CN114599786A

CN114599786A - 用于生产己糖的固定化酶组合物

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Publication number: CN114599786A
Application number: CN202080065138.3A
Authority: CN
Inventors: D·J·维歇莱茨基; J·瓦格纳
Original assignee: Bonumos Co ltd
Current assignee: Bonumos Co ltd
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2022-06-07
Also published as: CA3143852A1; EP3999636A1; JP2022541471A; CO2022001348A2; EP3999636A4; US20220259628A1; WO2021011881A1; KR20220035460A; BR112022000699A2; MX2022000381A

Abstract

本发明涉及用于制备己糖的固定化酶组合物。己糖包括例如塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖和肌醇。本发明还涉及通过使淀粉衍生物与本发明的固定化酶组合物接触，由糖类制备己糖的酶促方法。

Description

用于生产己糖的固定化酶组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年7月17日提交的美国申请No.62/875,321和2019年10月22日提交的美国申请No.62/924,323的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及使用固定化酶组合物制备己糖单糖。更具体地说，本发明涉及从糖类(例如多糖、寡糖、二糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖)制备D-己糖(或己糖)的方法，包括通过固定化酶催化的一个或多个酶促步骤将果糖6-磷酸转化为己糖的步骤。

背景技术

己糖是具有六个碳原子的单糖。己糖包括例如塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖和肌醇。己糖用于许多行业，显然在制药行业、生物技术以及食品和饮料行业有着多种应用。己糖可以使用酶法由糖类，例如单糖、寡糖、淀粉、淀粉衍生物、纤维素等制备。基于溶液的酶法在已公布的PCT申请WO 2018/169957、WO 2017/059278和WO 2018/112139中进行了描述，这些申请通过引用并入本文中。

酶法的商业发展对于增加利用绿色化学，从而减少合成对环境影响的工业过程数量非常重要。已经开发了许多用于商业生产的酶法(例如，PCT申请WO 2018/169957、WO2017/059278和WO 2018/112139)，但是当这些方法用于低成本产品(例如替代甜味剂)时，酶的使用成本妨碍这些方法的商业化。这个问题的常见解决方案是将酶固定在载体上(例如，WO 2016/160573)。固定在载体上使得酶可以多批次重复使用或用于连续过程。酶的重复使用大大降低了每公斤产品的酶使用成本，这对于商业可行性非常重要。酶的固定方法有许多种，但特定过程优选哪种方法并没有固定的规则(Datta et al.,Enzymeimmobilization:an overview on techniques and support materials.3Biotech(2013),3:1-9)。因此，对于每个过程必须开发独特的解决方案。

正如本领域熟悉的那样，商业过程中使用的酶可以吸附在通常用于提高功能性的不溶性有机或无机载体上。这些载体包括聚合载体如琼脂糖、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、酚醛树脂或葡聚糖，以及无机载体如玻璃、金属或碳基材料。这些材料通常具有比较大的表面积-体积比和促进固定化酶的附着及活性的特殊表面。酶可能通过共价、离子或疏水相互作用附着在这些固体载体上。酶还可以通过基因工程相互作用来固定，例如共价融合到另一种对固体载体具有亲和力的蛋白质或肽序列上，最常见的是多组氨酸序列。酶可以直接附着在表面或表面涂层上，或者它们可以附着在表面或表面涂层上已经存在的其他蛋白质上。酶可以全部固定在一种载体上、固定在单独的载体上或这两者的组合(例如，每个载体两种酶然后混合这些载体)。这种改变可以均匀混合或在规定的层中混合，从而优化连续反应器的周转率。这些酶可以均匀混合或在规定层或区域中混合，从而优化周转率。例如，反应器开始可能有一层aGP以确保初始G1P的高增加。酶可以全部固定到一种载体珠上，每种酶固定在单独的载体珠上，或多种酶固定在载体珠上。类似地，可以使用一种或多种固定方法在一个过程中将酶固定在特定载体或多种载体上。

需要己糖生产的改进方法，从而允许可放大规模和可重复使用的酶组合物，同时实现所需己糖的高产率。

发明内容

本发明涉及用于制备己糖的固定化酶组合物。己糖包括例如塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖和肌醇。本发明的固定化酶组合物包括、基本上由或由至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种载体、至少七种或至少八种固定化在至少一种载体或载体混合物上的以下酶组成：

a)α葡聚糖磷酸化酶(αGP)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和任选1,4-葡聚糖转移酶(4-GT)；和

b)选自以下酶组合中的酶：

(i)用于制备塔格糖的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)和塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)；

(ii)用于制备阿洛酮糖的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶(P6PE)和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(P6PP)；

(iii)用于制备阿洛糖的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、P6PE、阿洛糖-6-磷酸异构酶(A6PI)和阿洛糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)；

(iv)用于制备甘露糖的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、甘露糖-6-磷酸异构酶(M6PI)或磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶(PGPMI)和甘露糖-6-磷酸磷酸酶(M6PP)；

(v)用于制备半乳糖的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、F6PE、半乳糖-6-磷酸异构酶(Gal6PI)和半乳糖-6-磷酸磷酸酶(Gal6PP)；

(vi)用于制备果糖的PGI和果糖-6-磷酸磷酸酶(F6PP)；

(vii)用于制备阿卓糖的PGI、P6PE、阿卓糖-6-磷酸异构酶(Alt6PI)和阿卓糖-6-磷酸磷酸酶(Alt6PP)；

(viii)用于制备塔罗糖的PGI、F6PE、塔罗糖-6-磷酸异构酶(Tal6PI)和塔罗糖-6-磷酸磷酸酶(Tal6PP)；

(ix)用于制备山梨糖的PGI、F6PE、山梨糖-6-磷酸差向异构酶(S6PE)和山梨糖-6-磷酸磷酸酶(S6PP)；

(x)用于制备古洛糖的PGI、F6PE、S6PE、古洛糖-6-磷酸异构酶(Gul6PI)和古洛糖-6-磷酸磷酸酶(Gul6PP)；

(xi)用于制备艾杜糖的PGI、F6PE、S6PE、艾杜糖-6-磷酸异构酶(I6PI)和艾杜糖-6-磷酸磷酸酶(I6PP)；和

(xii)用于制备肌醇的肌醇-3-磷酸合酶(IPS)和肌醇单磷酸酶(IMP)。

在本发明的固定化酶组合物中，每种酶的重量相对于酶的总重量(w/w)％为0.1％至40％。

本发明还涉及由糖制备己糖的酶促方法：通过在合适的反应条件下使淀粉衍生物与本发明的固定化酶组合物接触，将淀粉衍生物转化为己糖。

附图说明

图1A示出了塔格糖生产优化的固定化酶组合物中酶的用量。

图1B示出了固定化酶组合物中酶的用量，其中根据观察到的每种酶相对T6PP活性的反应速率对用量进行标准化，以便在级联中具有相等的活性单位。

图1C示出了固定化酶组合物中酶的用量，其中用量w/w比为1:1:1:1:1:1。

图2示出了酶负载量(酶的总重量/载体重量的w/w％)与DUOLITE^TMA568上塔格糖生产优化的固定化酶组合物活性的关系。显示的结果基于相对于5％负载载体的相对酶级联率。

具体实施方式

以下描述根据实施例公开了本发明，这些实施例涉及制备和在方法中使用固定化在载体上的酶(“固定化酶组合物”)，将淀粉和淀粉衍生物和糖类转化为己糖单糖(包括例如塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖和肌醇)。这些方法通常可以描述为使用游离磷酸盐(无ATP)由淀粉、淀粉衍生物或糖类产生磷酸化中间体的酶促反应。游离磷酸盐在能量高度有利的最后一步中释放，产生目标己糖(例如，塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖或肌醇)。然后，磷酸盐循环使用以将其他淀粉、淀粉衍生物或糖类转化为磷酸化中间体，从而可以重复该方法。这样就可以使用非化学计量用量的磷酸盐，降低了方法中磷酸盐的使用成本，并限制了废物中磷酸盐的含量。

本发明的实施例包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种载体、至少七种或至少八种酶的组合物，这些酶固定化在载体上，分别催化将淀粉、淀粉衍生物和/或糖类转化为己糖的酶促方法中的反应。本发明的固定化酶组合物与它们游离在溶液中的使用相比具有许多优点，包括：活性持续时间更长(由于对蛋白质结构特征的保护)、多次循环重复利用以及下游不需要脱酶。此外，将酶固定化在固体表面上可以在搅拌釜反应器、填充床反应器或旋转床反应器中进行；具有扩大规模的灵活性。

包含在本发明的固定化酶组合物中的酶催化至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种载体、至少七种或至少八种涉及将淀粉、淀粉衍生物或糖类逐步转化为己糖的反应。以下专利公布文本公开了用于在溶液中生产己糖的酶促方法(即酶反应级联)：公开的PCT申请WO 2018/169957、WO 2017/059278和WO 2018/112139，这些专利公布文本以其整体全部在本文中公开。本发明的固定化酶组合物可以包括但不限于这些参考文献中公开的任何酶和酶组合。

本发明的一些固定化酶组合物包含催化反应的酶的组合，这些反应在不同己糖的生产方法中是常见的，例如导致葡萄糖-6-磷酸(G6P)转化为果糖-6-磷酸(F6P)的反应步骤。催化这些常见反应步骤的酶可称为“核心酶”。因此，在本发明的一些固定化酶组合物中，固定化酶组合物至少包含核心酶：将糖类转化为葡萄糖-1-磷酸(G1P)的α葡聚糖磷酸化酶(αGP)和将G1P转化为葡萄糖-6-磷酸(G6P)的磷酸葡萄糖变位酶(PGM)。本发明的固定化酶组合物中的酶，催化将G6P转化为各种己糖产物的其他反应步骤，可以与核心酶共同固定，或包含在单独的固定化酶组合物中。

通常，核心酶与一种或多种用于生产塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖或肌醇的酶组合在固定化组合物中。因此，除αGP和PGM之外，本发明的一些固定化酶组合物还包含：(i)用于制备塔格糖的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)和塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)；(ii)用于制备阿洛酮糖的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶(P6PE)和阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(P6PP)；(iii)用于制备阿洛糖的PGI、P6PE、阿洛糖-6-磷酸异构酶(A6PI)和阿洛糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)；(iv)用于制备甘露糖的PGI、甘露糖-6-磷酸异构酶(M6PI)或磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶(PGPMI)和甘露糖-6-磷酸磷酸酶(M6PP)；(v)用于制备半乳糖的PGI、F6PE、半乳糖-6-磷酸异构酶(Gal6PI)和半乳糖-6-磷酸磷酸酶(Gal6PP)；(vi)用于制备果糖的PGI和果糖-6-磷酸磷酸酶(F6PP)；(vii)用于制备阿卓糖的PGI、P6PE、阿卓糖-6-磷酸异构酶(Alt6PI)和阿卓糖-6-磷酸磷酸酶(Alt6PP)；(viii)用于制备塔罗糖的PGI、F6PE、塔罗糖-6-磷酸异构酶(Tal6PI)和塔罗糖-6-磷酸磷酸酶(Tal6PP)；(ix)用于制备塔罗糖的PGI、F6PE、山梨糖-6-磷酸差向异构酶(S6PE)和山梨糖-6-磷酸磷酸酶(S6PP)；(x)用于制备古洛糖的PGI、F6PE、S6PE、古洛糖-6-磷酸异构酶(Gul6PI)和古洛糖-6-磷酸磷酸酶(Gul6PP)；(xi)用于制备艾杜糖的PGI、F6PE、S6PE、艾杜糖-6-磷酸异构酶(I6PI)和艾杜糖-6-磷酸磷酸酶(I6PP)；和(xii)用于制备肌醇的肌醇-3-磷酸合酶(IPS)和肌醇单磷酸酶(IMP)。核心酶和酶组合物(i)-(xii)的每种组合都是本发明的单独实施例。

上述固定化酶组合物还可以任选包含4-葡聚糖转移酶(4GT)。4GT可用于通过将降解产物葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖再循环为更长的麦芽寡糖，其可以被αGP磷酸裂解产生G1P来提高己糖产率。

当比较固定化组合物中的任何两种酶时，本发明的固定化酶组合物中各种酶的相对重量比可以是1:1000至1000:1、1:100至100:1或1:50至50:1。可以改变酶的比例，包括下文讨论的其他任选酶，从而提高己糖生产的效率。例如，特定酶相对于另一种酶的用量可以是大约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍等。

可以优化本发明的固定化酶组合物中各种酶的相对重量/重量比，从而提高方法性能和/或己糖产率。在这方面，固定化酶组合物中每种酶的重量相对于酶的总重量(w/w)％为0.1％至70％。例如，本发明的一些固定化酶组合物包含10-30％(αGP)；10-30％(PGM)；及0.1-10％(PGI)(当存在时)和0.1-10％(4GT)(当存在时)。例如，在本发明可用于生产塔格糖的固定化酶组合物中，每种酶的重量相对于酶的总重量(w/w)％是：10-30％(αGP)；0-10％(4GT)；10-30％(PGM)；0.1-10％(PGI)；15-35％(F6PE)；和25-45％(T6PP)，其中组合物中各种酶的总重量相对于酶的总重量是100w/w％。本发明用于塔格糖生产的一些固定化酶组合物包含：19％αGP；3％4GT；17％PGM；3％PGI；23％F6PE；和35％T6PP，其中每种酶的重量％是相对于本发明固定化酶组合物中酶的总重量，并且组合物中各种酶的总重量相对于酶的总重量是100w/w％。在其他实施例中，在本发明用于生产阿洛酮糖的固定化酶组合物中，每种酶的重量相对于酶的总重量(w/w)％是：10-30％(αGP)；0-10％(4GT)；10-30％(PGM)；0.1-10％(PGI)；0.1-10％(P6PE)；和45-65％(P6PP)，其中组合物中各种酶的总重量相对于酶的总重量是100w/w％。本发明用于阿洛酮糖生产的一些固定化酶组合物包含：20％αGP；3％4GT；16.5％PGM；3％PGI；3％P6PE；和54％P6PP，其中每种酶的重量％是相对于本发明固定化酶组合物中酶的总重量，并且组合物中各种酶的总重量相对于酶的总重量是100w/w％。

虽然本发明的固定化组合物中包含的酶通常基于它们催化的反应(即由特异性和功能)来指代，但酶也通常通过以下来指代：氨基酸序列(例如，SEQ.ID.NO.；数据库标识号，例如UniProt ID)、与功能已知的酶的氨基酸序列一致性/相似性、核苷酸序列或与功能已知的酶的核苷酸序列一致性/相似性。本领域已知并用于制备己糖的酶可用于本发明的固定化酶组合物，包括可用于生产塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖和肌醇的固定化酶组合物。本领域已知的示例性酶可用于本发明的固定化酶组合物，其通过以下相关专利文件鉴定。列出专利中酶的公开内容通过引用特别并入本文中。

因此，在某些固定化酶组合物中，表1提供了UniProt ID和SEQ.ID No.以鉴定以下可包含在本发明固定化酶组合物中的酶：αGP、PGM、PGI、F6PE、T6PP、4-GT、P6PE和P6PP的非限制性实例的氨基酸序列。

表1

酶	UniProt ID(SEQ.ID.NO.)
		α葡聚糖磷酸化酶(αGP)	G8NCC0(SEQ.ID.NO.1)
磷酸葡萄糖变位酶(PGM)	A0A0P6YKY9(SEQ.ID.NO.2)
		磷酸葡萄糖异构酶(PGI)	Q5SLL6(SEQ.ID.NO.3)
果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)	A0A0P6XN50(SEQ.ID.NO.4)
		塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)	D1C7G9(SEQ.ID.NO.5)
1,4-葡聚糖转移酶(4-GT)	E8MXP8(SEQ.ID.NO.6)
		阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(P6PE)	A0A223HZI7(SEQ.ID.NO.7)
阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(P6PP)	A0A0E3NCH4(SEQ.ID.NO.8)

本发明的固定化酶组合物中包含的酶的氨基酸序列还包括因为任何原因，例如为了提高活性、稳定性(即半衰期)或产率而进行修饰的酶。所述修饰的酶包括例如酶片段、氨基酸取代和嵌合蛋白。修饰的酶包括此处公开的任何酶的变体。变体可以在一个或多个氨基酸残基处包含氨基酸取代。变体相对天然存在的酶，包括不超过15个、不超过12个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个保守氨基酸取代和/或相对天然存在的酶，包括不超过5个、不超过4个、不超过3个或不超过2个或不超过1个非保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)的氨基酸。如本文所述，本发明的变体酶可以包括用氨基酸类似物以及氨基酸进行的氨基酸取代。

本发明的酶组合物中包含的酶也可以是以下特性的酶：i)与本文公开的酶的氨基酸序列具有至少35％的序列一致性；ii)可以以过程所必需的特异性催化与具体公开酶的相同反应。因此，本发明组合物中的酶包括具有与本文公开的酶的氨基酸序列至少35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的酶。本文所述术语“序列一致性”是指两个或多个氨基酸或核酸序列之间的相似性。序列一致性通常以氨基酸序列之间的一致性(或相似性或同源性)百分比来衡量；百分比越高，比对序列彼此越相似。

如上所述，本发明的酶组合物固定化在至少一种载体上。载体在本文通常也可称为“载体材料”、“载体树脂”或“载体珠”。在本发明的固定化酶组合物中，可以使用多种不同的载体来固定化一种或多种酶。虽然本发明的固定化酶组合物中的载体不一定限于特定材料，但在本发明的一些固定化酶组合物中，载体是弱碱性离子交换树脂，其可以任选由酚醛树脂(即苯酚甲醛缩聚物)构成。在本发明的其他固定化酶组合物中，载体材料基于可控孔度玻璃(CPG)颗粒或杂化CPG颗粒(WO2015115993A1)。本发明的一些固定化酶组合物中的载体通过包含叔胺基团而被官能化，而在另一些载体中，由仲胺基团提供官能性。在本发明的一些固定化酶组合物中，载体树脂采用螯合金属(例如铁或锌)的基团而官能化。螯合金属基团允许分子通过适当的结合基团，例如组氨酸(His)标签进行高亲和力结合。此类官能团的实例参见WO2015115993A1和Cassimjee et al.A general protein purification andimmobilization method on controlled porosity glass:biocatalyticapplications.Chem.Commun.,2014,50,9134；包括但不限于2,4-二羟基苄基残基。

本发明的一些固定化酶组合物中的载体具有上面列出的两种或多种载体特征。例如，在本发明的一些固定化酶组合物中，本文所述的任何固定化酶组合物中的酶组合物用于将淀粉和淀粉衍生物和糖类转化为己糖单糖的方法中，包括生产塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖或肌醇的方法，所述酶组合物被固定化在弱碱性阴离子交换树脂上；所述树脂可能由或不由苯酚甲醛缩聚物构成；并且其可以被或不被叔胺基团官能化。具有上述特征的载体树脂在商业上以DUOLITE^TMA568出售。在本发明的其他固定化酶组合物中，本文所述的任何固定化酶组合物中的酶组合物用于将淀粉和淀粉衍生物和糖类转化为己糖单糖的方法中，包括生产塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖或肌醇的方法，所述酶组合物被固定化在弱碱性阴离子交换树脂上；所述树脂可能由或不由苯酚甲醛缩聚物构成；并且其可以被或不被仲胺基团官能化。具有上述特征的载体树脂在商业上以DUOLITE^TMPWA7出售。在本发明的其他固定化酶组合物中，本文所述的任何固定化酶组合物中的酶组合物用于将淀粉和淀粉衍生物和糖类转化为己糖单糖的方法中，包括生产塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖或肌醇的方法，所述酶组合物被固定化在His标签亲和树脂上；所述树脂可能由或不由CPG或杂化CPG颗粒材料载体组成；并且其可以或不可以螯合铁或锌。具有上述特征的载体树脂在商业上以EziG^TM Opal出售。

通常，本发明固定化酶组合物中酶的总重量相对于载体重量(w/w)％为2.5％-12.5％。因此，本文所述用于将淀粉和淀粉衍生物和糖类转化为己糖单糖的方法，包括生产塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖或肌醇的方法的任何固定化酶组合物中的酶组合物的总重量相对于载体的重量(w/w)％可以是大约2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％或其中的任何w/w％。例如，在用于生产塔格糖的一些固定化酶组合物中，(αGP、PGM、PGI、F6PE和T6PP)或(αGP、4GT、PGM、PGI、F6PE和T6PP)酶的总重量是5％，而(αGP、PGM、PGI、P6PE和P6PP)或(αGP、4GT、PGM、PGI、P6PE和P6PP)酶的总重量是6.5％。

本发明还涉及由糖类制备己糖的酶促方法，包括在合适的反应条件下使淀粉衍生物与本发明的固定化酶组合物接触，将淀粉衍生物转化为己糖。在本发明用于制备己糖的酶促方法中，方法中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种载体、至少七种或至少八种酶可以固定化在同一载体上，或固定化在多种载体上。例如，在本发明的酶促方法中，酶可以固定化在同一载体上，或者固定的酶可以分布在至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种载体、至少七种或至少八种载体上，这些载体可以是相同类型的载体，或不同载体和固定方法的任意组合，包括弱碱性阴离子交换树脂载体、酚醛缩聚物载体、包含叔胺官能团的载体(例如DUOLITE^TMA568)、包含仲胺官能团的载体(例如，DUOLITE^TMPWA7)、包含His标签亲和树脂的载体、包含可控孔度玻璃(CPG)颗粒的载体和螯合金属官能化的载体，包括螯合金属为铁或锌的载体(例如EziG^TMOpal)。

将酶固定化到本文所述的任何载体的方法，包括将酶与载体树脂结合的适当缓冲液和反应条件，是本领域熟知的。参见，例如，WO 2016/160573，其全部内容并入本文中。

使用本发明的固定化酶组合物将淀粉和淀粉衍生物和糖类转化为己糖的方法可以在使用溶液中非固定化酶生产己糖的相同温度、缓冲液和反应时间等参数下进行。例如，本发明的固定化酶组合物可用于在公布的PCT申请WO 2018/169957、WO 2017/059278和WO2018/112139中描述的反应条件下，由淀粉和淀粉衍生物和糖类生产塔格糖、阿洛酮糖、果糖、阿洛糖、甘露糖、半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖或肌醇。使用本发明的固定化酶组合物生产己糖的方法中的多个催化反应步骤可以在单个生物反应器中进行，或者在串联布置的多个生物反应器中进行，或者在反应容器中进行。或者，这些步骤也可以在串联或并联布置的多个生物反应器或反应容器中进行。所有上述方法都可以按分批模式或连续模式运行。在单个生物反应器中优选采用“一锅法”。

本发明酶促方法的步骤可以在约35℃至约90℃、约40℃至约70℃、约50℃至约60℃或约55℃的温度和约5.0至约8.0、约6.5至约7.5或约7.0至约7.5的pH下进行。它们可以进行约0.5小时至约48小时、约4小时至24小时或约8小时至12小时。本发明酶促方法的步骤可以在无ATP和/或无NAD(P)(H)的情况下进行。这些步骤可以在约0.1mM至约150mM的磷酸盐浓度下进行。本发明方法的磷酸化和去磷酸化步骤中使用的磷酸盐可以在酶促级联反应中循环使用。本发明的方法可以在填充柱或浆液中进行。

例如，每种方法中反应磷酸盐浓度可以是约0.1mM至约300mM、约0mM至约150mM、约1mM至约50mM，优选约5mM至约50mM，或更优选约10mM至约50mM。例如，每种方法中反应磷酸盐浓度可以是约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM或约55mM。

由于总磷酸盐含量低，而磷酸盐浓度低降低了磷酸盐脱除成本，因此使得生产成本降低。这样还可以防止高浓度游离磷酸盐对工艺酶的抑制，并降低磷酸盐污染的可能性。

此外，本文公开的每种方法都可以在不添加ATP作为磷酸盐来源的情况下进行，即不含ATP。每种方法也可以在不必添加NAD(P)(H)的情况下进行，即不含NAD(P)(H)。其他优点还包括：所公开的己糖制备方法的至少一个步骤涉及对高产率必不可少的能量上高度有利的化学反应。对于本发明的方法，能量上高度有利的化学反应的平衡常数(K_eq)是至少2、至少3或至少4。

作为本发明方法的第一步，淀粉衍生物可以通过淀粉的酶水解或通过淀粉的酸水解来制备。参见，例如WO 2017/059278。例如，淀粉的酶水解可以通过水解α-1,6-糖苷键的异淀粉酶(IA，EC.3.2.1.68)；水解α-1,6-糖苷键的支链淀粉酶(PA，EC.3.2.1.41)；催化短麦芽寡糖的转糖基化以产生更长的麦芽寡糖的4-α-葡聚糖转移酶(4GT，EC.2.4.1.25)；或裂解α-1,4-糖苷键的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)来催化或增强。此外，纤维素衍生物可以通过纤维素酶混合物催化的纤维素酶水解、酸水解或生物质预处理来制备。

实施例

实施例1酶载体的评估。对酶载体用于生产塔格糖的酶组合物的相对反应速率，以及它们对酶稳定性的影响进行评估。考虑到这些目标，对以下酶载体材料进行评估：四种品牌的酚醛基质树脂(DUOLITE^TMA568、DUOLITE^TMA561、DUOLITE^TMPWA7、AmberLite^TM FPA54)；两种品牌的聚苯乙烯树脂(Lifetech^TMECR1640和LifeTech^TMECR1504)；两种品牌的聚甲基丙烯酸酯树脂(Lifetech^TMECR8309M和Chromolite^TMD6154)；和一种品牌的可控孔度玻璃树脂(EziG Opal^TM)。

DUOLITE^TMA568(杜邦，DuPont)离子交换树脂是一种基于交联苯酚甲醛缩聚物的高孔隙度、粒状、弱碱性阴离子交换树脂。它的亲水性和可控的孔径分布使其成为最适合在许多生物加工应用中用作酶载体的树脂。DUOLITE^TMA568的离子强度、孔体积、孔径和粒径设计用于最佳地固定化淀粉和脂肪(及其他)行业中使用的酶。

DUOLITE^TMA561离子交换树脂是一种弱碱性阴离子交换树脂，由具有叔胺官能团的酚醛树脂制造，其广泛的规格与DUOLITE^TMA568树脂相似，但DUOLITE^TMA561具有不同的珠粒形态。

DUOLITE^TMPWA7是一种具有胺官能团和盐形式的弱碱性阴离子交换树脂。

AMBERLITE^TMFPA54离子交换树脂是一种基于交联苯酚-甲醛基质的高孔隙度弱碱性阴离子交换树脂。AMBERLITE^TMFPA54的低膨胀特性使其具有出色的渗透性和物理稳定性，与食品加工和生物加工应用中的常规苯乙烯树脂相比，产品损失更少，产品寿命更长。AMBERLITE^TMFPA54的亲水酚醛多孔基质允许可逆吸附天然产物和发酵产物溶液中常见的高分子量有机发色体。AMBERLITE^TMFPA54对硫酸盐和磷酸盐具有高选择性，因此非常适合用于处理源自发酵的柠檬酸和乳酸，特别是由于其出色的渗透稳定性，它在这些应用中具有悠久的使用历史。

Lifetech^TMECR1640是季胺官能化的二乙烯基苯(DVB)和苯乙烯共聚物。它用于通过可电离的表面氨基酸(Lys、Arg、His、Asp、Glu)与聚合物上叔胺的离子相互作用来固定化酶。它特别适用于固定pI范围为3-5的酶，如许多糖苷酶。Lifetech^TMECR1640的主要特点是树脂再生的可能性、固定前的pH调节和适用于色谱柱应用的大粒径。季胺DVB/苯乙烯，300-1200微米，pH稳定性1-14，湿式供货(66-72％水)，容量0.85eq/l Cl-形式。

Lifetech^TMECR1504是叔胺官能化的二乙烯基苯(DVB)和苯乙烯共聚物。它用于通过可电离的表面氨基酸(Lys、Arg、His、Asp、Glu)与聚合物上叔胺的离子相互作用来固定化酶。它特别适用于固定pI范围为3-5的酶，如许多糖苷酶。Lifetech^TMECR1504的主要特点是树脂再生的可能性、固定前的pH调节和适用于色谱柱应用的大粒径。叔胺DVB/苯乙烯，300-1200微米，pH稳定性1-14，湿式供货(53-62％水)，容量1.3eq/l游离碱。

Lifetech^TMECR8309M是一种亲水性、高孔隙率、短间隔(C2)上氨基官能化的甲基丙烯酸酯聚合物。

Chromolite^TMD6154是一种大孔聚甲基丙烯酸酯，是一种经官能化对多His标签特异性亲和结合的材料。官能团是Na⁺形式的亚氨基二乙酸。

EziG^TMOpal由可控孔度玻璃(CPG)颗粒制造，具有亲水性表面。该材料具有较窄的孔径分布，标准孔径约为

预计质量负载15-60％的活性酶。存在EziG^TM的其他变体(Amber和Coral)，对它们进行了测试，但与Opal相比，它们的表现欠佳。

将酶组合物固定化在上述每种载体上，所述酶组合物包含分别相对于组合物酶总重量的以下重量/重量(w/w)百分比的下述各种酶：19％α-葡聚糖磷酸化酶(αGP,UNIPROTID G8NCC0,SEQ.ID.NO.1)；17％磷酸葡萄糖变位酶(PGM,UNIPROT ID A0A0P6YKY9,SEQ.ID.NO.2)；3％磷酸葡萄糖异构酶(PGI,UNIPROT ID Q5SLL6,SEQ.ID.NO.3)；23％果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE,UNIPROT ID A0A0P6XN50,SEQ.ID.NO.4)；35％塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP,UNIPROT ID D1C7G9,SEQ.ID.NO.5)；和3％1,4-葡聚糖转移酶(4-GT,UNIPROTIDE8MXP8,SEQ.ID.NO.6)。所有固定化酶制剂均为5％总酶重量/载体。参见表2。先前使用下述固定化方法针对塔格糖生产对前述酶比例进行了优化。

表2

酶	Uniprot ID	％酶组合物
			α葡聚糖磷酸化酶(αGP)	G8NCC0(SEQ.ID.NO.1)	19％
磷酸葡萄糖变位酶(PGM)	A0A0P6YKY9(SEQ.ID.NO.2)	17％
			磷酸葡萄糖异构酶(PGI)	Q5SLL6(SEQ.ID.NO.3)	3％
果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)	A0A0P6XN50(SEQ.ID.NO.4)	23％
			塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)	D1C7G9(SEQ.ID.NO.5)	35％
1,4-葡聚糖转移酶(4-GT)	E8MXP8(SEQ.ID.NO.6)	3％

在将组合物中的酶附着到每种载体上之前，载体先用两当量体积的水，然后用三当量体积的pH 7.2的固定化缓冲液(5mM Na₂PO₄，5mM MgSO₄，0.25mM MnCl₂)平衡。将酶悬浮在固定化缓冲液中，形成酶组合物(优选5至10g/L酶)，然后将其添加到载体中以制备浆液。在800rpm的轨道摇床上室温孵育期间，在280nm处测量酶组合物和载体浆液的吸光度，跟踪载体上酶的吸附情况，直到>95％的可溶性酶不再悬浮在溶液中，对负载5％(w/w，酶/载体)的样品来说，这一过程大约需要6小时。去除上清液，并用pH 7.2的反应缓冲液(25mMNa₂PO₄，4mM Na₂SO₃，2.5mM MgSO₄，0.25mM MnCl₂)洗涤固定化载体，去除任何剩余的可溶性酶。将每个浆液样品与等体积的2倍浓缩进料溶液(320g/L葡萄糖当量5(DE5)的麦芽糖糊精，pH 7.2，25mM Na₂PO₄，4mM Na₂SO₃，2.5mM MgSO₄，0.25mM MnCl₂)混合，在反应条件下，最终麦芽糖糊精底物浓度达到160g/L。将麦芽糖糊精-载体混合物在2.0mL微量离心管中在Eppendorf Thermomixer F2.0中以800-1500rpm的速度摇动过夜，其中DUOLITE^TMA568、Lifetech^TMECR1640、LifeTech^TMECR1504、Lifetech^TMECR8309M、Chromolite^TMD6154和EziG^TMOpal组合物-载体组合在50℃下摇动过夜，而DUOLITE^TM

A561、DUOLITE^TMPWA7、AmberLite^TMFPA54组合物-载体组合在55℃下摇动过夜。反应持续15-18小时。使用配备在线示差折光检测器的Agilent 1100系列HPLC系统，将所得产物在HiPlex H配体交换柱(安捷伦)上运行(0.6mL/min，流动相5mM H₂SO₄，65℃)。塔格糖浓度通过将样品峰面积与已知塔格糖浓度的标准溶液的峰面积进行比较来确定。计算每种载体的固定化酶组合物级联活性率(产生的塔格糖微摩尔/分钟/毫克总酶)。每种载体-组合物制剂的级联活性率相对Duolite A568载体-组合物制剂的级联活性率在表1中报告。通过五次洗涤将剩余的麦芽糖糊精和塔格糖从每种固定化酶制剂上洗掉，每次洗涤由至少三体积当量的反应缓冲液组成，以平衡制剂供重复使用。如前所述，通过添加2倍浓缩麦芽糖糊精进料溶液重复使用固定化酶制剂。计算每次后续使用的反应速率，并绘图以确定固定化催化剂的工作半衰期。测量第0天和随后天数的级联率(μmol/min/mg)，直到少于一半的活性持续丧失(与第0天相比)，从而确定半衰期。表3中的n/d标注表示半衰期<10％或级联活性小于Duolite A568的50％。

表3

*糖转化为己糖的反应在55℃下进行

实施例2酶比例对级联活性率的影响。为了评估改变各种固定化酶的比例对塔格糖生产的影响，相对于使用实施例1和表1中描述的酶比例制备的DUOLITE^TMA568-固定化组合物(“实施例1固定化组合物”)，改变两种固定化组合物制剂中固定化在DUOLITE^TMA568上的αGP、PGM、PGI、F6PE、T6PP和4-GT的用量。对照实施例1固定化组合物的性能，对它们的活性率进行评价。在其中一种浓度改变的固定化组合物中，酶的用量基于观察到的每种酶相对于溶液中T6PP的活性率，如表4(图1B)所示，其中每种酶添加等量的酶活性(μmol/min)。这种固定化组合物的活性率是最佳比例的74％。另一种浓度改变的固定化组合物含有按重量计等量的每种酶(图1C)。该固定化组合物的活性率是最佳比例的85％。如实施例1中所述进行反应，并以μmol/min/mg总酶测定转化率。

表4

酶	酶活性，以T6PP活性的％计
		α葡聚糖磷酸化酶(αGP)	78％
磷酸葡萄糖变位酶(PGM)	861％
		磷酸葡萄糖异构酶(PGI)	2930％
果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)	215％
		塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)	100％
1,4-葡聚糖转移酶(4-GT)	977％

实施例3：酶在一种或多种载体上分布的影响。使用如实施例1所述在单一固定化反应中制备的DUOLITE^TMA568固定化组合物(19％αGP、17％PGM、3％PGI、23％F6PE、35％T6PP和3％4-GT)由麦芽糖糊精生产塔格糖的方法，与使用以下执行方法的活性率进行比较：(1)核心生产酶(αGP、PGM、PGI和4GT)的DUOLITE^TMA568固定化组合物和塔格糖生产专用酶(F6PE和T6PP)的DUOLITE^TMA568固定化组合物的混合物；和(2)以下6种单独的固定化酶制剂的混合物：DUOLITE^TMA568固定化αGP、DUOLITE^TMA568固定化PGM、DUOLITE^TMA568固定化PGI、DUOLITE^TMA568固定化4GT、DUOLITE^TMA568固定化F6PE和DUOLITE^TMA568固定化T6PP。(1)和(2)中所有酶的比例均与参考的DUOLITE^TMA568固定化组合物相同，所有固定化均采用如实施例1所述的5％w/w比例(酶/载体)和缓冲液/反应条件进行。结果如表5所示。

表5

实施例4酶负载量的影响。如实施例1所述并按照表2所列比例，将不同负载量的酶(g酶/g载体，以2.5％的间隔由2.5％至12.5％)固定化在Duolite A568上。然而，与实施例1不同的是，对于每个样品，固定化持续进行16小时而不是6小时，从而使更高负载量的酶有足够时间完成结合。用含有至少三倍样品体积的pH 7.2的反应缓冲液(25mM Na₂PO₄，4mMNa₂SO₃，2.5mM MgSO₄，0.25mM MnCl2)洗涤五次，洗掉可溶性酶。样品与麦芽糖糊精进料溶液反应16小时，按实施例1中的μmol/min/mg总酶测量转化率。将相对于5％负载量样品的相对酶级联率对照负载量作图，如图2所示。负载量响应以及酶和载体的价格允许设计出最具经济效益的催化剂。

实施例5使用固定化酶组合物制备阿洛酮糖。如表6中所述，将含有三种不同酶比例的以下酶：αGP、PGM、PGI、阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(P6PE)、阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(P6PP)和4-GT的酶组合物在各自的固定化反应中固定在DUOLITE^TMA568上。对三种固定化组合物制剂由麦芽糖糊精生产阿洛酮糖进行了比较分析。

表6阿洛酮糖固定化酶组合物

为了制备固定化混合物，将DUOLITE^TMA568在室温下在翻滚式旋转器中用1％戊二醛(GA)水溶液预处理2小时。用水洗涤5次，用固定化缓冲液(10mM pH 7.2的磷酸钠缓冲液，5mM MgSO₄和80μM CoCl₂)进行2次调节洗涤去除GA。然后，在最后的洗涤步骤后将酶溶液(表5)添加到GA预处理的载体中(弃去上清液)。酶溶液由5g/L酶的反应缓冲液(10mM pH 7.2的磷酸钠缓冲液，5mM MgSO₄，5mM NaSO₃和80μM CoCl₂)组成。将酶-载体溶液在室温下在设定800rpm的轨道摇床上孵育16小时，从而将酶混合物固定化在载体中。总负载百分比是6.5％(mg酶/mg载体)。用由反应缓冲液组成的洗涤液洗涤上清液6次，去除任何残留的未结合酶。除去最后的上清液，并加入预先溶解在反应缓冲液中的150g/L麦芽糖糊精。将麦芽糖糊精-载体混合物在2.0mL微量离心管中在Eppendorf Thermomixer F2.0中在55℃下以800-1500rpm摇动过夜(15-16小时)。使用配备在线示差折光检测器的Agilent 1100系列HPLC系统，将所得产物在SupelCogel Pb柱(Sigma Aldrich)上运行(0.6mL/min，80℃，超纯水流动相)。通过比较样品峰面积与已知浓度的阿洛酮糖标准溶液的峰面积来确定阿洛酮糖浓度，并计算酶级联比活性率。用反应缓冲液洗涤4次，将阿洛酮糖生产反应物从每种固定化制剂上洗掉，以平衡固定化制剂供重复使用。每种样品组合物的相对比活性结果如下表7所示。

表7固定化阿洛酮糖生产酶的相对活性

实施例6使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备阿洛糖。阿洛糖将使用包括αGP、PGM、PGI、4GT和P6PE、A6PI和A6PP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例7使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备果糖。果糖将使用包括αGP、PGM、PGI、4GT和F6PP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例8使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备甘露糖。甘露糖将使用包括αGP、PGM、PGI、4GT和M6PI或PGPMI和M6PP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例9使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备半乳糖。半乳糖将使用包括αGP、PGM、PGI、F6PE、4GT、Gal6PI和Gal6P的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例10使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备阿卓糖。阿卓糖将使用包括αGP、PGM、PGI、P6PE、Alt6PI和Alt6PP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例11使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备塔罗糖。塔罗糖将使用包括αGP、PGM、PGI、F6PE、Tal6PI和Tal6PP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例12使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备山梨糖。山梨糖将使用包括αGP、PGM、PGI、F6PE、S6PE和S6PP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例13使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备古洛糖。古洛糖将使用包括αGP、PGM、PGI、F6PE、S6PE、Gul6PI和Gul6PP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例15使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备艾杜糖。艾杜糖将使用包括αGP、PGM、PGI、F6PE、S6PE、I6PI和I6PP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

实施例16使用固定化酶组合物由麦芽糖糊精制备肌醇。肌醇将使用包括αGP、PGM、4GT、IPS和IMP的固定化酶组合物由麦芽糖糊精生产。

序列表

<110> 博努莫斯股份有限公司

<120> 用于生产己糖的固定化酶组合物

<130> P22JM1WN00008US

<150> 62/875321

<151> 2019-07-17

<150> 62/924323

<151> 2019-10-22

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 808

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌（Thermus sp. CCB_US3_UF1）

<400> 1

Met Pro Leu Leu Pro Glu Pro Leu Ser Gly Leu Lys Glu Leu Ala Tyr

1 5 10 15

Asn Leu Trp Trp Ser Trp Asn Pro Glu Ala Ala Glu Leu Phe Gln Glu

20 25 30

Ile Asp Pro Ser Leu Trp Lys Arg Phe Arg Gly Asn Pro Val Lys Leu

35 40 45

Leu Leu Glu Ala Asp Pro Gly Arg Leu Glu Gly Leu Ala Ala Thr Ser

50 55 60

Tyr Pro Ala Arg Val Gly Ala Val Val Glu Ala Leu Arg Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Arg Glu Glu Lys Gln Gly Pro Leu Val Ala Tyr Phe Ser Ala

85 90 95

Glu Tyr Gly Phe His Ser Ser Leu Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly

100 105 110

Val Leu Ala Gly Asp His Val Lys Ala Ala Ser Asp Leu Gly Leu Asn

115 120 125

Leu Val Gly Val Gly Ile Phe Tyr His Glu Gly Tyr Phe His Gln Arg

130 135 140

Leu Ser Pro Glu Gly Val Gln Val Glu Val Tyr Glu Thr Leu His Pro

145 150 155 160

Glu Glu Leu Pro Leu Tyr Pro Val Gln Asp Arg Glu Gly Arg Pro Leu

165 170 175

Arg Val Gly Val Glu Phe Pro Gly Arg Thr Leu Trp Leu Ser Ala Tyr

180 185 190

Arg Val Gln Val Gly Ala Val Pro Val Tyr Leu Leu Thr Ala Asn Leu

195 200 205

Pro Glu Asn Thr Pro Glu Asp Arg Ala Ile Thr Ala Arg Leu Tyr Ala

210 215 220

Pro Gly Leu Glu Met Arg Ile Gln Gln Glu Leu Val Leu Gly Leu Gly

225 230 235 240

Gly Val Arg Leu Leu Arg Ala Leu Gly Leu Ala Pro Glu Val Phe His

245 250 255

Met Asn Glu Gly His Ser Ala Phe Leu Gly Leu Glu Arg Val Arg Glu

260 265 270

Leu Val Ala Glu Gly His Pro Phe Pro Val Ala Leu Glu Leu Ala Arg

275 280 285

Ala Gly Ala Leu Phe Thr Thr His Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp

290 295 300

Ala Phe Pro Leu Glu Leu Val Glu Arg Tyr Leu Gly Gly Phe Trp Glu

305 310 315 320

Arg Met Gly Thr Asp Arg Glu Thr Phe Leu Ser Leu Gly Leu Glu Glu

325 330 335

Lys Pro Trp Gly Lys Val Phe Ser Met Ser Asn Leu Ala Leu Arg Thr

340 345 350

Ser Ala Gln Ala Asn Gly Val Ser Arg Leu His Gly Glu Val Ser Arg

355 360 365

Glu Met Phe His His Leu Trp Pro Gly Phe Leu Arg Glu Glu Val Pro

370 375 380

Ile Gly His Val Thr Asn Gly Val His Thr Trp Thr Phe Leu His Pro

385 390 395 400

Arg Leu Arg Arg His Tyr Ala Glu Val Phe Gly Pro Glu Trp Arg Lys

405 410 415

Arg Pro Glu Asp Pro Glu Thr Trp Lys Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu

420 425 430

Phe Trp Gln Ile His Lys Asp Leu Arg Ala Glu Leu Val Arg Glu Val

435 440 445

Arg Thr Arg Leu Tyr Glu Gln Arg Arg Arg Asn Gly Glu Ser Pro Ser

450 455 460

Arg Leu Arg Glu Ala Glu Lys Val Leu Asp Pro Glu Ala Leu Thr Ile

465 470 475 480

Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr Tyr Lys Arg Ala Val Leu Leu Phe

485 490 495

Lys Asp Pro Glu Arg Leu Arg Arg Leu Leu His Gly His Tyr Pro Ile

500 505 510

Gln Phe Val Phe Ala Gly Lys Ala His Pro Lys Asp Glu Pro Gly Lys

515 520 525

Ala Tyr Leu Gln Glu Leu Phe Ala Lys Ile Arg Glu Tyr Gly Leu Glu

530 535 540

Asp Arg Met Val Val Leu Glu Asp Tyr Asp Met Tyr Leu Ala Arg Val

545 550 555 560

Leu Val His Gly Ser Asp Val Trp Leu Asn Thr Pro Arg Arg Pro Met

565 570 575

Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ala Leu Asn Gly Ala Leu

580 585 590

Asn Leu Ser Val Leu Asp Gly Trp Trp Ala Glu Ala Tyr Asn Gly Lys

595 600 605

Asn Gly Phe Ala Ile Gly Asp Glu Arg Val Tyr Glu Ser Glu Glu Ala

610 615 620

Gln Asp Met Ala Asp Ala Gln Ala Leu Tyr Asp Val Leu Glu Phe Glu

625 630 635 640

Val Leu Pro Leu Phe Tyr Ala Lys Gly Pro Glu Gly Tyr Ser Ser Gly

645 650 655

Trp Leu Ser Met Val His Glu Ser Leu Arg Thr Val Gly Pro Arg Tyr

660 665 670

Ser Ala Ala Arg Met Val Gly Asp Leu Glu Ile Tyr Arg Arg Gly Gly

675 680 685

Ala Trp Ala Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Glu Ala Leu Ala Ala Phe

690 695 700

His Gln Ala Leu Pro Ala Leu Gln Gly Val Thr Leu Arg Ala Gln Val

705 710 715 720

Pro Gly Asp Leu Thr Leu Asn Gly Val Pro Met Arg Val Arg Ala Phe

725 730 735

Leu Glu Gly Glu Val Pro Glu Ala Leu Arg Pro Phe Leu Glu Val Gln

740 745 750

Leu Val Val Arg Arg Ser Ser Gly His Leu Glu Val Val Pro Met Arg

755 760 765

Pro Gly Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Tyr Arg Pro Ser Arg Pro Gly

770 775 780

Ser Tyr Ala Tyr Gly Val Arg Leu Ala Leu Arg His Pro Ile Thr Gly

785 790 795 800

His Val Ala Trp Val Arg Trp Ala

805

<210> 2

<211> 473

<212> PRT

<213> Thermanaerothrix daxensis

<400> 2

Met Gly His Lys Ile Met Phe Gly Thr Asp Gly Trp Arg Gly Val Ile

1 5 10 15

Ala Glu Asp Tyr Thr Phe Asp Asn Val Arg Arg Cys Ala Gln Gly Phe

20 25 30

Ala His Tyr Leu Lys Thr Lys Gly Tyr Lys Asp Glu Trp Val Val Val

35 40 45

Gly Tyr Asp Lys Arg Phe His Ser Glu Asn Phe Ala Gln Ala Ala Ala

50 55 60

Glu Val Leu Cys Gly Asn Gly Phe Arg Val Tyr Leu Thr Asp Lys Ala

65 70 75 80

Thr Pro Thr Pro Val Ile Ala Tyr Ala Val Val Glu Arg Lys Ala Ile

85 90 95

Gly Ala Val Asn Ile Thr Ala Ser His Asn Pro Pro Thr Asp Asn Gly

100 105 110

Phe Lys Val Arg Asp Ala Ser Gly Gly Ala Ile Asp Pro Glu Gly Leu

115 120 125

Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ile Pro Asp Glu Met Ser Ala Val Lys Arg

130 135 140

Met Pro Ala Ser Glu Ala Glu Ala Gln Gly Arg Leu Val Arg Phe Asp

145 150 155 160

Pro Ala Pro Ala Tyr Ile Glu His Leu Lys Ser Leu Ile Asp Leu Gln

165 170 175

Pro Ile Arg Asp Ala Gly Leu Lys Ile Val Val Asp Ala Met Trp Gly

180 185 190

Asn Gly Ala Gly Trp Phe Pro Arg Leu Leu Ala Gly Gly Lys Thr Glu

195 200 205

Val Tyr Glu Ile His Asn Thr Arg Asn Pro Ile Phe Pro Glu Met Lys

210 215 220

Arg Pro Glu Pro Ile Pro Pro Asn Ile Asp Val Gly Leu Arg Thr Thr

225 230 235 240

Val Glu Arg Arg Ala Asp Val Leu Val Val Thr Asp Gly Asp Ala Asp

245 250 255

Arg Val Gly Ile Gly Asp Glu His Gly Arg Phe Val Asn Gln Leu Gln

260 265 270

Val Tyr Gly Leu Leu Ala Phe Tyr Leu Leu Glu Val Arg Gly Glu Arg

275 280 285

Gly Pro Ile Ile Lys Thr Leu Ser Thr Thr Ser Met Leu Glu Lys Leu

290 295 300

Gly Glu Ile Tyr Gly Val Pro Val Tyr Glu Thr Gly Val Gly Phe Lys

305 310 315 320

Tyr Val Ala Pro Lys Phe Leu Glu Thr Asn Ala Leu Ile Gly Gly Glu

325 330 335

Glu Ser Gly Gly Tyr Ala Phe Arg Gly Asn Val Pro Glu Arg Asp Gly

340 345 350

Ile Leu Ala Gly Leu Tyr Phe Leu Asp Met Met Val Arg Leu Asn Arg

355 360 365

Lys Pro Ser Gln Leu Leu Glu Leu Leu Phe Ser Lys Val Gly Pro His

370 375 380

Tyr Tyr Asp Arg Val Asp Arg Gln Phe Thr Gly Asp Arg Lys Thr Arg

385 390 395 400

Glu Glu Met Ile Leu Asn Ala Asn Pro His Thr Ile Gly Gly Leu Lys

405 410 415

Val Val Gly Leu Asn Thr Leu Asp Gly Phe Lys Phe Leu Leu Glu Asp

420 425 430

Gly Gly Trp Met Leu Ile Arg Phe Ser Gly Thr Glu Pro Ile Ile Arg

435 440 445

Val Tyr Cys Glu Thr Thr His Pro Asp Arg Val Gln Pro Ile Leu Gln

450 455 460

Asp Gly Leu Arg Ile Ala Gly Leu Ala

465 470

<210> 3

<211> 415

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）

<400> 3

Met Leu Arg Leu Asp Thr Arg Phe Leu Pro Gly Phe Pro Glu Ala Leu

1 5 10 15

Ser Arg His Gly Pro Leu Leu Glu Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Ala

20 25 30

Lys Arg Gly Glu Pro Gly Ser Met Leu Gly Trp Met Asp Leu Pro Glu

35 40 45

Asp Thr Glu Thr Leu Arg Glu Val Arg Arg Tyr Arg Glu Ala Asn Pro

50 55 60

Trp Val Glu Asp Phe Val Leu Ile Gly Ile Gly Gly Ser Ala Leu Gly

65 70 75 80

Pro Lys Ala Leu Glu Ala Ala Phe Asn Glu Ser Gly Val Arg Phe His

85 90 95

Tyr Leu Asp His Val Glu Pro Glu Pro Ile Leu Arg Leu Leu Arg Thr

100 105 110

Leu Asp Pro Arg Lys Thr Leu Val Asn Ala Val Ser Lys Ser Gly Ser

115 120 125

Thr Ala Glu Thr Leu Ala Gly Leu Ala Val Phe Leu Lys Trp Leu Lys

130 135 140

Ala His Leu Gly Glu Asp Trp Arg Arg His Leu Val Val Thr Thr Asp

145 150 155 160

Pro Lys Glu Gly Pro Leu Arg Ala Phe Ala Glu Arg Glu Gly Leu Lys

165 170 175

Ala Phe Ala Ile Pro Lys Glu Val Gly Gly Arg Phe Ser Ala Leu Ser

180 185 190

Pro Val Gly Leu Leu Pro Leu Ala Phe Ala Gly Ala Asp Leu Asp Ala

195 200 205

Leu Leu Met Gly Ala Arg Lys Ala Asn Glu Thr Ala Leu Ala Pro Leu

210 215 220

Glu Glu Ser Leu Pro Leu Lys Thr Ala Leu Leu Leu His Leu His Arg

225 230 235 240

His Leu Pro Val His Val Phe Met Val Tyr Ser Glu Arg Leu Ser His

245 250 255

Leu Pro Ser Trp Phe Val Gln Leu His Asp Glu Ser Leu Gly Lys Val

260 265 270

Asp Arg Gln Gly Gln Arg Val Gly Thr Thr Ala Val Pro Ala Leu Gly

275 280 285

Pro Lys Asp Gln His Ala Gln Val Gln Leu Phe Arg Glu Gly Pro Leu

290 295 300

Asp Lys Leu Leu Ala Leu Val Ile Pro Glu Ala Pro Leu Glu Asp Val

305 310 315 320

Glu Ile Pro Glu Val Glu Gly Leu Glu Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Gly

325 330 335

Lys Thr Leu Phe Gln Leu Leu Lys Ala Glu Ala Glu Ala Thr Tyr Glu

340 345 350

Ala Leu Ala Glu Ala Gly Gln Arg Val Tyr Ala Leu Phe Leu Pro Glu

355 360 365

Val Ser Pro Tyr Ala Val Gly Trp Leu Met Gln His Leu Met Trp Gln

370 375 380

Thr Ala Phe Leu Gly Glu Leu Trp Glu Val Asn Ala Phe Asp Gln Pro

385 390 395 400

Gly Val Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Arg Lys Arg Leu Ala Gly

405 410 415

<210> 4

<211> 426

<212> PRT

<213> Thermanaerothrix daxensis

<400> 4

Met Val Thr Tyr Leu Asp Phe Val Val Leu Ser His Arg Phe Arg Arg

1 5 10 15

Pro Leu Gly Ile Thr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Tyr Val Ile Glu

20 25 30

Ala Ala Leu Arg Asn Gly Met Met Thr His Thr Pro Val Leu Ile Glu

35 40 45

Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr

50 55 60

Pro Ala Asp Phe Val Arg Tyr Val Glu Asn Ile Ala Ala Arg Val Gly

65 70 75 80

Ser Pro Arg Glu Asn Leu Leu Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu

85 90 95

Val Trp Ala His Glu Pro Ala Glu Ser Ala Met Glu Lys Ala Arg Ala

100 105 110

Leu Val Lys Ala Tyr Val Glu Ala Gly Phe Arg Lys Ile His Leu Asp

115 120 125

Cys Ser Met Pro Cys Ala Asp Asp Arg Asp Phe Ser Pro Lys Val Ile

130 135 140

Ala Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Gln Val Ala Glu Ser Thr Cys Asp

145 150 155 160

Val Met Gly Leu Pro Leu Pro Asn Tyr Val Ile Gly Thr Glu Val Pro

165 170 175

Pro Ala Gly Gly Ala Lys Ala Glu Ala Glu Thr Leu Arg Val Thr Arg

180 185 190

Pro Glu Asp Ala Ala Glu Thr Ile Ala Leu Thr Arg Ala Ala Phe Phe

195 200 205

Lys Arg Gly Leu Glu Ser Ala Trp Glu Arg Val Val Ala Leu Val Val

210 215 220

Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asp His Gln Ile His Val Tyr Arg Arg

225 230 235 240

Glu Glu Ala Gln Ala Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ser Gln Pro Gly Leu

245 250 255

Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Arg Asp Ala Leu Arg

260 265 270

Ala Leu Val Glu Asp His Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu

275 280 285

Thr Phe Ala Phe Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Ser Ile Glu Asp

290 295 300

Trp Val Cys Asp Ser Pro Ser Arg Ile Leu Glu Val Leu Glu Thr Thr

305 310 315 320

Met Leu Ala Asn Pro Val Tyr Trp Gln Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Glu

325 330 335

Arg Ala Arg Arg Ile Ala Arg Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ile Arg

340 345 350

Tyr Tyr Trp Ser Ala Pro Ala Val Glu Gln Ala Phe Glu Arg Leu Arg

355 360 365

Ala Asn Leu Asn Arg Val Ser Ile Pro Leu Val Leu Leu Ser Gln Tyr

370 375 380

Leu Pro Asp Gln Tyr Arg Lys Val Arg Asp Gly Arg Leu Pro Asn Gln

385 390 395 400

Phe Asp Ala Leu Ile Leu Asp Lys Ile Gln Ala Val Leu Glu Asp Tyr

405 410 415

Asn Val Ala Cys Gly Val Arg Ile Gly Glu

420 425

<210> 5

<211> 219

<212> PRT

<213> 嗜热球杆菌（Sphaerobacter thermophilus）

<400> 5

Met Ser Gln Gly Val Arg Gly Val Val Phe Asp Leu Asp Gly Leu Leu

1 5 10 15

Val Glu Ser Glu Glu Tyr Trp Glu Gln Ala Arg Arg Glu Phe Val Ser

20 25 30

Arg Tyr Gly Gly Thr Trp Gly Asp Asp Ala Gln Gln Ala Val Met Gly

35 40 45

Ala Asn Thr Arg Gln Trp Ser Arg Tyr Ile Arg Glu Ala Phe Asp Ile

50 55 60

Pro Leu Thr Glu Glu Glu Ile Ala Ala Ala Val Ile Ala Arg Met Gln

65 70 75 80

Glu Leu Tyr His Asp His Leu Pro Leu Leu Pro Gly Ala Ile Pro Ala

85 90 95

Val Arg Ala Leu Ala Asp Arg Tyr Pro Leu Ala Val Ala Ser Ser Ser

100 105 110

Pro Pro Val Leu Ile Arg Phe Val Leu Ala Glu Met Gly Val Ala Glu

115 120 125

Cys Phe Gln Ser Val Thr Ser Ser Asp Glu Val Ala His Gly Lys Pro

130 135 140

Ala Pro Asp Val Tyr His Leu Ala Cys Glu Arg Leu Gly Val Ala Pro

145 150 155 160

Glu Gln Ala Val Ala Phe Glu Asp Ser Thr Ala Gly Ile Ala Ala Ala

165 170 175

Leu Ala Ala Gly Leu Arg Val Ile Ala Val Pro Asn Arg Ser Tyr Pro

180 185 190

Pro Asp Pro Asp Val Leu Arg Arg Ala Asp Leu Thr Leu Pro Ser Leu

195 200 205

Glu Glu Phe Asp Pro Ala Val Leu Glu Gln Trp

210 215

<210> 6

<211> 511

<212> PRT

<213> 嗜热厌氧绳菌（Anaerolinea thermophila）

<400> 6

Met Ser Leu Phe Lys Arg Ala Ser Gly Ile Leu Leu His Pro Thr Ser

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Asp Gly Ile Gly Asp Leu Gly Pro Glu Ala Tyr Arg

20 25 30

Trp Val Asn Phe Leu Ala Glu Ser Gly Cys Ser Leu Trp Gln Ile Leu

35 40 45

Pro Leu Gly Pro Thr Gly Phe Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Cys Phe Ser

50 55 60

Ala Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Val Ser Pro Ala Leu Leu Leu Asp

65 70 75 80

Glu Gly Leu Leu Thr Ser Glu Asp Leu Ala Asp Arg Pro Glu Phe Pro

85 90 95

Ala Ser Arg Val Asp Tyr Gly Pro Val Ile Gln Trp Lys Leu Thr Leu

100 105 110

Leu Asp Arg Ala Tyr Val Arg Phe Lys Arg Ser Thr Ser Gln Lys Arg

115 120 125

Lys Ala Ala Phe Glu Ala Phe Lys Glu Glu Gln Arg Ala Trp Leu Leu

130 135 140

Asp Phe Ser Leu Phe Met Ala Ile Lys Glu Ala His Gly Gly Ala Ser

145 150 155 160

Trp Asp Tyr Trp Pro Glu Pro Leu Arg Lys Arg Asp Pro Glu Ala Leu

165 170 175

Asn Ala Phe His Arg Ala His Glu Val Asp Val Glu Arg His Ser Phe

180 185 190

Arg Gln Phe Leu Phe Phe Arg Gln Trp Gln Ala Leu Arg Gln Tyr Ala

195 200 205

His Glu Lys Gly Val Gln Ile Ile Gly Asp Val Pro Ile Phe Val Ala

210 215 220

Tyr Asp Ser Ala Asp Val Trp Ser His Pro Asp Leu Phe Tyr Leu Asp

225 230 235 240

Glu Thr Gly Lys Pro Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe

245 250 255

Ser Ala Thr Gly Gln Leu Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Asp Tyr

260 265 270

His Arg Glu Thr Gly Phe Ala Trp Trp Leu Glu Arg Leu Lys Ala Thr

275 280 285

Phe Ala Met Val Asp Ile Val Arg Leu Asp His Phe Arg Gly Phe Ala

290 295 300

Gly Tyr Trp Glu Val Pro Tyr Gly Met Pro Thr Ala Glu Lys Gly Arg

305 310 315 320

Trp Val Pro Gly Pro Gly Ile Ala Leu Phe Glu Ala Ile Arg Asn Ala

325 330 335

Leu Gly Gly Leu Pro Ile Ile Ala Glu Asp Leu Gly Glu Ile Thr Pro

340 345 350

Asp Val Ile Glu Leu Arg Glu Gln Leu Gly Leu Pro Gly Met Lys Ile

355 360 365

Phe Gln Phe Ala Phe Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Phe Leu Pro His

370 375 380

Asn Tyr Val Gln Asn Cys Val Ala Tyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asp

385 390 395 400

Thr Ala Ile Gly Trp Tyr Asn Ser Ala Pro Glu Lys Glu Arg Asp Phe

405 410 415

Val Arg Arg Tyr Leu Ala Arg Ser Gly Glu Asp Ile Ala Trp Asp Met

420 425 430

Ile Arg Ala Val Trp Ser Ser Val Ala Met Phe Ala Ile Ala Pro Leu

435 440 445

Gln Asp Phe Leu Lys Leu Gly Pro Glu Ala Arg Met Asn Tyr Pro Gly

450 455 460

Arg Pro Ala Gly Asn Trp Gly Trp Arg Tyr Glu Ala Phe Met Leu Asp

465 470 475 480

Asp Gly Leu Lys Asn Arg Ile Lys Glu Ile Asn Tyr Leu Tyr Gly Arg

485 490 495

Leu Pro Glu His Met Lys Pro Pro Lys Val Val Lys Lys Trp Thr

500 505 510

<210> 7

<211> 225

<212> PRT

<213> 热解糖高温厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）

<400> 7

Met Lys Pro Met Phe Ala Pro Ser Leu Met Cys Ala Asn Phe Leu Asp

1 5 10 15

Leu Lys Asn Gln Ile Glu Ile Leu Asn Glu Arg Ala Asp Ile Tyr His

20 25 30

Ile Asp Ile Met Asp Gly His Tyr Val Lys Asn Phe Ala Leu Ser Pro

35 40 45

Tyr Leu Met Glu Gln Leu Lys Thr Ile Ala Lys Ile Pro Met Asp Ala

50 55 60

His Leu Met Val Glu Asn Pro Ala Asp Phe Leu Glu Cys Ile Ala Lys

65 70 75 80

Ser Gly Ala Thr Tyr Ile Ser Pro His Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp

85 90 95

Ala Phe Arg Ile Met Arg Thr Ile Lys Ala Leu Gly Cys Lys Thr Gly

100 105 110

Ile Val Leu Asn Pro Ala Thr Pro Val Glu Tyr Ile Lys Tyr Tyr Ile

115 120 125

Gly Met Leu Asp Lys Ile Thr Ile Leu Thr Val Asp Ala Gly Phe Ala

130 135 140

Gly Gln Thr Phe Ile Asn Glu Met Leu Asp Lys Ile Ala Glu Ile Lys

145 150 155 160

Ser Leu Arg Asp Gln Asn Gly Tyr Ser Tyr Leu Ile Glu Val Asp Gly

165 170 175

Ser Cys Asn Glu Lys Thr Phe Lys Gln Leu Ala Glu Ala Gly Thr Asp

180 185 190

Val Phe Val Val Gly Ser Ser Gly Leu Phe Asn Leu Asp Thr Asp Leu

195 200 205

Lys Val Ala Trp Asp Lys Met Met Asp Thr Phe Thr Arg Cys Thr Ser

210 215 220

Asn

225

<210> 8

<211> 220

<212> PRT

<213> 嗜热甲烷八叠球菌（Methanosarcina thermophila）

<400> 8

Met Leu Lys Ala Leu Ile Phe Asp Met Asp Gly Val Leu Val Asp Ser

1 5 10 15

Met Pro Phe His Ala Ala Ala Trp Lys Lys Ala Phe Phe Glu Met Gly

20 25 30

Met Glu Ile Gln Asp Ser Asp Ile Phe Ala Ile Glu Gly Ser Asn Pro

35 40 45

Arg Asn Gly Leu Pro Leu Leu Ile Arg Lys Ala Arg Lys Glu Pro Glu

50 55 60

Ala Phe Asp Phe Glu Ala Ile Thr Ser Ile Tyr Arg Gln Glu Phe Lys

65 70 75 80

Arg Val Phe Glu Pro Lys Ala Phe Glu Gly Met Lys Glu Cys Leu Glu

85 90 95

Val Leu Lys Lys Arg Phe Leu Leu Ser Val Val Ser Gly Ser Asp His

100 105 110

Val Ile Val His Ser Ile Ile Asn Arg Leu Phe Pro Gly Ile Phe Asp

115 120 125

Ile Val Val Thr Gly Asp Asp Ile Ile Asn Ser Lys Pro His Pro Asp

130 135 140

Pro Phe Leu Lys Ala Val Glu Leu Leu Asn Val Arg Arg Glu Glu Cys

145 150 155 160

Val Val Ile Glu Asn Ala Ile Leu Gly Val Glu Ala Ala Lys Asn Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Cys Ile Gly Val Pro Thr Tyr Val Glu Pro Ser His Leu

180 185 190

Asp Lys Ala Asp Leu Val Val Glu Asp His Arg Gln Leu Met Gln His

195 200 205

Leu Leu Ser Leu Glu Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gln

210 215 220

Claims

1.一种用于制备己糖的固定化酶组合物，包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种载体、至少七种或至少八种固定化在至少一种载体或载体混合物上的以下酶：

b)选自以下酶组合中的酶：

(vi)用于制备果糖的PGI和果糖-6-磷酸磷酸酶(F6PP)；

2.根据权利要求1所述的固定化酶组合物，其中每种酶的重量相对于酶的总重量(w/w)％为0.1％至40％。

3.根据权利要求1或2所述的固定化酶组合物，其包括10-30％(αGP)；0-10％(4GT)；10-30％(PGM)；和0.1-10％(PGI)(当存在时)。

4.根据权利要求3中任一项所述的固定化酶组合物，进一步包括用于制备塔格糖的PGI、F6PE和T6PP。

5.根据权利要求4所述的固定化酶组合物，其中每种酶的重量相对于酶的总重量(w/w)％是：10-30％(αGP)；0-10％(4GT)；10-30％(PGM)；0.1-10％(PGI)；15-35％(F6PE)；和25-45％(T6PP)，其中组合物中各种酶的总重量相对于酶的总重量是100w/w％。

6.根据权利要求5所述的固定化酶组合物，其中

αGP包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列或其片段；

4-GT包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列或其片段；

PGM包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其片段；

PGI包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列或其片段；

F6PE包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列或其片段；以及

T6PP包含SEQ ID NO.5的氨基酸序列或其片段。

7.根据权利要求3中任一项所述的固定化酶组合物，进一步包括用于制备阿洛酮糖的PGI、P6PE和P6PP。

8.根据权利要求7所述的固定化酶组合物，其中每种酶的重量相对于酶的总重量(w/w)％是：10-30％(αGP)；0-10％(4GT)；10-30％(PGM)；0.1-10％(PGI)；0.1-10％(P6PE)；和45-65％(P6PP)，其中组合物中各种酶的总重量相对于酶的总重量是100w/w％。

9.根据权利要求8所述的固定化酶组合物，其中：

αGP包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列或其片段；

4-GT包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列；

PGM包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列；

PGI包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列；

P6PE包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列；以及

P6PP包含SEQ ID NO.8的氨基酸序列。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的固定化酶组合物，其中酶的总重量相对载体的重量(w/w)％为2.5％-12.5％。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的固定化酶组合物，其中所述载体是弱碱性阴离子交换树脂。

12.根据权利要求11所述的固定化酶组合物，其中所述载体包括苯酚甲醛缩聚物。

13.根据权利要求11或12所述的固定化酶组合物，其中所述载体包含叔胺官能团，其中所述组合物任选地是DUOLITE^TMA568。

14.根据权利要求11或12所述的固定化酶组合物，其中所述载体包含仲胺官能团，其中所述组合物任选地是DUOLITE^TMPWA7。

15.根据权利要求1-10中任一项所述的固定化酶组合物，其中所述载体包含His标签亲和树脂。

16.根据权利要求15中任一项所述的固定化酶组合物，其中所述载体包含可控孔度玻璃(CPG)颗粒。

17.根据权利要求15或16所述的固定化酶组合物，其中所述载体通过螯合金属而官能化。

18.根据权利要求18所述的固定化酶组合物，其中所述螯合金属是铁或锌，或者其中所述载体任选地是EziG^TMOpal。

19.一种由糖类制备己糖的酶促方法，包括在合适的反应条件下使淀粉衍生物与权利要求1-18中任一项所述的固定化酶组合物接触，将淀粉衍生物转化为己糖。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法步骤在约40℃至约85℃的温度，在约5.0至约8.0的pH下进行，和/或进行约0.5小时至约48小时。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述方法步骤在单个生物反应器、多个串联布置的生物反应器或多个并联布置的生物反应器中进行。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述方法步骤在不含ATP、不含NAD(P)(H)、磷酸盐浓度为约0.1mM至约150mM的条件下进行，磷酸盐在酶级联反应中循环使用，和/或所述方法的至少一个步骤涉及能量高度有利的化学反应。