CN103305487B - 一种利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法，包括：将短乳杆菌划线接种培养16～24h，并在4℃下保存备用；取一定量酵母膏溶于双蒸水中，调节其pH值在6.0～8.0之间，在121℃下灭菌15～20min，得到酵母膏含量在1～10wt.％之间的活化液；挑取短乳杆菌接种到活化液中，在30～40℃下活化8～12h，得到活化的短乳杆菌菌体的液体；按照接种量1～10％(体积分数)将短乳杆菌菌体接入发酵培养基中；在30～40℃，摇床转速为90～180r/min下，发酵8～16h，得到发酵液；将发酵液在3000～5000r/min条件下离心10～30min，离心管内的沉淀即为含有胸苷磷酸化酶的短乳杆菌湿菌体，其中胸苷磷酸化酶的酶活在0.30～0.50U/mg湿菌体。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种适合短乳杆菌生长并高产胸苷磷酸化酶的发酵方法。
背景技术
胸苷磷酸化酶为同源二聚体(2×45ku)，其广泛存在于动植物及微生物中，参与细胞核酸代谢途径，在“补救途径”中催化脱氧胸苷可逆磷酸化反应，提供脱氧核糖-1-磷酸，释放碱基胸腺嘧啶。因此，胸苷磷酸化酶在生物合成核苷药物中具有重要作用。合成出的核苷药物被广泛应用于医药领域，如抗病毒和抗肿瘤核苷药物。
目前已通过传统的筛选和诱变技术获得了一些具有较高酶活的产胸苷磷酸化酶的菌种如产气肠杆菌、乙酰短杆菌等，但是这些菌种不仅具有一定的致病性而且产酶量低，各种酶量比例不协调等缺点，严重限制了它们在工业生产中的应用。而短乳杆菌则没有致病性，并且通过筛选优化可以提高产胸苷磷酸化酶的能力。
菌种生长、繁殖和合成产物，需要使用到发酵培养基。发酵培养基的制备及发酵方法与菌种本身也密切相关。短乳杆菌有其最适生长培养基，而生产不同的核苷磷酸化酶又往往需要使用不同的培养基，而且短乳杆菌菌体的最适生长培养基，也未必就是使短乳杆菌高产胸苷磷酸化酶的最佳培养基。因此，需要筛选一种既适合短乳杆菌菌体生长又有利于其高产胸苷磷酸化酶的培养基。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法。
本发明提供了一种利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将短乳杆菌划线接种到固体斜面培养基上培养16～24h，得到含有短乳杆菌的固体斜面培养基；
步骤2，取一定量的酵母膏溶于双蒸水中，调节其pH值在6.0～8.0之间，在121℃条件下灭菌15～20min，得到酵母膏含量在1～10％(质量分数)之间的活化液；
步骤3，在无菌环境下从步骤1中含有短乳杆菌的固体斜面培养基上挑取短乳杆菌接种到步骤2得到的活化液中，在30～40℃下活化8～12h，得到含有活化的短乳杆菌菌体的液体；
步骤4，将步骤3得到的含有活化的短乳杆菌菌体的液体按照接种量1～10％(体积分数)接入经过灭菌的适合短乳杆菌高产胸苷磷酸化酶的发酵培养基中，并在温度30-40℃，摇床转速为90～180r/min的条件下，发酵培养8～16h，得到含有胸苷磷酸化酶的发酵液，
其中，上述发酵培养基包含：浓度在5～10g/L范围内的NaCl，浓度在20～30g/L范围内的葡萄糖，浓度在10～20g/L范围内的酵母膏，浓度在10～20g/L范围内的蛋白胨，浓度在10～20mmol/L范围内的胸苷，以及双蒸水；
步骤5，将步骤4中得到的发酵液放置于离心管中在3000～5000r/min条件下离心10～30min，离心管内得到的沉淀即为含有胸苷磷酸化酶的短乳杆菌湿菌体。
进一步，本发明提供的一种利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法，还可以具有这样的特征：其中，在步骤5得到的含有胸苷磷酸化酶的短乳杆菌湿菌体中胸苷磷酸化酶的酶活在0.30～0.50U/mg湿菌体。
发明作用与效果
本发明公开一种适合短乳杆菌生产胸苷磷酸化酶的发酵培养基及其发酵方法，该发酵方法中使用不具致病性的短乳杆菌作为产胸苷磷酸化酶的菌种，该发酵培养基中含有适合短乳杆菌生长的必要元素，以及胸苷磷酸化酶的底物诱导剂—胸苷，使得短乳杆菌在上述发酵培养基中良好生长的前提下能够高产胸苷磷酸化酶，并且该培养基成分简单、成本低，应用前景广阔，该发酵方法简单实用，且得到胸苷磷酸化酶的酶活在0.30～0.50U/mg湿菌体。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一
1、发酵培养基
发酵培养基中包含：浓度为7.5g/L的NaCl，浓度为15g/L的酵母膏，浓度为15g/L的蛋白胨，浓度为15mmol/L的胸苷，浓度为18g/L的葡萄糖，以及双蒸水。
2、发酵方法
步骤1，将短乳杆菌划线接种到固体斜面培养基(固体斜面培养基的制备：将葡萄糖(20g/L)、酵母膏(10g/L)、NaCl(5g/L)和琼脂(20g/L)按照所需浓度称取好后用双蒸水在搪瓷缸内煮沸溶解，在121℃条件下高压灭菌15min；将灭好菌的培养基按照体积比1/3的比例倒入无菌试管中，在30°的斜面上放置使培养基凝固形成固体斜面培养基。)上培养16～24h，得到含有短乳杆菌的固体斜面培养基；
步骤2，取一定量的酵母膏溶于双蒸水中，调节其pH值在6.0～8.0之间，在121℃条件下灭菌15～20min，得到酵母膏含量在1～10％(质量分数)之间的活化液；
步骤3，在无菌环境下从步骤1中含有短乳杆菌的固体斜面培养基上挑取一环短乳杆菌接种到步骤2得到的活化液中，在30～40℃下活化8～12h，得到含有活化的短乳杆菌菌体的液体；
步骤4，将步骤3得到的含有活化的短乳杆菌菌体的液体按照接种量1～10％(体积分数)接入经过灭菌的本实施例中的发酵培养基中，并在温度为30～40℃，摇床转速为90～180r/min的条件下，发酵培养8～16h，得到含胸苷磷酸化酶的发酵液；
步骤5，将步骤4中得到的发酵液放置于离心管中在3000～5000r/min条件下离心10～30min，离心管内得到的沉淀即为含有胸苷磷酸化酶的短乳杆菌湿菌体。
3、短乳杆菌产胸苷磷酸化酶能力的测定方法
步骤1，标准酶反应混合液：25mmol/L的胸苷，1mmol/L的EDTA，pH值为7.3、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液；
步骤2，用锥形瓶装5～10ml的标准酶反应液，按照5％(体积分数)的湿菌体量加入短乳杆菌；
步骤3，将加入湿菌体的反应液在恒温水浴振荡器中反应，反应条件为57℃水浴下反应3h，反应结束后，将反应液在沸水中煮沸3～5min终止反应；
步骤4，终止反应后将反应液转入离心管中，在4000～5000r/min离心沉淀。取上清液用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
步骤5，将稀释好的上清液用紫外分光光度计在290nm处测定吸光值OD290nm的增值△OD290nm＝OD290nm反应液—OD290nm空白液。空白液与反应液的处理过程完全相同只是不添加菌液，最后同样用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
TPase酶活单位定义为：在上述条件下，1min内OD290nm变化0.01所需要的湿菌体量定义为一个酶活力单位；
本实验中测定的湿菌体中胸苷磷酸化酶其TPase活力为0.453～0.489U/mg湿菌体，而未筛选优化前仅为0.150～0.162U/mg湿菌体。
实施例一的作用与效果
本实施例中的实验结果表明，使用本发明公开的一种发酵培养基和发酵方法，使得短乳杆菌良好生长的前提下能够高产胸苷磷酸化酶，通过发酵使短乳杆菌生产胸苷磷酸化酶，其中胸苷磷酸化酶的酶活达到0.453～0.489U/mg湿菌体。
实施例二
1、发酵培养基
发酵培养基中包含：浓度为5g/L的NaCl，浓度为10g/L的酵母膏，浓度为10g/L的蛋白胨，浓度为10mmol/L的胸苷，浓度为20g/L的葡萄糖，以及双蒸水。
2、发酵方法
步骤1，将短乳杆菌划线接种到固体斜面培养基(固体斜面培养基的制备：将葡萄糖(20g/L)、酵母膏(10g/L)、NaCl(5g/L)和琼脂(20g/L)按照所需浓度称取好后用双蒸水在搪瓷缸内煮沸溶解，在121℃条件下高压灭菌15min；将灭好菌的培养基按照体积比1/3的比例倒入无菌试管中，在30°的斜面上放置使培养基凝固形成固体斜面培养基。)上培养16～24h，得到含有短乳杆菌的固体斜面培养基；
步骤2，取一定量的酵母膏溶于双蒸水中，调节其pH值在6.0～8.0之间，在121℃条件下灭菌15～20min，得到酵母膏含量在1～10％(质量分数)之间的活化液；
步骤3，在无菌环境下从步骤1中含有短乳杆菌的固体斜面培养基上挑取一环短乳杆菌接种到步骤2得到的活化液中，在30～40℃下活化8～12h，得到含有活化的短乳杆菌菌体的液体；
步骤4，将步骤3得到的含有活化的短乳杆菌菌体的液体按照接种量1～10％(体积分数)接入经过灭菌的本实施例中的发酵培养基中，并在温度为30～40℃，摇床转速为90～180r/min的条件下，发酵培养8～16h，得到含胸苷磷酸化酶的发酵液；
步骤5，将步骤4中得到的发酵液放置于离心管中在3000～5000r/min条件下离心10～30min，离心管内得到的沉淀即为含有胸苷磷酸化酶的短乳杆菌湿菌体。
3、短乳杆菌产胸苷磷酸化酶能力的测定方法
步骤1，标准酶反应混合液：25mmol/L的胸苷，1mmol/L的EDTA，pH值为7.3、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液；
步骤2，用锥形瓶装5～10ml的标准酶反应液，按3％(体积分数)的湿菌体量加入短乳杆菌；
步骤3，将加入湿菌体的反应液在恒温水浴振荡器中反应，反应条件为55℃水浴下反应3h，反应结束后，将反应液在沸水中煮沸3～5min终止反应；
步骤4，终止反应后将反应液转入离心管中，在4000～5000r/min离心沉淀。取上清液用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
步骤5，将稀释好的上清液用紫外分光光度计在290nm处测定吸光值OD290nm的增值△OD290nm＝OD290nm反应液—OD290nm空白液。空白液与反应液的处理过程完全相同只是不添加菌液，最后同样用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
TPase酶活单位定义为：在上述条件下，1min内OD290nm变化0.01所需要的湿菌体量定义为一个酶活力单位；
本实验中测定的湿菌体中胸苷磷酸化酶其TPase活力为0.315～0.386U/mg湿 菌体，而未筛选优化前仅为0.150～0.162U/mg湿菌体。
实施例二的作用与效果
本实施例中的实验结果表明，使用本发明公开的一种发酵培养基和发酵方法，使得短乳杆菌良好生长的前提下能够高产胸苷磷酸化酶，通过发酵使短乳杆菌生产胸苷磷酸化酶，其中胸苷磷酸化酶的酶活达到0.315～0.386U/mg湿菌体。
实施例三
1、发酵培养基
发酵培养基中包含：浓度为10g/L的NaCl，浓度为20g/L的酵母膏，浓度为15g/L的蛋白胨，浓度为20mmol/L的胸苷，浓度为25g/L的葡萄糖，以及双蒸水。
2、发酵方法
步骤1，将短乳杆菌划线接种到固体斜面培养基(固体斜面培养基的制备：将葡萄糖(20g/L)、酵母膏(10g/L)、NaCl(5g/L)和琼脂(20g/L)按照所需浓度称取好后用双蒸水在搪瓷缸内煮沸溶解，在121℃条件下高压灭菌15min；将灭好菌的培养基按照体积比1/3的比例倒入无菌试管中，在30°的斜面上放置使培养基凝固形成固体斜面培养基。)上培养16～24h，得到含有短乳杆菌的固体斜面培养基；
步骤2，取一定量的酵母膏溶于双蒸水中，调节其pH值在6.0～8.0之间，在121℃条件下灭菌15～20min，得到酵母膏含量在1～10％(质量分数)之间的活化液；
步骤3，在无菌环境下从步骤1中的含有短乳杆菌的固体斜面培养基上挑取一环短乳杆菌接种到步骤2得到的活化液中，在30～40℃下活化8～12h，得到含有活化的短乳杆菌菌体的液体；
步骤4，将步骤3得到的含有活化的短乳杆菌菌体的液体按照接种量1～10％(体积分数)接入经过灭菌的本实施例中的发酵培养基中，并在温度为30～40℃，摇床转速为90～180r/min的条件下，发酵培养8～16h，得到含胸苷磷酸化酶的发酵液；
步骤5，将步骤4中得到的发酵液放置于离心管中在3000～5000r/min条件下离心10～30min，离心管内得到的沉淀即为含有胸苷磷酸化酶的短乳杆菌湿菌体。
3、短乳杆菌产胸苷磷酸化酶能力的测定方法
步骤1，标准酶反应混合液：25mmol/L的胸苷，1mmol/L的EDTA，pH值为7.3、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液；
步骤2，用锥形瓶装5～10ml的标准酶反应液，按照10％(体积分数)的湿菌体量加入短乳杆菌；
步骤3，将加入湿菌体的反应液在恒温水浴振荡器中反应，反应条件为60℃水浴下反应3h，反应结束后，将反应液在沸水中煮沸3～5min终止反应；
步骤4，终止反应后将反应液转入离心管中，在4000～5000r/min离心沉淀。取上清液用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
步骤5，将稀释好的上清液用紫外分光光度计在290nm处测定吸光值OD290nm的增值△OD290nm＝OD290nm反应液—OD290nm空白液。空白液与反应液的处理过程完全相同只是不添加菌液，最后同样用pH值为12的NaOH溶液稀释100倍；
TPase酶活单位定义为：在上述条件下，1min内OD290nm变化0.01所需要的湿菌体量定义为一个酶活力单位；
本实验中测定的湿菌体中胸苷磷酸化酶其TPase活力为0.384～0.422U/mg湿菌体，而未筛选优化前仅为0.150～0.162U/mg湿菌体。
实施例三的作用与效果
本实施例中的实验结果表明，使用本发明公开的一种发酵培养基和发酵方法，使得短乳杆菌良好生长的前提下能够高产胸苷磷酸化酶，通过发酵使短乳杆菌生产胸苷磷酸化酶，其中胸苷磷酸化酶的酶活达到0.384～0.422U/mg湿菌体。
Claims (2)
1.一种利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，按照葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、NaCl5g/L和琼脂20g/L的浓度制备固体斜面培养基，将短乳杆菌划线接种到所述固体斜面培养基上培养16～24h，得到含有短乳杆菌的固体斜面培养基；
步骤2，取一定量的酵母膏溶于双蒸水中，调节其pH值在6.0～8.0之间，在121℃条件下灭菌15～20min，得到酵母膏质量分数在1～10％之间的活化液；
步骤3，在无菌环境下从所述固体斜面培养基上挑取所述短乳杆菌接种到所述活化液中，在30～40℃下活化8～12h，得到含有活化的短乳杆菌菌体的液体；
步骤4，将所述含有活化的短乳杆菌菌体的液体按照体积分数为1～10％的接种量接入经过灭菌的发酵培养基中，在温度为30～40℃，摇床转速为90～180r/min的条件下，发酵培养8～16h，得到含胸苷磷酸化酶的发酵液，
其中，所述发酵培养基包含：浓度在5～10g/L范围内的NaCl，浓度在20～30g/L范围内的葡萄糖，浓度在10～20g/L范围内的酵母膏，浓度在10～20g/L范围内的蛋白胨，浓度在10～20mmol/L范围内的胸苷，以及双蒸水；
步骤5，将所述发酵液放置于离心管中，在3000～5000r/min条件下离心10～30min，离心管内得到的沉淀即为含有胸苷磷酸化酶的短乳杆菌湿菌体。
2.根据权利要求1所述的利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法，其特征在于：
其中，在所述含有胸苷磷酸化酶的短乳杆菌湿菌体中所述胸磷酸化酶的酶活在0.30～0.50U/mg湿菌体。
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