CN112391427B - 一种利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，属于生物医药工程技术领域。本发明的技术方案要点为：大肠杆菌（Escherochia coli）高效表达的NsGfo氧化还原酶可在纯酶反应体系、粗酶液反应体系或静息细胞催化反应体系中催化核苷合成阿糖核苷，该NsGfo氧化还原酶可直接将核苷的核糖催化为阿拉伯糖，从而将核苷转化为阿糖核苷。本发明工艺简单、成本低廉且底物转化率较高，将对阿糖系列核苷药物的生物合成起到重大的推动作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法。
背景技术
阿糖胞苷是治疗急性白血病，各种癌症如淋巴瘤的基本药物。作为癌症治疗的一线药物，其市场需求量巨大(吴德沛,傅琤琤,唐晓文等.含有大剂量阿糖胞苷的联合化疗治疗难治和复发急性白血病.中华血液学杂志,2004,25(11):696-697)。长期以来，阿糖胞苷的生产由美国辉瑞公司垄断，占据世界市场份额的98％以上。2019年1月，美国辉瑞公司的产品“赛德萨”退出中国，于是在全国范围内阿糖胞苷出现供货不足的严重现象(国家卫健委.关于做好阿糖胞苷注射剂供应保障工作的通知.2019.1)。
国内外阿糖胞苷主要是通过化学合成法制备，其工艺复杂，生产成本高，且对环境造成污染(渠桂荣,郭海明,杨西宁等.化学合成法生产阿糖胞苷的工艺.CN201010263980.6,2011)。生物合成法条件温和，生产成本低，污染小，理论上能绿色环保的生产阿糖胞苷。其中酶法合成阿糖胞苷是以低成本的核苷为底物，以含有相关酶的微生物或者酶制剂为酶源通过碱基或者核糖交换，来获得目的产物。理论上可通过核苷磷酸化酶和N-脱氧核糖转移酶来分别催化生产阿糖胞苷，但这两种酶均为初级代谢产物，理论上不能在微生物细胞内大量表达，以避免微生物的遗传物质紊乱。因此，阿糖胞苷的生物合成法虽有报道，但并没有进入到产业化的开发阶段(朱嘉震,史峻嵩,李海存等.生物转化法生产核苷类药物中间体阿糖胞苷的方法.CN201310044260.4,2013)。
在以前的生物合成阿糖胞苷方法中，基本思路是通过糖或碱基的交换来获得目的产物。这种方法的局限性在于需要一个成本较高的阿糖类核苷作为底物提供阿拉伯糖基团，一定程度上限制了进一步产业化推广。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种工艺简单、成本低廉且底物转化率较高的利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于：所述NsGfo氧化还原酶属于Gfo/Idh/MocA氧化还原酶家族，该NsGfo氧化还原酶包括但不局限于来源于Nonomuraea sp.WAC 01424的Gfo/Idh/MocA氧化还原酶(NsGfo，UniProtKB：A0A429BPC3)。
进一步限定，所述核苷包括但不限于胞苷、腺苷、鸟苷或尿苷中的一种或多种。
进一步限定，所述阿糖核苷的合成过程在纯酶反应体系、粗酶液反应体系或静息细胞催化反应体系中进行。
进一步限定，在纯酶反应体系或粗酶液反应体系中，辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的使用浓度为0.01mM-2mM，核苷的使用浓度为0.1mM-10mM，NsGfo氧化还原酶的使用浓度为5μg/mL-1000μg/mL。
进一步限定，在纯酶反应体系中反应在缓冲液中进行，该缓冲液包括但不限于磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液或MOPS缓冲液中的一种或多种。
进一步限定，在粗酶液反应体系中，粗酶液的制备是将表达NsGfo氧化还原酶的大肠杆菌工程菌进行裂解，离心获取上清得到的。
进一步限定，在静息细胞催化反应体系中，核苷的使用浓度为0.1mM-20mM，反应条件为：pH 3.0-9.0，温度20℃-55℃，反应时间为24h。
进一步限定，在静息细胞催化反应体系中，静息细胞为表达NsGfo氧化还原酶的大肠杆菌工程菌。
进一步限定，所述利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于具体过程为：将0.5mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和1mM的胞苷溶解在1mL浓度为50mM，pH7.5的磷酸缓冲液中，加入终浓度为5μg/mL的NsGfo氧化还原酶，混匀，于37℃反应24h后，取100μL，加900μL体积比为4:4:1的乙腈甲醇水混合液终止反应，底物胞苷的转化率高达75.6％。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明通过构建大肠杆菌(Escherochia coli)工程菌(菌株保藏号：CCTCCM2019706)来高效表达NsGfo氧化还原酶，该NsGfo氧化还原酶可直接将核苷的核糖催化为阿拉伯糖，从而将核苷转化为阿糖核苷。因此，本发明将对阿糖系列核苷药物的生物合成起到重大的推动作用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
对比例1
无辅酶条件下NsGfo氧化还原酶催化反应
将2mM的胞苷溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为50μg/mL的NsGfo氧化还原酶，混匀，于37℃反应24h后，取100μL，加900μL体积比为4:4:1的乙腈甲醇水混合液终止反应。
用高效液相色谱检测反应体系中胞苷和阿糖胞苷的浓度，在24h取样，仅检测到胞苷的特征峰。说明在没有辅酶条件下，NsGfo氧化还原酶不能催化胞苷生成阿糖胞苷。
对比例2
酶失活条件下NsGfo氧化还原酶的催化反应
将NsGfo氧化还原酶在100℃水浴中加热30min，使NsGfo氧化还原酶失活后备用。
将1mM的NAD和2mM的胞苷溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为200μg/mL的酶失活的NsGfo氧化还原酶，混匀，于37℃反应24h，取100μL，加900μL体积比为4:4:1的乙腈甲醇水混合液终止反应。
用高效液相色谱检测反应中胞苷和阿糖胞苷的浓度，在24h取样，没有出现阿糖胞苷的特征峰，仅检测到胞苷的特征峰。说明在辅酶条件下，没有活性NsGfo氧化还原酶不能催化胞苷生成阿糖胞苷。
实施例1
以NAD为辅酶，NsGfo氧化还原酶催化胞苷产生阿糖胞苷
将0.5mM的NAD和1mM的胞苷溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的磷酸缓冲液中，加入终浓度为5μg/mL的NsGfo氧化还原酶，混匀，于37℃反应24h后，取100μL，加900μL体积比为4:4:1的乙腈甲醇水混合液终止反应。
用高效液相色谱检测反应中胞苷和阿糖胞苷的浓度，1h取样，检测到胞苷的特征峰，同时也检测到阿糖胞苷的特征峰。至24h，测定反应体系中的胞苷和阿糖胞苷含量，胞苷对阿糖胞苷的转化率达75.6％(表1)。
表1胞苷转化率随时间变化
综合对比例1，对比例2和实施例1的结果说明，以NAD为辅酶，NAD依赖型的NsGfo氧化还原酶能够催化胞苷产生阿糖胞苷，并且辅酶NAD和催化剂NsGfo氧化还原酶在此催化反应中起关键作用。
实施例2
粗酶液反应体系中NsGfo氧化还原酶催化胞苷产生阿糖胞苷
将0.5mM的NAD和0.5mM的胞苷溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的磷酸缓冲液中，加入终浓度为20μg/mL的NsGfo氧化还原酶粗酶液，混匀，于37℃反应24h后，取100μL，加900μL体积比为4:4:1的乙腈甲醇水混合液终止反应。
用高效液相色谱检测反应中胞苷和阿糖胞苷的浓度，1h取样，检测到胞苷的特征峰，同时也检测到阿糖胞苷的特征峰。至24h，测定反应体系中的胞苷和阿糖胞苷含量，胞苷对阿糖胞苷的转化率达55.8％(表2)。
表2胞苷转化率随时间变化
实施例3
静息细胞催化反应体系中NsGfo氧化还原酶催化胞苷产生阿糖胞苷
将10mM的胞苷溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的磷酸缓冲液中，加入终浓度为200μg/mL的静息细胞，混匀，于37℃反应24h后，取100μL，加900μL体积比为4:4:1的乙腈甲醇水混合液终止反应。
用高效液相色谱检测反应中胞苷和阿糖胞苷的浓度，1h取样，检测到胞苷的特征峰，同时也检测到阿糖胞苷的特征峰。至24h，测定反应体系中的胞苷和阿糖胞苷含量，胞苷对阿糖胞苷的转化率达60.4％(表3)。
表3胞苷转化率随时间变化
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
Claims (8)
1.一种利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于：所述NsGfo氧化还原酶属于Gfo/Idh/MocA氧化还原酶家族，该NsGfo氧化还原酶是序列为Nonomuraeasp .WAC 01424的Gfo/Idh/MocA氧化还原酶，NsGfo，UniProtKB：A0A429BPC3，所述核苷为胞苷、腺苷、鸟苷或尿苷中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于：所述阿糖核苷的合成过程在纯酶反应体系、粗酶液反应体系或静息细胞催化反应体系中进行。
3. 根据权利要求2所述的利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于：在纯酶反应体系或粗酶液反应体系中，辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的使用浓度为0.01mM-2mM，核苷的使用浓度为0.1mM-10mM，NsGfo氧化还原酶的使用浓度为5μg/mL-1000μg/mL。
4.根据权利要求3所述的利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于：在纯酶反应体系中反应在缓冲液中进行，该缓冲液为磷酸缓冲液、
Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液或MOPS缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于：在粗酶液反应体系中，粗酶液的制备是将表达NsGfo氧化还原酶的大肠杆菌工程菌进行裂解，离心获取上清得到的。
6. 根据权利要求2所述的利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于：在静息细胞催化反应体系中，核苷的使用浓度为0.1mM-20mM，反应条件具体为：pH3.0-9.0，温度20℃-55℃，反应时间为24h。
7.根据权利要求2或6所述的利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于：在静息细胞催化反应体系中，静息细胞为表达NsGfo氧化还原酶的大肠杆菌工程菌。
8. 根据权利要求1所述的利用NsGfo氧化还原酶催化核苷合成阿糖核苷的方法，其特征在于具体过程为：将0.5mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和1mM的胞苷溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的磷酸缓冲液中，加入终浓度为5μg/mL的NsGfo氧化还原酶，混匀，于37℃反应24h后，取100μL，加900μL体积比为4:4:1的乙腈甲醇水混合液终止反应，底物胞苷的转化率高达75.6%。
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