CN101328498B - 一种通用、实时的核酸酶荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通用、实时的核酸酶荧光检测方法，在核酸酶及其底物DNA的反应体系中加入含通用序列的单链核酸模板和通用分子信标核酸探针，并在DNA聚合酶作用下实时监测荧光信号，根据荧光信号的变化情况对核酸酶的活性进行分析，其中所述单链核酸模板3’端具有与核酸酶作用产物片段相结合的特异结合区，5’端具有与通用分子信标相结合的通用序列区，当通用分子信标被核酸酶作用产物片段延伸后取代下来时荧光淬灭，从而产生可检测的信号。本发明可通用、低廉、灵敏、准确地应用于各种基因检测体系和相关的核酸酶活性分析，不仅操作方便，而且费用大大降低，对于各种疾病早期检测、疗效评价、人群普查及遗传分析等均有很高的实用价值。

Description

一种通用、实时的核酸酶荧光检测方法

技术领域

本发明涉及限制性内切酶、磷酸激酶等核酸酶活性分析检测领域，更具体地，涉及一种通用序列模板分析核酸酶活性的方法。

背景技术

DNA是生命重要的遗传物质，这与各种核酸酶特殊的活性之间有着直接的关系。核酸酶的功能往往体现在与DNA的相互作用之中，例如，核酸的延伸、校正、连接、磷酸化、去磷酸化、酶切等重要的生命过程。因此，快速简便的核酸酶的动力学分析方法为研究生物多样性和深入理解生命现象有着重要意义。

核酸酶活性分析，通过研究酶切产物的方法有凝胶电泳、高效液相色谱、filter binding等。这些方法都是不连续性分析，操作麻烦、费时、费用高，无法快速、方便地获取分析结果，而且一般是采用放射性标记来提高灵敏度。采用增色效应紫外分析法可进行酶切的连续检测，但是可检测底物浓度的范围较窄。酶联免疫吸附方法(ELISA)也被用于酶切反应的研究，但也是一种不连续的分析体系。近几年来，随着荧光核酸探针的发展，出现了一些新的分析技术和方法来检测核酸的切割过程，主要是通过荧光共振能量转移对目标DNA切割前后体系荧光的变化进行实时的监测。其中分子信标(Molecular Beacon)核酸探针应用最为广泛。分子信标是呈发夹结构的短链DNA，一端标记荧光基团，一端标记淬灭基团。在进行核酸酶活性分析中，将分子信标设计成特异的序列与核酸酶相互作用导致分子信标的构象发生变化，从而由荧光信号实时指示核酸酶的动力学作用过程。对不同的核酸酶的活性研究，所采用的分子信标都是目标序列特异性的，对于不同的体系都要根据目标物重新设计分子信标，重新优化分子信标序列，优化反应条件，工作量大，设计繁琐，这些问题限制了其在临床实验室环境下用于常规操作时的应用性，而且检测费用昂贵。最困难的问题之一是，在不同实验室的检测体系选用的分子信标探针序列不一样，检测模式差别较大，对于不同的核酸酶活性分析不易进行对比分析。

因此，迫切需要出开发普及性高、易用、灵敏、价廉、准确地核酸酶活性分析技术。

发明内容

本发明的目的提供一种可用于检测核酸酶活性的易用、灵敏、低廉、准确的分析技术，以克服现有技术中的许多局限。

本发明的技术方案如下：

一种核酸酶荧光检测方法，在核酸酶及其底物DNA的反应体系中加入含通用序列的单链核酸模板和通用分子信标核酸探针，并在DNA聚合酶作用下实时监测荧光信号，根据荧光信号的变化情况对核酸酶的活性进行分析，其中：

所述单链核酸模板包括：a)特异结合区，位于单链核酸模板的3’端，用于特异性结合核酸酶与底物DNA相互作用的产物片段；b)通用序列区，位于单链核酸模板的5’端，用于与通用分子信标核酸探针相结合；

所述通用分子信标核酸探针5’端标记荧光基团(比如FAM，TET，HEX，ROX，CY5，TAMRA)，3’端标记淬灭基团(如DABCYL)，该探针在游离状态下形成茎环的发卡结构时荧光淬灭，环部15-30个碱基，茎部4-7对互补碱基，其中环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列与单链核酸模板的通用序列区互补。

上述单链核酸模板的通用序列区与通用分子信标核酸探针结合的T_m值应高于其特异结合区与核酸酶作用的产物片段结合的T_m值。

通用分子信标核酸探针的数量通常等于单链核酸模板的数量。当所述通用分子信标核酸探针与所述单链核酸模板特异性结合时释放荧光(如图1所示)，当通用分子信标核酸探针被核酸酶作用产物片段延伸后取代下来时荧光淬灭，从而产生可检测的信号。

分子信标常用的各荧光基团和淬灭基团的中英文全称见表1。

表1.分子信标5’和3’的荧光基团和淬灭基团标记的中英文全称

缩写	英文全称	中文名
			FAM	6-carboxy-fluorescein；494；518green	6-羧基荧光素
TET	5-tetrachloro-fluorescein 521；538orange	5-四氯荧光素
			HEX	5-hexachloro-fluorescein 535；553；pink	5-六氯荧光素
ROX	6-carboxy-x-rhodamine；587；607；red	6-羧基罗丹明x
			CY5	Indodicarbocyanine；643；667；violet	N，N′-对羧苄基吲哚三菁
TAMRA	tetramethyl-6-carboxyrhodamine；560；582；rose	6-羧基四甲基罗丹明
			DABCYL	4-(4′-dimethylaminophenylazo)benzoic acid	4-(4′-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸

本发明的核酸酶检测方法原则上归为引物扩增取代分子信标的反应，其关键是使用通用适合的DNA杂交序列对作为分子信标核酸探针和模板的通用序列。上述通用分子信标核酸探针的环部优选为十个AG的重复序列，5’端茎部序列优选为5’-CCGGG-3’。

通用分子信标核酸探针与单链核酸模板的杂交可以有三种情况：环部和5’茎部，环部和两端茎部，或者仅环部与单链核酸模板的通用序列区结合。通用序列区的长度一般为25bp。单链核酸模板的通用序列区与通用分子信标核酸探针结合的T_m值通常比其特异结合区与核酸酶作用产物片段结合的T_m值高出2-20℃，较佳的高出5-12℃。

在本发明的单链核酸模板中，对所述特异结合区的长度没有特别限制，通常长度为5-25bp。该单链核酸模板可以是一般的单链DNA，也可以在3’端形成自杂交的双链构型，自杂交的的碱基互补数大于4个，一般以5-10为宜，这种自杂交形成的双链DNA作为核酸酶的作用底物。

在本发明中，选用的DNA聚合酶必须具有链取代活性(即具有取代双链DNA其中一条链的活性)，而且没有3’外切活性，这样才可以实现对通用分子信标的取代并保证分子信标的完整性。

在本发明中，对待测核酸酶没有限制，代表性的核酸酶包括但并不限于：DNA限制性内切酶和DNA磷酸激酶。

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“DNA”：脱氧核糖核酸。

“目标物”：待直接或间接检测的核酸酶。

“单链核酸模板”：单链核酸模板是合成的寡核苷酸序列，其3’端是特异结合区，与核酸酶作用产物片段特异性结合，在DNA聚合酶作用下反应；其5’端是通用序列区，与通用分子信标结合。单链核酸模板可以用本领域技术人员已知的各种方法合成。

“通用分子信标(Universal molecular beacon，U-MB)”：是一种茎环结构的寡核苷酸片段，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，所述通用分子信标在下列两种情况下状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于单链核酸模板的通用序列区，(ii)通用分子信标被核酸酶作用产物片段延伸取代下来。

本发明可通用、价廉、灵敏、准确地应用于各种基因检测体系和相关的核酸酶活性分析，不仅操作方便，而且费用大大降低，对于各种疾病早期检测、疗效评价、人群普查及遗传分析等均有很高的实用价值。本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

(1)通用性，可建立标准分析体系，有利于不同的核酸酶活性比较。本发明创造性地通过将单链核酸模板的通用序列与分子信标特异性结合，实现了分子信标与目标检测体系没有序列相关性，而又可以做为指示信号进行反应的检测。

(2)高准确性，该体系分子信标与通用序列特异性结合，而且5’茎部或两端茎部也可与通用序列结合，比常规的分子信标实时荧光检测体系的结合更加稳定，而且能减少与核酸酶底物序列的非特异性结合，减少假阳性现象。

(3)简化检测，现有技术在对不同体系进行核酸酶活性分析时，不同酶的特异性作用的分子信标的碱基序列不同，反应最佳条件各不相同，因此，优化检测条件步骤繁琐，费用高。使用本发明，更换检测体系不需要重新设计、优化分子信标，便于对大量不同体系进行核酸酶活性分析，而且可实现同系列酶反应体系条件标准化，从而实现在一管中对多种目标的检测。

(4)降低成本，在现有核酸酶分析检测技术中，对于不同检测体系都有特异的分子信标探针，而在本发明中，不同的目标体系只需一种分子信标探针，因此，大大降低设计、合成成本。

(5)为核酸酶活性分析提供了一种高通量、实时、简便的方法。利用实时荧光PCR仪器可以高通量进行核酸酶活性分析，大大提高检测效率，而且采用同一种检测模式和分子信标探针，为不同核酸酶活性差异的对比提供了有效分析依据。

附图说明

图1是本发明的单链核酸模板与通用分子信标结合的结构示意图。

图2是本发明实施例1进行限制性内切酶活性分析方法的原理示意图。

图3是本发明实施例2进行磷酸激酶去磷酸活性分析方法的原理示意图。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例进一步阐述本发明。本领域的技术人员应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1<限制性内切酶EcoR I活性分析>

在该例子中，使用通用分子信标、单链核酸模板进行DNA限制性内切酶活性检测。检测原理参见图2，具体步骤如下：

1、将含有限制性内切酶作用位点的底物DNA、通用分子信标、单链核酸模板置于反应体系中，在合适的条件下发生杂交反应，即通用分子信标的环部和5’茎部与单链核酸模板5’端杂交。

2、在反应体系中加入限制性内切酶和DNA聚合酶。

3、限制性内切酶作用于底物DNA。

4、限制性内切酶体系切割底物DNA，产物发生变性，有一条游离切割片段与单链核酸模板杂交作为后续反应引物。

5、在DNA聚合酶作用下引物延伸，通用分子信标被取代，恢复茎环结构，从而产生可检测信号。

6、重复步骤4和5。

在经过若干循环后，通用分子信标被取代恢复茎环结构产生的可检测信号也是成指数级下降的。荧光信号用实时荧光PCR仪Strategene 3000p进行检测。

在本发明进行限制性内切酶活性分析体系中，限制性内切酶作用底物的DNA识别序列的侧翼通常不要超过6bp。

对于限制性内切酶EcoR I的活性分析，设计了如下序列：

通用分子信标为：5’-FAM-CCGGG(AG)₁₀CCCGG-DABCYL-3’(SEQ ID No.1)

单链核酸模板为：5’-(CT)₁₀CCGGAATT-3’(SEQ ID No.2)

限制性内切酶EcoR I作用底物(两条链自身互补)：5’-CCGGAATTCCGG-3’(下划线为酶切识别序列)(SEQ ID No.3)

不同底物浓度的50μL反应体系：DNA聚合酶(Klenow大片段)1.5U，通用分子信标、模板浓度均为160nM，EcoR I：5U，底物DNA浓度分别为：30、68、126、250、400、520、640nM。

空白对照体系：DNA聚合酶(Klenow大片段)1.5U，通用分子信标、模板浓度均为160nM，底物DNA浓度：68nM。

PCR方案是：37℃1000秒，每4s检测一次荧光强度。

检测时使用的检测仪器为实时荧光PCR仪Strategene 3000p，激发光源为石英卤钨灯，波长为492nm。

检测结果：在反应前200s内，空白对照体系荧光强度变化不大，波动在3％左右，不同浓度底物DNA检测，反应200个循环后，荧光淬灭效率依次为：10％，15％，20％，30％，65％，80％，85％。

用上述模板、底物及相应的通用分子信标探针在Strategene 3000p进行检测。结果加入EcoR I，产生荧光下降现象，而且随着所加入的底物DNA依次增加，荧光下降速率增大，而空白对照样品均未出现荧光下降信号。

实施例2<磷酸激酶T4PNK去磷酸化活性分析>

在该例子中，使用通用分子信标和单链核酸模板进行磷酸激酶的去磷酸化活性检测。检测原理参见图3，具体步骤如下：

1、将通用分子信标和单链核酸模板置于反应体系，该单链核酸模板的3’端磷酸化并在3’端形成自杂交双链构型，在合适的条件下通用分子信标的环部和5’茎部与单链核酸模板5’端杂交。

2、反应体系中加入DNA聚合酶和磷酸激酶。

3、磷酸激酶作用于单链核酸模板，3’端去磷酸化。

4、在DNA聚合酶作用下发生延伸反应，分子信标被取代，恢复茎环结构，从而产生可检测信号。

5：重复步骤3和4。

在经过若干循环后，通用分子信标被取代恢复茎环结构产生的可检测信号也是成指数级下降的。荧光信号用实时荧光PCR仪Strategene 3000p进行检测。

在该实施例中，具体设计了如下序列：

通用分子信标为：5’-FAM-CCGGG(AG)₁₀CCCGG-DABCYL-3’(SEQ ID No.1)

单链核酸模板为：5’-(CT)₁₀CCGGGAGTTGCGCACCTAAAGGGTGCG-P-3’(该模板3’磷酸化，下划线部分互补，形成3’端自杂交构型)(SEQ ID No.4)

不同磷酸激酶浓度的50μL反应体系：DNA聚合酶(Klenow大片段)10U，通用分子信标、模板浓度均为200nM，dNTPs：0.4nM，磷酸激酶分别为：1，5，10，20，30U。

空白对照体系：DNA聚合酶(Klenow大片段)10U，通用分子信标、模板浓度均为200nM。

PCR方案是：37℃1000秒，每4s检测一次荧光强度。

检测时使用的检测仪器为实时荧光PCR仪Strategene 3000p，激发光源为石英卤钨灯，波长为492nm。

检测结果：在反应前200s，空白对照体系荧光强度变化不大，波动在3％左右，不同浓度磷酸激酶检测体系反应200个循环后，荧光淬灭效率依次为：5％，15％，25％，35％，40％。

用上述模板及相应的通用分子信标探针在Strategene 3000p进行检测。结果加入磷酸激酶T4PNK，产生荧光下降现象，而且随着磷酸激酶T4PNK依次增加，荧光下降速率增大，而空白对照样品均未出现荧光下降信号。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京大学

<120>一种通用、实时的核酸酶荧光检测方法

<130>JSP080171

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccgggagaga gagagagaga gagagcccgg                                  30

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctctctctct ctctctctct ccggaatt                                    28

<210>3

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ccggaattcc gg                                                     12

<210>4

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctctctctct ctctctctct ccgggagttg cgcacctaaa gggtgcg               47

Claims (9)

1.一种核酸酶荧光检测方法，在核酸酶及其底物DNA的反应体系中加入含通用序列的单链核酸模板和通用分子信标核酸探针，并在DNA聚合酶作用下实时监测荧光信号，根据荧光信号的变化情况对核酸酶的活性进行分析，其中：所述核酸酶为DNA限制性内切酶或DNA磷酸激酶；所述单链核酸模板包括：a)特异结合区，位于单链核酸模板的3’端，用于特异性结合核酸酶与底物DNA相互作用的产物片段；b)通用序列区，位于单链核酸模板的5’端，用于与通用分子信标核酸探针相结合；所述通用分子信标核酸探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，该探针在游离状态下形成茎环的发卡结构时荧光淬灭，环部为15-30个碱基，茎部为4-7对互补碱基，环部或环部与5’端茎部或环部与两端茎部的序列与单链核酸模板的通用序列区互补；单链核酸模板的通用序列区与通用分子信标核酸探针结合的T_m值高于其特异结合区与核酸酶作用的产物片段结合的T_m值。

2.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述荧光基团为6-羧基荧光素、5-四氯荧光素、5-六氯荧光素、6-羧基罗丹明x、N，N′-对羧苄基吲哚三菁或6-羧基四甲基罗丹明，所述淬灭基团为4-(4′-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸。

3.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述通用分子信标核酸探针的环部为十个AG的重复序列。

4.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述通用分子信标核酸探针的5’端茎部序列为5’-CCGGG-3’。

5.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述单链核酸模板的通用序列区与通用分子信标核酸探针结合的T_m值比其特异结合区与核酸酶作用产物片段结合的T_m值高出2-20℃。

6.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述单链核酸模板特异结合区的长度为5-25bp。

7.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述核酸酶为DNA限制性内切酶，其底物DNA在限制性内切酶识别序列两端的侧翼不超过6bp。

8.如权利要求1所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述核酸酶为DNA磷酸激酶，在检测其去磷酸化活性时，所述单链核酸模板的3’端磷酸化，且在3’端形成自杂交的双链构型作为DNA磷酸激酶的作用底物。

9.如权利要求1～8中任一权利要求所述的核酸酶荧光检测方法，其特征在于：所述DNA聚合酶具有链取代活性，而且没有3’外切活性。

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