CN113237940B - 一种快速检测黄曲霉毒素的方法 - Google Patents

一种快速检测黄曲霉毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测黄曲霉毒素的方法，属于生物传感检测技术领域。其包括以下步骤：采用检测电极对不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液进行修饰，通过与饱和甘汞电极、铂丝电极共同组成三电极系统连接到光电化学检测设备，绘制光信号强度与黄曲霉毒素毒素标准溶液浓度关系的工作曲线，通过待测样品同样进行检测，根据工作曲线和响应光信号强度降低的差值ΔD，得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。本发明的快速检测黄曲霉毒素的方法，能够在室温条件下检测极低浓度的黄曲霉毒素，表现出高灵敏，稳定性高、特异性强。

Description

一种快速检测黄曲霉毒素的方法
技术领域
本发明涉及生物传感检测技术领域，具体涉及一种快速检测黄曲霉毒素的方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2等几种。黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌物，毒性比砒霜大68倍，仅次于肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种检出率更高。
目前，检测黄曲霉毒素的方法主要有色谱法、质谱法等。此类方法仪器贵重、操作复杂，化验人员需要专业培训后才能进行检测。因此，研发成本低、检测快、灵敏度高、特异性强的黄曲霉毒素传感器具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测黄曲霉毒素的方法，以解决现有检测黄曲霉毒素中对设备要求高，操作复杂的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种快速检测黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：
(1)配置一组包括空白标样在内的不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液；
(2)将不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液分别滴涂在检测电极表面进行修饰，4℃冰箱中保存晾干，得到修饰电极；
(3)将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与修饰电极共同组成三电极系统，连接到光电化学检测设备上；在电解槽中分别加入15ml的K2S2O8溶液和100μl的H2O2溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；
根据测得光信号强度与黄曲霉毒素毒素标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；空白标样的光信号强度记为D0，含有不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液的光信号强度记为Di，响应光信号强度降低的差值为ΔD＝D0-Di，ΔD与黄曲霉毒素标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔD-C工作曲线；黄曲霉毒素的线性检测范围为：0.003～100ng/mL，检出限为：1.1pg/mL；
(4)用待测样品代替步骤(1)中的黄曲霉毒素标准溶液，按照步骤(2)和(3)的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔD和工作曲线，得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述检测电极包括：工作电极、GO-Bi2MoO6/g-C3N4、黄曲霉毒素抗体和牛血清白蛋白。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述检测电极的制备包括以下步骤：
(1)以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂1～10mg/ml的GO-Bi2MoO6/g-C3N4溶液；
(2)将步骤(1)中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂1～10mg/ml的黄曲霉毒素抗体溶液，4℃冰箱中保存晾干；
(3)将步骤(2)中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂1～10mg/ml的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中保存晾干。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述GO-Bi2MoO6/g-C3N4的制备包括以下步骤：
(1)将二氰二胺进行高温煅烧，研末后制得g-C3N4单体；
(2)将GO、g-C3N4单体和Bi(NO3)5·5H2O加入到水中，在搅拌状态下加入Na2MoO4·2H2O，搅拌反应0.5-1h；
(3)对反应液在120-150℃下加热反应10-20h，经过滤、洗涤、干燥，制得GO-Bi2MoO6/g-C3N4；
其中，二氰二胺、GO、Bi(NO3)5·5H2O和Na2MoO4·2H2O加入的摩尔比为(0.01-0.1)：1：(3-5)：(10-12)。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述GO-Bi2MoO6/g-C3N4的制备步骤(1)中煅烧温度为500-600℃。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的快速检测黄曲霉毒素的方法，能够在室温条件下检测极低浓度的黄曲霉毒素，表现出高灵敏，稳定性高、特异性强。
2、本发明利用将GO-Bi2MoO6/g-C3N4应用于光电化学生物传感器的制备中，显著提高了光生载流子的有效浓度，大大提高了光电化学传感器的检测灵敏度。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。在本申请下面实施例中的黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1。
实施例1：
本实施例的快速检测黄曲霉毒素的方法用检测电极包括：工作电极、GO-Bi2MoO6/g-C3N4、黄曲霉毒素抗体和牛血清白蛋白。
本实施例的快速检测黄曲霉毒素的方法用检测电极的制备包括以下步骤：
(1)以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂1mg/ml的GO-Bi2MoO6/g-C3N4溶液；
(2)将步骤(1)中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂1mg/ml的黄曲霉毒素抗体溶液，4℃冰箱中保存晾干；
(3)将步骤(2)中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂1mg/ml的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中保存晾干。
其中，GO-Bi2MoO6/g-C3N4的制备包括以下步骤：
(1)将二氰二胺进行500℃高温煅烧1-3h，研末后制得g-C3N4单体；
(2)将GO、g-C3N4单体和Bi(NO3)5·5H2O加入到水中，在搅拌状态下加入Na2MoO4·2H2O，搅拌反应0.5h；
(3)对反应液在120℃下加热反应10h，经过滤、洗涤、干燥，制得GO-Bi2MoO6/g-C3N4；
其中，二氰二胺、GO、Bi(NO3)5·5H2O和Na2MoO4·2H2O加入的摩尔比为0.01：1：3：10。
实施例2：
本实施例的快速检测黄曲霉毒素的方法用检测电极包括：工作电极、GO-Bi2MoO6/g-C3N4、黄曲霉毒素抗体和牛血清白蛋白。
本实施例的快速检测黄曲霉毒素的方法用检测电极的制备包括以下步骤：
(1)以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂5mg/ml的GO-Bi2MoO6/g-C3N4溶液；
(2)将步骤(1)中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂5mg/ml的黄曲霉毒素抗体溶液，4℃冰箱中保存晾干；
(3)将步骤(2)中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂5mg/ml的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中保存晾干。
其中，GO-Bi2MoO6/g-C3N4的制备包括以下步骤：
(1)将二氰二胺进行550℃高温煅烧2h，研末后制得g-C3N4单体；
(2)将GO、g-C3N4单体和Bi(NO3)5·5H2O加入到水中，在搅拌状态下加入Na2MoO4·2H2O，搅拌反应1h；
(3)对反应液在135℃下加热反应15h，经过滤、洗涤、干燥，制得GO-Bi2MoO6/g-C3N4；
其中，二氰二胺、GO、Bi(NO3)5·5H2O和Na2MoO4·2H2O加入的摩尔比为0.05：1：4：11。
实施例3：
本实施例的快速检测黄曲霉毒素的方法用检测电极包括：工作电极、GO-Bi2MoO6/g-C3N4、黄曲霉毒素抗体和牛血清白蛋白。
本实施例的快速检测黄曲霉毒素的方法用检测电极的制备包括以下步骤：
(1)以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂10mg/ml的GO-Bi2MoO6/g-C3N4溶液；
(2)将步骤(1)中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂10mg/ml的黄曲霉毒素抗体溶液，4℃冰箱中保存晾干；
(3)将步骤(2)中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂10mg/ml的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中保存晾干。
其中，GO-Bi2MoO6/g-C3N4的制备包括以下步骤：
(1)将二氰二胺进行600℃高温煅烧1-3h，研末后制得g-C3N4单体；
(2)将GO、g-C3N4单体和Bi(NO3)5·5H2O加入到水中，在搅拌状态下加入Na2MoO4·2H2O，搅拌反应1h；
(3)对反应液在150℃下加热反应20h，经过滤、洗涤、干燥，制得GO-Bi2MoO6/g-C3N4；
其中，二氰二胺、GO、Bi(NO3)5·5H2O和Na2MoO4·2H2O加入的摩尔比为0.1：1：3：10。
实施例4：
本实施例的快速检测黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：
(1)配置一组包括空白标样在内的不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液；
(2)将不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液分别滴涂在检测电极表面进行修饰，4℃冰箱中保存晾干，得到修饰电极；
(3)将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与修饰电极共同组成三电极系统，连接到光电化学检测设备上；在电解槽中分别加入15ml的K2S2O8溶液和100μl的H2O2溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；
根据测得光信号强度与黄曲霉毒素毒素标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；空白标样的光信号强度记为D0，含有不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液的光信号强度记为Di，响应光信号强度降低的差值为ΔD＝D0-Di，ΔD与黄曲霉毒素标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔD-C工作曲线；黄曲霉毒素的线性检测范围为：0.003～100ng/mL，检出限为：1.1pg/mL；
(4)用待测样品代替步骤(1)中的黄曲霉毒素标准溶液，按照步骤(2)和(3)的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔD和工作曲线，得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种快速检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配置一组包括空白标样在内的不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液；
（2）将不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液分别滴涂在检测电极表面进行修饰，4℃冰箱中保存晾干，得到修饰电极；
（3）将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与修饰电极共同组成三电极系统，连接到光电化学检测设备上；在电解槽中分别加入15ml的K2S2O8溶液和100μl的H2O2溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；
根据测得光信号强度与黄曲霉毒素毒素标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；空白标样的光信号强度记为D0，含有不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液的光信号强度记为Di，响应光信号强度降低的差值为ΔD=D0-Di，ΔD与黄曲霉毒素标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔD-C工作曲线；黄曲霉毒素的线性检测范围为：0.003~100ng/mL，检出限为：1.1pg/mL；
（4）用待测样品代替步骤（1）中的黄曲霉毒素标准溶液，按照步骤（2）和（3）的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔD和工作曲线，得到待测样品中黄曲霉毒素的含量；
其中，所述检测电极包括：工作电极、GO-Bi2MoO6/g-C3N4、黄曲霉毒素抗体和牛血清白蛋白；
所述检测电极的制备包括以下步骤：
（1）以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂1~10mg/ml的GO-Bi2MoO6/g-C3N4溶液；
（2）将步骤（1）中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂1~10mg/ml的黄曲霉毒素抗体溶液，4℃冰箱中保存晾干；
（3）将步骤（2）中处理后的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂1~10mg/ml的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中保存晾干；
所述GO-Bi2MoO6/g-C3N4的制备包括以下步骤：
（1）将二氰二胺进行高温煅烧，研末后制得g-C3N4单体；
（2）将GO、g-C3N4单体和Bi(NO3)5·5H2O加入到水中，在搅拌状态下加入Na2MoO4·2H2O，搅拌反应0.5-1h；
（3）对反应液在120-150℃下加热反应10-20h，经过滤、洗涤、干燥，制得GO-Bi2MoO6/g-C3N4；
其中，二氰二胺、GO、Bi(NO3)5·5H2O和Na2MoO4·2H2O加入的摩尔比为（0.01-0.1）：1：（3-5）：（10-12）。
2.根据权利要求1所述的快速检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。
3.根据权利要求1所述的快速检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述GO-Bi2MoO6/g-C3N4的制备步骤（1）中煅烧温度为500-600℃。
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