JPS6121076B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、場合によつて界面活性剤を含有する
水溶液中のシユードモナス属菌からのコレステリ
ンエステラーゼ―ヒドロラーゼ（コレステリンエ
ステラーゼ、E.C.3.1.1.13）を安定化する方法に
関する。 コレステリンエステラーゼは、コレステリンエ
ステル含有溶液殊に診断学における血清の酵素的
分析用の試薬中でかなり多く使用されている。 この際、この酵素は、長鎖状の脂肪酸を有する
そのエステルからコレステリンを遊離させる作用
をし、このコレステリンは、引続き、適当な検出
法で通例コレステリン―オキシダーゼ（E.
C.1.1.3.6.）により接触される反応の使用下に酵
素的に測定される。 血清中のこのエステル化されたコレステリンの
測定のために、殊に、シユードモナス属菌からの
コレステリンエステラーゼは、それがリパーゼ活
性をも有するので、好適である。この特性を有す
る酵素は、例えば、西ドイツ特許出願公告第
2819384号明細書に記載されている。この種の酵
素は、屡々、反応バツチ中の試料のトリグリセリ
ド含分により惹起される濁りを除く（澄明化す
る）能力があり、従つて例えば光学的測定法にお
ける障害を取除く能力がある。 リパーゼ活性を有するこの種のコレステリンエ
ステラーゼは、遊離するグリセリンを適当な検出
反応に供する際に、試料中のトリグリセリドの検
出のためにも使用することができる。 更に、この種の酵素は、一般に、それを用いて
はコレステリンエステルもトリグリセリドも測定
されないが、測定技術的理由から、試料からのト
リグリセリドによる濁りを除くことが望ましい血
清分析用試薬中で使用できる。 ところで、コレステリンエステラーゼは、他の
成分を含有しない緩衝媒体中では、その基質に対
して加水分解活性示させないか又は非常に僅かに
のみ加水分解活性を示すことが公知である。従つ
て、反応混合物に、活性化剤を添加することが必
要である。 活性化剤としては、多くの界面活性剤（Dete
―rgentien）例えば、非イオン性界面活性剤例え
ばアルキル―もしくはアリール―及びアラルキル
ーアルコール―ポリグリコールエーテル〔トリト
ンX100（Tritonx―100）、テサイト
（Thesit）、ルテンソル（Lutensol）ON60もし
くは70、イソトリデシルエーテル〕及び／又はア
ニオン性界面活性剤例えば、没食子酸又はその共
役物の塩が好適である。 その活性化作用は、屡々、反応媒体中の高いイ
オン濃度により支えられ、この際、最適イオン濃
度は、最も簡単に、緩衝物質の適当な配量により
得ることができる。 緩衝剤としては、コレステリンエステラーゼの
最適活性の範囲で、大抵はPH５〜９で最大作用を
するものが好適である。特に、コレステリンエス
テラーゼに関する文献から明らかなように燐酸塩
緩衝液が有利である。 コレステリンエステラーゼとしては、多く、動
物又は微生物起源の酵素が使用され、この際、い
ずれにせよ異なる酵素の間で、血清中に生じるコ
レステリン―脂肪酸―エステルのパレツト
（palette）に対する作用スペクトルにおける部分
的に著るしいちがいが生じうる。バホウニイ
（Vahouny）、ウエアジング（Weeresing）及びト
レードウエル（Treadwell）は、Arch.Biochem.
Biophys.1964年107巻、７〜15頁に、酵素活性が
脂肪酸エステルの鎖長の種類によつては充分に影
響されずに残存する膵液からのコレステリンエス
テラーゼを記載しており、Z.Klin.Chem.Klin.
Biochem.（1974年）12巻403〜407頁の記載から
は、その加水分解作用がかなり著るしくコレステ
リンエステル中の脂肪酸分の性質に依り決まる微
生物源コレステリンエステラーゼが公知である。 更に、トリグリセリドを変換できないか又は僅
かに低い速度で変換することのできるコレステリ
ンエステラーゼが存在する（例えばJ.Biol.
Chem.1962年237巻、3469〜3656頁参照）。 シユードモナス属からの前記コレステリンエス
テラーゼは、コレステリンエステル中の脂肪酸分
の種類に関して、非常に広い作用スペクトルを有
し、同時にトリグリセリドを高速度で適当な反応
条件下に変換し、従つてはじめに挙げた理由から
まつたく特別にコレステリンエステル及び／又は
トリグリセリド含有溶液（例えば血清）を分析す
るための試薬の製造に好適である。 この目的のためにこの酵素を使用することは、
いずれにせよ、使用準備のできた試薬中で即ち水
溶液中で充分に安定であることが前提である。 ところで、シユードモナス属菌からの酵素は、
通例、血清―総コレステリンの測定のための市販
の試薬の製造に使用される純粋な隣酸塩緩衝液中
でもなお充分な安定性を有するが、この隣酸塩緩
衝液中に前記種類の界面活性剤即ち例えばトリト
ンX100又はイソトリデシルエーテルを活性化剤
として含有する際には意想外に迅速にその活性を
失なうことが判明した。従つて、これを直ちに、
実施性及び経費の理由から、充分に、少なくとも
他の起源のコレステリンエステラーゼにおける技
術水準に相応する貯蔵性を必要とする試薬溶液中
で使用することはできない。 従つて、本発明は、これらの著るしい欠点を除
き、それを用いて、コレステリンエステラーゼ
を、使用準備のできた試薬中で少なくとも３〜５
日の長時間にわたり室温条件で著るしい活性消失
が確認することはできない程度に安定化する方法
を得ることを目的としている。この課題は、本発
明により、殊に界面活性剤の存在下でのシユード
モナス属菌からのコレステリンエステラーゼの水
溶液を安定化する方法により解決され、この方法
は、酵素をマグネシウムイオン10〜200mモル／
を含有し燐酸塩不含の緩衝液中に溶かすことよ
りなる。 マグネシウムイオンの濃度を25〜150mモル／
殊に50〜100mモル／に調節するのが有利で
ある。 緩衝液としては、トリス／トリス・HCl.トリ
エタノールアミン／トリエタノールアミン・
HCl、イミダゾール、HEPES、MOPS及び他の
燐酸塩不含の緩衝液混合物がこれに該当する。ト
リス緩衝液を使用するのが有利である。この緩衝
液のPH値は、5.0〜9.0の間、有利に6.5〜9.0殊に
トリス緩衝液を使用する際には7.5〜8.5が有利で
ある。 シユードモナス属菌―酵素における殊に界面活
性剤の存在下における燐酸塩の不安定化作用は意
想外であり、コレステリンエステラーゼに関する
文献からは推測できなかつた。 J.Biol.Chem.（1957年）228巻447〜457頁には
豚膵蔵からのコレステリンエステラーゼが記載さ
れており、その酵素活性は、酵素活性化剤として
のタウロコレートを含有する燐酸塩緩衝液中で測
定されている。この酵素の特性に対する燐酸塩緩
衝液の悪影響はこの文献には記載されていない。 更に、多くの文献例えばB.in J.Biol.Chem.
（1974年）75巻、1073〜1079頁、Biochem.
Biophys.Acta（1971年）231巻、194〜197頁、
Arch.Biochem.Biophys、（1963年）100巻、360〜
363頁、Clin.Chem.（1974年）20巻、470〜475頁
並びにBiochim.Biophys.Acta（1975年）384巻、
138〜145頁に、コレステリンエステラーゼの特性
に関する記載が存在するが、これらすべての文献
中では酵素活性を、部分的に界面活性物質を含有
する燐酸塩緩衝液含有溶液中で測定し、この際、
コレステリンエステラーゼに対する燐酸塩の不安
定化作用も、マグネシウム塩の安定化も開示され
てはいない。 微生物源コレステリンエステラーゼに関する文
献にも同様なことが当てはまる。 最後に、血清―コレステリンの完全酵素的測定
のための試薬中での微生物源コレステリンエステ
ラーゼの使用は、Z.Klin.Chem.Klin.Biochem.
（1974年）12巻、403〜407頁に記載されている。
この試薬は、界面活性剤としてのテサイト
（Thesit）と共に比較的高濃度の燐酸アンモニウ
ム緩衝液を含有し、この際、このエステラーゼを
含有する試薬の良好な安定性に関して特に言及さ
れている。 シユードモナス・フルオレツセンス（Pseud―
omonas fluoreszenz）からのコレステリンエス
テラーゼの特性は、Agric.Biol.Chem（1975年）
39巻、1511〜1512頁に記載されている。この酵素
の活性はClin.Chem.（1974年）20巻、470〜475
頁に記載の方法で測定され、この際にも試薬は燐
酸塩で緩衝されている。 従つて、界面活性剤の存在でシユードモナス属
菌からのコレステリンエステラーゼに対する燐酸
塩イオンの不安定化作用は、公知でなかつたの
で、この種のコレステリンエステラーゼの水溶液
から燐酸塩イオンを除くことは考え及ぶことでは
なかつた。同様に、この作用が、所定の濃度範囲
でのマグネシウムイオンの添加により除かれるこ
とも予想困難であつた。 本発明は、界面活性剤をも含有する溶液中のシ
ユードモナス属菌からのコレステリンエステラー
ゼの安定化のために重要であるが、本発明によ
り、水溶液中でのこの酵素の活性を良好に保持す
ることは、界面活性剤を添加しない場合にも達成
することができる。 シユードモナス属菌からのコレステリンエステ
ラーゼは公知であり、市販されている。これは、
既にシユードモナス属の種々の多くの菌株例え
ば、シユードモナス・フルオレツセンス（西ドイ
ツ特許出願公開第2819834号明細書参照）又はシ
ユードモナス・sp.（西ドイツ特許出願公開第
2933646号明細書参照）中で発見されている。シ
ユードモナス属菌からのすべての試験されたコレ
ステリンエステラーゼ―製剤において、本発明の
方法は、酵素源としてどのコレステリンエステラ
ーゼを含有するシユードモナス属菌株を用いたか
とは無関係に、非常に有効であることが立証され
た。このことは、シユードモナス・sp（DSM
1280）、シユードモナス・フルオレツセンス
（SIGMAKat.Nr.C2770）からの市販のコレステリ
ンエステラーゼ及びシユードモナス・sp（DSM
―1281）―コレステリンエステラーゼを用いて実
施した実験から明らかである。これらの３種のシ
ユードモナス属菌株からのコレステリンエステラ
ーゼは、それぞれ、界面活性剤として、コール酸
ナトリウム10mモル及びポリエトキシ脂肪アルコ
ールエーテル0.3％を含有する溶液中で試験し
た。結果を添付図面に示す。 第１図は、25℃で貯蔵の際の活性を百分率で示
す曲線である。白丸点上の曲線は燐酸カリウム緩
衝液0.1モル／（PH7.6）中の酵素溶液に関し、
三角点上の曲線はトリスXHCl―緩衝液0.1モル／
（PH7.0）中の酵素溶液に関し、黒丸点上の曲
線は、アスパラギン酸マグネシウム50mモル／
を含有するトリスXHCl0.1モル／（PH7.6）中
の酵素溶液に関する。第２図は、各々シユードモ
ナス・フルオレツセンスからの市販のエステラー
ゼに関する第１図におけると同様な曲線である。
第３図は各々、シユードモナス・sp（DSM
1281）からのコレステリンエステラーゼに関する
第１図におけると同様な曲線である。 マグネシウムイオンは、そのアニオンが酵素溶
液のいずれの成分にも悪影響を及ぼさない任意の
マグネシウム塩の形で添加することができる。無
機酸のマグネシウム塩例えば、塩化マグネシウム
又は硫酸マグネシウムと並んで、特に有機酸例え
ば脂肪酸、ジカルボン酸及びアミノ酸の塩が好適
である。アミノ酸のマグネシウム塩殊にアスパラ
ギン酸マグネシウムが有利である。 シユードモナス属菌からのコレステリンエステ
ラーゼに対するマグネシウムイオンの安定化作用
は、活性化作用ではない。これは、界面活性剤含
有溶液中での活性に関しては、アスパラギン酸マ
グネシウム又は食塩を匹適する濃度で添加する際
（後者は安定化作用を有しない）に差がないこと
から言える。更に、このことは界面活性剤含有燐
酸塩緩衝液中での貯蔵により充分に不活性化され
たシユードモナス属菌からのコレステリンエステ
ラーゼがマグネシウム塩の後からの添加によつて
は、燐酸塩緩衝液中の溶解度限度までの高濃度で
も、反応性にならないことから言える。 本発明により、その特性に基づきエステル化さ
れたコレステリンの測定のために特に好適なシユ
ードモナス属菌からのコレステリンエステラーゼ
は、水溶液中で、所望の貯蔵性が得られるように
安定化することができる。 本発明により得られた改良された安定性を、次
の例で更に明らかにする。この例中次の略字を使
用する： CHE＝シユードモナス属菌からのコレステリン
エステラーゼ HEPES＝ｎ―２―ヒドロキシエチルピペラジン
―n′―エタンスルホン酸 トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン イソトリデシルエーテル＝ポリオキシエチレンイ
ソトリデシルエーテル テサイト＝ポリオキシエチレンドデシルエーテル MOPS＝３―（ｎ―モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸 トリトンX100＝ポリオキシエチレンイソオク
チルフエニルエーテル ルテンソルON60もしくはON70＝ポリオキシエ
チレン脂肪アルコールエーテル 例 １ CHEの安定性を、25℃で種々の緩衝液中でM2+
を添加し又は添加しないで試験した。 第１表は、４種の緩衝液及び２種の界面活性剤
を用い、マグネシウムを添加せずに得られた結果
を示しており、第２表はMg2+50ｍモルを添加し
た際の相応する結果を示している。すべての場合
に、コレート10ｍモル／及びその都度の所定の
非イオン性界面活性剤0.3％を用いた。
水溶液中のシユードモナス属菌からのコレステリ
ンエステラーゼ―ヒドロラーゼ（コレステリンエ
ステラーゼ、E.C.3.1.1.13）を安定化する方法に
関する。 コレステリンエステラーゼは、コレステリンエ
ステル含有溶液殊に診断学における血清の酵素的
分析用の試薬中でかなり多く使用されている。 この際、この酵素は、長鎖状の脂肪酸を有する
そのエステルからコレステリンを遊離させる作用
をし、このコレステリンは、引続き、適当な検出
法で通例コレステリン―オキシダーゼ（E.
C.1.1.3.6.）により接触される反応の使用下に酵
素的に測定される。 血清中のこのエステル化されたコレステリンの
測定のために、殊に、シユードモナス属菌からの
コレステリンエステラーゼは、それがリパーゼ活
性をも有するので、好適である。この特性を有す
る酵素は、例えば、西ドイツ特許出願公告第
2819384号明細書に記載されている。この種の酵
素は、屡々、反応バツチ中の試料のトリグリセリ
ド含分により惹起される濁りを除く（澄明化す
る）能力があり、従つて例えば光学的測定法にお
ける障害を取除く能力がある。 リパーゼ活性を有するこの種のコレステリンエ
ステラーゼは、遊離するグリセリンを適当な検出
反応に供する際に、試料中のトリグリセリドの検
出のためにも使用することができる。 更に、この種の酵素は、一般に、それを用いて
はコレステリンエステルもトリグリセリドも測定
されないが、測定技術的理由から、試料からのト
リグリセリドによる濁りを除くことが望ましい血
清分析用試薬中で使用できる。 ところで、コレステリンエステラーゼは、他の
成分を含有しない緩衝媒体中では、その基質に対
して加水分解活性示させないか又は非常に僅かに
のみ加水分解活性を示すことが公知である。従つ
て、反応混合物に、活性化剤を添加することが必
要である。 活性化剤としては、多くの界面活性剤（Dete
―rgentien）例えば、非イオン性界面活性剤例え
ばアルキル―もしくはアリール―及びアラルキル
ーアルコール―ポリグリコールエーテル〔トリト
ンX100（Tritonx―100）、テサイト
（Thesit）、ルテンソル（Lutensol）ON60もし
くは70、イソトリデシルエーテル〕及び／又はア
ニオン性界面活性剤例えば、没食子酸又はその共
役物の塩が好適である。 その活性化作用は、屡々、反応媒体中の高いイ
オン濃度により支えられ、この際、最適イオン濃
度は、最も簡単に、緩衝物質の適当な配量により
得ることができる。 緩衝剤としては、コレステリンエステラーゼの
最適活性の範囲で、大抵はPH５〜９で最大作用を
するものが好適である。特に、コレステリンエス
テラーゼに関する文献から明らかなように燐酸塩
緩衝液が有利である。 コレステリンエステラーゼとしては、多く、動
物又は微生物起源の酵素が使用され、この際、い
ずれにせよ異なる酵素の間で、血清中に生じるコ
レステリン―脂肪酸―エステルのパレツト
（palette）に対する作用スペクトルにおける部分
的に著るしいちがいが生じうる。バホウニイ
（Vahouny）、ウエアジング（Weeresing）及びト
レードウエル（Treadwell）は、Arch.Biochem.
Biophys.1964年107巻、７〜15頁に、酵素活性が
脂肪酸エステルの鎖長の種類によつては充分に影
響されずに残存する膵液からのコレステリンエス
テラーゼを記載しており、Z.Klin.Chem.Klin.
Biochem.（1974年）12巻403〜407頁の記載から
は、その加水分解作用がかなり著るしくコレステ
リンエステル中の脂肪酸分の性質に依り決まる微
生物源コレステリンエステラーゼが公知である。 更に、トリグリセリドを変換できないか又は僅
かに低い速度で変換することのできるコレステリ
ンエステラーゼが存在する（例えばJ.Biol.
Chem.1962年237巻、3469〜3656頁参照）。 シユードモナス属からの前記コレステリンエス
テラーゼは、コレステリンエステル中の脂肪酸分
の種類に関して、非常に広い作用スペクトルを有
し、同時にトリグリセリドを高速度で適当な反応
条件下に変換し、従つてはじめに挙げた理由から
まつたく特別にコレステリンエステル及び／又は
トリグリセリド含有溶液（例えば血清）を分析す
るための試薬の製造に好適である。 この目的のためにこの酵素を使用することは、
いずれにせよ、使用準備のできた試薬中で即ち水
溶液中で充分に安定であることが前提である。 ところで、シユードモナス属菌からの酵素は、
通例、血清―総コレステリンの測定のための市販
の試薬の製造に使用される純粋な隣酸塩緩衝液中
でもなお充分な安定性を有するが、この隣酸塩緩
衝液中に前記種類の界面活性剤即ち例えばトリト
ンX100又はイソトリデシルエーテルを活性化剤
として含有する際には意想外に迅速にその活性を
失なうことが判明した。従つて、これを直ちに、
実施性及び経費の理由から、充分に、少なくとも
他の起源のコレステリンエステラーゼにおける技
術水準に相応する貯蔵性を必要とする試薬溶液中
で使用することはできない。 従つて、本発明は、これらの著るしい欠点を除
き、それを用いて、コレステリンエステラーゼ
を、使用準備のできた試薬中で少なくとも３〜５
日の長時間にわたり室温条件で著るしい活性消失
が確認することはできない程度に安定化する方法
を得ることを目的としている。この課題は、本発
明により、殊に界面活性剤の存在下でのシユード
モナス属菌からのコレステリンエステラーゼの水
溶液を安定化する方法により解決され、この方法
は、酵素をマグネシウムイオン10〜200mモル／
を含有し燐酸塩不含の緩衝液中に溶かすことよ
りなる。 マグネシウムイオンの濃度を25〜150mモル／
殊に50〜100mモル／に調節するのが有利で
ある。 緩衝液としては、トリス／トリス・HCl.トリ
エタノールアミン／トリエタノールアミン・
HCl、イミダゾール、HEPES、MOPS及び他の
燐酸塩不含の緩衝液混合物がこれに該当する。ト
リス緩衝液を使用するのが有利である。この緩衝
液のPH値は、5.0〜9.0の間、有利に6.5〜9.0殊に
トリス緩衝液を使用する際には7.5〜8.5が有利で
ある。 シユードモナス属菌―酵素における殊に界面活
性剤の存在下における燐酸塩の不安定化作用は意
想外であり、コレステリンエステラーゼに関する
文献からは推測できなかつた。 J.Biol.Chem.（1957年）228巻447〜457頁には
豚膵蔵からのコレステリンエステラーゼが記載さ
れており、その酵素活性は、酵素活性化剤として
のタウロコレートを含有する燐酸塩緩衝液中で測
定されている。この酵素の特性に対する燐酸塩緩
衝液の悪影響はこの文献には記載されていない。 更に、多くの文献例えばB.in J.Biol.Chem.
（1974年）75巻、1073〜1079頁、Biochem.
Biophys.Acta（1971年）231巻、194〜197頁、
Arch.Biochem.Biophys、（1963年）100巻、360〜
363頁、Clin.Chem.（1974年）20巻、470〜475頁
並びにBiochim.Biophys.Acta（1975年）384巻、
138〜145頁に、コレステリンエステラーゼの特性
に関する記載が存在するが、これらすべての文献
中では酵素活性を、部分的に界面活性物質を含有
する燐酸塩緩衝液含有溶液中で測定し、この際、
コレステリンエステラーゼに対する燐酸塩の不安
定化作用も、マグネシウム塩の安定化も開示され
てはいない。 微生物源コレステリンエステラーゼに関する文
献にも同様なことが当てはまる。 最後に、血清―コレステリンの完全酵素的測定
のための試薬中での微生物源コレステリンエステ
ラーゼの使用は、Z.Klin.Chem.Klin.Biochem.
（1974年）12巻、403〜407頁に記載されている。
この試薬は、界面活性剤としてのテサイト
（Thesit）と共に比較的高濃度の燐酸アンモニウ
ム緩衝液を含有し、この際、このエステラーゼを
含有する試薬の良好な安定性に関して特に言及さ
れている。 シユードモナス・フルオレツセンス（Pseud―
omonas fluoreszenz）からのコレステリンエス
テラーゼの特性は、Agric.Biol.Chem（1975年）
39巻、1511〜1512頁に記載されている。この酵素
の活性はClin.Chem.（1974年）20巻、470〜475
頁に記載の方法で測定され、この際にも試薬は燐
酸塩で緩衝されている。 従つて、界面活性剤の存在でシユードモナス属
菌からのコレステリンエステラーゼに対する燐酸
塩イオンの不安定化作用は、公知でなかつたの
で、この種のコレステリンエステラーゼの水溶液
から燐酸塩イオンを除くことは考え及ぶことでは
なかつた。同様に、この作用が、所定の濃度範囲
でのマグネシウムイオンの添加により除かれるこ
とも予想困難であつた。 本発明は、界面活性剤をも含有する溶液中のシ
ユードモナス属菌からのコレステリンエステラー
ゼの安定化のために重要であるが、本発明によ
り、水溶液中でのこの酵素の活性を良好に保持す
ることは、界面活性剤を添加しない場合にも達成
することができる。 シユードモナス属菌からのコレステリンエステ
ラーゼは公知であり、市販されている。これは、
既にシユードモナス属の種々の多くの菌株例え
ば、シユードモナス・フルオレツセンス（西ドイ
ツ特許出願公開第2819834号明細書参照）又はシ
ユードモナス・sp.（西ドイツ特許出願公開第
2933646号明細書参照）中で発見されている。シ
ユードモナス属菌からのすべての試験されたコレ
ステリンエステラーゼ―製剤において、本発明の
方法は、酵素源としてどのコレステリンエステラ
ーゼを含有するシユードモナス属菌株を用いたか
とは無関係に、非常に有効であることが立証され
た。このことは、シユードモナス・sp（DSM
1280）、シユードモナス・フルオレツセンス
（SIGMAKat.Nr.C2770）からの市販のコレステリ
ンエステラーゼ及びシユードモナス・sp（DSM
―1281）―コレステリンエステラーゼを用いて実
施した実験から明らかである。これらの３種のシ
ユードモナス属菌株からのコレステリンエステラ
ーゼは、それぞれ、界面活性剤として、コール酸
ナトリウム10mモル及びポリエトキシ脂肪アルコ
ールエーテル0.3％を含有する溶液中で試験し
た。結果を添付図面に示す。 第１図は、25℃で貯蔵の際の活性を百分率で示
す曲線である。白丸点上の曲線は燐酸カリウム緩
衝液0.1モル／（PH7.6）中の酵素溶液に関し、
三角点上の曲線はトリスXHCl―緩衝液0.1モル／
（PH7.0）中の酵素溶液に関し、黒丸点上の曲
線は、アスパラギン酸マグネシウム50mモル／
を含有するトリスXHCl0.1モル／（PH7.6）中
の酵素溶液に関する。第２図は、各々シユードモ
ナス・フルオレツセンスからの市販のエステラー
ゼに関する第１図におけると同様な曲線である。
第３図は各々、シユードモナス・sp（DSM
1281）からのコレステリンエステラーゼに関する
第１図におけると同様な曲線である。 マグネシウムイオンは、そのアニオンが酵素溶
液のいずれの成分にも悪影響を及ぼさない任意の
マグネシウム塩の形で添加することができる。無
機酸のマグネシウム塩例えば、塩化マグネシウム
又は硫酸マグネシウムと並んで、特に有機酸例え
ば脂肪酸、ジカルボン酸及びアミノ酸の塩が好適
である。アミノ酸のマグネシウム塩殊にアスパラ
ギン酸マグネシウムが有利である。 シユードモナス属菌からのコレステリンエステ
ラーゼに対するマグネシウムイオンの安定化作用
は、活性化作用ではない。これは、界面活性剤含
有溶液中での活性に関しては、アスパラギン酸マ
グネシウム又は食塩を匹適する濃度で添加する際
（後者は安定化作用を有しない）に差がないこと
から言える。更に、このことは界面活性剤含有燐
酸塩緩衝液中での貯蔵により充分に不活性化され
たシユードモナス属菌からのコレステリンエステ
ラーゼがマグネシウム塩の後からの添加によつて
は、燐酸塩緩衝液中の溶解度限度までの高濃度で
も、反応性にならないことから言える。 本発明により、その特性に基づきエステル化さ
れたコレステリンの測定のために特に好適なシユ
ードモナス属菌からのコレステリンエステラーゼ
は、水溶液中で、所望の貯蔵性が得られるように
安定化することができる。 本発明により得られた改良された安定性を、次
の例で更に明らかにする。この例中次の略字を使
用する： CHE＝シユードモナス属菌からのコレステリン
エステラーゼ HEPES＝ｎ―２―ヒドロキシエチルピペラジン
―n′―エタンスルホン酸 トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン イソトリデシルエーテル＝ポリオキシエチレンイ
ソトリデシルエーテル テサイト＝ポリオキシエチレンドデシルエーテル MOPS＝３―（ｎ―モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸 トリトンX100＝ポリオキシエチレンイソオク
チルフエニルエーテル ルテンソルON60もしくはON70＝ポリオキシエ
チレン脂肪アルコールエーテル 例 １ CHEの安定性を、25℃で種々の緩衝液中でM2+
を添加し又は添加しないで試験した。 第１表は、４種の緩衝液及び２種の界面活性剤
を用い、マグネシウムを添加せずに得られた結果
を示しており、第２表はMg2+50ｍモルを添加し
た際の相応する結果を示している。すべての場合
に、コレート10ｍモル／及びその都度の所定の
非イオン性界面活性剤0.3％を用いた。
【表】
【表】
【表】
上記結果は、本発明による燐酸塩不含の緩衝液
とマグネシウムイオンとの組合せにより安定性が
著るしく改良されることを示している。 例 ２ 安定化作用とマグネシウムイオン濃度との関係
を、25℃で100ｍモルのトリス緩衝液（PH7.6）中
で試験した。得られた結果を第３表に示す。界面
活性剤に関しては例１の記載が通用する。
とマグネシウムイオンとの組合せにより安定性が
著るしく改良されることを示している。 例 ２ 安定化作用とマグネシウムイオン濃度との関係
を、25℃で100ｍモルのトリス緩衝液（PH7.6）中
で試験した。得られた結果を第３表に示す。界面
活性剤に関しては例１の記載が通用する。
【表】
この第３表に記載の結果から、10ｍモルの
Mg2+―濃度で既に安定性は著るしく高いことが
認められる。 例 ３ 例１の記載と同様にして、種々の緩衝液及び
種々の界面活性剤におけるマグネシウムイオンを
添加しない場合とした場合とのCHEの安定性を
試験した。但し、溶液を４℃に保持した点は、例
１とは異なつた。 第４表は、マグネシウム不含の際の安定性、第
５表はMg2+5〜50mgを含有する際の安定性を示し
ている。
Mg2+―濃度で既に安定性は著るしく高いことが
認められる。 例 ３ 例１の記載と同様にして、種々の緩衝液及び
種々の界面活性剤におけるマグネシウムイオンを
添加しない場合とした場合とのCHEの安定性を
試験した。但し、溶液を４℃に保持した点は、例
１とは異なつた。 第４表は、マグネシウム不含の際の安定性、第
５表はMg2+5〜50mgを含有する際の安定性を示し
ている。
【表】
【表】
【表】
第５表の値と第２表の値とを比較すると、本発
明により、室温における安定性は、冷蔵庫温度に
おけると同様に良好であることが判る。 例 ４ 例２の記載と同様にして、CHE―安定性と
Mg2+―濃度との関係を試験したが、温度は４℃
であつた。他のすべての条件は例２のそれと同じ
である。 結果を第６表に示す。
明により、室温における安定性は、冷蔵庫温度に
おけると同様に良好であることが判る。 例 ４ 例２の記載と同様にして、CHE―安定性と
Mg2+―濃度との関係を試験したが、温度は４℃
であつた。他のすべての条件は例２のそれと同じ
である。 結果を第６表に示す。
第１図は、25℃における貯蔵の際の活性と時間
の関係を示す曲線であり、第２図は、シユードモ
ナス・フルオレツセンスからの市販のエステラー
ゼの25℃における貯蔵の際の活性と時間の関係を
示す曲線であり、第３図はシユードモナス・sp
（DSM 1281）からのコレステリンエステラーゼ
の25℃における貯蔵の際の活性と時間の関係を示
す曲線である。 −〇−〇−〇− 燐酸カルシウム緩衝液0.1モ
ル／（PH 7.6）中の酵素溶液に関す
る、 −△−△−△− トリスXHC―緩衝液0.1モ
ル／（PH 7.0）中の酵素溶液に関す
る、 −●−●−●− アスパラギン酸マグネシウム50
ｍモル／を含有するトリスXHC0.1モ
ル／（PH 7.6）中の酵素溶液に関す
る。
の関係を示す曲線であり、第２図は、シユードモ
ナス・フルオレツセンスからの市販のエステラー
ゼの25℃における貯蔵の際の活性と時間の関係を
示す曲線であり、第３図はシユードモナス・sp
（DSM 1281）からのコレステリンエステラーゼ
の25℃における貯蔵の際の活性と時間の関係を示
す曲線である。 −〇−〇−〇− 燐酸カルシウム緩衝液0.1モ
ル／（PH 7.6）中の酵素溶液に関す
る、 −△−△−△− トリスXHC―緩衝液0.1モ
ル／（PH 7.0）中の酵素溶液に関す
る、 −●−●−●− アスパラギン酸マグネシウム50
ｍモル／を含有するトリスXHC0.1モ
ル／（PH 7.6）中の酵素溶液に関す
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 殊に界面活性剤の存在で、シユードモナス属
菌からのコレステリンエステラーゼの水溶液を安
定化するために、この酵素を、マグネシウム10〜
200ｍモル／を含有し、隣酸塩を含有しない緩
衝液中い溶かすことを特徴とする、シユードモナ
ス属菌からのコレステリンエステラーゼの水溶液
を安定化する方法。 ２ マグネシウムイオン25〜150ｍモル／を添
加する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ PH5.0〜9.0の緩衝液を使用する、特許請求の
範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４ PH6.5〜9.0の緩衝液を使用する、特許請求の
範囲第３項記載の方法。 ５ 活性化剤として、アニオン性及び／又は非イ
オン性界面活性剤を添加する、特許請求の範囲第
１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19823200274 DE3200274A1 (de) | 1982-01-07 | 1982-01-07 | Verfahren zur stabilisierung waessriger loesungen von cholesterinesterase aus pseudomonaden |
| DE3200274.2 | 1982-01-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58175488A JPS58175488A (ja) | 1983-10-14 |
| JPS6121076B2 true JPS6121076B2 (ja) | 1986-05-24 |
Family
ID=6152717
Family Applications (1)
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