CN110564717B - 一种热稳定性提高的碱性果胶酶-无机杂化纳米花及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性果胶酶Pel3‑磷酸铜杂化纳米花及其应用，属于酶工程技术领域。其由碱性果胶酶Pel3与Cu₃(PO₄)₂共结晶形成的杂化纳米花，所述杂化纳米花的粒径小于20μm。该纳米花最适反应温度为55℃，最适pH 9，热稳定性有显著提高，重复利用四次后残余相对酶活在50％以上。其良好的热稳定性和可重复利用性在生产健康产品聚半乳糖醛酸寡糖、纺织、饲料上有非常好的商业化生产前景。

Description

一种热稳定性提高的碱性果胶酶-无机杂化纳米花及其应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体而言，涉及一种碱性果胶酶-无机杂化纳米花，尤其涉及一种热稳定性提高的碱性果胶酶-无机杂化纳米花及其应用。

背景技术

果胶是一种广泛分布于植物果实、根、茎、叶中的多糖类高分子化合物，是植物细胞壁的组成成分，伴随着纤维素而存在，构成相邻细胞中间层黏结物，用于黏结植物组织。果胶主要由半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接成长链，分子量在10-400kDa之间，其水解产物聚半乳糖醛酸寡糖对动植物具有良好的生物活性。寡聚半乳糖醛酸能诱导植物防御，对烟草花叶病毒、小麦白粉病、苹果花叶病、玉米大斑病、棉花黄萎等植物疾病有良好的抗性作用，还能活化、促进益生菌双歧杆菌的生长，对维护肠道菌群平衡，抑制有害肠菌，合成各类微量元素，治疗便秘，腹泻等疾病，助消化，降低胆固醇，预防高血压，增强机体抵抗力等具有良好的促进作用。另外，在纺织工业生产中，生物催化可以替代传统化学试剂实现绿色制造及降低生产成本。高活性、热稳定性良好的碱性果胶裂解酶(Pels)用于纺织品加工的煮练和苎麻脱胶工艺能够带来巨大的经济效益。

目前，获得聚半乳糖醛酸寡糖的方法主要有三种：天然原料中提取，化学合成和天然多糖水解。然而，天然植物中聚半乳糖醛酸寡糖含量极低，分离难度大且纯度低，不适宜大量制备；化学合成具有立体选择性不可控、产率低、副反应多等缺点，酶法合成中用到的糖苷合成酶价格昂贵，也不适用于商业化生产。多糖水解分为化学法和酶法，化学法是利用强酸强碱等水解果胶，其降解速度较快，可控性差，极易得到单糖而不易得到寡糖，因此降解产物复杂，均一性差，引入的化学试剂使得寡糖的分离纯化过程复杂化，产率低。酶法水解果胶的反应条件温和且特异性强，无副反应，反应过程可控，产物均一性好，具有良好的商业化生产前景。

果胶酶主要分为三类：果胶酯酶，果胶水解酶和果胶裂解酶。目前，已报道的果胶酶大部分来源于微生物。果胶裂解酶可将果胶解聚生成低聚半乳糖醛酸，分子量在25-45kDa，最适pH在7.5-10.0，最适温度在40-50℃。然而，现有的果胶酶由于酶活性和热稳定性达不到要求而阻碍了其在工业生产上的应用。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明通过对酶进行固定化处理，提供一种热稳定性提高的碱性果胶酶-磷酸铜杂化纳米花。

为了实现本发明的目的，本发明人选择益生菌枯草芽孢杆菌来源的碱性果胶酶PEL168经分子改造后比酶活和热稳定性均有所提高的突变体PelK47E V132F R272W(简称Pel3，其获取方法参见本发明人前期申报的专利CN 106085994 A)作为研究对象，通过有机-无机共沉淀的酶固定化方法，获得一种最适温度55℃、最适pH 9、热稳定性提高、重复利用四次后残余相对酶活在50％以上的碱性果胶酶-磷酸铜杂化纳米花。

具体地，本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种杂化纳米花，由碱性果胶酶Pel3与Cu₃(PO₄)₂共结晶形成的杂化纳米花，所述杂化纳米花的粒径小于20μm。

优选地，如上所述的杂化纳米花，其最适温度为55℃，最适pH为9，重复利用四次后残余相对酶活在50％以上。

本发明还提供了一种上述杂化纳米花的制备方法，该方法包括如下步骤：在磷酸盐缓冲液中加入终浓度为8mM的可溶性金属离子Cu²⁺，同时加入终浓度为0.02mg/mL的碱性果胶酶Pel3，摇匀后孵育，离心得沉淀，水洗，冷冻干燥，得杂化纳米花。

进一步优选地，如上所述杂化纳米花的制备方法，其中孵育的温度为25℃。

进一步优选地，如上所述杂化纳米花的制备方法，其中孵育的时间为72h。

进一步优选地，如上所述杂化纳米花的制备方法，其中磷酸盐缓冲液的浓度为8-12mM。

另外，发明人在试验中发现，本发明的杂化纳米花在55℃中孵育18小时后，还保留50％的相对酶活，而Pel3在55℃中孵育18小时后几乎没有酶活。因此，本发明提供了一种杂化纳米花的新用途，即上述Pel3-Cu₃(PO₄)₂杂化纳米花在提高碱性果胶酶Pel3热稳定性中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和进步性：本发明提供的碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花最适酶活反应温度为55℃，最适pH 9，这与游离碱性果胶酶Pel3的最适温度和最适pH一致。此外，碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花的热稳定性有显著提高，50℃处理18h后仍有将近50％的相对酶活，而Pel3只剩不到10％的残余活性。碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花具有可重复利用性，在重复利用三次后仍有超过50％的相对酶活。

附图说明

图1：SDS-PAGE分析纯化后Pel3蛋白。

图2：不同金属离子与碱性果胶酶孵育后的效果比较。

图3：筛选碱性果胶酶Pel3浓度。A.不同浓度果胶酶的转化率；B.SEM分析对应不同浓度果胶酶形成纳米花的形貌。

图4：碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花表征。A.SEM分析纳米花形貌；B.FT-IR分析纳米花组成特征。

图5：碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花酶学性质分析。A.游离碱性果胶酶Pel3和碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花最适温度比较；B.游离碱性果胶酶Pel3和碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花最适pH比较；C.游离碱性果胶酶Pel3和碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花热稳定性比较；D.碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花重复使用残余酶活。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：碱性果胶酶Pel3的表达、纯化

在含有kana抗性LB固体培养皿上划线活化Pel3表达菌株Rosetta/pET28a-pelK47E V132F R272W(按照发明人前期申报的专利CN 106085994A中方法获得)，挑取阳性单克隆于5mL LB培养基中37℃过夜培养，按1％转接于500mL LB中，37℃培养到菌体OD600至0.5-0.8，加入IPTG(终浓度0.1-0.2mM)诱导，18℃培养20h，4000rmp离心10min收集菌体。

向上述收集到的菌体中加入适量(20mL-30mL)的裂解buffer，震荡混菌后用超声破碎仪超声破碎大肠杆菌细胞，4℃12000rmp离心20min取上清。在4℃条件下，将上清液装入有镍填料的重力柱中，用含有不同浓度(20mM-200mM)咪唑的Tris-HCl buffer洗脱，对不同浓度下洗脱的样品进行SDS-PAGE分析，收集较纯的蛋白样品，用超滤管脱咪唑后溶于50mM，pH 8的Tris-HCl buffer(图1)。

实施例2：不同金属离子的筛选

2mL 10mM磷酸盐缓冲液中分别加入终浓度为8mM的可溶性金属离子Ca²⁺，Co²⁺，Cu^{2 +}，Mu²⁺和Zn²⁺，同时加入终浓度为0.02mg/mL的Pel3，摇匀后25℃或者室温孵育72h，同时以不加金属离子作为对照。4℃12000rmp离心10min分离上清和沉淀，上清根据Bradford法测蛋白浓度，沉淀用去离子水洗涤三次，冷冻干燥备用。实验结果表明(图2)，不同金属离子形成纳米花时的转化率均接近100％，与对照组相比较，使用Co²⁺，Cu²⁺和Zn²⁺形成的纳米花的相对酶活均有所提高。其中Cu²⁺形成的纳米花Pel3-Cu₃(PO₄)₂相对酶活提高了2.4倍。因此，Cu^{2 +}为果胶酶Pel3形成杂化纳米花的最适金属离子。

实施例3：筛选碱性果胶酶Pel3浓度的筛选

2mL 10mM磷酸盐缓冲液中加入终浓度为8mM的可溶性金属离子Cu²⁺，同时分别加入终浓度为0.02mg/mL、0.035mg/mL、0.05mg/mL、0.07mg/mL的Pel3，25℃或室温孵育72h。4℃，12000rpm离心10min分离上清和沉淀，上清根据Bradford方法测蛋白浓度，沉淀用去离子水洗两次，冷冻干燥备用。实验结果表明(图3A)，Pel3浓度达到0.07mg/mL时，形成的纳米花转化率依然有90％以上。同时，对各浓度Pel3形成的纳米花进行SEM分析并观察其形貌特征(图3B)，发现Pel3使用浓度为0.02mg/mL时可形成多瓣花状纳米结构。Pel3使用浓度提高后形成的纳米结构呈球形，没有明显的多瓣花状形成。因此，0.02mg/mL为Pel3使用最佳浓度。

实施例4：碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花表征

扫描电子显微镜分析(SEM)：取适量冷冻干燥的碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花粉末粘贴到导电胶上，通过表面镀金，在测试电压10kV下对其进行SEM测试，观察其表面形貌特征。实验结果表明(图4A)，Pel3-磷酸铜杂化纳米花为多瓣花状纳米结构，其半径为10-20μm。

傅里叶-红外分析(FT-IR)：取适量碱性果胶酶Pel3干燥粉末、碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花干燥粉末及磷酸铜纳米颗粒粉末，采用溴化钾压片法对样品进行处理后装入检测池中扫面。扫描范围为4000cm^-1-400cm^-1，以波数cm^-1为横坐标，透光率T为纵坐标作图。实验结果表明(图4B)，Pel3-磷酸铜杂化纳米花有P-O振动特征吸收峰1014cm^-1,950cm^-1和634cm^-1，与对照组磷酸铜纳米颗粒图谱对应；Pel3-磷酸铜杂化纳米花还有酰胺键-CONH振动特征吸收峰1340-1430cm^-1、1536cm^-1和3350cm^-1，与对照组游离Pel3图谱对应。

实施例5：游离碱性果胶酶Pel3和Pel3-磷酸铜杂化纳米花酶活测定

取等质量浓度的游离碱性果胶酶Pel3和碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花，分别加入到2mL含0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中启动酶促反应，55℃反应15min后，用3mL 0.03M的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光值。改变反应温度，在20-70℃之间测酶活，实验结果表明(图5A)，游离碱性果胶酶Pel3和碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花最适反应温度均为55℃。改变甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH值，在8.6-9.4之间测酶活，实验结果表明(图5B)，游离碱性果胶酶Pel3和碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花最适反应pH均为9.0。

实施例6：游离碱性果胶酶Pel3和Pel3-磷酸铜杂化纳米花热稳定性测定

取等质量浓度的游离碱性果胶酶Pel3和碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花，在50℃干浴锅中分别孵育0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、18h、24h。50℃处理后的酶以上述实施例5的方法分别测定其酶活。以0h为100％，计算其他样品的残余酶活。实验结果显示(图5C)，碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花50℃处理18h后仍有将近50％的相对酶活，而游离碱性果胶酶Pel3只剩不到10％的残余活性，表明碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花的热稳定性有显著提高。

实施例7：碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花重复利用

对实施例5催化后的纳米花进行回收利用，用去离子水洗涤3次，以除去残留在纳米花表面底物和产物，干燥后，按实施例5的方法测定酶活，如此反复3次，以第一次催化酶活为100％，测定重复利用的纳米花残余酶活。实验结果显示(图5D)，碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花在重复利用三次后仍有超过50％的相对酶活，表明碱性果胶酶Pel3-磷酸铜杂化纳米花具有较好的可重复利用性。

Claims (5)

1.一种杂化纳米花的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：在磷酸盐缓冲液中加入终浓度为8 mM的可溶性金属离子Cu²⁺，同时加入终浓度为0.02 mg/mL的碱性果胶酶PelK47E V132F R272W，摇匀后孵育，离心得沉淀，水洗，冷冻干燥，得杂化纳米花。

2.根据权利要求1所述杂化纳米花的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为室温。

3. 根据权利要求1所述杂化纳米花的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为25℃。

4. 根据权利要求1所述杂化纳米花的制备方法，其特征在于，所述孵育的时间为72 h。

5. 根据权利要求1所述杂化纳米花的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为8-12 mM。

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