CN103320407B - 一种发酵培养基及用该培养基发酵生产尿苷磷酸化酶的方法 - Google Patents

一种发酵培养基及用该培养基发酵生产尿苷磷酸化酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供的一种发酵培养基，包含：NaCl (3~12g/L)，葡萄糖（10~25g/L），酵母膏（5~15g/L），蛋白胨（2~15g/L），K2HPO4.3H2O（2-5g/L），尿苷（7~25mmol/L），肌苷（15~30mmol/L）以及双蒸水。本发明提供的一种基于上述发酵培养基的发酵方法，包括：将短乳杆菌划线接种培养12~48h，并在4℃下保存备用；取一定量酵母膏溶于双蒸水中，调节其pH值在6.0~8.0之间，在121℃下灭菌15~20min，得到含有酵母膏1~10%（质量分数）之间的活化液；挑取短乳杆菌接种到活化液中，在30~40℃下活化4~12h，得到活化的短乳杆菌菌体；按照体积分数1~10%为接种量将短乳杆菌菌体接入发酵培养基中；培养基在30~40℃，摇床转速为90~180r/min下，发酵4~12h，得到发酵液；将发酵液在3000~5000r/min下离心10~30min，离心管内的沉淀即为发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体，将其作为尿苷磷酸化酶酶源进行核苷发酵。

Description

一种发酵培养基及用该培养基发酵生产尿苷磷酸化酶的方法
技术领域
本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种适合短乳杆菌生长并高产尿苷磷酸化酶的发酵培养基及其发酵方法。
背景技术
尿苷磷酸化酶为同源六聚体（6×27.5 ku），其广泛存在于动植物及微生物中，参与细胞核酸代谢途径，在“补救途径”中催化尿苷可逆磷酸化反应，提供核糖-1-磷酸，释放碱基尿嘧啶。因此，尿苷磷酸化酶在生物合成核苷药物中具有重要作用，合成出的核苷药物被广泛应用于医药领域，如抗病毒和抗肿瘤核苷药物。
目前已通过传统的筛选和诱变技术获得了一些具有较高酶活的产尿苷磷酸化酶的菌种如产气肠杆菌、乙酰短杆菌等，但是这些菌种不仅具有一定的致病性而且产酶量低，同时各种酶量比例不协调，严重限制了它们在工业生产中的应用。而短乳杆菌则没有致病性，并且通过筛选优化可以提高产尿苷磷酸化酶的能力。
菌种生长、繁殖和合成产物，需要使用到发酵培养基。发酵培养基的制备及发酵方法与菌种本身也密切相关。短乳杆菌有其最适生长培养基，而生产不同的核苷磷酸化酶又往往需要使用不同的培养基，而且短乳杆菌菌体的最适生长培养基，也未必就是使短乳杆菌高产尿苷磷酸化酶的最佳培养基。因此，需要筛选一种既适合短乳杆菌菌体生长又有利于其高产尿苷磷酸化酶的培养基。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于解决目前存在的现有菌种具有致病性以及产酶低、酶量比例不协调的缺点，提供没有致病性，且通过筛选优化可以提高产尿苷磷酸化酶的短乳杆菌培养基。
本发明提供的一种适合短乳杆菌高产尿苷磷酸化酶的发酵培养基，其包含：浓度在3~12g/L范围内的NaCl，浓度在10-25g/L范围内的葡萄糖，浓度在5~15g/L范围内的酵母膏，浓度在2~15g/L范围内的蛋白胨，浓度在2-5g/L的K2HPO4.3H2O，浓度在7~25mmol/L范围内的尿苷，浓度在15~30mmol/L的肌苷，以及双蒸水。
进一步，本发明提供的一种用如上述发酵培养基的发酵方法，还可以具有这样的特征，包括以下步骤：
步骤1，将短乳杆菌划线接种到固体斜面培养基上于恒温恒湿箱中培养12~48h，然后在4℃下的冰箱中保存备用；
步骤2，取一定量酵母膏溶于所述双蒸水中，调节其pH值在6.0~8.0之间，在121℃条件下灭菌15~20min，得到含有酵母膏1~10%（质量分数）之间的活化液；
步骤3，在无菌环境下从固体斜面培养基上挑取短乳杆菌接种到活化液中，在30~40℃下活化6~12h，得到活化的短乳杆菌菌体；
步骤4，按照体积分数1~10%为接种量，将活化的短乳杆菌菌体接入发酵培养基中；
步骤5，将发酵培养基在温度为30~40℃，摇床转速为90~180r/min的条件下发酵培养4-12h，得到发酵液；
步骤6，将发酵液在3000~5000r/min条件下离心10~30min，得到发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体。
步骤7 将发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体作为尿苷磷酸化酶酶源进行核苷发酵。
进一步，本发明提供的发酵方法，还可以具有这样的特征：
其中，全细胞短乳杆菌湿菌体中尿苷磷酸化酶的酶活在0.65~1.15U/mg湿菌体。
发明作用与效果
本发明公开了一种发酵培养基及其发酵方法，该发酵方法中使用不具致病性的短乳杆菌作为产尿苷磷酸化酶的菌种，该发酵培养基中含有适合短乳杆菌生长的必要元素，以及尿苷磷酸化酶的底物诱导剂—尿苷，使得短乳杆菌在上述发酵培养基中良好生长的前提下能够高产尿苷磷酸化酶，并且该培养基成分简单、成本低，应用前景广阔，通过该发酵方法简单实用，且得到尿苷磷酸化酶的酶活在0.65~1.15U/mg湿菌体。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细阐述。应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一
1、发酵培养基
发酵培养基中包含：浓度为7.5g/L的NaCl，浓度为15g/L的酵母膏，浓度为15g/L的蛋白胨，浓度为15mmol/L的尿苷，浓度为18g/L的葡萄糖，浓度为3.5g/L的K2HPO4.3H2O，浓度为15mmol/L的肌苷，以及双蒸水。
2、发酵方法
步骤1，固体斜面培养基的制备：将葡萄糖(20g/L)、酵母膏(10g/L)、NaCl(5g/L)和琼脂(20g/L)按照所需浓度称取好后用双蒸水在搪瓷缸内煮沸溶解，在121℃条件下高压灭菌20min；将灭好菌的培养基按照体积比1/3的比例倒入无菌试管中，在30°的斜面上放置使培养基凝固形成固体斜面培养基。
步骤2，将短乳杆菌划线接种到固体斜面培养基上在恒温恒湿箱内培养16~24h，培养好后放在冰箱中4℃下保存备用；
步骤3，称取1~10g酵母膏溶于100ml双蒸水中，调节使其pH值在6.0~8.0之间，在121℃条件下灭菌20min，得到活化液。
步骤4，在无菌操作条件下将保存在固体斜面培养基上的短乳杆菌取两环接种到步骤8的活化液中，将接好种的活化液放在空气摇床中活化10h，活化条件为温度36℃，转速110r/min。
步骤5，按照体积分数2%为接种量，将活化的短乳杆菌菌体接入上述发酵培养基中；
步骤6，将接好种的发酵培养基在温度为38℃，摇床转速为110r/min的条件下于恒温空气摇床中发酵培养10h，得到发酵液；
步骤7，取一定量的发酵液于无菌离心管中，用离心机在3000~5000r/min条件下离心20min，离心管底沉淀即为发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体。
步骤8，直接以发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体作为尿苷磷酸化酶酶源进行核苷发酵。
3、短乳杆菌产尿苷磷酸化酶能力的测定方法
步骤1，配制标准酶反应混合液：20mmol/L的尿苷，1mmol/L的EDTA，pH值为7.3、75mmol/L的磷酸钾缓冲溶液；
步骤2，用锥形瓶装5~10ml的标准酶反应液，按照体积分数5-15%的湿菌体量加入短乳杆菌；
步骤3，将加入湿菌体的反应液在恒温水浴振荡器中反应，于55-60℃水浴下反应3h，反应结束后，将反应液在沸水中煮沸3~5min终止反应；
步骤4，终止反应后将反应液转入离心管中，以转速4000~5000r/min离心出沉淀，取上清液用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
步骤5，将稀释好的上清液用紫外分光光度计在290nm处测定吸光值OD290nm的增值：△OD290nm=OD290nm反应液—OD290nm空白液。空白液与反应液的处理过程完全相同只是不添加菌液，最后同样用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
UPase酶活单位定义为：在上述条件下，1min内OD290nm变化0.01所需要的湿菌体量定义为一个酶活力单位；
本实验中测定的湿菌体中尿苷磷酸化酶其UPase活力为0.957-1.079U/mg湿菌体，而未筛选优化前仅为0.413-0.507U/mg湿菌体。
实施例一的作用与效果
本实施例中的实验结果表明，使用本发明公开的一种发酵培养基和发酵方法，使得短乳杆菌良好生长的前提下能够高产尿苷磷酸化酶，通过发酵使短乳杆菌生产尿苷磷酸化酶，其中尿苷磷酸化酶的酶活达到0.957-1.079U/mg湿菌体。
实施例二
1、发酵培养基
发酵培养基中包含：浓度为5g/L 的NaCl，浓度为10g/L的酵母膏，浓度为10g/L的蛋白胨，浓度为10mmol/L的尿苷，浓度为20g/L的葡萄糖，浓度为2.5g/L的K2HPO4.3H2O，浓度为10mmol/L的肌苷，以及双蒸水。
2、发酵方法
步骤1，固体斜面培养基的制备：将葡萄糖(20g/L)、酵母膏(10g/L)、NaCl(5g/L)和琼脂(20g/L)按照所需浓度称取好后用双蒸水在搪瓷缸内煮沸溶解，在121℃条件下高压灭菌20min；将灭好菌的培养基按照体积比1/3的比例倒入无菌试管中，在30°的斜面上放置使培养基凝固形成固体斜面培养基。
步骤2，将短乳杆菌划线接种到固体斜面培养基上在恒温恒湿箱内培养16~24h，培养好后放在冰箱中4℃下保存备用；
步骤3，称取1~10g酵母膏溶于100ml双蒸水中，调节使其pH值在6.0~8.0之间。在121℃条件下灭菌20 min，得到活化液。
步骤4，在无菌操作条件下将保存在固体斜面培养基上的短乳杆菌取两环接种到步骤8的活化液中，将接好种的活化液放在空气摇床中活化8h，活化条件为：温度36℃，摇床转速110r/min。
步骤5，按照体积分数5%为接种量，将活化的短乳杆菌菌体接入上述发酵培养基中；
步骤6，将接好种的发酵培养基在温度为36℃，摇床转速为110r/min的条件下于恒温空气摇床中发酵培养8h，得到发酵液；
步骤7，取一定量的发酵液于无菌离心管中，用离心机在3000~5000r/min条件下离心20min，离心管底沉淀即为发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体。
步骤8，直接以发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体作为尿苷磷酸化酶酶源进行核苷发酵。
3、短乳杆菌产尿苷磷酸化酶能力的测定方法
步骤1，配制标准酶反应混合液：20mmol/L的尿苷，1mmol/L的EDTA，pH值为7.3、75mmol/L的磷酸钾缓冲溶液；
步骤2，用锥形瓶装5~10ml的标准酶反应液，按体积分数为5-10%的湿菌体量加入短乳杆菌；
步骤3，将加入湿菌体的反应液在恒温水浴振荡器中反应，在55-60℃水浴下反应3h，反应结束后，将反应液在沸水中煮沸3~5min终止反应；
步骤4，终止反应后将反应液转入离心管中，在4000~5000r/min离心出沉淀，取上清液用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
步骤5，将稀释好的上清液用紫外分光光度计在290nm处测定吸光值OD290nm的增值：△OD290nm=OD290nm反应液—OD290nm空白液。空白液与反应液的处理过程完全相同只是不添加菌液，最后同样用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
UPase酶活单位定义为：在上述条件下，1min内OD290nm变化0.01所需要的湿菌体量定义为一个酶活力单位；
本实验中测定的湿菌体中尿苷磷酸化酶其UPase活力为0.751-0.782U/mg湿菌体，而未筛选优化前仅为0.413-0.507U/mg湿菌体。
实施例二的作用与效果
本实施例中的实验结果表明，使用本发明公开的一种发酵培养基和发酵方法，使得短乳杆菌良好生长的前提下能够高产尿苷磷酸化酶，通过发酵使短乳杆菌生产尿苷磷酸化酶，其中尿苷磷酸化酶的酶活达到0.751-0.782U/mg湿菌体。
实施例三
1、发酵培养基
发酵培养基中包含：浓度为10g/L的NaCl，浓度为20g/L的酵母膏，浓度为15g/L的蛋白胨，浓度为25mmol/L的尿苷，浓度为25g/L的葡萄糖，浓度为4.0g/L的K2HPO4.3H2O，浓度为25mmol/L的肌苷，以及双蒸水。
2、发酵方法
步骤1，固体斜面培养基的制备：将葡萄糖(20g/L)、酵母膏(10g/L)、NaCl(5g/L)和琼脂(20g/L)按照所需浓度称取好后用双蒸水在搪瓷缸内煮沸溶解，在121℃条件下高压灭菌15min；将灭好菌的培养基按照体积比1/3的比例倒入无菌试管中，在30°的斜面上放置使培养基凝固形成固体斜面培养基。
步骤2，将短乳杆菌划线接种到固体斜面培养基上在恒温恒湿箱内培养16~24h，培养好后放在冰箱中4℃下保存备用；
步骤3，称取1~10g酵母膏溶于100ml双蒸水中，调节使其pH值在6.0~8.0之间。在121℃条件下灭菌15min，得到活化液。
步骤4，在无菌操作条件下将保存在固体斜面培养基上的短乳杆菌取两环接种到步骤8的活化液中，将接好种的活化液放在空气摇床中活化10h，活化条件为：温度36℃，转速110r/min。
步骤5，按照体积分数为3%为接种量将活化的短乳杆菌菌体接入上述发酵培养基中；
步骤6，将接好种的发酵培养基在温度为38℃，摇床转速为110r/min的条件下于恒温空气摇床中发酵培养12h，得到发酵液；
步骤7，取一定量的发酵液于无菌离心管中，用离心机在3000~5000r/min条件下离心20min，离心管底沉淀即为发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体，此处直接以发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体作为尿苷磷酸化酶酶源进行核苷发酵。
3、短乳杆菌产尿苷磷酸化酶能力的测定方法
步骤1，标准酶反应混合液：20mmol/L的尿苷，1mmol/L的EDTA，pH值为7.3、75mmol/L的磷酸钾缓冲溶液；
步骤2，用锥形瓶装5~10ml的标准酶反应液，按照5-10%（体积分数）的湿菌体量加入短乳杆菌；
步骤3，将加入湿菌体的反应液在恒温水浴振荡器中反应，在55-60℃水浴下反应3h，反应结束后，将反应液在沸水中煮沸3~5min终止反应；
步骤4，终止反应后将反应液转入离心管中，在4000~5000r/min离心沉淀。取上清液用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
步骤5，将稀释好的上清液用紫外分光光度计在290nm处测定吸光值OD290nm的增值：△OD290nm=OD290nm反应液—OD290nm空白液。空白液与反应液的处理过程完全相同只是不添加菌液，最后同样用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
UPase酶活单位定义为：在上述条件下，1min内OD290nm变化0.01所需要的湿菌体量定义为一个酶活力单位；
本实验中测定的湿菌体中尿苷磷酸化酶其UPase活力为0.892-1.075U/mg湿菌体，而未筛选优化前仅为0.413-0.507U/mg湿菌体。
实施例三的作用与效果
本实施例中的实验结果表明，使用本发明公开的一种发酵培养基和发酵方法，使得短乳杆菌良好生长的前提下能够高产尿苷磷酸化酶，通过发酵使短乳杆菌生产尿苷磷酸化酶，其中尿苷磷酸化酶的酶活达到0.892-1.075U/mg湿菌体。

Claims (2)

1.一种利用短乳杆菌发酵生产尿苷磷酸化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，按照葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L和琼脂20g/L的浓度配置固体斜面培养基，将短乳杆菌划线接种到所述固体斜面培养基上于恒温恒湿箱中培养12～48h，然后在4℃下的冰箱中保存备用；
步骤2，取一定量酵母膏溶于双蒸水中，调节其pH值在6.0～8.0之间，在121℃条件下灭菌15～20min，得到含有所述酵母膏的质量分数为1～10％的活化液；
步骤3，在无菌环境下从所述固体斜面培养基上挑取所述短乳杆菌接种到所述活化液中，在30～40℃下活化6～12h，得到活化的短乳杆菌菌体；
步骤4，按照体积分数1～10％的接种量，将所述活化的短乳杆菌菌体接入发酵培养基中，
其中，所述发酵培养基包括：浓度在3～12g/L范围内的NaCl，浓度在10～25g/L范围内的葡萄糖，浓度在5～15g/L范围内的酵母膏，浓度在2～15g/L范围内的蛋白胨，浓度在2～5g/L的K2HPO4·3H2O，浓度在7～25mmol/L范围内的尿苷，浓度在15～30mmol/L的肌苷，以及双蒸水；
步骤5，将所述发酵培养基在温度为30～40℃，摇床转速为90～180r/min的条件下发酵培养4-12h，得到发酵液；
步骤6，将所述发酵液在3000～5000r/min条件下离心10～30min，得到发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体；
步骤7将所述发酵好的全细胞短乳杆菌湿菌体作为尿苷磷酸化酶酶源进行核苷发酵。
2.根据权利要求1所述的利用短乳杆菌发酵生产尿苷磷酸化酶的方法，其特征在于：
其中，所述全细胞短乳杆菌湿菌体中所述尿苷磷酸化酶的酶活在0.65～1.15U/mg湿菌体。
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