FI77262B - Foerfarande foer stabilisering av vattenloesningar av kolesterolesteras haerstammande fraon pseudomonader. - Google Patents

Description

77262

Menetelmä pseudomonadeista peräisin olevan kolesterolieste-raasin vesiliuosten stabiloimiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä pseudomonadeista peräisin olevan kolesteroliesteri-hydrolaasin (kolesteroliesteraasin, E.C. 3.1.1.13) stabiloimiseksi mahdollisesti pinta-aktiivi-sen aineen sisältävässä vesiliuoksessa.

Kolesteroliesteraaseja käytetään laajalti reagensseissa koles-teroliesteripitoisten liuosten entsymaattista analysointia varten, erikoisesti veriheran analysointiin kliinisessä diagnostiikassa.

Nämä entsyymit aiheuttavat tällöin kolesterolin vapautumisen estereistään pitkäketjuisten rasvahappojen kanssa, minkä jälkeen kolesteroli määritetään sopivilla toteamismenetelmillä, tavallisesti entsymaattisesti käyttämällä kolesteroli-oksidaasilla (E.C. 1-1·3 .6·) katalysoitua reaktiota.

Tämän esteröityneen kolesterolin määritykseen veriherassa soveltuu erikoisesti pseudomonadeista peräisin oleva koles-teroliesteraasi, koska sillä on myös lipaasi-aktiivisuus.

Tämän ominaisuuden omaava entsyymi on esitetty esim. saksalaisessa kuulutusjulkaisussa 28 19 384. Tällaiset entsyymit kykenevät poistamaan tutkittavan aineen triglyseridipitoi-suuden aiheuttamat samentumat ja siten esim. estämään häiriöt fotometrisissä mittausmenetelmissä.

Tällaisia lipaasi-aktiivisuuden omaavia kolesteroliesteraaseja voidaan myös käyttää triglyseridien toteamiseen tutkittavassa aineessa, kun suoritetaan sopiva toteamisreaktio vapautuvan glyseriinin määrittämiseksi.

Lisäksi voidaan tällaisia entsyymejä yleensä käyttää verihera-analyysin reagensseissa, joilla ei tosin määritetä kolesteroli-estereitä eikä triglyseridejä, mutta joissa mittausteknillisistä syistä tutkittavasta aineesta lähtevien triglyseridien aiheuttamien samentumien poisto on toivottavaa.

77262 2

Nykyisin on tunnettua, että kolesterolioksidaasit puskuroidussa väliaineessa, joka ei sisällä muita komponentteja, substraattiensa suhteen eivät kehitä lainkaan tai kehittävät hyvin vähän hydrolyyttistä aktiivisuutta. Niinpä on tarpeen lisätä reaktioseokseen aktivaattoreja.

Aktivaattoreiksi ovat useat pinta-aktiiviset aineet (deter-gentit) sopivia kuten epäioniset detergentit, esim. alkyy- li- tai aryyli- ja aralkyyli-alkoholipolyglykolieetterit (Triton X-10cf^, Thesit, Lutensol® ON 60 tai 70, isotridekyy-lieetteri) ja/tai anioniset detergentit, esim. sappihappojen suolat tai niiden konjugaatit.

Aktivoivaa vaikutusta auttaa usein suurempi ionipitoisuus reaktioväliaineessa, jolloin optimi ionipitoisuus aikaansaadaan yksinkertaisimmin puskuriaineiden vastaavalla annostelulla.

Puskureiksi soveltuvat sellaiset, jotka kolesteroliesteraa-sien aktiviteettioptimin alueella, useimmiten pH-arvoilla välillä 5-9 ovat tehokkaimmillaan. Erikoisen edullisia ovat fosfaattipuskurit, kuten kolesteroliesteraasia käsittelevästä kirjallisuusmateriaalista ilmenee.

Kolesteroliesteraaseina käytetään enimmäkseen eläimistä tai mikrobeista peräisin olevia entsyymejä, jolloin tosin voi osaksi muodostua huomattavia eroja vaikutusspektrissä veri-herassa esiintyvien kolesteroli-rasvahappo-esterien paletin suhteen. Vahouny, Weersing ja Treadwell (Arch.Biochem. Biophys. (1964) 107, 7-15) esittävät haimamesteestä peräisin olevan kolesteroliesteraasin, jonka entsymaattiseen aktiivisuuteen rasvahappoesterin ketjunpituuden laatu jää suurin piirtein vaikuttamatta, kun taas julkaisusta Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. (1974) 1_2, 403-407 mikrobeista peräisin oleva kolesteroliesteraasi on tullut tunnetuksi, jonka hydrolyyttinen tehokkuus riippuu suhteellisen voimakkaasti kolesterolieste-rissä olevan rasvahappo-osuuden luonteesta.

Il 3 77262

Edelleen on olemassa kolesteroliesteraaseja, jotka eivät kykene muuttamaan triglyseridejä tai kykenevät muuttamaan niitä vain pienellä nopeudella, kuten esim. on selostettu julkaisussa J. Biol. Chem. (1962) 237, 3469-3656.

Edellä mainitulla pseudomonadeista peräisin olevalla koles-teroliesteraasilla on sangen leveä vaikutusspektri koleste-roliesterin rasvahappo-osuuden laadun suhteen, se muuttaa samalla myös triglyseridejä suurella nopeudella sopivien reaktio-olosuhteiden vallitessa ja soveltuisi sen vuoksi alussa mainituista syistä erittäin hyvin reagenssien valmistukseen kolesteroliesteri- ja/tai triglyseridipitoisten liuosten, kuten esim. veriheran analysointia varten.

Entsyymin käyttö näihin tarkoituksiin edellyttää tosin, että se on käyttövalmiissa reagenssissa, ts. vesiliuoksessa riittävän stabiili.

Nyt on todettu, että pseudomonadeista peräisin oleva entsyymi, joka omaa tosin pelkässä fosfaattipuskurissa, jota tavallisesti käytetään kaupallisten reagenssien valmistukseen veriheran kokonaiskolesterolin määritystä varten, vielä riittävän stabiliteetin, kuitenkin menettää yllättävän nopeasti aktiivisuutensa, jos fosfaattipuskuriliuos sisältää yllämainittua lajia olevaa pinta-aktiivista ainetta, siis esim. valmistetta Triton X-100 tai isotridekyylieetteriä aktivaattorina. Niin ollen tällaista ainetta ei voida ilman muuta lisätä reagenssiliuok-siin, joilta käyttökelpoisuus- ja kustannussyistä vaaditaan riittävää, vähintään tekniikan tasoa muuta alkuperää olevissa kolesteroliesteraaseissa vastaavaa varastointikestävyyttä.

Niinpä keksinnön tarkoituksena on poistaa tämä huomattava epäkohta ja aikaansaada menetelmä, jonka avulla kolesteroli-esteraasi tulee siten stabiloiduksi, että sitä käyttövalmiissa reagenssissa voidaan säilyttää verraten pitkän ajan, vähintään 3-5 vuorokautta huoneenlämpötilassa ilman olennaista aktiivisuuden menetystä.

77262 4 Tämä tavoite saavutetaan keksinnön mukaisesti sellaisella menetelmällä pseudomonadeista peräisin olevan kolesteroliesteraasin vesiliuosten stabiloimiseksi, erikoisesti pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa, jolle on tunnusomaista, että entsyymi liuotetaan fosfaattia sisältämättömään puskuriin, joka sisältää 10-200 mmoolia/1 magnesiumioneja.

Sopivimmin sovitetaan magnesiumionien pitoisuus välille 25-150 mmoolia/1, erikoisen sopivasti välille 50-100 mmoolia/1.

Puskureina tulevat kyseeseen sellaiset aineet kuin tris/tris-HC1, trietanoliamiini/trietanoliamiini-HCl, imidatsoli, HEPES, MOPS ja muut fosfaattia sisältämättömät puskuriseokset. Edullisinta on käyttää Tris-puskuria. Puskuriliuoksen pH-arvo on välillä 5,0-9,0, sopivammin välillä 6,5-9,0 ja sopivimmin välillä 7,5-8,5, varsinkin kun Tris-puskuria käytetään.

Fosfaatin stabiloitumattomaksi tekevä vaikutus pseudomonadi-entsyymissä, erikoisesti pinta-aktiivisten aineiden läsnäollessa, on yllättävää, eikä se ollut johdettavissa kolesterolies-teraaseja käsittelevästä kirjallisuusmateriaalista.

Niinpä julkaisussa J. Biol. Chem. (1957) 228, 447-457 on esitetty sianhaimasta peräisin oleva kolesteroliesteraasi, jonka entsymaattinen aktiivisuus fosfaattipuskurissa mitataan tauro-kolaatin ollessa aktivaattorina. Fosfaattipuskurin haitallista vaikutusta entsyymin ominaisuuksiin ei tässä julkaisussa mainita.

Edelleen esiintyy mainintoja kolesteroliesteraasien ominaisuuksista useissa kirjallisuuden kohdissa, kuten esim. seuraavissa: J. Biol. Chem. (1974) 75i, 1073-1079, Biochim. Biophys. Acta (1971) 231, 194-197, Arch. Biochem. Biophys. (1963) 100, 360-363, elin. Chem. (1974) 20^, 470-475 sekä Biochim. Biophys. Acta (1975) 384, 138-145. Kaikissa mainituissa julkaisuissa entsyymiaktiivisuuden määritys suoritetaan fosfaattipuskuripitoisissa liuoksissa, jotka osaksi sisältävät pinta-aktiivisia aineita, minkä yhteydessä ei ilmoiteta fosfaatin epästabiloivaa vaikutusta eikä magnesiumsuo-lojen stabiloivaa vaikutusta kolesteroliesteraaseihin.

Vastaavasti on laita kirjallisuuden niiden kohtien suhteen, joissa käsitellään mikrobeista peräisin olevia kolesteroliesteraaseja.

Il 5 77262

Mikrobeista peräisin olevan kolesteroliesteraasin käyttö reagenssissa veriherankolesterolin kokonaisentsymaattista määritystä varten on selostettu julkaisussa Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. (1974) 1_2, 403-407. Reagenssi sisältää deter-genttinä toimivan valmisteen Thesit ohella suhteellisen suuren pitoisuuden ammoniumfosfaattipuskuria/ minkä yhteydessä viitataan erikoisesti esteraasia sisältävän reagenssin hyvään stabiliteettiin.

Pseudomonasfluorescens-bakteereista peräisin oleva kolesteroliesteraasin ominaisuuksia selostetaan julkaisussa Agric. Biol. Chem. (1975) 39^, 1511-1512. Entsyymin aktiivisuus määritetään julkaisussa Clin. Chem. (1974) 2Q, 470-475 selostetun menetelmän perusteella, reagenssin ollessa myös tässä tapauksessa puskuroituna fosfaatilla.

Fosfaatti-ionien destabiloiva vaikutus pseudomonadeista peräisin olevaan kolesteroliesteraasiin pinta-aktiivisten aineiden läsnäollessa ei niin ollen ole ollut tunnettu, niin ettei myöskään ollut mitään syytä pitää fosfaatti-ioneja erillään tällaisten kolesteroliesteraasien vesiliuoksesta.

Yhtä vähän on ollut aavistettavissa, että tämä vaikutus voidaan poistaa lisäämällä magnesiumioneja yllä mainitulla alueella olevassa pitoisuudessa.

Keksinnöllä on tosin erikoisesti merkitystä pseudomonadeista peräisin olevien kolesteroliesteraasien stabiloinnin suhteen liuoksissa, jotka sisältävät myös pinta-aktiivisen aineen, mutta kuitenkin voidaan keksinnön mukaisesti näiden entsyymien aktiivisuuden parempi säilyvyys vesiliuoksessa saavuttaa myös silloin, kun ei mitään pinta-aktiivista ainetta ole läsnä.

Pseudomonadeista peräisin oleva kolesteroliesteraasi on tunnettu ja kaupallisesti saatavissa. Se löydettiin jo useissa pseudomonadien kantalajeissa, kuten esimerkiksi lajissa Pseudomonasfluorescens (DE-OS 28 19 384) tai Pseudomonas sp. (DE-OS 29 33 646) . Kaikissa tutkituissa pseudomonadeista peräisin olevissa kolesteroliesteraasivalmisteissa osoittautui 6 77262 keksinnön mukainen menetelmä erittäin tehokkaaksi riippumatta siitä, mitä kolesteroliesteraasia sisältävää pseudomonadi-kantalajia käytettiin entsyymin lähteenä. Tämä ilmenee niistä kokeista, jotka suoritettiin käyttäen seuraavia aineita: Pseudomonas sp DSM 1280, kaupallinen Pseudomonasfluorescens-lajista peräisin oleva kolesteroliesteraasi (SIGMA, Kat. Nr.

C 2770) ja Pseudomonas sp DSM 1281 - kolesteroliesteraasi. Näistä kolmesta Pseudomonas-kantalajista peräisin oleva kolesteroliesteraasia tutkittiin kulloinkin liuoksessa, joka sisälsi pinta-aktiivisena aineena 10 mmoolia natriumkolaattia ja 0,3 % polyetoksirasva-alkoholieetteriä. Tulokset on esitetty oheisessa piirustuksessa.

Piirustuksessa esittää kuvio 1 graafista esitystä, johon on prosentteina merkitty aktiivisuus lämpötilassa 25°C suoritetun varastoinnin aikana. Ympyröiden kautta piirretty käyrä tarkoittaa entsyymiliuosta K-fosfaattipuskurissa, 0,1 moolia/1, pH 7,6, kolmioiden kautta piirretty käyrä tarkoittaa entsyymiä Tris x HCl-pus-kurissa, 0,1 moolia/1, ph 7,0, ja mustien pisteiden kautta piirretty käyrä puskuria Tris x HCl, 0,1 moolia/1, pH 7,6, joka sisältää 50 mmoolia/1 magnesiumaspartaattia, kuvio 2 kuviota 1 vastaavaa graafista esitystä, koskien kuitenkin bakteereista Pseudomonas fluorescens peräisin olevaa kaupallista esteraasia, kuvio 3 kuviota 1 vastaavaa graafista esitystä, koskien kuitenkin bakteereista Pseudomonas sp DSM 1281 peräisin olevaa kolesteroliesteraasia.

Magnesiumionit voidaan lisätä minkä tahansa sellaisen magne-siumsuolan muodossa, jonka anionilla ei ole mitään haitallista vaikutusta mihinkään entsyymiliuoksen aineosaan. Epäorgaanisten happojen magnesiumsuolojen, kuten magnesiumkloridin tai magnesiumsulfaatin ohella ovat ennen kaikkea orgaanisten happojen, kuten rasvahappojen, dikarbonihappojen ja aminohappojen magnesiumsuolat sopivia. Edullisimpia ovat aminohappojen magnesiumsuolat, erikoisesti magnesiumaspartaatti.

Il 7 77262

Magnesiumionien stabiloivassa vaikutuksessa pseudomonadeista peräisin olevaan kolesteroliesteraasiin ei ole kysymyksessä aktivoiva vaikutus. Tätä osoittaa se, ettei pinta-aktiivista ainetta sisältävässä liuoksessa esiinny aktiivisuuden suhteen mitään erotusta riippumatta siitä, lisätäänkö magnesiumsspar-taattia tai keittosuolaa vastaavissa pitoisuuksissa, joista jälkimmäinen ei omaa mitään stabiloivaa vaikutusta. Edelleen tätä osoittaa se, että detergenttipitoisessa fosfaattipuskurissa suoritetun varastoinnin johdosta erittäin inaktivoitu-nut pseudomonadeista peräisin oleva kolesteroliesteraasi lisättäessä jälkeenpäin magnesiumsuoloja suurimmissakin pitoisuuksissa, ts. liukenemisrajaan saakka fosfaattipuskurissa, ei aktivoidu uudelleen.

Keksinnön avulla on mahdollista ominaisuuksiensa johdosta esteröidyn kolesterolin määritykseen erittäin hyvin soveltuva pseudomonadeista peräisin oleva kolesteroliesteraasi stabiloida vesiliuoksessa siten, että tavoiteltu kestävyys saavutetaan .

Keksinnön mukaisesti saavutettua parannettua stabiliteettia selitetään edelleen seuraavien esimerkkien avulla. Näissä esimerkeissä käytetään seuraavia lyhennyksiä: CHE = pseudomonadeista peräisin oleva kolesteroliesteraasi HEPES = n-2-hydroksietyylipiperatsii- ni-n'-etaanisulfonihappo

Tris = tris(hydroksimetyyli)aminometaani

Isotridekyylieetteri = polyoksietyleeni-isotridekyylieetteri

Thesit = polyoksietyleenidodekyylieetteri MOPS = 3-(n-morfolino)propaanisulfonihappo

Triton X-10(f^ = polyoksietyleeni-iso-oktyylife- nyylieetteri

Lutensol®ON 60 tai ON 70 = polyoksietyleenirasva-alkoholi- eetteri 8 77262

Esimerkki 1

Esteraasin CHE stabiliteettia tutkittiin lämpötilassa 25°C

2+ erilaisissa puskureissa, joihin oli lisätty Mg -ioneja tai niitä lisäämättä. Taulukossa 1 on esitetty neljällä eri puskurilla ja kahdella eri pinta-aktiivisella aineella ilman magnesiumlisäystä saadut tulokset. Taulukossa 2 on esitetty vastaavat tulokset lisättäessä 50 mmol/1 Mg + -io-neja. Kaikissa tapauksissa lisättiin 10 mmoolia/1 kolaat-tia ja 0,3 % kulloinkin mainittua ei-ionista pinta-aktiivista ainetta.

Taulukko 1

Ei-ioninen Puskuri CHE-stabiliteetti (%) pinta-aktiivinen 100 mmol/1 1d 2d 4d 7d 10d 14d aine K-fosfaatti 21 14 11 0 pH = 7,6

Isotridekyyli- Tris 77 61 39 16 5 0 eetteri pH = 7,6

Imidatsoli 78 72 50 10 8 6 pH = 7,6 MOPS 87 74 43 46 33 27 pH = 7,0 K-fosfaatti 2 0

Tris 58 34 0

Triton X-100 Imidatsoli 57 35 10 2 0 MOPS 76 53 20 9 7 0

II

Ei-ioninen Puskuri CHE-stabiliteetti (%) pinta-aktiivinen 1d 1d 4d 7d 10d 14d aine lilt! 9

Taulukko 2

Tris 102 102 83 52 45 40 pH = 7,6

Isotridekyyli- Imidatsoli 84 87 71 55 43 38 eetteri pH = 7,6 MOPS 96 82 63 61 58 56 pH = 7,0

Tris 85 77 50 36 35 30

Triton X-100 Imidatsoli 75 60 33 25 30 20 MOPS 92 82 53 51 45 34

Edellä saadut tulokset osoittavat, että käytettäessä keksinnön mukaista fosfaattia sisältämättömän puskurin ja magne-siumionien yhdistelmää stabiliteetti paranee olennaisesti.

Esimerkki 2

Stabiloivan vaikutuksen riippuvuutta magnesiumpitoisuudesta tutkittiin lämpötilassa 25°C 100 mmol/1 Tris-puskurissa, pH 7,6. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 3. Pinta-aktiivisten aineiden suhteen pätevät esimerkissä 1 mainitut tiedot.

Ei-ioninen Mg -pitoisuus CHE-stabiliteetti (%) pinta-aktiivinen mmol/1 1d 2d 4d 7d 10d 14d aine 10 77262

Taulukko 3 2 + 0 77 61 39 16 5 0 10 102 94 81 53 33 33

Isotridekyyli- 50 102 102 83 52 45 40 eetteri 100 98 92 79 64 56 49 150 104 102 93 68 61 56 0 58 34 0 30 65 51 17 19 10 7

Triton X-100 50 85 77 50 36 35 30 100 93 85 66 43 35 32 150 96 81 35 34 31 30

Taulukossa 3 esitetyistä tuloksista ilmenee, että jo Mg^+-pi-toisuuden ollessa 10 mmol/1 stabiliteetti olennaisesti suurenee.

Esimerkki 3

Samoin kuin esimerkissä 1 esteraasin CHE stabiliteettia tutkittiin sekä magnesiumionilisäyksellä että ilman sitä eri puskurien ja eri pinta-aktiivisten aineiden yhteydessä.

Toisin kuin esimerkissä 1 liuosta pidettiin kuitenkin lämpötilassa 4°C.

Taulukossa 4 on esitetty stabiliteetti ilman magnesiumia, 2 + taulukossa 5 Mg -pitoisuuden ollessa 50 mmol/1.

Il 77262

Ei-ioninen Puskuri CHE-stabiliteetti (%) pinta-aktiivinen 2d 4d 7d 14d 21d 28d 35d 42d aine 1 1

Taulukko 4 K-fosfaatti 35 13 2 0 pH = 7,6

Isotridekyyli- eetteri Tris 93 63 54 48 32 28 21 18 pH = 7,6

Imidatsoli 85 60 57 50 37 28 28 22 pH = 7,6 MOPS 81 60 58 60 60 55 47 40 pH = 7,0 K-fosfaatti 29 13 13 8 0

Triton X-100 Tris 58 35 31 25 13 6 2 0

Imidatsoli 65 43 35 35 35 30 24 20 MOPS 74 47 36 29 17 11 8 7

Taulukko 5

Ei-ioninen Puskuri CHE-stabiliteetti (%) pinta-aktiivinen 2d 4d 7d 14d 21d 28d 35d 42d aine

Isotridekyyli- Tris 110 77 75 75 67 67 55 58 eetteri pH = 7,6

Imidatsoli 89 62 78 60 53 55 47 47 pH = 7,6 MOPS 87 44 73 71 69 69 55 56 pH = 7,0

Triton X-100 Tris 67 45 63 49 55 55 45 38

Imidatsoli 102 62 60 50 45 40 35 30 MOPS 79 55 43 45 32 26 17 18

Taulukon 5 arvojen vertailu taulukon 2 arvojen kanssa osoittaa, että keksinnön mukaisesti stabiliteetti huoneenlämpötilassa on yhtä hyvä kuin jäähdytystilassa.

Esimerkki 4

Samoin kuin esimerkissä 2 tutkittiin CHE-stabiliteetin riippuvuutta Mg2+-ionipitoisuudesta, tosin lämpötilassa 4°C.

Kaikki muut olosuhteet olivat samat kuin esimerkissä 2.

12 77262

Tulokset on esitetty taulukossa 6.

Taulukko 6 2 +

Ei-ioninen Mg -pitoisuus CHE-stabiliteetti (%) pinta-aktiivinen mmol/1 2d 4d 7d 14d 21d 28d 35d 42d aine 0 93 63 54 48 32 28 21 18 10 110 74 69 71 61 61 46 46

Isotridekyyli- 50 110 77 75 75 67 67 55 58 eetteri 100 92 66 72 68 56 70 62 59 150 93 79 81 77 70 70 63 63 0 58 35 31 25 13 6 2 0

Triton X-100 10 71 44 47 34 30 22 22 17 50 67 45 63 49 55 55 45 38 100 97 58 48 26 25 24 26 24 150 95 61 65 52 46 65 52 46

II

Claims (3)

13 77262 Eatenttivaatimukset

1. Pörfarande för stabilisering av vattenlösningar av kolesteroleeteras härstammande frän pseudomonader, speciellt i närvaro av ett ytaktivt medel, kännetecknat av att enzyme t loses i en fosfatfri buffert innehällande 10-200 mmol/1 magnesiumjoner.

1. Menetelmä pseudomonadeieta peräisin olevan koleatero-liesteraasin vesiliuosten stabiloimiseksi, erikoisesti pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa, tunnettu siitä, että ent-eyymi liuotetaan fosfaattia sisältämättömään puskuriin, joka sisältää 10-200 mmoolia/1 magnesiumioneja.

2. Pörfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att 25-150 mmol/1 magnesiumjoner tillsättes.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että magnesiumioneja lisätään 25-150 mmoolia/1.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään puskuria, jonka pH on välillä 5,0-9,0.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään puskuria, jonka pH on välillä 6,5-9,0.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aktivointiaineeksi lisätään anio-nista ja/tai ei-ionista pinta-aktiivista ainetta.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat av att en buffert används, vara pH är 5,0-9,0.