CN108642022A - 多维复合酶菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明涉及一种多维复合酶菌剂及其制备方法与应用，制备方法包括步骤：将细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物混合，得到菌种混合物；将菌种混合物接种至固体发酵培养基中，得到发酵混合物；调节发酵混合物的水分，然后堆成锥形堆发酵，得到一次发酵产物；将一次发酵产物进行厌氧发酵，得到二次发酵产物；将二次发酵产物烘干后粉碎，得到多维复合酶菌剂。本发明采用枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、哈茨木霉、米曲霉、粉状毕赤酵母和生香酵母等多种菌种作为发酵菌种，制备得到含有多种高效酶、有益物质和有益微生物群体的具有高活性发酵功能的多维复合酶菌剂，可以用于制备有机肥、饲料和饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多维复合酶菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，人们对于食品的安全性越来越重视。然而在我国，抗生素等抗菌药物的滥用造成了药物残留以及大量耐药性细菌产生，其结果严重阻碍了畜禽养殖业的健康持续发展，为食品安全和消费者的身体健康埋下了隐患，因此寻找安全、无残留的抗生素替代品迫在眉睫。包含益生菌和酶等的生物饲料添加剂是一种十分理想的抗生素替代品。其中，酶是一种具有催化反应能力的特殊蛋白质，是促进生物化学反应的高效物质，酶制剂作为饲料添加剂对提高动物饲料利用率，消除饲料中的抗营养因子，提高动物的消化吸收能力等具有十分积极的作用。然而，目前作为饲料或饲料添加剂的菌种或酶制剂，对于提高动物的吸收效率、改善饲料利用效率，改善肠道蠕动等方面的效果还有待提高，因此，还需要开发新型的产品。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种多维复合酶菌剂及其制备方法与应用，以采用枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、哈茨木霉、米曲霉、粉状毕赤酵母和生香酵母等多种菌种作为发酵菌种，通过单独培养、混合固体发酵等方法，制备得到含有多种高效酶、有益物质和多种有益微生物群体的具有高活性发酵功能的多维复合酶菌剂，可以用于制备有机肥、饲料和饲料添加剂。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供了一种多维复合酶菌剂的制备方法，包括步骤：S1：将细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物混合，得到菌种混合物；S2：将菌种混合物接种至固体发酵培养基中，得到发酵混合物；S3：调节发酵混合物的水分为45％～55％，然后堆成锥形堆进行发酵，得到一次发酵产物；S4：将一次发酵产物进行厌氧发酵，得到二次发酵产物；S5：将二次发酵产物烘干后粉碎，得到多维复合酶菌剂。
优选地，S1中，细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物的质量比为1:1:3；S2中，菌种混合物和固体发酵培养基的质量比(2～5):100；固体发酵培养基的原料组分包括麸皮、豆粕和玉米粉；麸皮、豆粕和玉米粉的质量比为3:1:1。需要说明的是，固体发酵培养基可以采用卧式灭菌锅干热灭菌，自然降温至室温备用。
优选地，S3中，锥形堆的中心温度为50～55℃，锥形堆发酵的时间为5～7天。需要说明的是，锥形堆发酵过程中，中心温度超过50～55℃，需要用翻抛机抛散翻堆降温，一般每天翻堆一次即可。
优选地，S4中，厌氧发酵具体包括：将一次发酵产物转移至密闭装置中，装满密封后进行厌氧发酵；厌氧发酵的时间为6～8天，厌氧发酵的环境温度为22～25℃。需要说明的是，密闭装置可以是容积150～400kg的塑料大桶，需要装满并拍实，然后盖盖密封后进行厌氧发酵。
优选地，S5中，烘干的温度为45～60℃。
优选地，S1中，细菌混合发酵液的菌种包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；细菌混合发酵液的制备方法包括步骤；将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别在37℃进行斜面培养活化2～4h，然后分别采用营养肉汤培养基进行一次扩大培养；将一次扩大培养的枯草芽孢杆菌、一次扩大培养的解淀粉芽孢杆菌、一次扩大培养的胶冻样芽孢杆菌和一次扩大培养的地衣芽孢杆菌分别按照3％～5％的接种量接种至发酵罐中，进行二次扩大培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；将枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液以3:2:1:3的体积比混合均匀，得到细菌混合发酵液；其中，扩大培养的过程中：温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为12h；二次扩大培养的过程中：通风比为1:1，培养温度为37℃，摇床的转速为200～220r/min，培养时间为18～21h，装液量为70％；二次扩大培养采用的培养基的组分按质量分数计，包括：葡萄糖0.6～0.8％、玉米浆粉2～3％、磷酸氢二钾0.1～0.3％、硫酸铵0.15～0.25％、氯化钠0.3～0.5％、泡敌0.1～0.2％、酵母膏0.25～0.3％，余量为水；pH值为6.5～7.5。需要说明的是，斜面培养活化、一次扩大培养、二次扩大培养过程，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌四种菌种均需要分开进行；一次扩大培养的过程才用的营养肉汤培养基，每L营养肉汤培养基的组分包括：蛋白胨10g、牛肉浸出粉3g、氯化钠5g，余量为水，pH值为7.4；二次扩大培养优选采用标准种子罐(200L)，装液量为70％。
优选地，S1中，霉菌混合物的菌种包括哈茨木霉和米曲霉；霉菌混合物的制备方法包括步骤；将哈茨木霉和米曲霉分别在28℃进行斜面培养活化36～48h，然后分别接种至固体培养基中进行固体培养，分别得到哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物；将哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物以1:3的质量比混合，得到霉菌混合物；其中，固体培养的温度为28℃，固体培养的时间为5～7天；固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙15～17份、硫酸镁0.5～1份、氢氧化钠0.1～1份、葡萄糖100～150份、牛肉膏15～20份和蛋白胨40～45份；物料和水的质量比为1:0.7。需要说明的是，500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g；固体培养过程中每天拍打，防止结团。
优选地，S1中，酵母菌混合物的菌种包括粉状毕赤酵母和生香酵母；酵母菌混合物的制备方法包括步骤；将粉状毕赤酵母和生香酵母分别在28℃进行斜面培养活化36～48h，然后分别接种至固体培养基中进行固体培养，分别得到毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物；将毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物以1:2.5的质量比混合，得到酵母菌混合物；其中，固体培养的温度为28℃，固体培养的时间为3～5天；固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙15～17份、硫酸镁0.5～1份、氢氧化钠0.1～1份、葡萄糖100～150份、牛肉膏15～20份和蛋白胨40～45份；物料和水的质量比为1:0.7。需要说明的是，500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g；固体培养过程中每天拍打，防止结团。
本发明还保护根据上述方法制备得到的多维复合酶菌剂。
本发明还保护多维复合酶菌剂在制备有机肥、饲料和饲料添加剂中的应用。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明采用枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、哈茨木霉、米曲霉、粉状毕赤酵母和生香酵母等多种菌种作为发酵菌种，通过单独培养、混合固体发酵等方法，制备得到含有多种高效酶、有益物质和多种有益微生物群体的具有高活性发酵功能的多维复合酶菌剂；发酵方法独特，菌种搭配科学；
(2)本发明提供的多维复合酶菌剂，采用的菌种具有产酶能力强、产酶种类多和发酵功能强的特性，且对于人畜是没有毒性；其产生的多维复合酶群包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、氧化还原酶、乳糖酶、酒精分解酶、麦芽糖酶、蔗糖酶、尿酶等几十种不同类型的酶；多维复合酶群具有很强的好氧性、厌氧性和兼氧性的发酵能力，该酶群能快速分解有机物，包括碳氢化合物和含氮化合物，除掉有毒物质，因此可用作无害化发酵有机物和畜禽粪便快速除臭制作优质肥料，生产饲料及饲料添加剂，对从源头上解决畜禽粪便污染环境及对城市生活垃圾进行无害化发酵生产生态活性有机肥料具有独特功能；
(3)本发明提供的多维复合酶菌剂，含有多种微生物和动植物多所需的营养物质和有益物质：含有多种氨基酸、腐殖酸、黄腐酸、维生素、生长未知因子、糖、多种有机酸、酒精、核酸、多肽、生长调节剂等物质；作为饲料添加剂，可以提高畜禽的食欲，改善胃肠道蠕动。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供一种多维复合酶菌剂的制备方法，包括步骤：
S1：(1)细菌混合发酵液的制备
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别在37℃进行斜面培养活化2～4h，然后分别采用营养肉汤培养基进行一次扩大培养，一次扩大培养的过程中：温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为12h；其中，每L营养肉汤培养基的组分包括：蛋白胨10g、牛肉浸出粉3g、氯化钠5g，余量为水，pH值为7.4；
将一次扩大培养的枯草芽孢杆菌、一次扩大培养的解淀粉芽孢杆菌、一次扩大培养的胶冻样芽孢杆菌和一次扩大培养的地衣芽孢杆菌分别按照3％～5％的接种量接种至标准种子罐(200L)中，进行二次扩大培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；其中，二次扩大培养的过程中：通风比为1:1，培养温度为37℃，摇床的转速为200～220r/min，培养时间为18～21h，装液量为70％；二次扩大培养采用的培养基的组分按质量分数计，包括：葡萄糖0.6～0.8％、玉米浆粉2～3％、磷酸氢二钾0.1～0.3％、硫酸铵0.15～0.25％、氯化钠0.3～0.5％、泡敌0.1～0.2％、酵母膏0.25～0.3％，余量为水；pH值为6.5～7.5；
将枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液以3:2:1:3的体积比混合均匀，得到细菌混合发酵液。
(2)霉菌混合物的制备
将哈茨木霉和米曲霉分别在28℃进行斜面培养活化36～48h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌丝的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养5～7天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙15～17份、硫酸镁0.5～1份、氢氧化钠0.1～1份、葡萄糖100～150份、牛肉膏15～20份和蛋白胨40～45份；物料和水的质量比为1:0.7；
将哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物以1:3的质量比混合，得到霉菌混合物。
(3)酵母菌混合物的制备
将粉状毕赤酵母和生香酵母分别在28℃进行斜面培养活化36～48h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养3～5天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙15～17份、硫酸镁0.5～1份、氢氧化钠0.1～1份、葡萄糖100～150份、牛肉膏15～20份和蛋白胨40～45份；物料和水的质量比为1:0.7；
将毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物以1:2.5的质量比混合，得到酵母菌混合物。
(4)混合
将细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物以1:1:3的质量比混合，得到菌种混合物。
S2：将菌种混合物接种至固体发酵培养基中，菌种混合物和固体发酵培养基的质量比(2～5):100，混拌均匀，得到发酵混合物；其中，固体发酵培养基的原料组分包括质量比为3:1:1的麸皮、豆粕和玉米粉，采用卧式灭菌锅干热灭菌，自然降温至室温后使用。
S3：用水调节发酵混合物的水分为45％～55％，然后堆成锥形堆发酵5～7天，锥形堆的中心温度为50～55℃，超过50～55℃用翻抛机抛散翻堆降温，得到一次发酵产物。
S4：将一次发酵产物转移至密闭装置塑料大桶中，桶容积150～400kg，装满拍实后密封，置于22～25℃的环境中，厌氧发酵6～8天，得到二次发酵产物。
S5：将二次发酵产物采用烘干机在45～60℃烘干，然后粉碎，得到多维复合酶菌剂。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例一
本实施例提供一种多维复合酶菌剂的制备方法，包括步骤：
S1：(1)细菌混合发酵液的制备
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别在37℃进行斜面培养活化3h，然后分别采用营养肉汤培养基进行一次扩大培养，扩大培养的过程中：温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为12h；其中，每L营养肉汤培养基的组分包括：蛋白胨10g、牛肉浸出粉3g、氯化钠5g，余量为水，pH值为7.4；
将一次扩大培养的枯草芽孢杆菌、一次扩大培养的解淀粉芽孢杆菌、一次扩大培养的胶冻样芽孢杆菌和一次扩大培养的地衣芽孢杆菌分别按照4％的接种量接种至标准种子罐(200L)中，进行二次扩大培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；其中，二次扩大培养的过程中：通风比为1:1，培养温度为37℃，摇床的转速为210r/min，培养时间为19h，装液量为70％；二次扩大培养采用的培养基的组分按质量分数计，包括：葡萄糖0.7％、玉米浆粉2.5％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸铵0.20％、氯化钠0.4％、泡敌0.15％、酵母膏0.28％，余量为水；pH值为7.0；
将枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液以3:2:1:3的体积比混合均匀，得到细菌混合发酵液。
(2)霉菌混合物的制备
将哈茨木霉和米曲霉分别在28℃进行斜面培养活化42h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌丝的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养6天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙16份、硫酸镁0.8份、氢氧化钠0.5份、葡萄糖125份、牛肉膏17份和蛋白胨42份；物料和水的质量比为1:0.7；
将哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物以1:3的质量比混合，得到霉菌混合物。
(3)酵母菌混合物的制备
将粉状毕赤酵母和生香酵母分别在28℃进行斜面培养活化42h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养4天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙16份、硫酸镁0.8份、氢氧化钠0.5份、葡萄糖25份、牛肉膏17份和蛋白胨42份；物料和水的质量比为1:0.7；
将毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物以1:2.5的质量比混合，得到酵母菌混合物。
(4)混合
将细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物以1:1:3的质量比混合，得到菌种混合物。
S2：将菌种混合物接种至固体发酵培养基中，菌种混合物和固体发酵培养基的质量比3.5:100，混拌均匀，得到发酵混合物；其中，固体发酵培养基的原料组分包括质量比为3:1:1的麸皮、豆粕和玉米粉，采用卧式灭菌锅干热灭菌，自然降温至室温后使用。
S3：用水调节发酵混合物的水分为50％，然后堆成锥形堆发酵6天，锥形堆的中心温度为52℃，超过52℃用翻抛机抛散翻堆降温，得到一次发酵产物。
S4：将一次发酵产物转移至密闭装置塑料大桶中，桶容积250kg，装满拍实后密封，置于25℃的环境中，厌氧发酵7天，得到二次发酵产物。
S5：将二次发酵产物采用烘干机在50℃烘干，然后粉碎，得到多维复合酶菌剂。
实施例二
本实施例提供一种多维复合酶菌剂的制备方法，包括步骤：
S1：(1)细菌混合发酵液的制备
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别在37℃进行斜面培养活化2h，然后分别采用营养肉汤培养基进行一次扩大培养，扩大培养的过程中：温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为12h；其中，每L营养肉汤培养基的组分包括：蛋白胨10g、牛肉浸出粉3g、氯化钠5g，余量为水，pH值为7.4；
将一次扩大培养的枯草芽孢杆菌、一次扩大培养的解淀粉芽孢杆菌、一次扩大培养的胶冻样芽孢杆菌和一次扩大培养的地衣芽孢杆菌分别按照3％～5％的接种量接种至标准种子罐(200L)中，进行二次扩大培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；其中，二次扩大培养的过程中：通风比为1:1，培养温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为18h，装液量为70％；二次扩大培养采用的培养基的组分按质量分数计，包括：葡萄糖0.6％、玉米浆粉2％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸铵0.15％、氯化钠0.3％、泡敌0.1％、酵母膏0.25％，余量为水；pH值为6.5；
将枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液以3:2:1:3的体积比混合均匀，得到细菌混合发酵液。
(2)霉菌混合物的制备
将哈茨木霉和米曲霉分别在28℃进行斜面培养活化36h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌丝的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养5天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙15份、硫酸镁0.5份、氢氧化钠0.1份、葡萄糖100份、牛肉膏15份和蛋白胨40份；物料和水的质量比为1:0.7；
将哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物以1:3的质量比混合，得到霉菌混合物。
(3)酵母菌混合物的制备
将粉状毕赤酵母和生香酵母分别在28℃进行斜面培养活化36h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养3天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙15份、硫酸镁0.5份、氢氧化钠0.1份、葡萄糖100份、牛肉膏15份和蛋白胨40份；物料和水的质量比为1:0.7；
将毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物以1:2.5的质量比混合，得到酵母菌混合物。
(4)混合
将细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物以1:1:3的质量比混合，得到菌种混合物。
S2：将菌种混合物接种至固体发酵培养基中，菌种混合物和固体发酵培养基的质量比2:100，混拌均匀，得到发酵混合物；其中，固体发酵培养基的原料组分包括质量比为3:1:1的麸皮、豆粕和玉米粉，采用卧式灭菌锅干热灭菌，自然降温至室温后使用。
S3：用水调节发酵混合物的水分为45％，然后堆成锥形堆发酵5天，锥形堆的中心温度为50℃，超过50℃用翻抛机抛散翻堆降温，得到一次发酵产物。
S4：将一次发酵产物转移至密闭装置塑料大桶中，桶容积150kg，装满拍实后密封，置于22℃的环境中，厌氧发酵6天，得到二次发酵产物。
S5：将二次发酵产物采用烘干机在45℃烘干，然后粉碎，得到多维复合酶菌剂。
实施例三
本实施例提供一种多维复合酶菌剂的制备方法，包括步骤：
S1：(1)细菌混合发酵液的制备
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别在37℃进行斜面培养活化4h，然后分别采用营养肉汤培养基进行一次扩大培养，扩大培养的过程中：温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为12h；其中，每L营养肉汤培养基的组分包括：蛋白胨10g、牛肉浸出粉3g、氯化钠5g，余量为水，pH值为7.4；
将一次扩大培养的枯草芽孢杆菌、一次扩大培养的解淀粉芽孢杆菌、一次扩大培养的胶冻样芽孢杆菌和一次扩大培养的地衣芽孢杆菌分别按照3％～5％的接种量接种至标准种子罐(200L)中，进行二次扩大培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；其中，二次扩大培养的过程中：通风比为1:1，培养温度为37℃，摇床的转速为220r/min，培养时间为21h，装液量为70％；二次扩大培养采用的培养基的组分按质量分数计，包括：葡萄糖0.8％、玉米浆粉3％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸铵0.25％、氯化钠0.5％、泡敌0.2％、酵母膏0.3％，余量为水；pH值为7.5；
将枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液以3:2:1:3的体积比混合均匀，得到细菌混合发酵液。
(2)霉菌混合物的制备
将哈茨木霉和米曲霉分别在28℃进行斜面培养活化48h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌丝的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养7天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙17份、硫酸镁1份、氢氧化钠1份、葡萄糖150份、牛肉膏20份和蛋白胨45份；物料和水的质量比为1:0.7；
将哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物以1:3的质量比混合，得到霉菌混合物。
(3)酵母菌混合物的制备
将粉状毕赤酵母和生香酵母分别在28℃进行斜面培养活化48h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养5天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙17份、硫酸镁1份、氢氧化钠1份、葡萄糖150份、牛肉膏20份和蛋白胨45份；物料和水的质量比为1:0.7；
将毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物以1:2.5的质量比混合，得到酵母菌混合物。
(4)混合
将细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物以1:1:3的质量比混合，得到菌种混合物。
S2：将菌种混合物接种至固体发酵培养基中，菌种混合物和固体发酵培养基的质量比5:100，混拌均匀，得到发酵混合物；其中，固体发酵培养基的原料组分包括质量比为3:1:1的麸皮、豆粕和玉米粉，采用卧式灭菌锅干热灭菌，自然降温至室温后使用。
S3：用水调节发酵混合物的水分为55％，然后堆成锥形堆发酵7天，锥形堆的中心温度为55℃，超过55℃用翻抛机抛散翻堆降温，得到一次发酵产物。
S4：将一次发酵产物转移至密闭装置塑料大桶中，桶容积400kg，装满拍实后密封，置于25℃的环境中，厌氧发酵8天，得到二次发酵产物。
S5：将二次发酵产物采用烘干机在60℃烘干，然后粉碎，得到多维复合酶菌剂。
对比例一
本对比例提供一种多维复合酶菌剂的制备方法，包括步骤：
S1：(1)细菌混合发酵液的制备
将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别在37℃进行斜面培养活化3h，然后分别采用营养肉汤培养基进行一次扩大培养，扩大培养的过程中：温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为12h；其中，每L营养肉汤培养基的组分包括：蛋白胨10g、牛肉浸出粉3g、氯化钠5g，余量为水，pH值为7.4；
将一次扩大培养的枯草芽孢杆菌、和一次扩大培养的地衣芽孢杆菌分别按照4％的接种量接种至标准种子罐(200L)中，进行二次扩大培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；其中，二次扩大培养的过程中：通风比为1:1，培养温度为37℃，摇床的转速为210r/min，培养时间为19h，装液量为70％；二次扩大培养采用的培养基的组分按质量分数计，包括：葡萄糖0.7％、玉米浆粉2.5％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸铵0.20％、氯化钠0.4％、泡敌0.15％、酵母膏0.28％，余量为水；pH值为7.0；
将枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液以1:1的体积比混合均匀，得到细菌混合发酵液。
(2)霉菌混合物的制备
将哈茨木霉和米曲霉分别在28℃进行斜面培养活化42h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌丝的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养6天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙16份、硫酸镁0.8份、氢氧化钠0.5份、葡萄糖125份、牛肉膏17份和蛋白胨42份；物料和水的质量比为1:0.7；
将哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物以1:3的质量比混合，得到霉菌混合物。
(3)酵母菌混合物的制备
将粉状毕赤酵母和生香酵母分别在28℃进行斜面培养活化42h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养4天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙16份、硫酸镁0.8份、氢氧化钠0.5份、葡萄糖25份、牛肉膏17份和蛋白胨42份；物料和水的质量比为1:0.7；
将毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物以1:2.5的质量比混合，得到酵母菌混合物。
(4)混合
将细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物以1:1:3的质量比混合，得到菌种混合物。
S2：将菌种混合物接种至固体发酵培养基中，菌种混合物和固体发酵培养基的质量比3.5:100，混拌均匀，得到发酵混合物；其中，固体发酵培养基的原料组分包括质量比为3:1:1的麸皮、豆粕和玉米粉，采用卧式灭菌锅干热灭菌，自然降温至室温后使用。
S3：用水调节发酵混合物的水分为50％，然后堆成锥形堆发酵6天，锥形堆的中心温度为52℃，超过52℃用翻抛机抛散翻堆降温，得到一次发酵产物。
S4：将一次发酵产物转移至密闭装置塑料大桶中，桶容积250kg，装满拍实后密封，置于25℃的环境中，厌氧发酵7天，得到二次发酵产物。
S5：将二次发酵产物采用烘干机在50℃烘干，然后粉碎，得到多维复合酶菌剂。
对比例二
本对比例提供一种多维复合酶菌剂的制备方法，包括步骤：
S1：(1)细菌混合发酵液的制备
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别在37℃进行斜面培养活化3h，然后分别采用营养肉汤培养基进行一次扩大培养，扩大培养的过程中：温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为12h；其中，每L营养肉汤培养基的组分包括：蛋白胨10g、牛肉浸出粉3g、氯化钠5g，余量为水，pH值为7.4；
将一次扩大培养的枯草芽孢杆菌、一次扩大培养的解淀粉芽孢杆菌、一次扩大培养的胶冻样芽孢杆菌和一次扩大培养的地衣芽孢杆菌分别按照4％的接种量接种至标准种子罐(200L)中，进行二次扩大培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；其中，二次扩大培养的过程中：通风比为1:1，培养温度为37℃，摇床的转速为210r/min，培养时间为19h，装液量为70％；二次扩大培养采用的培养基的组分按质量分数计，包括：葡萄糖0.7％、玉米浆粉2.5％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸铵0.20％、氯化钠0.4％、泡敌0.15％、酵母膏0.28％，余量为水；pH值为7.0；
将枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液以3:2:1:3的体积比混合均匀，得到细菌混合发酵液。
(2)霉菌混合物的制备
将哈茨木霉和米曲霉分别在28℃进行斜面培养活化42h，然后分别用灭菌的接种铲挖取一块带菌丝的培养基分别接种至固体培养基(500mL三角瓶中固体培养基的装量为100g)中进行固体培养，28℃固体培养6天，固体培养过程中每天拍打，防止结团，分别得到哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物；其中，固体培养基的原料组分包括物料和水，物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙16份、硫酸镁0.8份、氢氧化钠0.5份、葡萄糖125份、牛肉膏17份和蛋白胨42份；物料和水的质量比为1:0.7；
将哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物以1:3的质量比混合，得到霉菌混合物。
(3)混合
将细菌混合发酵液和霉菌混合物以1:1的质量比混合，得到菌种混合物。
S2：将菌种混合物接种至固体发酵培养基中，菌种混合物和固体发酵培养基的质量比3.5:100，混拌均匀，得到发酵混合物；其中，固体发酵培养基的原料组分包括质量比为3:1:1的麸皮、豆粕和玉米粉，采用卧式灭菌锅干热灭菌，自然降温至室温后使用。
S3：用水调节发酵混合物的水分为50％，然后堆成锥形堆发酵6天，锥形堆的中心温度为52℃，超过52℃用翻抛机抛散翻堆降温，得到一次发酵产物。
S4：将一次发酵产物转移至密闭装置塑料大桶中，桶容积250kg，装满拍实后密封，置于25℃的环境中，厌氧发酵7天，得到二次发酵产物。
S5：将二次发酵产物采用烘干机在50℃烘干，然后粉碎，得到多维复合酶菌剂。
将本发明实施例一至实施例三制备得到的多维复合酶菌剂，通过功能学试验来系统评价其效果，并以对比例一和对比例二制备得到的多维复合酶菌剂作为对照。
1、对猪健康的影响
选择体重、健康状况相近的猪300头进行实验，体重15～20kg不等。将其随机分为6组，每组50头。第一组至第五组作为实验组，分别投喂本发明实施例一至实施例三、对比例一和对比例二制备得到的多维复合酶菌剂，第六组作为对照组，仅饲喂饲料。具体地，实施例一至实施例三、对比例一和对比例二中，每头猪按照0.2g/kg给多维复合酶菌剂，于早晨喂食时投喂，饲喂90天。试验过程中，所有猪均采用市售猪用饲料投喂。
试验期间，猪每隔1个月空腹称重1次，统计日增重和饲料消耗情况，并且统计腹泻率；具体数据如表1所示：
表1各实施例和对比例的情况
| 组别 | 腹泻率/％ | 日增重(g/d) | 料肉比 |
| 实施例一 | 0 | 794 | 1.18:1 |
| 实施例二 | 0 | 785 | 1.19:1 |
| 实施例三 | 0 | 787 | 1.20:1 |
| 对比例一 | 4 | 631 | 1.28:1 |
| 对比例二 | 2 | 715 | 1.32:1 |
| 对照组 | 5 | 512 | 1.54:1 |
2、对猪肉质的影响
按照体重相近、遗传基础相似原则，选取土猪(公母各半，体重约30kg)300头，随机等分为6组：对照组、实施例一组、实施例二组、实施例三组、对比例一组和对比例二组，每组3个重复，每重复10头。对照组只饲喂市面购买的猪用饲料，实施例一组、实施例二组、实施例三组、对比例一组和对比例二组和对比例三组分别饲喂对应实施例制备得到的多维复合酶菌剂和相同量的市面购买的猪用饲料，多维复合酶菌剂和猪用饲料的质量比为1：100，试验期为60天。试验过程中每天记录饲养场温度。按常规进行饲养管理，舍内保持清洁干燥，自由饮水，自由采食，每天按时饲喂，每日加料3次。饲喂60天后每组分别选取生猪6头，宰杀，快速收集相同部位的猪肉，进行猪肉营养品质和安全品质分析。
猪肉营养品质指标：(1)外观品质：测定猪肉的色泽；(2)基础营养物质。
测定得到的结果如表2所示。
表2对猪肉基础营养物质的影响效果
需要注意的是，本发明采用的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、哈茨木霉、米曲霉和粉状毕赤酵母均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，其中：枯草芽孢杆菌(CICC21164)，解淀粉芽孢杆菌(CICC20164)，胶冻样芽孢杆菌(CICC20667)，地衣芽孢杆菌(CICC20085)，哈茨木霉(CICC13055)，米曲霉(CICC40186)和粉状毕赤酵母(CICC1688)；本发明采用的生香酵母来自日本，当然，也可以采用其它途径购买。
除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。
Claims (10)
1.一种多维复合酶菌剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1：将细菌混合发酵液、霉菌混合物和酵母菌混合物混合，得到菌种混合物；
S2：将所述菌种混合物接种至固体发酵培养基中，得到发酵混合物；
S3：调节所述发酵混合物的水分为45％～55％，然后堆成锥形堆进行发酵，得到一次发酵产物；
S4：将所述一次发酵产物进行厌氧发酵，得到二次发酵产物；
S5：将所述二次发酵产物烘干后粉碎，得到所述多维复合酶菌剂。
2.根据权利要求1所述的多维复合酶菌剂的制备方法，其特征在于：
S1中，所述细菌混合发酵液、所述霉菌混合物和所述酵母菌混合物的质量比为1:1:3；
S2中，所述菌种混合物和所述固体发酵培养基的质量比(2～5):100；所述固体发酵培养基的原料组分包括麸皮、豆粕和玉米粉；所述麸皮、所述豆粕和所述玉米粉的质量比为3:1:1。
3.根据权利要求1所述的多维复合酶菌剂的制备方法，其特征在于：
S3中，所述锥形堆的中心温度为50～55℃，所述锥形堆发酵的时间为5～7天。
4.根据权利要求1所述的多维复合酶菌剂的制备方法，其特征在于：
S4中，所述厌氧发酵具体包括：将所述一次发酵产物转移至密闭装置中，装满密封后进行厌氧发酵；所述厌氧发酵的时间为6～8天，所述厌氧发酵的环境温度为22～25℃。
5.根据权利要求1所述的多维复合酶菌剂的制备方法，其特征在于：
S5中，所述烘干的温度为45～60℃。
6.根据权利要求1所述的多维复合酶菌剂的制备方法，其特征在于，
S1中，所述细菌混合发酵液的菌种包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；
所述细菌混合发酵液的制备方法包括步骤；
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别在37℃进行斜面培养活化2～4h，然后分别采用营养肉汤培养基进行一次扩大培养；
将所述一次扩大培养的枯草芽孢杆菌、所述一次扩大培养的解淀粉芽孢杆菌、所述一次扩大培养的胶冻样芽孢杆菌和所述一次扩大培养的地衣芽孢杆菌分别按照3％～5％的接种量接种至发酵罐中，进行二次扩大培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；
将所述枯草芽孢杆菌发酵液、所述解淀粉芽孢杆菌发酵液、所述胶冻样芽孢杆菌发酵液和所述地衣芽孢杆菌发酵液以3:2:1:3的体积比混合均匀，得到所述细菌混合发酵液；
其中，所述扩大培养的过程中：温度为37℃，摇床的转速为200r/min，培养时间为12h；所述二次扩大培养的过程中：通风比为1:1，培养温度为37℃，摇床的转速为200～220r/min，培养时间为18～21h，装液量为70％；所述二次扩大培养采用的培养基的组分按质量分数计，包括：葡萄糖0.6～0.8％、玉米浆粉2～3％、磷酸氢二钾0.1～0.3％、硫酸铵0.15～0.25％、氯化钠0.3～0.5％、泡敌0.1～0.2％、酵母膏0.25～0.3％，余量为水；pH值为6.5～7.5。
7.根据权利要求1所述的多维复合酶菌剂的制备方法，其特征在于：
S1中，所述霉菌混合物的菌种包括哈茨木霉和米曲霉；
所述霉菌混合物的制备方法包括步骤；
将哈茨木霉和米曲霉分别在28℃进行斜面培养活化36～48h，然后分别接种至固体培养基中进行固体培养，分别得到哈茨木霉发酵物和米曲霉发酵物；
将所述哈茨木霉发酵物和所述米曲霉发酵物以1:3的质量比混合，得到所述霉菌混合物；
其中，所述固体培养的温度为28℃，所述固体培养的时间为5～7天；所述固体培养基的原料组分包括物料和水，所述物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙15～17份、硫酸镁0.5～1份、氢氧化钠0.1～1份、葡萄糖100～150份、牛肉膏15～20份和蛋白胨40～45份；所述物料和所述水的质量比为1:0.7。
8.根据权利要求1所述的多维复合酶菌剂的制备方法，其特征在于：
S1中，所述酵母菌混合物的菌种包括粉状毕赤酵母和生香酵母；
所述酵母菌混合物的制备方法包括步骤；
将粉状毕赤酵母和生香酵母分别在28℃进行斜面培养活化36～48h，然后分别接种至固体培养基中进行固体培养，分别得到毕赤酵母发酵物和生香酵母发酵物；
将所述毕赤酵母发酵物和所述生香酵母发酵物以1:2.5的质量比混合，得到所述酵母菌混合物；
其中，所述固体培养的温度为28℃，所述固体培养的时间为3～5天；所述固体培养基的原料组分包括物料和水，所述物料的组分按重量份计，包括：麸皮750份、豆粉250份、碳酸钙15～17份、硫酸镁0.5～1份、氢氧化钠0.1～1份、葡萄糖100～150份、牛肉膏15～20份和蛋白胨40～45份；所述物料和所述水的质量比为1:0.7。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的多维复合酶菌剂。
10.权利要求9所述的多维复合酶菌剂在制备有机肥、饲料和饲料添加剂中的应用。
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