CN102174618A - 用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法 - Google Patents

用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法 Download PDF

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邱蔚然
曹静
李喻
周长林
邱志云
陆长德
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JIANGSU QIUZHIYOU NUCLEIC ACID DRUG ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种应用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法，包括如下步骤：(1)培养乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo.0472；(2)然后将步骤(1)获得的菌体加入底物溶液，所述底物溶液中，含有脱氧核糖受体、脱氧核糖供体和磷酸缓冲液，反应，然后从反应产物中收集2’-脱氧鸟苷。本发明使用乙酰短杆菌QD96的酶合成2’-脱氧鸟苷，可低成本，高收率地获得2’-脱氧鸟苷，其转化率可达60％以上。

Description

用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法
技术领域
本发明涉及合成2’-脱氧鸟苷的方法。
背景技术
2’-脱氧鸟苷是合成寡脱氧核苷酸等抗病毒、抗肿瘤核酸药物的重要原料。核苷类衍生物的传统制造方法大多采用化学合成法，此法的缺点是化学合成步骤多，难度高，周期长且有异构体产生。例如要对天然核苷进行化学修饰，往往需要先对碱基或核糖活性基团进行保护，反应结束后还要去除保护基团，这样合成反应的总收率将会降低。用化学法直接将碱基与核糖缩合，会形成α异构体，要获得与天然相同的β-化合物，往往需要复杂的分离方法，而且收率较低。化学合成要用到多种易燃易爆、有毒有害的有机溶剂，对环境的污染和对人身的伤害不容忽视。
因此，近年来人们一直致力于生物酶法合成核苷及其类似物。酶法合成核苷药物，不需要保护基团，具有较高催化效率和立体特异性，通常酶法生产的核苷均为β-结构。特别是嘌呤类核苷的化学合成远比嘧啶类核苷复杂和困难。所述2’-脱氧鸟苷亦可以DNA为原料，用核酸酶水解生成脱氧核苷酸，然后再用磷酸单酯酶水解，使其生成脱氧核苷，然后从中分离出2′-脱氧尿苷。此方法成本高，而且DNA来源有限，大量生产会受到限制。
JPll-137290文献报道，日本横关键三等应用肺炎克雷伯氏菌(Klebsillapneumoniae IFO3321)核苷磷酸化酶的生产方法，但2’-脱氧鸟苷转化率仅为28％。他在Molecular Catalysis B：Enzymatic，2000(10)文献报道，使用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenesAJ-11125)为酶源，以2’-脱氧尿苷和鸟苷为底物，2’-脱氧鸟苷转化率仅为18％。其它亦有用胸苷和2、6-二氨基嘌呤生成2、6-二氨基2’-脱氧核苷，再用腺苷脱氨酶处理得到2’-脱氧鸟苷的方法，但路线太长，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法，包括如下步骤：
(1)将乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo.0472接入培养基进行培养，培养获得的菌体作为核苷酸磷酸化酶备用；
所述培养基为常规的，其组分和重量含量包括：牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 0.5％，pH为7.0；
(2)然后将步骤(1)获得的菌体加入底物溶液，所述底物溶液中，脱氧核糖受体的含量为5～40mol/L，脱氧核糖供体浓度为5～40mol/L，磷酸缓冲液浓度为10～50mmol/L，菌体的湿重加入重量为1～5％，40～65℃反应1～4h，离心，获得溶液含有2’-脱氧鸟苷的溶液，溶液经HPLC检测，2’-脱氧鸟苷的转化率达60％，然后从反应产物中收集2’-脱氧鸟苷；
所述的脱氧核糖受体选自鸟嘌呤、鸟苷或鸟苷酸，但由于鸟嘌呤在水中溶解度较低，其中以鸟苷酸为最佳；
所述的脱氧核糖供体选自2’-脱氧核糖、2’-脱氧核糖-1-磷酸，胸苷、2’-脱氧尿苷或2’-脱氧胞苷等，但从目前原料来源难易和价格因素考虑，选择胸苷、2’-脱氧尿苷或脱氧核糖较好。
所述的乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)QD96，在已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会。保藏号为CGMCCNo.0472，保藏日期为2000年7月5日，在中国专利ZL 00125112.0中，该菌种的有关信息，已经进行了充分的描述，本发明不再赘述。
HPLC检测条件：
色谱柱：ODS2-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：50mmol/LKH2PO4(用H3PO4调pH5.5)和10％甲醇。V(KH2PO4)∶V(甲醇)＝9∶1。
流速：1.0ml/min
检测波长：260nm
进样量：20μl
柱温：25℃。
本发明使用乙酰短杆菌QD96的酶合成2’-脱氧鸟苷，可低成本，高收率地获得2’-脱氧鸟苷，其转化率可达60％以上。
附图说明
图1为脱氧鸟苷反应六种标准品HPLC图谱。
图2为实施例1的脱氧鸟苷反应液1的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1
在250ml三角瓶中装入50ml培养基，其中，含牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 0.5％，pH 7.0，于118℃灭菌30min，冷却后接入乙酰短杆菌QD96，于30℃振荡(200r/min)培养16h，将培养液经4000r/min冷冻离心30min，再用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤，再离心，所得之菌体冷藏保存，作为核苷酸磷酸化酶备用。
在100ml圆底烧瓶中，装入50ml底物溶液，其中含鸟苷酸和胸苷浓度各为40mol/L，磷酸缓冲液为25mmol/L，菌体加入量为5％(湿重)，在恒温水浴中60℃搅拌反应2h，反应完毕，冷冻离心去除菌体和少量胸腺嘧啶沉淀物。然后将溶液经HPLC检测其中含24mmol/L脱氧鸟苷，其转化率达60％(见图2)。经阴离子交换树脂分离，可获得0.26g脱氧鸟苷。
其中，阴离子交换树脂分离的方法，为公知的方法，在中国专利ZL98110601.3，ZL0213639.2等中已经有详细的报道。
实施例2
在100ml圆底烧瓶中装入50ml底物溶液，其中含鸟苷酸和2’-脱氧尿苷浓度各为40mmol/L，磷酸缓冲液为25mmol/L，菌体加入量为5％(湿重)，以后操作同实施例1。将反应后溶液经HPLC检测，其中含26mmol/L脱氧鸟苷，其转化率65％。

Claims (4)

1.用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo.0472；
(2)然后将步骤(1)获得的菌体加入底物溶液，所述底物溶液中，含有脱氧核糖受体、脱氧核糖供体和磷酸缓冲液，反应，然后从反应产物中收集2’-脱氧鸟苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脱氧核糖受体选自鸟嘌呤、鸟苷或鸟苷酸，所述的脱氧核糖供体选自2’-脱氧核糖、2’-脱氧核糖-1-磷酸，胸苷、2’-脱氧尿苷或2’-脱氧胞苷。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脱氧核糖受体为鸟苷酸，所述的脱氧核糖供体为胸苷、2’-脱氧尿苷或脱氧核糖。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述底物溶液中，脱氧核糖受体的含量为5～40mol/L，脱氧核糖供体浓度为5～40mol/L，磷酸缓冲液浓度为10～50mmol/L，菌体的湿重加入重量为1～5％，40～65℃反应1～4h。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103305487A (zh) * 2012-11-20 2013-09-18 上海理工大学 一种发酵培养基及用该培养基发酵生产胸苷磷酸化酶的方法
CN104830930A (zh) * 2015-03-30 2015-08-12 乐山市瑞和祥生物制药有限公司 一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1285411A (zh) * 2000-09-12 2001-02-28 华东理工大学 一种乙酰短杆菌及以该菌种为酶源制备5－氟尿苷的方法
US6197552B1 (en) * 1997-11-14 2001-03-06 Ajinomoto Co., Inc. Process for preparing 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside and 2′-deoxyguanosine
CN1670207A (zh) * 2005-03-04 2005-09-21 上海秋之友生物科技有限公司 固定化核苷磷酸化酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197552B1 (en) * 1997-11-14 2001-03-06 Ajinomoto Co., Inc. Process for preparing 2,6-diaminopurine-2′-deoxyriboside and 2′-deoxyguanosine
CN1285411A (zh) * 2000-09-12 2001-02-28 华东理工大学 一种乙酰短杆菌及以该菌种为酶源制备5－氟尿苷的方法
CN1670207A (zh) * 2005-03-04 2005-09-21 上海秋之友生物科技有限公司 固定化核苷磷酸化酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《工业微生物》 20060331 洪云海 应用乙酰短杆菌酶法合成2'-脱氧腺苷 第36卷, 第1期 *
洪云海: "应用乙酰短杆菌酶法合成2’-脱氧腺苷", 《工业微生物》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103305487A (zh) * 2012-11-20 2013-09-18 上海理工大学 一种发酵培养基及用该培养基发酵生产胸苷磷酸化酶的方法
CN103305487B (zh) * 2012-11-20 2014-11-05 上海理工大学 一种利用短乳杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法
CN104830930A (zh) * 2015-03-30 2015-08-12 乐山市瑞和祥生物制药有限公司 一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法
CN104830930B (zh) * 2015-03-30 2018-07-27 乐山市瑞和祥生物制药有限公司 一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法

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