CN104328066A - 枯草芽孢杆菌h4及其制备的腐熟菌剂、腐熟菌剂的应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌h4及其制备的腐熟菌剂、腐熟菌剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌H4及其制备的腐熟菌剂、腐熟菌剂的应用，所述腐熟菌剂由短短芽孢杆菌H3冻干粉、枯草芽孢杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉以重量比为1:1:1:97构成；本发明提供一株新菌株--枯草芽孢杆菌H4，利用该菌株制备的腐熟菌剂具有耐高温，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的优点，利用所述腐熟菌剂堆肥具有环境污染小、经济易行等优点，堆肥处理后的产品经过后续处理，可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。

Description

枯草芽孢杆菌H4及其制备的腐熟菌剂、腐熟菌剂的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种腐熟菌剂，株枯草芽孢杆菌及应用，特别涉及一种腐熟菌剂、腐熟菌剂在处理富含蛋白质与脂肪的废弃物的应用及制备腐熟菌剂的新菌株--枯草芽孢杆菌H4。
(二)背景技术
有机废弃物常被当作垃圾送进垃圾场、焚化炉或者随意丢弃。开发利用有机废弃物的方法是非常必要的，不光能保护环境，而且能变废为宝。当前已经开发了不少利用有机废弃物的方法，但是大部分都是对纤维素、淀粉含量高的废弃物的利用，而对含蛋白质与脂肪较高的废弃物的利用方法则较少。
富含蛋白质与脂肪的废弃物(如动物类废弃物)，如果直接丢弃，将产生大量的污水、臭气，污染环境，并有可能导致病菌传播扩散，存在极大的安全隐患。目前世界范围内处理动物类废弃物的方法主要包括深埋法、焚化法、和炼油法。但这些方法都各自存在这一些诸如成本高、效率低或安全性差等不足之处。正是基于这一出发点，应用堆肥法处理动物类废弃物逐渐走入了人们的视线。堆肥法可以定义为利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等)或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化学过程。由于堆肥过程受微生物种类、环境温度等因素的影响较大，所以在没有人为添加菌剂的情况下堆肥发酵效率较低。所以亟待开发一种发酵效率高的菌剂以安全环保又经济的处理动物类废弃物。
本发明提供的菌剂具有耐高温，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的优点。利用该菌剂堆肥具有环境污染小、经济易行等优点，堆肥处理后的产品经过后续处理，可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种腐熟菌剂、腐熟菌剂在处理富含蛋白质和/或脂肪的废弃物的应用及制备腐熟菌剂的新菌株---枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)H4，所述腐熟菌剂能高效分解蛋白质、脂肪，在处理动物类废弃物方面有良好的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种腐熟菌剂，所述腐熟菌剂由短短芽孢杆菌H3冻干粉、枯草芽孢杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉构成，所述短短芽孢杆菌H3冻干粉与枯草芽孢杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉重量比为1:1:1:97；
所述短短芽孢杆菌H3冻干粉是由短短芽孢杆菌H3经发酵培养获得的发酵液离心，取沉淀冷冻干燥(优选-50℃～-10℃冷冻干燥12～24h，更优选-50℃冷冻干燥24h)获得的，所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)H3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013481，地址为湖北武汉武汉大学；
所述枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉是由枯草芽孢杆菌H8-3经发酵培养获得的发酵液离心，取沉淀冷冻干燥(优选-50℃～-10℃冷冻干燥12～24h，更优选-50℃冷冻干燥24h)获得的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H8-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013483，地址为湖北武汉武汉大学；
所述枯草芽孢杆菌H4冻干粉是由枯草芽孢杆菌H4经发酵培养获得的发酵液离心，取沉淀冷冻干燥(优选-50℃～-10℃冷冻干燥12～24h，更优选-50℃冷冻干燥24h)获得的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013482，地址为：湖北武汉武汉大学。
本发明还提供一种所述腐熟菌剂在降解含蛋白质和/或脂肪的废弃物中的应用，具体所述的应用为：将腐熟菌剂加入到含蛋白质和/或脂肪的废弃物中，在30℃～60℃下降解反应1～4天(即将腐熟菌剂与废弃物混合均匀后放置1～4天即可进行降解)，降解产物处理后作为植物有机肥再利用，所述处理优选常温堆肥1～4周即可。
进一步，优选所述腐熟菌剂与废弃物重量比为0.1～5：100。
进一步，优选所述降解的温度为50℃～60℃。
本发明还提供一种用于制备所述腐熟菌剂的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)H4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013482，地址为：湖北武汉武汉大学。
所述枯草芽孢杆菌H4生理生化特征如下：在LB培养基上菌落呈乳白色，无光泽，边缘不整齐，表面有皱褶。好氧呼吸，在有氧条件下生长良好；革兰氏染色阳性；在葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、麦芽糖发酵试验中可产酸；能水解明胶、淀粉和酪蛋白；还原石蕊牛奶；V-P测定阳性；甲基红测定阴性。产蛋白酶，能耐70℃的高温。
枯草芽孢杆菌H8-3生理生化特征如下：在LB培养基上菌落呈乳白色，无光泽，边缘不整齐，表面有皱褶。好氧呼吸，在有氧条件下生长良好；革兰氏染色阳性；在葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、麦芽糖发酵试验中可产酸；能水解明胶、淀粉和酪蛋白；还原石蕊牛奶；V-P测定阳性；甲基红测定阴性。产蛋白酶，能耐60℃的高温。
短短芽孢杆菌H3生理生化特征如下：在LB培养基上菌落呈白色，无光泽，边缘不整齐，表面有皱褶。好氧呼吸，在有氧条件下生长良好；产脂肪酶，能耐60℃的高温。
本发明所述枯草芽孢杆菌H4具有耐高温(在70℃高温能存活)、蛋白酶活性较高，且生长较迅速的优点。
本发明所述枯草芽孢杆菌H4冻干粉的制备方法为：
(1)斜面培养
将枯草芽孢杆菌H4接种至斜面培养基，30℃～50℃培养1天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0；
(2)种子培养
从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃～70℃培养1天，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0；
(3)发酵培养
将种子液以体积浓度0.1％～1％(优选0.1％)的接种量接种至发酵培养基，30℃～70℃、100～300rpm发酵培养1～2天，获得发酵液，将发酵液离心，收集沉淀在-50℃～-10℃冷冻干燥12～24h(优选-50℃冷冻干燥24h)，获得所述枯草芽孢杆菌H4冻干粉；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.2。
本发明所述枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉的制备方法为：
(1)斜面培养
将枯草芽孢杆菌H8-3接种至斜面培养基，30℃～50℃培养1天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0；
(2)种子培养
从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃～60℃培养1天，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0；
(3)发酵培养
将种子液以体积浓度0.1％～1％(优选0.1％)的接种量接种至发酵培养基，30℃～60℃、100～300rpm发酵培养1～2天，获得发酵液，将发酵液离心，收集沉淀在-50℃～-10℃冷冻干燥12～24h(优选-50℃冷冻干燥24h)，获得所述枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.2。
本发明所述短短芽孢杆菌H3冻干粉的制备方法为：
(1)斜面培养
将短短芽孢杆菌H3接种至斜面培养基，30～50℃培养1天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0；
(2)种子培养
从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30～60℃培养1天，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0；
(3)发酵培养
将种子液以体积浓度0.1％～1％(优选0.1％)的接种量接种至发酵培养基，30～60℃、100～300rpm发酵培养1～2天，获得发酵液，将发酵液离心，收集沉淀在-50℃～-10℃冷冻干燥12～24h(优选-50℃冷冻干燥24h)，获得所述短短芽孢杆菌H3冻干粉；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.2。
本发明所述含蛋白质和/或脂肪的废弃物是指自然死亡的家畜家禽，如鸡、鸭、猪等，以及它们屠宰后的废弃物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--枯草芽孢杆菌H4，利用该菌株制备的腐熟菌剂具有耐高温，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的优点，利用所述腐熟菌剂堆肥具有环境污染小、经济易行等优点，堆肥处理后的产品经过后续处理，可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。
(四)附图说明
图1枯草芽孢杆菌H4耐高温实验图。
图2枯草芽孢杆菌H4蛋白水解圈实验图。
图3枯草芽孢杆菌H4蛋白酶活性实验图。
图4枯草芽孢杆菌H8-3耐高温实验图。
图5枯草芽孢杆菌H8-3蛋白酶水解圈实验图。
图6枯草芽孢杆菌H8-3蛋白酶活性实验图。
图7短短芽孢杆菌H3耐高温实验图。
图8短短芽孢杆菌H3脂肪酶水解圈实验图。
图9短短芽孢杆菌H3脂肪酶活性实验图。
图10猪肉经腐熟菌剂处理前后对比图。
图11腐熟菌剂消化猪肉实验中游离蛋白质含量变化图。
图12腐熟菌剂消化猪肉实验中粗脂肪含量变化图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1 菌株筛选及鉴定
1、菌株H4的筛选及鉴定
(1)培养基及试剂配方：
SOC液体培养基终浓度组成为：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0.5g/L、KCl 2.5mmol/L、MgCl20.01mol/L、葡萄糖0.02mol/L，溶剂为去离子水，pH值7.0。
SOC固体培养基终浓度组成为：SOC液体培养基加质量终浓度1.5％的琼脂粉。
SOC液体培养基配制方法：配置每升培养基，在965ml去离子水中加入胰化蛋白胨20g、酵母提取物5g、NaCl 0.5g摇动容器使溶质完全溶解。加10ml 250mmol/L KCl水溶液，用5mol/L NaOH调pH至7.0，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。灭菌后的溶液加入5ml过滤灭菌的2mol/L MgCl2，冷却至60℃或60℃以下，加20ml过滤灭菌的1mol/L葡萄糖水溶液。
脱脂奶粉培养基终浓度组成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，脱脂奶粉20g/L，15g/L琼脂粉，溶剂为去离子水，pH值为7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。
LB液体培养基终浓度组成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。
LB平板终浓度组成：LB液体培养基加质量终浓度1.5％的琼脂粉。
(2)土样采集
储藏于杭州师范大学生物医药与健康研究中心的土样：郴州汝城温泉土壤。
(3)菌种初筛
配制SOC液体培养基，灭菌冷却后分装，每根试管加入10ml培养基，加入土壤样品0.5g，混匀后60℃水浴摇床震荡3小时。无菌水稀释103倍，涂布SOC固体培养基平板，37℃培养20小时。
(4)菌种复筛
挑取初筛平板生长良好的菌落接种于脱脂奶粉培养基，37℃培养20小时。观察是否有透明圈产生。得到一株能产生明显透明圈的菌株，标记为菌株H4，保存。
(5)耐高温实验
将菌株H4接种于LB液体培养基，37℃培养6小时。分装于10ml试管，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的水浴摇床震荡半小时，取出冷却，无菌水稀释105倍，取200μl涂布于LB平板上，37℃培养18小时，计数生长的菌落(见图1)。可见菌株H4能耐70℃的高温。
(6)蛋白酶活性实验
将菌株H4接种于脱脂奶粉培养基，37℃培养24小时，以无蛋白酶活性的大肠杆菌作为对照。结果见图2，表明H4具有蛋白酶活性。
将菌株H4培养于LB液体培养基，37℃培养18小时，培养液离心，取上清。取BSA(1mg/ml)(购于宝生物工程大连有限公司)100微升，加入100微升上清，50℃孵育0、5、10、15、20、25、30分钟，加入5ml考马斯亮蓝染色液终止反应。分光光度计测OD600吸收值。结果见图3，表明菌株H4能产蛋白酶。
(7)16S rDNA测序鉴定菌种
使用DNA提取试剂盒(购自杭州宝赛生物有限公司)提取菌株H4的DNA，以16S rDNA通用引物为引物，进行PCR扩增。扩增体系为16S rDNA通用引物1μl，DNA模板0.1μl，dnTP2μl，buffer 2μl，rTaq酶0.2μl，无菌水补足20μl。扩增条件为95℃预变性5min，32个循环(98℃变性10sec；58℃退火30sec；72℃延伸2min)，16℃保持。扩增序列由南京金斯瑞生物科技有限公司测定，菌株H4的16S rDNA全序列为SEQ ID.NO1所示。根据菌株H4的16S rRNA序列分析结果，结合生理生化试验结果，在NCBI基因库比对后，确定菌株H4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H4。
引物：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT
2、菌株H8-3筛选及鉴定
(1)培养基及试剂配方：
SOC液体培养基终浓度组成为：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0.5g/L、KCl 2.5mmol/L、MgCl20.01mol/L、葡萄糖0.02mol/L，溶剂为去离子水，pH值7.0。
SOC固体培养基终浓度组成为：SOC液体培养基加质量终浓度1.5％的琼脂粉。
SOC液体培养基配制方法：配置每升培养基，在965ml去离子水中加入胰化蛋白胨20g、酵母提取物5g、NaCl 0.5g摇动容器使溶质完全溶解。加10ml 250mmol/L KCl水溶液，用5mol/L NaOH调pH至7.0，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。灭菌后的溶液加入5ml过滤灭菌的2mol/L MgCl2，冷却至60℃或60℃以下，加20ml过滤灭菌的1mol/L葡萄糖水溶液。
脱脂奶粉培养基终浓度组成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，脱脂奶粉20g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。
LB液体培养基终浓度组成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。
LB平板终浓度组成：LB液体培养基加质量终浓度1.5％的琼脂粉。
(2)土样采集
储藏于杭州师范大学生物医药与健康研究中心的土样：福建清流县高赖温泉土壤。
(3)菌种初筛
配制SOC液体培养基，灭菌冷却后分装，每根试管加入10ml培养基，加入土壤样品0.5g，混匀后60℃水浴摇床震荡3小时。无菌水稀释103倍，涂布SOC固体培养基平板，37℃培养20小时。
(4)菌种复筛
挑取初筛平板生长良好的菌落接种于脱脂奶粉培养基，37℃培养20小时。观察是否有透明圈产生。得到一株能产生明显透明圈的菌株，标记为菌株H8-3，保存。
(5)耐高温实验
将菌株H8-3接种于LB液体培养基，37℃培养6小时。分装于10ml试管，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的水浴摇床震荡半小时，取出冷却，无菌水稀释105倍，取200μl涂布于LB平板上，37℃培养18小时，计数生长的菌落(见图4)。可见菌株H8-3能耐60℃的高温。
(6)蛋白酶活性实验
将菌株H8-3接种于脱脂奶粉培养基，37℃培养24小时，以无蛋白酶活性的大肠杆菌作为对照。结果见图5，表明菌株H8-3具有蛋白酶活性。
将菌株H8-3培养于LB液体培养基，37℃培养18小时，培养液离心，取上清。取BSA(1mg/ml)(购于宝生物工程大连有限公司)100微升，加入100微升上清，50℃孵育0、5、10、15、20、25、30分钟，加入5ml考马斯亮蓝染色液终止反应。分光光度计测OD600吸收值。结果见图6，表明菌株H8-3能产蛋白酶。
(7)16s rRNA测序鉴定菌种
使用DNA提取试剂盒(购自杭州宝赛生物有限公司)提取菌株H8-3的DNA，以16S rDNA通用引物为引物，进行PCR扩增。扩增体系为16SrDNA通用引物1μl，DNA模板0.1μl，dnTP2μl，buffer 2μl，rTaq酶0.2μl，无菌水补足20μl。扩增条件为95℃预变性5min，32个循环(98℃变性10sec；58℃退火30sec；72℃延伸2min)，16℃保持。扩增序列由南京金斯瑞生物科技有限公司测定，菌株H8-3的16S rDNA全序列为SEQ ID.NO2所示。根据菌株H8-3的16S rRNA序列分析结果，结合生理生化试验结果，在NCBI基因库比对后，确定菌株H8-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H8-3。
引物：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT
SEQ ID.NO2：
AATAcATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCG。
3、菌株H3筛选及鉴定
(1)培养基及试剂配方：
SOC液体培养基终浓度组成为：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0.5g/L、2.5mmol/L KCl、0.01mol/L MgCl2、葡萄糖0.02mol/L，溶剂为去离子水，pH值7.0。
SOC固体培养基终浓度组成为：SOC液体培养基加质量终浓度1.5％的琼脂粉。
SOC液体培养基配制方法：配置每升培养基，在965ml去离子水中加入胰化蛋白胨20g、酵母提取物5g、NaCl 0.5g摇动容器使溶质完全溶解。加10ml 250mmol/L KCl水溶液，用5mol/L NaOH调pH至7.0，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。灭菌后的溶液加入5ml过滤灭菌的2mol/L MgCl2，冷却至60℃或60℃以下，加20ml过滤灭菌的1mol/L葡萄糖水溶液。
橄榄油筛选培养基终浓度组成：酵母膏2g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 5g/L，橄榄油乳化液12g/L，琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。其中橄榄油乳化液配制方法为：分别量取橄榄油25ml和体积浓度2％聚乙烯醇水溶液75ml，混匀，漩涡震荡乳化3次，每次1分钟。
LB液体培养基终浓度组成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。
LB平板终浓度组成：LB液体培养基加质量终浓度1.5％的琼脂粉。
(2)土样采集
储藏于杭师大生物医药与健康研究中心的土样：郴州汝城温泉土壤。
(3)菌种初筛
配制SOC液体培养基，灭菌冷却后分装，每根试管加入10ml培养基，加入土壤样品0.5g，混匀后60℃水浴摇床震荡3小时。无菌水稀释103倍，涂布SOC固体培养基平板，37℃培养20小时。
(4)菌种复筛
挑取初筛平板生长良好的菌落接种于橄榄油筛选培养基平板，37℃培养20小时。观察是否有水解圈产生。得到一株能产生明显水解圈的菌株，标记为菌株H3，保存。
(5)耐高温实验
将菌株H3接种于LB液体培养基，37℃培养6小时。分装于10ml试管，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的水浴摇床震荡半小时，取出冷却，无菌水稀释105倍，取200μl涂布于LB平板上，37℃培养18小时，计数生长的菌落(见图7)。可见菌株H3能耐60℃的高温。
(6)脂肪酶活性实验
将菌株H3接种于橄榄油筛选培养基平板，37℃培养24小时，以无脂肪酶活性的大肠杆菌作为对照。结果见图8，表明H3具有脂肪酶活性。
将菌株H3培养于LB培养基，37℃培养18小时，离心取上清。取4ml对硝基苯酚棕榈酸酯底物(0.09mg/ml，PH＝7.0)溶液预热5min后加入1ml菌株H3上清(以加1ml双蒸水作为对照)，50℃孵育0、5、10、15、20、25、30分钟，立即加入5ml无水乙醇终止反应。分光光度计OD405测吸收值。结果见图9。表明H3能产脂肪酶。
(7)16s rRNA测序鉴定菌种
使用DNA提取试剂盒(购自杭州宝赛生物有限公司)提取菌株H3的DNA，以16S rDNA通用引物为引物，进行PCR扩增。扩增体系为16S rDNA通用引物1μl，DNA模板0.1μl，dnTP2μl，buffer 2μl，rTaq酶0.2μl，无菌水补足20μl。扩增条件为95℃预变性5min，32个循环(98℃变性10sec；58℃退火30sec；72℃延伸2min)，16℃保持。扩增序列由南京金斯瑞生物科技有限公司测定，菌株H3的16S rDNA全序列为SEQ ID.NO3所示。根据菌株H3的16S rRNA序列分析结果，结合生理生化试验结果，在NCBI基因库比对后，确定菌株H3为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，命名为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)H3。
引物：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT
SEQ ID.NO3：
GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATCTACCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCCCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAGGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGTTTTAAGAGATTGGCGTCCTCTCGCGAGGTAGCATCCCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGTCTTGTCGACGGCAGTCTCTCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGCTGCCCCGAAGGGAAGCTCTGTCTCCAGAGCGGTCAGCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCACTCTTGCGAGCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGCGTTAGCTGCGGCACTGAGGGTATTGAAACCCCCAACACCTAGCACTCATTGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATACCGCTTTCCTCTTCTGCACTCAAGCTACACAGTTTCCGATGCGAaCCGGGGtTGAGCCCcGgGCTTTAACAcCAGACTTACATAGCcGCcTGCgcGCGCTTtACGCCcaatAAGTCcGgACaACGCtTGCCACcTACGTATTACCGCgGCTGCTGgCACGTAGtTAGcCGTGGCTTTCTCGTCAgGTAcCG。
实施例2 腐熟菌剂
(1)枯草芽孢杆菌H4冻干粉
a、斜面培养
将枯草芽孢杆菌H4接种至斜面LB培养基，在37℃培养1天，获得斜面菌体。
b、种子培养
从斜面菌体上挑取一接种环菌种，接种至100ml LB液体培养基中，50℃摇床培养24小时，获得种子液。
c、发酵培养
以体积比1:1000的比例将种子液接种至发酵培养基中，50℃发酵24小时，发酵罐罐压：0.04MPa，通气量：0.2v/v.min，转速200rpm。取发酵液离心，收集湿菌体，-50℃冷冻干燥24h，获得枯草芽孢杆菌H4冻干粉。
发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、氯化钠2g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L，溶剂为去离子水，pH为7.0。
(2)枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉
枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉的制备同枯草芽孢杆菌H4冻干粉，培养基及培养条件均相同。
所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H8-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC M2013483，地址为湖北武汉武汉大学。
(3)短短芽孢杆菌H3冻干粉
短短芽孢杆菌H3冻干粉的制备同枯草芽孢杆菌H4冻干粉，培养基及培养条件均相同。
所用的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)H3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC M2013481，地址为湖北武汉武汉大学。
(4)腐熟菌剂
将步骤(1)～(3)制备的短短芽孢杆菌H3冻干粉与枯草芽孢杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉以质量比1:1:1:97混合均匀，制成腐熟菌剂，500g密封袋分装，4℃保存。
实施例3 腐熟菌剂的性质
(1)蛋白酶活性
配制10、20、30、40、50、60μg/ml的L-酪氨酸标准液，以不含酪氨酸的双蒸水为空白对照，紫外分光光度计275nm波长测定吸光度。以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到方程式y＝0.0074x，吸光常数K为135.1。
取实施例2方法制备的腐熟菌剂10g，加入100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.5)，200rpm摇床震荡30min。3000rpm离心，取腐熟剂上清。
取腐熟剂上清1.0ml，40℃保温2分钟，加入1.0ml酪素水溶液(10mg/ml)，混匀后40℃反应20min，加入2ml三氯乙酸水溶液(0.4mol/L)终止反应，3000rpm离心，取上清，双蒸水稀释10倍后紫外分光光度计275nm波长测定吸光度。平行实验3次，得到样品平均吸光度为0.271。
以下列方法作为对照：取腐熟剂上清1.0ml，40℃保温2分钟，加入2ml三氯乙酸水溶液(0.4mol/L)使上清液失活，加入1.0ml酪素水溶液(10mg/ml)，混匀后40℃反应30min，3000rpm离心，取上清，双蒸水稀释10倍后紫外分光光度计275nm波长测定吸光度，平行实验3次，得到对照平均吸光度为0.134。
X＝(A–B)×K×4/1×1/20×n  公式(1)
公式(1)中:X—样品的酶活力，U/g；A—样品平均吸光度；B—对照平均吸光度；K—吸光常数；4—反应试剂的总体积，mL；1—吸取酶液1.0mL，以lmL计；1/20—反应时间20min，以lmin计；n—样品稀释倍数，
计算得到该腐熟菌剂的蛋白酶活性为369U/g。
蛋白酶活力单位定义：1g腐熟菌剂，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g表示。
(2)脂肪酶活性
配制橄榄油PVA乳化液：取质量浓度4％聚乙烯醇(PVA)水溶液150ml，加橄榄油50ml，高速震荡2次，每次2min。
取实施例2方法制备的腐熟菌剂10g，加入100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.5)，200rpm摇床震荡30min。3000rpm离心，取上清。
橄榄油PVA乳化液4ml和磷酸缓冲液(0.1mol/L、pH＝7.5)5ml混匀，40℃预热5min，加入上清1.0ml，40℃反应15分钟，加入15ml体积浓度95％乙醇水溶液终止反应。滴加酚酞指示剂2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至体系呈现为红色并保持30s不褪为其终点，记录消耗的0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积，平行试验3次，得到平均氢氧化钠溶液消耗量为1.23ml。
以下列方法作为对照：橄榄油PVA乳化液4ml和磷酸缓冲液(0.1mol/L、pH＝7.5)5ml混匀，40℃预热5min，加入15ml体积浓度95％乙醇水溶液，加入上清1.0ml，40℃反应15分钟。滴加酚酞指示剂2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至体系呈现为红色并保持30s不褪为其终点，记录消耗的0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。平行试验3次，得到平均氢氧化钠溶液消耗量为0.21ml。
X＝A×c/0.05×50×1/15×n  公式(2)
公式(2)中:X—样品的酶活力，U/g；A—滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积差，mL；c—氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；0.05一氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；50—0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol；1/15—反应时间15min，以1min计；n—样品稀释倍数。
经过计算，得到脂肪酶活性为34U/g。
脂肪酶活力单位定义：1g腐熟菌剂，在40℃和pH＝7.5的条件下，水解脂肪每分钟产生1μmol的脂肪酸，为一个酶活力单位，以U/g表示。
实施例4 腐熟菌剂的应用
(1)取1000g新鲜猪肉，绞肉机搅成肉末。120℃高温湿热灭菌20min。冷却后加入10g实施例2方法制备的腐熟菌剂，60℃恒温搅拌进行降解反应，在培养0、6、12、18、24小时各取样品50g，0℃保存，测定样品脂肪含量和游离氨基酸含量。
10小时后观察，碎块全部消化变成肉汤。24小时后观察，肉汤里有大量菌球出现。降解培养结束后，向降解反应物中加入500g麸皮，常温堆肥处理一周，成为有机肥料(样品如图10)。
游离蛋白质含量测定：取各降解时间段样品1g，离心取上清25微升，加水补足100微升，加入5ml考马斯亮蓝染色液。分光光度计OD600测吸收值。结果见图11。表明腐熟菌剂能降解猪肉中的蛋白质。
脂肪含量测定：分别取各降解时间段样品10g，石油醚萃取3次，旋蒸除掉溶剂后，称重粗脂肪含量。结果见图12。表明腐熟菌剂能有效水解脂肪。
(2)取500KG猪屠宰场废弃物，绞拌机粉碎。120℃高温灭菌2小时。冷却至60℃以下时加入1KG实施例2方法制备的腐熟菌剂，60℃恒温搅拌进行降解反应24小时，加入200Kg麸皮搅拌混匀，常温堆肥2周成为有机肥料。将该有机肥料送杭州宝赛生物科技有限公司检测，检测结果如表1所示：
表1 有机肥料指标检测

Claims (6)

1.一种腐熟菌剂，其特征在于所述腐熟菌剂由短短芽孢杆菌H3冻干粉、枯草芽孢杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉构成，所述短短芽孢杆菌H3冻干粉与枯草芽孢杆菌H4冻干粉、枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉和淀粉重量比为1:1:1:97；
所述短短芽孢杆菌H3冻干粉是由短短芽孢杆菌H3经发酵培养获得的发酵液离心，取沉淀冷冻干燥获得的，所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)H3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013481，地址为湖北武汉武汉大学；
所述枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉是由枯草芽孢杆菌H8-3经发酵培养获得的发酵液离心，取沉淀冷冻干燥获得的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H8-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013483，地址为湖北武汉武汉大学；
所述枯草芽孢杆菌H4冻干粉是由枯草芽孢杆菌H4经发酵培养获得的发酵液离心，取沉淀冷冻干燥获得的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013482，地址为：湖北武汉武汉大学。
2.一种权利要求1所述腐熟菌剂在降解含蛋白质和/或脂肪的废弃物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将腐熟菌剂加入到含蛋白质和/或脂肪的废弃物中，在30～60℃的条件下降解反应1～4天，降解产物处理后作为植物有机肥再利用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述腐熟菌剂与废弃物重量比为0.1～5：100。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解的温度为50℃～60℃。
6.一种用于制备权利要求1所述腐熟菌剂的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)H4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2013482，地址为：湖北武汉武汉大学。
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