CN104342477A - 一种四环素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四环素的制备方法，具体为将金色链霉菌菌种制备后先进行种子摇瓶培养和种子罐培养，当培养至20～26小时，转为发酵培养。待pH值达5.6～7.6，总效价≥8000U/mL，总糖含量≤2.0％，氨基氮>50mg/100mL，滤速≥5mL/5min时，发酵结束并放罐。最后进行板框过滤，离子交换树脂脱色，结晶，气流干燥，制得四环素。本发明所述方法发酵工艺简单，能有效提高发酵单位，提高收率，降低生产成本，同时避免了化学有机溶剂的使用。

Description

一种四环素的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种抗生素的制备方法，具体涉及一种四环素的制备方法。
背景技术
四环素是从放线菌、金色链霉菌等的培养液分离出来的抗菌物质，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，其主要作用机理为破坏细菌聚核糖体形成，干扰蛋白质合成，从而抑制细菌生长，属于一种广谱抗菌素。随着生物制药领域对四环类抗生素研究的深入，以盐酸四环素为核心的四环类抗生素种类日益增多，作为大宗基础原料药，盐酸四环素的研究日益深入，在市场激烈的竞争下，提高发酵水平，提高精制收率成为研究核心。然而现有技术关于四环素的制备方法存在下述缺点：使用到易燃易爆且存储成本较高的有机试剂；设备投入大，生产成本高，收率低，经济效益低；制备过程中反复加水稀释、酸化，导致酸化时间长，易产生差向异构体，从而严重影响产品质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种四环素的制备方法该方法能有效提高发酵单位，降低生产成本。
本发明采用的具体技术方案如下：
一种四环素的制备方法，包括以下步骤：
a.种子培养
1)菌种制备
将金色链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34±0.5℃下培养3.5～5天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在34±0.5℃下培养3～5天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮3.0～3.4％，MgSO40.005±0.001％，(NH4)2HPO40.015±0.005％，KH2PO40.01±0.002％，琼脂粉1.8～2.2％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，培养温度为30～33℃，通气量为1:1.5～2.0v/v/min，罐压为0.03～0.05MPa，搅拌速度为150～230rpm/min，培养时间为20～26小时；
所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉3.0～5.0％，花生饼粉0～4％，黄豆饼粉0～4％，酵母粉0～2％，玉米浆0～0.8％，碳酸钙0.2～0.6％，硫酸铵0.2～0.6％，溴化钠0～0.3％，硫酸镁0.02～0.04％，磷酸二氢钾0.01～0.06％，淀粉酶0～0.05％，植物油或豆油0～0.6％，消泡剂0～0.6％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度28～33℃，通气量1:0.8～1:1.0v/v/min，罐压0.02～0.05MPa，搅拌速度120～180rpm/min，pH值5.6～6.2，发酵时间≥80小时；发酵过程中当发酵液总糖质量百分浓度<3.5％时，加入补料培养基；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于2％；
发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～8.0％，花生饼粉0～4.0％，黄豆饼粉0～5.0％，酵母粉0～2.0％，玉米浆0～1.8％，碳酸钙0.4～0.7％，硫酸铵0.5～1.0％，溴化钠0.1～0.4％，硫酸镁0～0.03％，磷酸二氢钾0～0.03％，淀粉酶0～0.08％，植物油或豆油0～0.3％，消泡剂0～0.6％，余量为水；
补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～50％，花生饼粉0～1.0％，黄豆饼粉0～1.0％，酵母粉0～0.5％，玉米浆0～4％，碳酸钙0.2～0.6％，硫酸铵0～0.7％，溴化钠0～0.5％，硫酸镁0～0.03％，磷酸二氢钾0～0.02％，淀粉酶0～0.1％，植物油或豆油0～0.6％，消泡剂0.02～0.2％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
发酵培养结束后，对发酵液进行预处理，然后板框过滤；过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至滤液透光度≥90％后进入结晶罐结晶；在结晶罐内温度为8～10℃条件下，用氨水将脱色后滤液pH值调至4.4～4.8，然后保温50～60min，再进行离心分离，直至分离后湿晶体含水量按质量百分浓度计达20％；将离心得到的湿晶体采用气流干燥方式进行干燥，保持进风温度为100～160℃，最后得到含水量按质量百分浓度计≤10％的干粉。
优选的，所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮3.0％，MgSO40.005％，(NH4)2HPO40.01％，KH2PO40.01％，琼脂粉2％，余量为水。
优选的，所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉4％，花生饼粉2％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.2％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，淀粉酶0.01％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
优选的，所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉4％，黄豆饼粉5％，酵母粉2％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
优选的，所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.1％，玉米浆2％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，淀粉酶0.1％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
优选的，包括如下步骤：
a.种子培养
1)菌种制备
将金色链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34℃下培养4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在34℃下培养5天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮3.0％，MgSO40.005％，(NH4)2HPO40.01％，KH2PO40.01％，琼脂粉2％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，培养温度为32℃，通气量为1:2.0v/v/min，罐压为0.03MPa，搅拌速度为200rpm/min，培养时间为25小时；
所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉4％，花生饼粉2％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.2％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，淀粉酶0.01％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度33℃，通气量1:1.0v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度180rpm/min，pH值6.0，发酵时间110小时；发酵过程中当发酵液总糖质量百分浓度<3.5％时，加入补料培养基；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于2％；
发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉4％，黄豆饼粉5％，酵母粉2％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；
补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.1％，玉米浆2％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，淀粉酶0.1％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
发酵培养结束后，对发酵液进行预处理，然后板框过滤；过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至滤液透光度达96％后进入结晶罐结晶；在结晶罐内温度为9℃条件下，用氨水将脱色后滤液pH值调至4.6，然后保温60min，再进行离心分离，直至分离后湿晶体含水量按质量百分浓度计达20％；将离心得到的湿晶体采用气流干燥方式进行干燥，保持进风温度为158℃，最后得到含水量按质量百分浓度计为7％的干粉。
优选的，所述步骤c中所述发酵液预处理包括：首先对发酵液进行稀释，然后用草酸进行酸化，酸化后pH值为1.90～2.00，然后按重量体积比向发酵液中加入发酵液体积3.0±0.3‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比加入发酵液体积2.0‰的硫酸锌。
本发明的有益效果在于：本发明发酵工艺简单，能有效提高发酵单位，提高收率，降低生产成本，同时避免了化学有机溶剂的使用，防止有机溶剂对四环素造成污染，避免了对动物的危害；并且采用本发明所述培养基利于四环素特殊结构的合成，从而提高四环素收率，还能有利于后续对四环素的分离纯化；另外，由于气流干燥以蒸汽为热源，采用气流干燥方式对四环素进行干燥，大大提高了生产效率，降低了工作量。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
四环素的制备方法如下：
a.种子培养
1)菌种制备
将金色链霉菌孢子接种到含有孢子培养基(母斜面)的琼脂斜面中并在34℃下培养4天。然后再转接种到子斜面上，在34℃下培养5天直到孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮3.0％，MgSO40.005％，(NH4)2HPO40.01％，KH2PO40.01％，琼脂粉2％，余量为水。子斜面培养基成分同母斜面培养基成分；
2)种子罐培养
将菌种接种至灭菌后的种子罐中，在培养温度32℃、罐压0.03MPa、通气量1:2.0v/v/min、搅拌速度200rpm下培养25小时，取样检测；
检测结果：种子液为浅黄色、稠，菌丝浓度为20％，pH值为5.8，总糖2.5％，氨基氮78mg/100mL，效价150U/mL，镜检结果显示菌丝呈密网状分节菌丝粗壮，无杂菌，达到种子培养液质控指标；
种子罐培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉4％，花生饼粉2％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.2％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，淀粉酶0.01％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；b.发酵培养
将种子液移至发酵罐中培养，在培养温度33℃、罐压0.03MPa、pH值为6.0、通气量1:1.0v/v/min、搅拌速度180rpm下培养110小时，取样检测；
检测结果：总糖1.5％，氨基氮78mg/100mL，效价18000U/mL，滤速12mL/min。发酵罐培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉4％，黄豆饼粉5％，酵母粉2％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；
发酵过程中当发酵液总糖质量百分浓度<3.5％时，加入补料培养基；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于2％；补料罐培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.1％，玉米浆2％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，淀粉酶0.1％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
1)发酵液的预处理和过滤
发酵完毕，将10吨发酵液压入酸化罐中，开启搅拌并用自来水进行稀释，同时加入草酸进行酸化，调节pH值为1.90。取酸化样品测定效价为17000U/mL，滤速为14mL/min。之后按重量体积比向发酵液中加入发酵液体积3‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比再加入发酵液体积2‰的硫酸锌，稀释后板框过滤；
2)脱色
过滤后的滤液通入122离子交换树脂罐中进行脱色，每隔3小时取样测定效价和透光度，测得透光度为96％，效价为2100U/mL，脱色液进入连续结晶罐进行结晶；
3)结晶
脱色液由泵输送至结晶罐，罐内温度控制在9℃，加入15％氨水(w/w)调节pH值至4.6，然后保温60min，再进入离心机进行分离；
4)离心分离
往离心机中加入结晶液(每台离心机分离湿晶体60kg)离心分离，并水洗两次，共4分钟，第一次洗去泡沫，第二洗至水清，最终得到的湿晶体含水量为20％(w/w)；
5)干燥与混粉
湿晶体的干燥采用气流干燥，进风温度为158℃，湿粉经粉碎机粉碎后进入管道，物料随热空气经扩大罐至旋风干燥器，过筛后进入混粉器，得到含水量7％(w/w)的干粉，总收率为87.8％。
其中，种子罐转移至发酵罐中的移种指标如表1：
表1种子罐转移至发酵罐中的移种指标
参数 参考值
种子龄 20～26小时
外观 浅黄色、稠
菌丝浓度 ≥15％以上
pH 5.7～6.3
总糖 <4％
氨基氮 <100mg/100ml
效价 >50U/ml
镜检 菌丝密网状分节菌丝粗壮，无杂菌
发酵过程中糖浓度控制指标如表2：
表2发酵过程中糖浓度控制指标
周期(小时) 糖含量(％)
发酵前 5.5～9.0
发酵前期(0-60h) ≥3.5
发酵后期(60-90h) ≤3.5
放罐时 ≤2.0
发酵完毕后，放罐指标如表3：
表3发酵结束后放罐指标
参数 参数值
pH 5.6～7.6
总效价 ≥8000U/mL
总糖含量 ≤2.0％
氨基氮 >50mg/100mL
滤速 ≥5mL/5min
实施例2
四环素的制备方法如下：
a.种子培养
1)菌种制备
将金色链霉菌孢子接种到含有孢子培养基(母斜面)的琼脂斜面中并在34℃下培养5天。然后再转接种到子斜面上，在34℃下培养4天直到孢子成熟。
孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮3.4％，MgSO40.005％，(NH4)2HPO40.015％，KH2PO40.01％，琼脂粉2.2％，余量为水，子斜面培养基成分同母斜面培养基成分。
2)种子罐培养过程
将制备的菌种接种至灭菌后的种子罐中，在培养温度33℃、通气量1:1.8v/v/min、搅拌速度200rpm下培养23小时，取样检测；
检测结果：种子液为浅黄色、稠，菌丝浓度19％，pH值为5.9，总糖3％，氨基氮90mg/100mL，效价168U/mL，镜检结果显示菌丝呈密网状分节，菌丝粗壮，无杂菌。
种子罐培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉3％，花生饼粉3％，黄豆饼粉3％，酵母粉2％，玉米浆0.5％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.2％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，淀粉酶0.01％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
b.发酵培养
将种子液移至发酵罐中培养。在培养温度30℃、通气量1:1.0v/v/min、搅拌速度170rpm下培养100小时，取样检测；
检测结果：总糖1.7％，氨基氮78mg/100mL，效价17000U/mL，滤速15mL/min。
发酵罐培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉7％，花生饼粉4％，黄豆饼粉5％，酵母粉1％，玉米浆1.8％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
发酵过程中当发酵液总糖质量百分浓度<3.5％时，加入补料培养基；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于2％；补料罐培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.4％，玉米浆4％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，淀粉酶0.1％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
c.发酵液的分离纯化
1)发酵液的酸化、净化、过滤
发酵完毕，将10吨发酵液压入酸化罐中，开启搅拌并用自来水进行稀释，同时加入草酸进行酸化，调节pH值为1.90。取酸化样品测定效价为15000U/mL，滤速为20mL/min。之后按重量体积比加入发酵液体积2.8‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比加入1.8‰的硫酸锌，稀释后测得pH值为1.88，效价10500U/mL。将稀释液进行板框过滤。
2)脱色
滤液通入122离子交换树脂罐进行脱色，中间每隔3小时取样测定效价和透光度，测得透光度为94％，效价为2200U/mL，脱色液进入连续结晶罐进行结晶。
3)结晶
脱色液由泵输送至结晶罐，罐内温度控制在10℃，加入15％氨水(w/w)调节pH值至4.0，然后保温60min，再进入离心机进行分离。
4)离心分离
往离心机中加入结晶液进行离心分离，并水洗两次，共4分钟。第一次洗去泡沫，第二洗至水清。最终获得的湿晶体含水量为18％(w/w)。
5)干燥与混粉
湿晶体的干燥采用气流干燥，进风温度为148℃，湿粉经粉碎机粉碎后进入管道，物料随热空气经扩大罐至旋风干燥器，过筛后进入混粉器，得到含水量8％(w/w)的干粉，总收率为84％。
其中，种子罐转移至发酵罐中的移种指标、发酵过程中糖浓度控制指标以及发酵完毕的放罐指标同实施例1。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种四环素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.种子培养
1)菌种制备
将金色链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34±0.5℃下培养3.5～5天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在34±0.5℃下培养3～5天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮3.0～3.4％，MgSO40.005±0.001％，(NH4)2HPO40.015±0.005％，KH2PO40.01±0.002％，琼脂粉1.8～2.2％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，培养温度为30～33℃，通气量为1:1.5～2.0v/v/min，罐压为0.03～0.05MPa，搅拌速度为150～230rpm/min，培养时间为20～26小时；
所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉3.0～5.0％，花生饼粉0～4％，黄豆饼粉0～4％，酵母粉0～2％，玉米浆0～0.8％，碳酸钙0.2～0.6％，硫酸铵0.2～0.6％，溴化钠0～0.3％，硫酸镁0.02～0.04％，磷酸二氢钾0.01～0.06％，淀粉酶0～0.05％，植物油或豆油0～0.6％，消泡剂0～0.6％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度28～33℃，通气量1:0.8～1:1.0v/v/min，罐压0.02～0.05MPa，搅拌速度120～180rpm/min，pH值5.6～6.2，发酵时间≥80小时；发酵过程中当发酵液总糖质量百分浓度<3.5％时，加入补料培养基；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于2％；
发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～8.0％，花生饼粉0～4.0％，黄豆饼粉0～5.0％，酵母粉0～2.0％，玉米浆0～1.8％，碳酸钙0.4～0.7％，硫酸铵0.5～1.0％，溴化钠0.1～0.4％，硫酸镁0～0.03％，磷酸二氢钾0～0.03％，淀粉酶0～0.08％，植物油或豆油0～0.3％，消泡剂0～0.6％，余量为水；
补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～50％，花生饼粉0～1.0％，黄豆饼粉0～1.0％，酵母粉0～0.5％，玉米浆0～4％，碳酸钙0.2～0.6％，硫酸铵0～0.7％，溴化钠0～0.5％，硫酸镁0～0.03％，磷酸二氢钾0～0.02％，淀粉酶0～0.1％，植物油或豆油0～0.6％，消泡剂0.02～0.2％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
发酵培养结束后，对发酵液进行预处理，然后板框过滤；过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至滤液透光度≥90％后进入结晶罐结晶；在结晶罐内温度为8～10℃条件下，用氨水将脱色后滤液pH值调至4.4～4.8，然后保温50～60min，再进行离心分离，直至分离后湿晶体含水量按质量百分浓度计达20％；将离心得到的湿晶体采用气流干燥方式进行干燥，保持进风温度为100～160℃，最后得到含水量按质量百分浓度计≤10％的干粉。
2.根据权利要求1所述的一种四环素的制备方法，其特征在于，所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮3.0％，MgSO40.005％，(NH4)2HPO40.01％，KH2PO40.01％，琼脂粉2％，余量为水。
3.根据权利要求1所述的一种四环素的制备方法，其特征在于，所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉4％，花生饼粉2％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.2％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，淀粉酶0.01％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
4.根据权利要求1所述的一种四环素的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉4％，黄豆饼粉5％，酵母粉2％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
5.根据权利要求1所述的一种四环素的制备方法，其特征在于，所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.1％，玉米浆2％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，淀粉酶0.1％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水。
6.根据权利要求1所述的一种四环素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.种子培养
1)菌种制备
将金色链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34℃下培养4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在34℃下培养5天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮3.0％，MgSO40.005％，(NH4)2HPO40.01％，KH2PO40.01％，琼脂粉2％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，培养温度为32℃，通气量为1:2.0v/v/min，罐压为0.03MPa，搅拌速度为200rpm/min，培养时间为25小时；
所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉4％，花生饼粉2％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.2％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，淀粉酶0.01％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度33℃，通气量1:1.0v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度180rpm/min，pH值6.0，发酵时间110小时；发酵过程中当发酵液总糖质量百分浓度<3.5％时，加入补料培养基；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于2％；
发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉4％，黄豆饼粉5％，酵母粉2％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；
补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.1％，玉米浆2％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，溴化钠0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，淀粉酶0.1％，植物油0.1％，消泡剂0.2％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
发酵培养结束后，对发酵液进行预处理，然后板框过滤；过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至滤液透光度达96％后进入结晶罐结晶；在结晶罐内温度为9℃条件下，用氨水将脱色后滤液pH值调至4.6，然后保温60min，再进行离心分离，直至分离后湿晶体含水量按质量百分浓度计达20％；将离心得到的湿晶体采用气流干燥方式进行干燥，保持进风温度为158℃，最后得到含水量按质量百分浓度计为7％的干粉。
7.根据权利要求1～6任一项所述的一种四环素的制备方法，其特征在于，所述步骤c中所述发酵液预处理包括：首先对发酵液进行稀释，然后用草酸进行酸化，酸化后pH值为1.90～2.00，然后按重量体积比向发酵液中加入发酵液体积3.0±0.3‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比加入发酵液体积2.0‰的硫酸锌。
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