜１５頁
に、酵素活性が脂肪酸エステルの鎖長の種類によっては
充分（：影響されずに残存する膵液からのコレステリン
ニステラーぜを記載しており、Ｚ、 Ｋ１１ｎ、Ｃｈｅ
ｍ、 Ｋｌｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 （１９７４年）１２
！４０３〜４０？頁の記載からは、その加水分解作用が
かなり著るしくコレステリンエステル中の脂肪酸分の性
質に依り決まる微生物源コレステリンエステラーゼが公
知〒ある。
に、酵素活性が脂肪酸エステルの鎖長の種類によっては
充分（：影響されずに残存する膵液からのコレステリン
ニステラーぜを記載しており、Ｚ、 Ｋ１１ｎ、Ｃｈｅ
ｍ、 Ｋｌｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 （１９７４年）１２
！４０３〜４０？頁の記載からは、その加水分解作用が
かなり著るしくコレステリンエステル中の脂肪酸分の性
質に依り決まる微生物源コレステリンエステラーゼが公
知〒ある。
史に、トリグリセリｒを変換できないが又は僅かに低い
速度で変換することの１きるコレステリンエステラーゼ
が存在すル（例えｉｆ Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
速度で変換することの１きるコレステリンエステラーゼ
が存在すル（例えｉｆ Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
ｆ：ｊｈｓｍ、 １９６２年２３７巻、３４６９〜３６
５６頁滲照）。
５６頁滲照）。
シュードモナス属からの前記コレステリンエステラーゼ
は、コレステリンエステル中の脂肪酸分の種類に関して
、非常に広い作用スペクトルを有し、同時にトリグリセ
リドを高速凝で適当な反応条件下に肇換し、従ってはじ
めに挙げた理由からまったく特別にコレステリンエステ
ル及び／又はトリグリセリド含有溶液（例えば血清）を
分析するための試薬の製造に好適↑ある０ この目的のためにこの酵素を使用することは、いずれに
せよ、使用＄４のできた試薬中ｔννち水容液中で充分
に安定！あることが前提ｔあるＯ ところで、シュードモナス属菌からの＃素は、通例、血
清−総コレステリンの測定のための市販の試薬の製造に
使用される純粋な燐酸塩緩衝液中１もなお充分な安定性
を有するが、この燐酸塩緩衝液中に帥記棟類の界面活性
剤即ち例えばトリトンＸ１００又はイントリデシルエー
テルを活性化剤として含有する際には意想外に迅速にそ
の活性を失なうことが判明した。従って、これを直ちに
、実施性及び経費の理由から、充分に、少なくとも他の
起源のコレステリンエステラーゼにおける技術水準に相
応する貯蔵性を必要とする試薬溶液中１使用することは
マきない。
は、コレステリンエステル中の脂肪酸分の種類に関して
、非常に広い作用スペクトルを有し、同時にトリグリセ
リドを高速凝で適当な反応条件下に肇換し、従ってはじ
めに挙げた理由からまったく特別にコレステリンエステ
ル及び／又はトリグリセリド含有溶液（例えば血清）を
分析するための試薬の製造に好適↑ある０ この目的のためにこの酵素を使用することは、いずれに
せよ、使用＄４のできた試薬中ｔννち水容液中で充分
に安定！あることが前提ｔあるＯ ところで、シュードモナス属菌からの＃素は、通例、血
清−総コレステリンの測定のための市販の試薬の製造に
使用される純粋な燐酸塩緩衝液中１もなお充分な安定性
を有するが、この燐酸塩緩衝液中に帥記棟類の界面活性
剤即ち例えばトリトンＸ１００又はイントリデシルエー
テルを活性化剤として含有する際には意想外に迅速にそ
の活性を失なうことが判明した。従って、これを直ちに
、実施性及び経費の理由から、充分に、少なくとも他の
起源のコレステリンエステラーゼにおける技術水準に相
応する貯蔵性を必要とする試薬溶液中１使用することは
マきない。
従って、本発明は、これらの著るしい欠点を除き、それ
を用いて、コレステリンエステラーゼを、使用準備ので
きた試薬中１少なくとも３〜５日の長時間にわたり室温
条件下で着るしい活性消失が確認することは１きない程
度に安定化する方法を得ることを目的としている。この
課題は、本発明化より、殊に界面活性剤の存在下でのシ
ュードモナス属菌からのコレステリンエステラーゼの水
溶液を安定化する方法により解決され、この方法は、酵
素をマグネシウムイオン１０〜２００ｍモル／ｌを含有
し燐酸塩不含の緩衝液中に溶かすことよりなる。
を用いて、コレステリンエステラーゼを、使用準備ので
きた試薬中１少なくとも３〜５日の長時間にわたり室温
条件下で着るしい活性消失が確認することは１きない程
度に安定化する方法を得ることを目的としている。この
課題は、本発明化より、殊に界面活性剤の存在下でのシ
ュードモナス属菌からのコレステリンエステラーゼの水
溶液を安定化する方法により解決され、この方法は、酵
素をマグネシウムイオン１０〜２００ｍモル／ｌを含有
し燐酸塩不含の緩衝液中に溶かすことよりなる。
マグネシウムイオンのｉｌ＆を２５〜１５０ｍモル／ｌ
殊に５Ｏ−Ｚｏｏ罵モル／１に調節スるのが有利である
。
殊に５Ｏ−Ｚｏｏ罵モル／１に調節スるのが有利である
。
緩衝液としては、トリス／トリス・Ｈｅ／。
トリエタノールアミン／トリエタノールアミン・Ｈｏ／
、イミダゾール、ａ］ｇ！ｐｚｓＳＭＯＰＳ及び他の燐
酸塩不含の緩衝液混合物がこれに該当する。トリス緩衝
液を使用するのが有利〒ある。
、イミダゾール、ａ］ｇ！ｐｚｓＳＭＯＰＳ及び他の燐
酸塩不含の緩衝液混合物がこれに該当する。トリス緩衝
液を使用するのが有利〒ある。
この緩衝液のｐＨ値は、５．０〜９．０の間、有利に６
．５〜９．０殊にトリス緩衝液を使用する際には７．５
〜８．５が有利受ある。
．５〜９．０殊にトリス緩衝液を使用する際には７．５
〜８．５が有利受ある。
シュードモナス属菌−酵素における殊に界面活性剤の存
在下−に娠′□ける燐酸塩の不安定化作用は意想外であ
り、コレステリンエステラーゼに関する文献からは推測
できなかった。
在下−に娠′□ける燐酸塩の不安定化作用は意想外であ
り、コレステリンエステラーゼに関する文献からは推測
できなかった。
Ｊ、 Ｂ１１１． Ｏｈｅｍ、 （１９５７年）２２８
巻４４７〜４５７頁には豚膵臓からのコレステリンエス
テラーゼが記載されており、その酵素活性は、酵素活性
化剤としてのタウロコレートを含有する燐酸塩緩衝液中
で測定されている。この酵素の特性に対する燐酸塩緩衝
液の悪影響はこの文献には記載されていない。
巻４４７〜４５７頁には豚膵臓からのコレステリンエス
テラーゼが記載されており、その酵素活性は、酵素活性
化剤としてのタウロコレートを含有する燐酸塩緩衝液中
で測定されている。この酵素の特性に対する燐酸塩緩衝
液の悪影響はこの文献には記載されていない。
更に、多くの文献例えばＢ、 ｉｎ Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ。
Ｃｈｅｍ。
（１９７４年）７５巻、１０７３〜１ｏ７９頁、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ、ムｅｔａ （１９７１年）
２３１巻、１９４〜１９７頁、ムｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅ、ａ。
ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ、ムｅｔａ （１９７１年）
２３１巻、１９４〜１９７頁、ムｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅ、ａ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 （１９６３年３１００巻、３６０〜
３６３頁、Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｍ、 （，１９７４年）
２０巻、４７０〜４７５＊並びＣ二ＢｉＯｃｈｉｍ、
Ｂｉｏ、ｐｈｙｓ。
３６３頁、Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｍ、 （，１９７４年）
２０巻、４７０〜４７５＊並びＣ二ＢｉＯｃｈｉｍ、
Ｂｉｏ、ｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ （１９７５年）３８４巻、１３８〜１４５頁
に、コレステリンエステラーゼの特性５二関する記載が
存在するが、これらすべての文献中では酵素活性を、部
分的に界面活性物質を含有する燐酸塩緩衝液含有溶液中
で測定し、この際、コレステリンエステラーゼに対する
燐酸塩の不安定化作用も、マグネシウム塩の安定化も開
示されてはいない。
に、コレステリンエステラーゼの特性５二関する記載が
存在するが、これらすべての文献中では酵素活性を、部
分的に界面活性物質を含有する燐酸塩緩衝液含有溶液中
で測定し、この際、コレステリンエステラーゼに対する
燐酸塩の不安定化作用も、マグネシウム塩の安定化も開
示されてはいない。
微生物源コレステリンエステラーゼに関する文献にも同
様なことが轟て＃ｉまる。
様なことが轟て＃ｉまる。
最後に、血清−コレステリンの完全酵素的測定のための
試薬中での微生物源コレステリンエステラーゼの使用は
・、Ｚ−Ｋ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、 Ｋ１１ｎ。
試薬中での微生物源コレステリンエステラーゼの使用は
・、Ｚ−Ｋ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、 Ｋ１１ｎ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 （１９７４年）１２巻、４０３〜４
０７頁１：記載されている。この試薬は、界面活性剤と
してのテサイ） （’Ｔｈｅａｉｔ ）と共に比較的高
＃度の燐酸アンモニウム緩衝液を含有し、この際、との
エステラーゼを含有する試薬の良好な安定性に関して％
に言及されている。
０７頁１：記載されている。この試薬は、界面活性剤と
してのテサイ） （’Ｔｈｅａｉｔ ）と共に比較的高
＃度の燐酸アンモニウム緩衝液を含有し、この際、との
エステラーゼを含有する試薬の良好な安定性に関して％
に言及されている。
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐａｅｕｄ−Ｏｍ
Ｏｎａ５１ ｒｌｕｏｒｅｓｚｅｎｇ）からのコレステ
リンニステラーぜの特性Ｆｉ、ムｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１．
Ｏｈａｍ、 （１９７５年）３９巻、１５１１〜１５１
２頁に記載されている。この酵素の活性は０１ｉｎ、
Ｃｈｅｍ、 （１９７４年）２０巻、４７０〜４７５頁
４二記載の方法ｆｆｉ １１１１定され、この際にも試
薬は燐酸塩！緩衝されている。
Ｏｎａ５１ ｒｌｕｏｒｅｓｚｅｎｇ）からのコレステ
リンニステラーぜの特性Ｆｉ、ムｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１．
Ｏｈａｍ、 （１９７５年）３９巻、１５１１〜１５１
２頁に記載されている。この酵素の活性は０１ｉｎ、
Ｃｈｅｍ、 （１９７４年）２０巻、４７０〜４７５頁
４二記載の方法ｆｆｉ １１１１定され、この際にも試
薬は燐酸塩！緩衝されている。
従って、界面活性剤の存在でシュードモナス鴫菌カらの
コレステリンエステラーゼに対スル燐酸塩イオンの不安
定化作用は、公知でなかったの１、この柿のコレステリ
ンエステラーゼの水＠液から燐酸塩イオンを除くことは
考え及ぶこと〒はなかった。同８１＆二、この作用が、
所定の！＃關範囲〒のマグネシウムイオンの添加により
除かれることも予想困離であった。
コレステリンエステラーゼに対スル燐酸塩イオンの不安
定化作用は、公知でなかったの１、この柿のコレステリ
ンエステラーゼの水＠液から燐酸塩イオンを除くことは
考え及ぶこと〒はなかった。同８１＆二、この作用が、
所定の！＃關範囲〒のマグネシウムイオンの添加により
除かれることも予想困離であった。
本発明は、界面活性剤をも含有する溶液中の７ユードモ
ナス属菌からのコレステリンエステラーゼの安定化のた
めに亀要ｔあるが、本発明によＩ）、水溶液中フのこの
酵素の活性を良好に保持することは、界面活性剤を添加
しない場合にも達成することが１きる。
ナス属菌からのコレステリンエステラーゼの安定化のた
めに亀要ｔあるが、本発明によＩ）、水溶液中フのこの
酵素の活性を良好に保持することは、界面活性剤を添加
しない場合にも達成することが１きる。
シュードモナス属菌からのコレステリンエステラーゼは
公知１あ番】、市販されている。これ＃１、既６にシュ
ードモナス属の種々の多くの菌株例工ば、シュードモナ
ス・フルオレッセンス（西ドイツ特許出願公開率２８１
９３８４号明細１＃Ａ参照）又はシュードモナス・８ｐ
、（西ドイツ特許出願公開第２９３３６４６号明＃書参
照）中１発見されている。シュードモナス属ｉ１カラの
すべての試験されたコレステリンエステラーゼ−製剤に
おいて、本発明の方法は、酵素源とＩてどのコレステリ
ンエステラーゼを含有するシュードモナス属菌株を用い
たかとは無関係に、非常に有効１あることが汀された。
公知１あ番】、市販されている。これ＃１、既６にシュ
ードモナス属の種々の多くの菌株例工ば、シュードモナ
ス・フルオレッセンス（西ドイツ特許出願公開率２８１
９３８４号明細１＃Ａ参照）又はシュードモナス・８ｐ
、（西ドイツ特許出願公開第２９３３６４６号明＃書参
照）中１発見されている。シュードモナス属ｉ１カラの
すべての試験されたコレステリンエステラーゼ−製剤に
おいて、本発明の方法は、酵素源とＩてどのコレステリ
ンエステラーゼを含有するシュードモナス属菌株を用い
たかとは無関係に、非常に有効１あることが汀された。
このこトは、シュードモナｘ−ａｐ（ＤＡＭ １２８
０ ）、シュードモナス・フルオレッセンス（ＳＩＧＭ
ＡＫａｔ、 Ｎｒ、 ０２７７０ ）からの市販のコレ
ステリンエステラーゼ及びシュードモナス・ｓｐ（ＤＡ
Ｍ−１２８１）−コレステリンエステラーゼを用いて実
権した実験から明らか〒ある。これらの３ｆｌＩｊ＋の
シュードモナスｌＩ４菌株からのコレステリンエステラ
ーゼは、それぞれ、界面活性剤として、コール酸ナトリ
ウム１０１１１モル及びポリエトキシ脂肪アルコールエ
ーテル０．３ ％を含有スる溶液中！試験した。結果を
添付図面に示す〇第１図は、２５℃で貯蔵の際の活性を
百分率〒示す曲［１’ある。白丸点上の曲線は燐酸カリ
ウム緩衝液０．１モル／ ／ （ｐＨ７，６）中の酵素
溶液に関し、三角点上の曲線はトリスＸＨＯｔ−緩衝液
０．１モル／／（ｐ）Ｉ７．ｏ）中の酵素溶液に関し、
黒丸点上の曲線は、アスノぞラギン酸マグネシウム５０
ｍモル／ｌを含有すするトリスＸＨＯ１０，１モル／／
（ｐＨ７，６）中の酵素溶液に関する。第２図は、各々
シュードモナス・フルオレッセンスからの市販のエステ
ラーゼに関する８１図におけると同様な曲線１ある。第
３図は各々、シュードモナス°ｏｐ（Ｄ８Ｍ ｌ ２
８１ ）からのコレステリンエステラーゼに関する第１
図におけると同様な曲線である。
０ ）、シュードモナス・フルオレッセンス（ＳＩＧＭ
ＡＫａｔ、 Ｎｒ、 ０２７７０ ）からの市販のコレ
ステリンエステラーゼ及びシュードモナス・ｓｐ（ＤＡ
Ｍ−１２８１）−コレステリンエステラーゼを用いて実
権した実験から明らか〒ある。これらの３ｆｌＩｊ＋の
シュードモナスｌＩ４菌株からのコレステリンエステラ
ーゼは、それぞれ、界面活性剤として、コール酸ナトリ
ウム１０１１１モル及びポリエトキシ脂肪アルコールエ
ーテル０．３ ％を含有スる溶液中！試験した。結果を
添付図面に示す〇第１図は、２５℃で貯蔵の際の活性を
百分率〒示す曲［１’ある。白丸点上の曲線は燐酸カリ
ウム緩衝液０．１モル／ ／ （ｐＨ７，６）中の酵素
溶液に関し、三角点上の曲線はトリスＸＨＯｔ−緩衝液
０．１モル／／（ｐ）Ｉ７．ｏ）中の酵素溶液に関し、
黒丸点上の曲線は、アスノぞラギン酸マグネシウム５０
ｍモル／ｌを含有すするトリスＸＨＯ１０，１モル／／
（ｐＨ７，６）中の酵素溶液に関する。第２図は、各々
シュードモナス・フルオレッセンスからの市販のエステ
ラーゼに関する８１図におけると同様な曲線１ある。第
３図は各々、シュードモナス°ｏｐ（Ｄ８Ｍ ｌ ２
８１ ）からのコレステリンエステラーゼに関する第１
図におけると同様な曲線である。
マグネシウムイオンは、そのアニオンが酵素溶液のいず
れの成分にも悪影響を及ぼさない任意のマグネシウム塩
の形で添加することが１きる。無機酸のマグネシウム塩
例えば、塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウムと並ん
〒、特に有機酸例えば脂肪酸、ジカルゼン酸及びアミノ
酸の塩が好適である。アミノ酸のマグネシウム塩殊にア
スパラギン酸マグネシウムが有利〒ある。
れの成分にも悪影響を及ぼさない任意のマグネシウム塩
の形で添加することが１きる。無機酸のマグネシウム塩
例えば、塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウムと並ん
〒、特に有機酸例えば脂肪酸、ジカルゼン酸及びアミノ
酸の塩が好適である。アミノ酸のマグネシウム塩殊にア
スパラギン酸マグネシウムが有利〒ある。
シュードモナス属菌からのコレステリンエステラーゼに
対するマグネシウムイオンの安定化作用は、活性化作用
ではない。これは、外曲活性剤含有溶液中での活性に関
しては、アスパラギン酸マグネシウム又は食塩を四速す
る＃度１添加する際（後者は安定化作用を有しない）に
差がないことから言える。更に、このことは界面活性剤
含有燐酸塩緩衝液中での貯幀により充分に不活性化され
たシュードモナス属菌からのコレステリンエステラーゼ
がマグネシウム塩の後からの添加によっては、燐酸塩緩
衝液中の溶解電限度まフの高濃度〒も、反応性にならな
いことから言える。
対するマグネシウムイオンの安定化作用は、活性化作用
ではない。これは、外曲活性剤含有溶液中での活性に関
しては、アスパラギン酸マグネシウム又は食塩を四速す
る＃度１添加する際（後者は安定化作用を有しない）に
差がないことから言える。更に、このことは界面活性剤
含有燐酸塩緩衝液中での貯幀により充分に不活性化され
たシュードモナス属菌からのコレステリンエステラーゼ
がマグネシウム塩の後からの添加によっては、燐酸塩緩
衝液中の溶解電限度まフの高濃度〒も、反応性にならな
いことから言える。
本発明により、その特性に基づきニス°チル化されたコ
レステリンの測定のために特に好適なシュードモナス属
−からのコレステリンエステ）ラーゼは、水溶液中１、
所望の貯蔵性が得られるようシニ安定化することができ
る。
レステリンの測定のために特に好適なシュードモナス属
−からのコレステリンエステ）ラーゼは、水溶液中１、
所望の貯蔵性が得られるようシニ安定化することができ
る。
本発明（二より得られた改良された安定性を、次の例で
更に明らかにする。この例中次の略字を使用する： （ＨＥ ＝シュードモナス緘醒からのコレステリン
エステラーゼ ＨＥＰＥ８ ＝ｎ−２−とドロキシエチルピペラジン
−ｎ−エタンスルホン酸 トリス ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン インドリデシ＝ポリオキシエチレンイソトリデシルエー
テル 、ニーチャ テサ、イト ＝ポリオキシエチレンドデシルエーテル ＭＯＰＢ ＝３−（ｎ−モルホリノ）プロノｅンス
ルホン酸 トリ）４ｘ１００＝ポリオキシエチレンインオクチルフ
エニルエーテル ルテンノノ層０Ｎ６０＝ポリオキシエチレン脂肪アルも
しく ＦｉＯｌｉ ７０ ヨーヤエーテ。
更に明らかにする。この例中次の略字を使用する： （ＨＥ ＝シュードモナス緘醒からのコレステリン
エステラーゼ ＨＥＰＥ８ ＝ｎ−２−とドロキシエチルピペラジン
−ｎ−エタンスルホン酸 トリス ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン インドリデシ＝ポリオキシエチレンイソトリデシルエー
テル 、ニーチャ テサ、イト ＝ポリオキシエチレンドデシルエーテル ＭＯＰＢ ＝３−（ｎ−モルホリノ）プロノｅンス
ルホン酸 トリ）４ｘ１００＝ポリオキシエチレンインオクチルフ
エニルエーテル ルテンノノ層０Ｎ６０＝ポリオキシエチレン脂肪アルも
しく ＦｉＯｌｉ ７０ ヨーヤエーテ。
例１
ＣＨＦ、の安定性を、２５℃で棟々の緩衝液中でＭｔ２
＋を添加し又は添加しない１試験した。
＋を添加し又は添加しない１試験した。
ｓｉ表は、４種の緩衝液及び２棟の界面活性剤を用い、
！グネシウムを添加せずに得られた結果を示しており、
第２表はＭｙ” ５０ ｍモルを添加した際の相応する
結果を示している。すべての場合に、コレート１０７Ｘ
モル／ｌ及びその都度ρ所定の非イオン性界曲活性剤０
．３チを用いた。
！グネシウムを添加せずに得られた結果を示しており、
第２表はＭｙ” ５０ ｍモルを添加した際の相応する
結果を示している。すべての場合に、コレート１０７Ｘ
モル／ｌ及びその都度ρ所定の非イオン性界曲活性剤０
．３チを用いた。
第 １ 表
第 ２ 表
上記結果は、本発明による燐酸塩不含の緩衝液とマグネ
シウムイオンとの組合せにより安定性が着るしく改良さ
れることを示してし為る。
シウムイオンとの組合せにより安定性が着るしく改良さ
れることを示してし為る。
例２
安定化作用とマグネシウムイオン製置との関係を、２５
℃−ｔ’１ｏｏｌＩ１モルのトリス緩衝液（ｐＨ７，６
）中で試験した。得られた結果を第３衣に示す０界面活
性剤に関しては例１の記載か連用する。
℃−ｔ’１ｏｏｌＩ１モルのトリス緩衝液（ｐＨ７，６
）中で試験した。得られた結果を第３衣に示す０界面活
性剤に関しては例１の記載か連用する。
第 ３ 表
この第３表に記載の結果から、１０ｍモルのＭ１２＋
−濃度で、既に安定性は着るしく高いことが認められる
。
−濃度で、既に安定性は着るしく高いことが認められる
。
例３
例１の記載と同ｔＩ！４二して、神々の緩衝液及び神々
の界面活性剤におけるマグネシウムイオンを添加しない
場合とした場合との０ＨＫ（７）安定性を試験し５た。
の界面活性剤におけるマグネシウムイオンを添加しない
場合とした場合との０ＨＫ（７）安定性を試験し５た。
但し、溶液を４℃に保持した点は、例１とは異なった。
＠４表は、マグネシウム不含の際の安定性、第５表はＭ
、２＋ ５〜５０ＴＩｖを含有する際の安定性を示して
いる。
、２＋ ５〜５０ＴＩｖを含有する際の安定性を示して
いる。
第４表
＠ ５ 表
第５表の価と第２表の値とを比較すると、本発明によＩ
Ｊ１室温における安定性は、冷蔵庫、′＠破におけると
同様に良好ｔあることが判る。
Ｊ１室温における安定性は、冷蔵庫、′＠破におけると
同様に良好ｔあることが判る。
例４
例２の記載と則嘩にして、ＣＨＥ−安定性とＭ２＋ −
濃度との関係を試験したが、ｍ［は４℃〒あった。他の
すべての条件は例２のそれと同じである。
濃度との関係を試験したが、ｍ［は４℃〒あった。他の
すべての条件は例２のそれと同じである。
結果を第６表に示す。
第６表
第１図は、２５℃における貯蔵の際の活性と時間の関係
を示す曲線であ番）、第２図は、シュードモナス゛フル
オレツ六ンスからの市販のエステラーゼの２５℃におけ
る貯蔵の際の活性と□ 時間の関係を示す曲線であり、第３図はシュードモナス
・ｓｐ（Ｄ８Ｍ １ ｉ ８１ ）からのコレステリン
エステラーゼの２５℃における貯蔵の際の活性と時間の
関係を示す曲＃−ｆ％ある７、−Ｃ’）−０−〇−燐酸
カルシウム緩衝液０．１モル／／（ｐＨ７，６）中の＃
素溶液に関 する ーΔ−Δ−Δ−トリスＸＨＯｌ−緩衡液０．１モル／／
（ｐＨ７，０）中の酵素溶液に関 する −・−・−拳一 アス／にラギン酸マグネシウム５０ｍ
モル／ｌを含有するトリスＸＨＯｅ
を示す曲線であ番）、第２図は、シュードモナス゛フル
オレツ六ンスからの市販のエステラーゼの２５℃におけ
る貯蔵の際の活性と□ 時間の関係を示す曲線であり、第３図はシュードモナス
・ｓｐ（Ｄ８Ｍ １ ｉ ８１ ）からのコレステリン
エステラーゼの２５℃における貯蔵の際の活性と時間の
関係を示す曲＃−ｆ％ある７、−Ｃ’）−０−〇−燐酸
カルシウム緩衝液０．１モル／／（ｐＨ７，６）中の＃
素溶液に関 する ーΔ−Δ−Δ−トリスＸＨＯｌ−緩衡液０．１モル／／
（ｐＨ７，０）中の酵素溶液に関 する −・−・−拳一 アス／にラギン酸マグネシウム５０ｍ
モル／ｌを含有するトリスＸＨＯｅ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 殊に界面活性剤の存在で、シュードモナスｌ！４
＠から内コレステリンエステラーゼの水溶液を安定化す
るために、この酵素を、マグネシウム１０〜２００ｍモ
ル／ｌを含有し、隣酸塩を含有しない緩衝液中に溶がす
ことを特徴とする、シュードモナスｍｌからのコレステ
リンエステラーゼの水溶液を安定化する方法０ ２ マグネシウムイオン２５〜１５０Ｆ１１モル／ｌを
特徴する特許請求の範囲ＩＪ１項記載の方法。 ａｐｕｓ、ｏ〜９．０の緩衝液を特徴する特許請求の範
囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、 ｐＨ６，５〜９．０の緩衝液を特徴する特許請
求の範囲第３項記載の方法。 ＆ 活性化剤として、アニオン性及び／又は非イオン性
界面活性剤を特徴する特許請求の範囲第１項〜ｇ／！４
４項のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3200274.2 | 1982-01-07 | ||
| DE19823200274 DE3200274A1 (de) | 1982-01-07 | 1982-01-07 | Verfahren zur stabilisierung waessriger loesungen von cholesterinesterase aus pseudomonaden |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58175488A true JPS58175488A (ja) | 1983-10-14 |
| JPS6121076B2 JPS6121076B2 (ja) | 1986-05-24 |
Family
ID=6152717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58000568A Granted JPS58175488A (ja) | 1982-01-07 | 1983-01-07 | シユ−ドモナス属菌からのコレステリンエステラ−ゼの水溶液の安定化法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4476223A (ja) |
| EP (1) | EP0084684B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58175488A (ja) |
| AT (1) | ATE12659T1 (ja) |
| AU (1) | AU553593B2 (ja) |
| CA (1) | CA1198698A (ja) |
| DD (1) | DD208824A5 (ja) |
| DE (2) | DE3200274A1 (ja) |
| DK (1) | DK163527C (ja) |
| ES (1) | ES518694A0 (ja) |
| FI (1) | FI77262C (ja) |
| ZA (1) | ZA8367B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6030680A (ja) * | 1983-07-30 | 1985-02-16 | Amano Pharmaceut Co Ltd | リパ−ゼにエステラ−ゼ活性を付加する方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3447390A1 (de) * | 1984-12-24 | 1986-07-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| EP0218083A1 (en) * | 1985-09-03 | 1987-04-15 | Abbott Laboratories | Stabilized cholesterol reagent and method for determining total cholesterol using the reagent |
| DK145090D0 (da) * | 1990-06-14 | 1990-06-14 | Novo Nordisk As | Cellulasepraeparat og anvendelse deraf |
| US5460944A (en) * | 1991-10-28 | 1995-10-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Storable protein solution |
| DK99492D0 (da) * | 1992-08-07 | 1992-08-07 | Novo Nordisk As | Nyt enzym |
| EP3722418A1 (en) * | 2019-04-08 | 2020-10-14 | AB Enzymes Oy | Solution stable enzyme composition |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR891187A (fr) * | 1942-09-25 | 1944-02-29 | Procédé de conservation de la présure | |
| US3884764A (en) * | 1974-03-25 | 1975-05-20 | Eastman Kodak Co | Method and composition for blood serum cholesterol analysis |
| DE2911284C2 (de) * | 1979-03-22 | 1982-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagenz zur Aktivierung der Cholesterinesterase |
| DE2933648A1 (de) * | 1979-08-20 | 1981-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 68305 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| DE2933646A1 (de) * | 1979-08-20 | 1981-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 68305 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| US4409326A (en) * | 1980-07-10 | 1983-10-11 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum |
-
1982
- 1982-01-07 DE DE19823200274 patent/DE3200274A1/de not_active Withdrawn
- 1982-12-15 CA CA000417722A patent/CA1198698A/en not_active Expired
- 1982-12-20 AU AU91668/82A patent/AU553593B2/en not_active Ceased
- 1982-12-23 US US06/452,690 patent/US4476223A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-12-30 ES ES518694A patent/ES518694A0/es active Granted
- 1982-12-31 AT AT82112129T patent/ATE12659T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-12-31 EP EP82112129A patent/EP0084684B1/de not_active Expired
- 1982-12-31 DE DE8282112129T patent/DE3263043D1/de not_active Expired
-
1983
- 1983-01-03 DK DK000283A patent/DK163527C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-01-05 DD DD83247040A patent/DD208824A5/de unknown
- 1983-01-06 ZA ZA8367A patent/ZA8367B/xx unknown
- 1983-01-06 FI FI830036A patent/FI77262C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-01-07 JP JP58000568A patent/JPS58175488A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6030680A (ja) * | 1983-07-30 | 1985-02-16 | Amano Pharmaceut Co Ltd | リパ−ゼにエステラ−ゼ活性を付加する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK163527C (da) | 1992-08-03 |
| FI77262B (fi) | 1988-10-31 |
| DE3200274A1 (de) | 1983-07-14 |
| AU553593B2 (en) | 1986-07-24 |
| ATE12659T1 (de) | 1985-04-15 |
| ES8402347A1 (es) | 1984-02-16 |
| AU9166882A (en) | 1983-07-14 |
| US4476223A (en) | 1984-10-09 |
| EP0084684B1 (de) | 1985-04-10 |
| FI830036A0 (fi) | 1983-01-06 |
| ZA8367B (en) | 1983-10-26 |
| FI830036L (fi) | 1983-07-08 |
| DK163527B (da) | 1992-03-09 |
| DD208824A5 (de) | 1984-04-11 |
| CA1198698A (en) | 1985-12-31 |
| DK283D0 (da) | 1983-01-03 |
| DK283A (da) | 1983-07-08 |
| EP0084684A1 (de) | 1983-08-03 |
| ES518694A0 (es) | 1984-02-16 |
| JPS6121076B2 (ja) | 1986-05-24 |
| FI77262C (fi) | 1989-02-10 |
| DE3263043D1 (en) | 1985-05-15 |
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