CN114686467B - 基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶。该方法将基底蛋白的核苷酸序列和目标蛋白的核苷酸序列与断裂型内含肽两端的核苷酸序列分别连接，连接后分别进行融合表达；将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花，使基底蛋白被固定化；将固定化后的基底蛋白与融合表达后的目标蛋白混合，通过断裂型内含肽的反式自剪接功能直接进行特异性自组装，使目标蛋白被间接固定化。该方法将断裂型内含肽和酶杂化纳米花相结合，可将目标蛋白的纯酶或者粗酶液直接与固定化的基底蛋白结合，避免对蛋白构象的影响，高效便捷。该方法制备玉米赤霉烯酮降解的固定化酶，具有良好稳定性、催化效率和重复利用率。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶。
背景技术
酶是一类重要的生物催化剂，具有催化效率高、底物特异性强以及反应条件温和等特点，被广泛应用于医药、化工、食品和环境等领域，但是许多天然酶的大规模制备比较困难，并且较难回收再使用，而且稳定性和对环境的敏感性都极大地制约了生物酶的大规模应用。为了提高酶的催化活性和稳定性，各种酶固定化技术不断涌现。酶固定后，与固定基质间相互作用可能会改变酶催化活性中心以外的空间结构，因此酶的固定化技术不仅可以改善酶的高效专一的催化活性，而且可以实现酶蛋白的重复回收，提高生物酶的利用率，降低酶使用成本，符合可持续发展战略的要求，酶固定化是酶工程发展的必然趋势。
近年来，酶杂化纳米花作为一种新型的酶固定化技术得到了广泛的研究和报道，它是利用生物矿化的原理通过自组装法实现酶的一步固定化。跟其他的酶固定化技术相比，酶杂化纳米制备简单具有高比表面积，能显著提升酶的稳定性、催化效率以及重复利用性，因此有望被广泛地应用于生物传感、制药、污染物处理等领域。
然而，单纯的采用酶杂化纳米花对目标蛋白进行直接固定化，则必须对目标蛋白进行纯化，而且由于固定化时间较长，可能会造成目标蛋白酶活降低。
内含肽(intein)是位于宿主蛋白质中的一段插入序列，内含肽不是一个独立的基因，必须插入于外显肽基因才能复制转录，可从前体蛋白中切除并将两侧外显肽连接起来成为成熟的具有活性的蛋白质。从内含肽的内部有无自导引归巢核酸内切酶结构域，可将内含肽分为2种类型：一种是全功能型内含肽，具有蛋白剪接活性和自导引核酸内切酶序列；另一种是微型内含肽，只有蛋白剪接活性。另外根据其存在形式，可以分为整体型内含肽和断裂型内含肽。整体型内含肽剪接区域都共同存在于同一多肽片段上，进行顺式剪接，断裂型内含肽的剪接区域分裂成两份或者更多片段，存在于不同的多肽片段上，进行反式剪接。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，包括以下步骤：将基底蛋白的核苷酸序列和所述目标蛋白的核苷酸序列与一种断裂型内含肽的两段核苷酸序列分别连接，连接后分别进行融合表达，得到融合表达后的基底蛋白和目标蛋白；将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花，使所述基底蛋白被固定化；将固定化后的所述基底蛋白与融合表达后的所述目标蛋白的纯酶或者粗酶液混合，通过所述断裂型内含肽的自剪接功能直接进行特异性自组装，使所述目标蛋白被间接固定化。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所用断裂型内含肽包括N端片段和C端片段；所述基底蛋白的核苷酸序列与所述N端片段的核苷酸序列连接，所述目标蛋白的核苷酸序列与所述C端片段的核苷酸序列连接。或者，所述基底蛋白的核苷酸序列与所述C端片段的核苷酸序列连接，所述目标蛋白的核苷酸序列与所述N端片段的核苷酸序列连接。
进一步，所述断裂型内含肽的所述N端片段和所述C端片段分别带有0-6个外显肽氨基酸。
进一步，所述断裂型内含肽的所述N端片段和所述C端片段分别带有5个外显肽氨基酸。
进一步，所述断裂型内含肽为gp41-1、gp41-8、NrdJ-1、IMPDH-1其中一种。
进一步，所述将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花的具体步骤为：将进行融合表达后的所述基底蛋白加入到磷酸缓冲液中，并向所述磷酸缓冲液中加入无机金属盐溶液，在4℃-25℃放置36-60h，离心收集沉淀，并将所述沉淀用所述磷酸缓冲液清洗2-3次，得到所述基底蛋白的酶/磷酸盐杂化纳米花。
进一步，所述无机金属盐溶液中的金属离子包括Ca2+，Cu2+，Zn2+，Mn2+中的一种。
进一步，进行融合表达后的所述基底蛋白的终浓度为0.01-0.1mg/ml；所述无机金属盐溶液的无机金属离子终浓度为5-10mM。
本发明还提供如上述的纳米固定化方法在固定玉米赤霉烯酮降解酶中的应用，所述玉米赤霉烯酮降解酶为目标蛋白。
本发明还提供一种固定化酶，采用如上述的纳米固定化方法制备；所述固定化酶为玉米赤霉烯酮降解酶的固定化酶。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，将断裂型内含肽和酶杂化纳米花相结合，可将目标蛋白的粗酶液直接与固定化的基底蛋白结合，无须纯化蛋白即可实现酶蛋白的立体固定，而且酶蛋白是翻译后组装，能最大化避免对蛋白构象的影响。
2)本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，与传统固定化方法相比，该方法将目标蛋白间接固定，避免直接固定化过程中酶活损失。
3)本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，具有高效便捷的优点。
4)本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，可以发展为一步实现多个酶蛋白的立体固定。
附图说明
图1为本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法中，实施例1中制备得到的MBP-Zhd518固定化蛋白电泳图；
图2为本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法中，实施例2中，高效液相色谱仪测定的底物降解量的色谱图；
图3为本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法中，实施例3中，Zhd518固定化蛋白酶在不同pH中的活性测定结果折线图；
图4为本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法中，实施例4中，Zhd518固定化酶在啤酒中的活性测定结果柱形图；
图5为本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法中，实施例5中，不同循环数的Zhd518固定化酶的活性测定结果柱形图；
图6为本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法流程图；
图7为本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法中，实施例6中制备得到的MBP-GFP固定化蛋白电泳图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，包括以下步骤：将基底蛋白的核苷酸序列和目标蛋白的核苷酸序列与一种断裂型内含肽的两端核苷酸序列分别连接，连接后分别进行融合表达，并得到融合表达后的基底蛋白和目标蛋白的重组酶液；将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花，使基底蛋白被固定化；将固定化后的基底蛋白与融合表达后的目标蛋白混合，通过断裂型内含肽的自剪接功能直接进行特异性自组装，使目标蛋白被间接固定化。
本发明将断裂型内含肽与纳米花结合，基于断裂型内含肽高效的反式自剪接功能实现目标蛋白的间接固定化，将基底蛋白制备成酶杂化纳米花可以避免目标蛋白直接固定化过程中的酶活损失，基于断裂型内含肽的特异性自剪接特性，目标蛋白无需纯化即可实现固定化。该方法操作简单，无毒无害，具有经济实用的优势，而且可以发展为一步实现多个酶蛋白的立体固定。
如图6所示，目标蛋白的间接固定化的具体过程为，融合表达后的基底蛋白-内含肽(Vector protein-InteinN)制备成酶杂化纳米花而被固定；融合表达后的目标蛋白-内含肽(Target protein-InteinC)与固定后的基底蛋白-内含肽混合，通过内含肽的自剪接，使基底蛋白和目标蛋白连接，从而使目标蛋白也被固定。
本发明的固定化方法中采用的断裂型内含肽，包括N端片段和C端片段，基底蛋白的核苷酸序列和目标蛋白的核苷酸序列分别与N端片段和C端片段连接。
本发明采用的断裂型内含肽的具体结构为，断裂型内含肽的N端片段和C端片分别带有0-6个外显肽氨基酸。
优选的，断裂型内含肽的N端片段和C端片分别带有5个外显肽氨基酸。
优选的，断裂型内含肽包括但不限于gp41-1、gp41-8、NrdJ-1、IMPDH-1其中一种。
本发明的固定化方法中，将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花的具体步骤为：
将进行融合表达后的所述基底蛋白加入到磷酸缓冲液中，并向所述磷酸缓冲液中加入无机金属盐溶液，在4℃-25℃放置36-60h，离心收集沉淀，并将所述沉淀用所述磷酸缓冲液清洗2-3次，得到所述基底蛋白的酶/磷酸盐杂化纳米花。
优选的，反应条件为，在20℃放置48h。
本发明采用的无机金属盐溶液中的金属离子包括Ca2+，Cu2+，Zn2+，Mn2+中的一种。
优选地，无机金属盐溶液中的金属离子Ca2+。
本发明的固定化方法中，融合表达的基底蛋白的终浓度为0.01-0.1mg/ml。
优选地，融合表达的基底蛋白的终浓度为0.02mg/ml。
本发明的固定化方法中，无机金属盐溶液的无机金属离子终浓度为5-10mM。
优选地，无机金属盐溶液的无机金属离子终浓度为8mM。
本发明的固定化方法中，融合表达后的目标蛋白的重组酶液可以为纯酶或者粗酶液。
本发明的固定化方法可以固定各种需要固定的蛋白。
本发明提供了一种上述固定化方法的应用。采用上述方法制备玉米赤霉烯酮降解的固定化酶。该固定化酶具有良好的稳定性、催化效率和重复利用率。
本发明的固定化方法中，融合表达采用常规的基因工程方法，以下通过具体的实施例进行说明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1玉米赤霉烯酮降解酶(Zhd518)固定化酶的制备
本实施例采用的断裂型内含肽为gp41-1，N端片段为gp41-1N，C端片段为gp41-1C。
(1)断裂型内含肽gp41-1的N端和C端分别与基底蛋白(MBP)和目标蛋白Zhd518进行融合表达。
本实施例的融合表达载体分别为pET28a-MBP-gp41-1N和pET28a-gp41-1C-Zhd518，融合表达载体的具体构建方法为，分别将MBP和Zhd518序列与gp41-1N和gp41-1C进行连接，再将连接后的片段分别插入载体质粒pET28a。
其中，gp41-1N的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，gp41-1C的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。在本实施例中，上述两个序列均为委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
SEQ ID NO:1的序列如下：
acacgtagcggctactgcctggatctgaaaacccaggttcagaccccgcagggcatgaaagaaatcagcaacatccaggttggtgatctggttctgagcaacaccggctacaacgaagttctgaacgttttcccgaaaagcaaaaagaaaagctacaaaatcaccctggaagatggcaaagaaatcatctgcagcgaagaacacctgttcccgacccagaccggcgaaatgaacatcagcggcggcctgaaagaaggcatgtgcctgtacgttaaagaa。
SEQ ID NO:2的序列如下：
atgatgctaaagaaaatattaaaaattgaagagctggatgaacgtgaactgattgatatcgaggttagcggtaatcatctgttctacgcgaacgacatcttgacccacaacagctcttccgacgtg
将MBP插入gp41-1N时，先分别扩增gp41-1N的序列和MBP的序列。
扩增gp41-1N的序列使用的正向引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。上述引物根据SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计。序列如下：
正向引物P1：5′-gcagactggtagcggcagtacacgtagcggctactgcc-3′(SEQ ID NO:3)；
反向引物P2：5′-ttagtgatgatggtgatgatgttctttaacgtacaggcaca-3′(SEQ ID NO:4)。
MBP的序列如SEQ ID NO:5所示；扩增MBP的序列使用的正向引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，反向引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。各序列如下：
SEQ ID NO:5：
atgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggtctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcatccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacattatcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctgaaatcaccccggacaaagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttacaacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcgctgatttataacaaagatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggataaagaactgaaagcgaaaggtaagagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttcacctggccgctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggcaagtacgacattaaagacgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttcctggttgacctgattaaaaacaaacacatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaagctgcctttaataaaggcgaaacagcgatgaccatcaacggcccgtgggcatggtccaacatcgacaccagcaaagtgaattatggtgtaacggtactgccgaccttcaagggtcaaccatccaaaccgttcgttggcgtgctgagcgcaggtattaacgccgccagtccgaacaaagagctggcaaaagagttcctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaataaagacaaaccgctgggtgccgtagcgctgaagtcttacgaggaagagttggcgaaagatccacgtattgccgccaccatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagacttga
正向引物P3：5′-aggagatataccatgaaaatcgaagaaggta-3′(SEQ ID NO:6)；
反向引物P4：5′-tacgtgtactgccgctaccagtctgcgcgtctttcagg-3′(SEQ ID NO:7)。
分别将扩增得到的gp41-1N以及MBP片段进行纯化，然后将两个产物按照适当的比例混合，作为模板，再次进行PCR。此次PCR所用引物分别为上述的P3和P2。将此次PCR的产物MBP-gp41-1N进行纯化回收。
以载体pET28a作为模板，设计引物扩增载体片段，正向引物P5的核苷酸序列如SEQID NO:8所示，反向引物P6的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示：
正向引物P5：5′-attttcatggtatatctccttcttaaag-3′(SEQ ID NO:8)；
反向引物P6：5′-catcatcaccatcatcactaatgagatccggctgctaacaa-3′(SEQ ID NO:9)。
将扩增得到的载体片段进行纯化回收，然后与上述得到的片段MBP-gp41-1N进行同源重组(II One Step Cloning Kit，Vazyme)，将重组反应后产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述P3和P4引物进行菌落PCR，挑选PCR阳性转化子进行测序验证，结果表明，在pET28a上正确插入了MBP-gp41-1N片段，将该重组质粒命名为pET28a-MBP-gp41-1N。
对Zhd518进行上述相同的步骤。
扩增Zhd518的序列，其序列如SEQ ID NO:10所示，该序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
SEQ ID NO:10：
atggctgctactagaaccagaggttacgttactaccaaggacggtatcaagtggtactacgaacaagaaggttccggtccagacgttgttttgattccagatggtttgggtgagtgccagatgttcgataagccaatgtccttgatcgcctccaacggtttcagagttactaccttcgatatgccaggtatgtccagatcttctgacgctccaccagaaacttaccaggacatcactggtagaaagctggccggttacatcatcactttgttggacaccctggacatcaagatcgcttccgtttggggttgttcttctggtgcttctactgttttggccctgtgttctgactacccagagcgtgttagaaacggtatgccacacgaagttccaactgagaacccagacatcttgttgcacattcacgaagttgacccagccactatctctcaagaaatggctgcaaactccagagcctactctggtaacgttgaagcttgggatgctttgggtcctgaagttcatgctagactgcacgacaactacccaagatgggcttacggttacccaagaactattccaccatccgctccagttaagactgaggacttgcacaaggttccaatcgactggactgttggagcttccactccaactaagctgttcttcgagaacatcgttatcgctgccagagagggtatcaacatcggtactttgccaggtaaccactttccatacgtttctcacccagaagagttcgccaagtacgttgttgagacttccagaaagtacctgaagtga
设计引物如下：
正向引物P7：5′-cagctcttccgacgtgggcagtatggctgctactagaacc-3′(SEQ ID NO:11)
反向引物P8：5′-ggtggtggtggtggtgctcgagcttcaggtactttctgga-3′(SEQ ID NO:12)
以委托生工合成的含gp41-1C的pET28a质粒为模板反扩pET28a-gp41-1C片段，设计引物如下：
正向引物P9：5′-actgcccacgtcggaagagctg-3′(SEQ ID NO:13)；
反向引物P10：5′-ctcgagcaccaccaccaccaccactgag-3′(SEQ ID NO:14)
将扩增得到的Zhd518片段以及pET28a-gp41-1C载体片段进行同源重组(II One Step Cloning Kit，Vazyme)，将重组反应后产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述正向引物P7和反向引物P8进行菌落PCR，挑选PCR阳性转化子进行测序验证，结果表明，在pET28a上正确插入了gp41-1C-Zhd518片段，将该重组质粒命名为pET28a-gp41-1C-Zhd518。
(2)阳性重组菌BL21/pET28a-MBP-gp41-1N以及BL21/pET28a-gp41-1C-Zhd518的构建
将质粒pET28a-MBP-gp41-1N以及pET28a-gp41-1C-Zhd518分别转化大肠杆菌BL21(DE3)(Cat.N0 CD601,全式金公司)后，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，分别得到含有质粒
pET28a-MBP-gp41-1N和pET28a-gp41-1C-Zhd518的工程菌，记作
BL21/pET28a-MBP-gp41-1N和BL21/pET28a-gp41-1C-Zhd518。
(3)基底蛋白和目标蛋白的表达和纯化
His60 Ni Superflow resin纯化柱购自TaKaRa公司，产品目录号为635660。GEHiTrap Desalting纯化柱购自GE Healthcare公司，产品目录号分别为17-1408-01。
将上述步骤(2)制备的阳性重组菌BL21/pET28a-MBP-gp41-1N和BL21/pET28a-gp41-1C-Zhd518分别培养于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD600＝0.7时，加入IPTG至其在LB培养基中的终浓度0.5mM，转至18℃继续培养16h。在3800rpm、10min条件下离心收集菌体，用10ml溶液A(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)悬浮，于冰浴中超声破碎(35Hz，10min；超声2s，停止4s)，之后12000rpm离心10min，取上清液；将上清液先过0.22μm滤膜，再过His60 Ni Superflow resin纯化柱，用5mL溶液A冲洗，再用10mL溶液B(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，25mM咪唑)漂洗，最后用5mL溶液C(50mM Tris-HCl，0.5MNaCl，250mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用脱盐柱GE HiTrap Desalting进行脱盐处理，用溶液A进行洗脱，分别得到MBP-gp41-1N以及gp41-1C-Zhd518纯酶液。
(4)MBP-gp41-1N/Ca3(PO4)2杂化纳米花的制备
将8mM CaCl2溶液添加至2ml含有0.02mg/ml的MBP-gp41-1N蛋白的PBS缓冲液中，在20℃下孵育48h，然后12,000rpm离心，收集磷酸盐沉淀，用PBS缓冲液将沉淀清洗3次，然后用PBS缓冲液将沉淀重悬备用。
(5)MBP-gp41-1N/Ca3(PO4)2杂化纳米花与gp41-1C-Zhd518翻译后自组装
在splicing buffer中加入适量的MBP-gp41-1N/Ca3(PO4)2杂化纳米花以及gp41-1C-Zhd518蛋白以及2mM DTT，置于40℃反应30min。其中splicing buffer包含以下成分：50mM Tris/HCl(pH 7.0),300mM NaCl,1mM EDTA。将反应后的产物取出10μl进行SDS-PAGE分析，可以看出MBP-gp41-1N/Ca3(PO4)2杂化纳米花与gp41-1C-Zhd518能够很好的反应，得到MBP-Zhd518固定化蛋白，其电泳图如图1所示。
实施例2以玉米赤霉烯酮为底物验证MBP-Zhd518固定化蛋白的功能
MBP-Zhd518固定化蛋白的制备：在splicing buffer中加入适量的MBP-gp41-1N/Ca3(PO4)2杂化纳米花以及gp41-1C-Zhd518蛋白以及2mM DTT，置于40℃反应30min。
溶液A组成：由50mM，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液和玉米赤霉烯酮溶液组成；底物玉米赤霉烯酮在反应体系0.2mL中的终浓度为50.0μg/ml。
实验组：活性测定反应体系为0.2mL，含0.15mL溶液A和0.05mL MBP-Zhd518固定化蛋白液；反应体系的pH值为8.0；反应体系在特定温度范围40℃温育10min后，0.7mL色谱级甲醇终止反应，冷却后使用高效液相色谱仪(HPLC)测定底物降解量。
结果如图2所示，在上述反应条件下，MBP-Zhd518固定化酶能够将加入的20μg玉米赤霉烯酮完全降解。
实施例3Zhd518固定化蛋白酶与Zhd518游离酶在不同pH下催化效率的比较
在200μl的反应体系中，加入20μg ZEN标准品以及含10μg实施例2中所述Zhd518固定化蛋白酶或Zhd518游离酶，反应缓冲液为不同pH的50mM Tris-HCl(pH分别为3、5、6、7、8、9、11、12)，40℃分别反应10min后加入700μl甲醇终止反应，然后将样品离心过滤进行HPLC检测。
图3为Zhd518固定化酶在不同pH中的稳定性。通过图3可以看出，Zhd518固定化酶在不同pH的稳定性中较好，其表现为在pH值为3的酸性条件下仍能保持约80％的相对活性，而Zhd518游离酶在pH值为3的酸性条件下仅残留10％的相对活性，而在pH值为11的碱性条件下能保持90％以上的相对活性，Zhd518游离酶在pH值为11的碱性条件下仅残留20％的相对活性。Zhd518固定化酶以及Zhd518游离酶均在pH值为8时相对活性最高，Zhd518游离酶的活性随着酸度的递减或者碱度的递增相对酶活呈现下降趋势，而Zhd518固定化酶则保持相对稳定的相对酶活。
实施例4Zhd518固定化酶与Zhd518游离酶在啤酒中催化效率的比较
将含50μg Zhd518蛋白的Zhd518固定化酶及等量游离酶分别加入到含有20μg ZEN的200μl的啤酒中置于摇床中反应10min，然后加入700μl甲醇终止反应，然后过滤进行液相检测。
如图4所示，ZHD游离酶在啤酒中几乎完全丧失活性，其ZEN残留量同仅加入等量ZEN标品不加入任何酶的反应体系几乎一致，而Zhd518固定化酶则能够降解大部分的ZEN。这样的结果说明Zhd518固定化酶相对于游离酶在啤酒中的催化活性显著提高，是其具备直接在啤酒中降解ZEN的应用潜力。
实施例5 Zhd518固定化酶重复利用
在200μl的反应体系中，加入含10μg Zhd518蛋白的Zhd518固定化酶，然后加入20μg ZEN标准品，反应缓冲液为50mM Tris-HCl(pH8.0)，在40℃反应10min后加入甲醇终止反应，然后将样品离心过滤进行HPLC检测。然后将沉淀用50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液清洗后用200μl该缓冲液重悬，继续加入20μg ZEN标准品，在40℃反应10min后离心，重复上述步骤。将每一步反应后的产物进行HPLC分析。
分析结果如图5所示。根据图5可以看出，在前面的4次反应中，ZEN标品均能被完全降解掉，当反应进行第5个循环时，ZEN标品出现了少量残留，此时的降解率仍能达到95％以上，而当反应进行第6个循环时，ZEN降解率也能达到80％左右。
虽然随着反应循环数的增加，ZEN的降解率开始慢慢下降，但是仍能看出用该方法获得的杂化纳米花具备良好的重复使用性能。而且值得注意的一点是，在进行重复使用时，会对Zhd518固定化酶进行清洗，沉淀随着重复使用次数的增多有所损失，因此在同样的反应条件下也会造成降解效率的降低。而本次实验使用的杂化Zhd518固定化酶较少，因此由于离心转移以及清洗带来的相对损失更为严重。
该结果说明通过该方法固定的Zhd518蛋白具有良好的稳定性以及重复利用性，具备实际应用价值。
实施例6固定化绿色荧光蛋白GFP的制备
本实施例采用与实施例1相同的方法制备固定化绿色荧光蛋白GFP，采用的断裂型内含肽也为gp41-1，N端片段为gp41-1N，C端片段为gp41-1C，具体的步骤也与实施例1相同，主要包括以下步骤：
(1)断裂型内含肽gp41-1的N端和C端分别与承载蛋白(MBP)和目标蛋白GFP进行融合表达。
先制备pET28a-MBP-gp41-1N，再制备pET28a-gp41-1C-GFP，其中，pET28a-MBP-gp41-1N的制备方法及使用的引物序列与实施例1相同。
GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，该序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
SEQ ID NO:15：
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgcgcggcgagggcgagggcgatgccaccaacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcagcttcaaggacgacggcacctacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaacttcaacagccacaacgtctatatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccgaatttgaaattcgtcataatgtggaagatggcagcgtgcagctggcggatcattatcagcagaataccccgattggcgatggcccagtgctgctgccggatgaccactatctgagcaccgaaagcgtgctgagcaaagatccgaatgaagatcgtgatcatatggtcctgctggaatttgtgaccgcggcaggcattgatctgggcatggatgaactgtataaatga
设计引物如下：
正向引物P11：5′-cttccgacgtgggcagtatggtgagcaagggcgag-3′(SEQ ID NO:16)
反向引物P12：5′-gtggtggtggtgctcgagtttatacagttcatccatg-3′(SEQ ID NO:17)
以委托生工合成的含gp41-1C的pET28a质粒为模板反扩pET28a-gp41-1C片段，设计引物如下：
正向引物P13：5′-actgcccacgtcggaagagctg-3′(SEQ ID NO:18)；
反向引物P14：5′-ctcgagcaccaccaccaccaccactgag-3′(SEQ ID NO:19)
将扩增得到的GFP片段以及pET28a-gp41-1C载体片段进行同源重组(II One Step Cloning Kit，Vazyme)，将重组反应后产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述正向引物P11和反向引物P12进行菌落PCR，挑选PCR阳性转化子进行测序验证，结果表明，在pET28a上正确插入了gp41-1C-GFP片段，将该重组质粒命名为pET28a-gp41-1C-GFP。
(2)构建阳性重组菌BL21/pET28a-MBP-gp41-1N以及
BL21/pET28a-gp41-1C-GFP。
(3)基底蛋白和目标蛋白的表达和纯化，分别得到MBP-gp41-1N以及gp41-1C-GFP纯酶液。
(4)制备MBP-gp41-1N/Ca3(PO4)2杂化纳米花。
(5)MBP-gp41-1N/Ca3(PO4)2杂化纳米花与gp41-1C-GFP翻译后自组装
将反应后的产物取出10μl进行SDS-PAGE分析，其电泳图如图7所示。可以看出MBP-gp41-1N/Ca3(PO4)2杂化纳米花与gp41-1C-GFP能够很好的反应，得到MBP-GFP固定化蛋白。
本实施例的试验结果说明本发明的固定化方法对GFP也能进行固定化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶
<141> 2022-04-06
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 279
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
acacgtagcg gctactgcct ggatctgaaa acccaggttc agaccccgca gggcatgaaa 60
gaaatcagca acatccaggt tggtgatctg gttctgagca acaccggcta caacgaagtt 120
ctgaacgttt tcccgaaaag caaaaagaaa agctacaaaa tcaccctgga agatggcaaa 180
gaaatcatct gcagcgaaga acacctgttc ccgacccaga ccggcgaaat gaacatcagc 240
ggcggcctga aagaaggcat gtgcctgtac gttaaagaa 279
<210> 2
<211> 126
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgatgctaa agaaaatatt aaaaattgaa gagctggatg aacgtgaact gattgatatc 60
gaggttagcg gtaatcatct gttctacgcg aacgacatct tgacccacaa cagctcttcc 120
gacgtg 126
<210> 3
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gcagactggt agcggcagta cacgtagcgg ctactgcc 38
<210> 4
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttagtgatga tggtgatgat gttctttaac gtacaggcac a 41
<210> 5
<211> 1104
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac ttga 1104
<210> 6
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aggagatata ccatgaaaat cgaagaaggt a 31
<210> 7
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tacgtgtact gccgctacca gtctgcgcgt ctttcagg 38
<210> 8
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
attttcatgg tatatctcct tcttaaag 28
<210> 9
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
catcatcacc atcatcacta atgagatccg gctgctaaca a 41
<210> 10
<211> 801
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atggctgcta ctagaaccag aggttacgtt actaccaagg acggtatcaa gtggtactac 60
gaacaagaag gttccggtcc agacgttgtt ttgattccag atggtttggg tgagtgccag 120
atgttcgata agccaatgtc cttgatcgcc tccaacggtt tcagagttac taccttcgat 180
atgccaggta tgtccagatc ttctgacgct ccaccagaaa cttaccagga catcactggt 240
agaaagctgg ccggttacat catcactttg ttggacaccc tggacatcaa gatcgcttcc 300
gtttggggtt gttcttctgg tgcttctact gttttggccc tgtgttctga ctacccagag 360
cgtgttagaa acggtatgcc acacgaagtt ccaactgaga acccagacat cttgttgcac 420
attcacgaag ttgacccagc cactatctct caagaaatgg ctgcaaactc cagagcctac 480
tctggtaacg ttgaagcttg ggatgctttg ggtcctgaag ttcatgctag actgcacgac 540
aactacccaa gatgggctta cggttaccca agaactattc caccatccgc tccagttaag 600
actgaggact tgcacaaggt tccaatcgac tggactgttg gagcttccac tccaactaag 660
ctgttcttcg agaacatcgt tatcgctgcc agagagggta tcaacatcgg tactttgcca 720
ggtaaccact ttccatacgt ttctcaccca gaagagttcg ccaagtacgt tgttgagact 780
tccagaaagt acctgaagtg a 801
<210> 11
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cagctcttcc gacgtgggca gtatggctgc tactagaacc 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ggtggtggtg gtggtgctcg agcttcaggt actttctgga 40
<210> 13
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
actgcccacg tcggaagagc tg 22
<210> 14
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ctcgagcacc accaccacca ccactgag 28
<210> 15
<211> 720
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
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atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg cgcggcgagg gcgagggcga tgccaccaac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
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ttcaaggacg acggcaccta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
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cttccgacgt gggcagtatg gtgagcaagg gcgag 35
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<211> 37
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<211> 22
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<400> 18
actgcccacg tcggaagagc tg 22
<210> 19
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ctcgagcacc accaccacca ccactgag 28
Claims (7)
1.一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将基底蛋白的核苷酸序列和目标蛋白的核苷酸序列与一种断裂型内含肽的两端核苷酸序列分别连接，连接后分别进行融合表达，得到融合表达后的基底蛋白和目标蛋白；所述断裂型内含肽为gp41-1；
将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花，使所述基底蛋白被固定化；具体步骤为：
将融合表达后的所述基底蛋白加入到磷酸缓冲液中，并向所述磷酸缓冲液中加入无机金属盐溶液，在4℃-25℃放置36-60 h，离心收集沉淀，并将所述沉淀用所述磷酸缓冲液清洗2-3次，得到所述基底蛋白的酶/磷酸盐杂化纳米花；
所述无机金属盐溶液中的金属离子为Ca2+；
将固定化后的所述基底蛋白与融合表达后的所述目标蛋白的纯酶或粗酶液混合，通过所述断裂型内含肽的反式自剪接功能直接进行特异性自组装，使所述目标蛋白被间接固定化；
所述基底蛋白为MBP，所述目标蛋白为玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518。
2.根据权利要求1所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所用断裂型内含肽包括N端片段和C端片段；
所述基底蛋白的核苷酸序列与所述N端片段的核苷酸序列连接，所述目标蛋白的核苷酸序列与所述C端片段的核苷酸序列连接，或者，所述基底蛋白的核苷酸序列与所述C端片段的核苷酸序列连接，所述目标蛋白的核苷酸序列与所述N端片段的核苷酸序列连接。
3.根据权利要求2所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所述断裂型内含肽的所述N端片段和所述C端片段分别带有0-6个外显肽氨基酸。
4.根据权利要求3所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所述断裂型内含肽的所述N端片段和所述C端片段分别带有5个外显肽氨基酸。
5.根据权利要求1所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，反应体系中融合表达后的所述基底蛋白的终浓度为0.01-0.1 mg/ml；反应体系中所述无机金属盐溶液的无机金属离子终浓度为5-10 mM。
6.权利要求1~5任意一项所述的纳米固定化方法在固定玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518中的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518为目标蛋白。
7.一种固定化酶，其特征在于，采用如权利要求1~5任意一项所述的纳米固定化方法制备得到。
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| 付雅琪.基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶.《中国博士学位论文全文数据库_工程科技Ⅰ辑》.2022,(第2期),第B016-156页. * |
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