CN102216465B

CN102216465B - 生物催化法制备核苷

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Publication number: CN102216465B
Application number: CN200880131956.8A
Authority: CN
Inventors: 丹尼尔·芬斯赫·维瑟; 格雷戈里·埃内斯特·罗伯特·戈东; 弗里塔·亨尼西; 科纳纳尼·尤斯蒂奇·拉沙穆塞; 迪恩·布拉迪; 莫伊拉·莱安内·博德; 莫琳·伊丽莎白·劳
Original assignee: Council for Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council for Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2008-11-14
Filing date: 2008-11-17
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2028-11-17
Also published as: EP2356246A1; ZA201102945B; BRPI0823217A2; EP2356246B1; CN102216465A; WO2010055369A1

Abstract

一种操作核苷的方法，其包括通过生物催化的转糖基作用将鸟苷转换成5-甲基尿苷。生物催化剂包含以下的组合：来自耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)之嘌呤核苷磷酸化酶——具有序列ID NO.1的PNPase(BH1531)或与其具有至少90％序列相似性的蛋白质，以及嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)。

Description

生物催化法制备核苷

本发明涉及核苷。特别地，其涉及操作核苷的方法、催化酶以及用于该方法中的生物催化剂。

经修饰的核苷和核苷酸可用作抗病毒治疗剂或者此类药剂的前体。这类重要核苷的一个实例是β-胸苷。β-胸苷可以由5-甲基尿苷得到，但是，5-甲基尿苷是相对昂贵的中间产物，以致由其生产抗逆转录病毒药物AZT和司他夫定(stavudine)的成本相应提高。因此，本发明的一个目的是提供可以更节省成本的方式生产5-甲基尿苷的方法。

根据本发明的第一方面，提供了操作核苷的方法，其包括利用生物催化剂通过生物催化的转糖基作用将鸟苷转换成5-甲基尿苷，所述生物催化剂包含以下组合：来自耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)之嘌呤核苷磷酸化酶——具有序列ID NO.1的PNPase(BH1531)或与其具有至少90％序列相似性的蛋白质，以及嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)。

在本发明的一个实施方案中，嘧啶核苷磷酸化酶可来自大肠杆菌(Escherichia coli)，特别是具有序列ID No.2的大肠杆菌UPase，或者与其具有至少90％序列相似性的蛋白质。

在本发明的另一实施方案中，嘧啶核苷磷酸化酶可来自耐盐芽孢杆菌，特别是具有序列ID No.3的耐盐芽孢杆菌PyNPase(BH1533)，或者与其具有至少90％序列相似性的蛋白质。

因此，所述转换涉及将核糖-1-磷酸从鸟苷转移至第一含氮碱基，从而得到5-甲基尿苷和第二含氮碱基。一般来讲，生物催化的转糖基反应通过在磷酸根离子存在下将核糖-1-磷酸从核苷转移至嘌呤或者嘧啶碱基而发生。所述第一含氮碱基通常可以是胸腺嘧啶，而所述第二含氮碱基通常可以是鸟嘌呤。

因此，所述生物催化剂是以下的组合：具有序列ID NO.1的嘌呤核苷磷酸化酶PNPase(相关核苷酸序列如序列ID No.4所示)——耐盐芽孢杆菌PNPase(BH1531)或与其具有至少90％序列相似性的蛋白质，以及具有序列ID No.2的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)(相关核苷酸序列如序列ID No.5所示)——大肠杆菌尿苷磷酸化酶(UPase)或具有序列ID No.3的耐盐芽孢杆菌BH1533(相关核苷酸序列如序列ID No.6所示)或者与这二者之一具有至少90％序列相似性的蛋白质。

所述酶可以分离并且在大肠杆菌蛋白质表达系统中过表达。

所述耐盐芽孢杆菌可以是革兰氏阳性耐盐芽孢杆菌Alk36细菌的菌株，其于2005年11月23日保藏于Ferguson Building，Craibstone Estate，Buchsburn，Aberdeen AB219YA的NCIMB Ltd，登记号为NCIMB41348。由于耐盐芽孢杆菌Alk36和耐盐芽孢杆菌C-125基因组之间高度的序列同一性，因此根据日本DNA Data Bank(http://www.ddbj.nig.ac.jp)公开的耐盐芽孢杆菌C-125基因组序列设计克隆嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶基因的引物。标注为BH1531和BH1533的基因(根据GenBank)分别编码嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶。

嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶可以在合适的宿主生物(例如大肠杆菌)中异源表达。例如，可以分别在大肠杆菌BL21(DE3)[pMS1531]和大肠杆菌BL21(DE3)[pETUP]中表达PNPase和UPase。生产可以通过分批、分批补料或连续模式发酵培养宿主生物来实现。

一般来讲，生物催化剂可以是经纯化的酶、活性细胞裂解物、细胞糊(cell paste)、全细胞或者其固定化形式。

在一个实施方案中，生物催化剂可以采用游离的悬液形式。但是，在另一实施方案中，生物催化剂可以固定在骨架上。因此，生物催化剂可以采用如WO 2005/080561中所述的酶结构或颗粒形式，或者采用如ZA2007/09300中所述的乳剂来源之颗粒的形式(其中酶键合至颗粒的网格(lattice))。WO 2005/080561和ZA 2007/09300通过引用并入本文中。这使得在完成转糖基反应后可以对生物催化剂进行回收和循环利用。

转糖基反应可以在30℃至70℃之间进行，优选40℃至70℃之间，更优选55℃至65℃之间。

转糖基反应可以在pH 6～11范围内发生，优选pH 7～8.5。可以使用磷酸盐缓冲液作为反应介质进行反应。磷酸盐缓冲液的浓度可以为20～250mM，但优选25～50mM。

进行转糖基反应的反应介质中鸟苷的初始浓度可以为1～19.5％(质量/质量)，优选8～13％(质量/质量)。

反应介质中的第一含氮碱基的初始浓度可以为1～15％(质量/质量)，优选4～6％(质量/质量)。

转糖基反应可以使用2.3∶1至1∶1(优选1∶1至1.15∶1)的第一含氮碱基(胸腺嘧啶)与第一核苷(鸟苷)比率来进行。

5-甲基尿苷的摩尔产率可以为30～90％，通常为80％～90％。

转糖基反应的产量可以为0.5～27g/l/h，但通常为7～11g/l/h。

该方法可包括回收5-甲基尿苷。特别地，该方法可包括利用溶解度差异从第二含氮碱基(鸟嘌呤)中回收或分离5-甲基尿苷。因此，当第二含氮碱基是鸟嘌呤时，在上述温度下，反应介质中的5-甲基尿苷大部分是可溶的，而鸟嘌呤大部分是不可溶的。这有利于其分离。利用该方法，从转糖基反应介质中回收80～90％是可以实现的。再加上5-甲基尿苷80～90％的反应产率，这使得5-甲基尿苷从生物催化反应中的分离产率为64～80％。

对于所述生物催化反应(即转糖基反应)来说，可以首先将磷酸盐缓冲液加入到适宜的反应器皿或容器中，随后向反应器皿中加入鸟苷(优选采用固体颗粒形式)以及额外的磷酸盐缓冲液。胸腺嘧啶可以在转移至反应器皿之前用磷酸盐缓冲液预先润湿。加入到反应器皿中的各种成分构成了转糖基反应的反应介质。磷酸盐缓冲液中的这些底物可以在器皿中加热至上文所列出的反应温度，并且在向反应器皿中加入生物催化剂之前在该反应温度下保持一段时间，通常约2小时。生物催化剂组分(PNPase和PyNPase/UPase)可以在加至反应器皿之前在磷酸盐缓冲液中预先溶解。

该方法可包括用化学方法操作5-甲基尿苷，以由其获得胸苷。通过鸟苷的转换得到5-甲基尿苷后，不需要对其进行任何纯化即可进行化学操作。

5-甲基尿苷的化学操作可包括使5-甲基尿苷在乙腈中与溴化氢或乙酰溴反应，这是获得β-胸苷(C₁₀H₁₄N₂O₅)的第一个步骤。

因此，本发明的方法是可以合成生产β-胸苷的方法。经过所述化学操作步骤后，β-胸苷的最终产率可以为65～80％，通常为70～75％。

根据本发明的第二方面，提供了如下催化酶，其包含来自耐盐芽孢杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶——具有序列ID NO.1的PNPase(BH1531)，或者与其具有至少90％序列相似性的蛋白质。

所述酶可以通过将其在大肠杆菌宿主中过表达而获得。

根据本发明的第三方面，提供了包含如下组合的生物催化剂：嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)和嘌呤核苷磷酸化酶——具有序列ID No.1的耐盐芽孢杆菌PNPase(BH1531)或者与其具有至少90％序列相似性的蛋白质。

如上文所示，在本发明的一个实施方案中，嘧啶核苷磷酸化酶可以来自大肠杆菌，特别是具有序列ID No.2的大肠杆菌UPase，或者与其具有至少90％序列相似性的蛋白质。

在本发明的另一实施方案中，嘧啶核苷磷酸化酶可以来自耐盐芽孢杆菌，特别是具有序列ID No.3的耐盐芽孢杆菌PyNPase(BH1533)，或者与其具有至少90％序列相似性的蛋白质。

以下将参考所附的非限制性实施例、附图和序列表对本发明进行更详细地描述。

附图说明

图1显示实施例3得到的结果，即嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的组合对于产生5-甲基尿苷(5-MU)的相对效率。泳道1：PNP:rUP；泳道2：PNP:BH1533；泳道3：PNP:KP PyNP；泳道4：PNP:BL PyNP；泳道5：XapA:rUP；泳道6：XapA:BH1533；泳道7：XapA:BL PyNP；泳道8：XapA:KP PyNP；泳道9：BH1531:rUP；泳道10：BH1531:BH1533；泳道11：BH1531:BL PyNP；泳道12：BH1531:KP PyNP。

图2显示(实施例4)在大肠杆菌BL21中大肠杆菌尿苷磷酸化酶的过表达，其中泳道1：标记物；泳道2：大肠杆菌BL21[pET20b](阴性对照)；泳道3至8：大肠杆菌BL21[pETUP](多种构建体)。

图3显示(实施例4)在大肠杆菌BL21中耐盐芽孢杆菌BH1531的过表达，其中泳道1：标记物；泳道2：大肠杆菌BL21；泳道3：大肠杆菌BL21[pMS470]；泳道4：大肠杆菌BL21[pMS1531](未经诱导)；泳道5至10：大肠杆菌BL21[pMS1531](多种构建体)(经诱导)。

图4显示pH对鸟苷转换率以及5-甲基尿苷产率的影响(如实施例6中所述)。空心柱显示鸟苷转换率(Conv.)。阴影柱显示5-甲基尿苷产率。标准方差代表3次实验的平均值。

图5显示温度对鸟苷转换率和5-甲基尿苷产率的影响(如实施例7中所述)。符号◆代表40℃时鸟苷的转换率；△代表40℃时5-甲基尿苷的产率；▲代表50℃时鸟苷的转换率；■代表50℃时5-甲基尿苷的产率；*代表60℃时鸟苷的转换率；●代表60℃时5-甲基尿苷的产率；○代表70℃时鸟苷的转换率；□代表70℃时5-甲基尿苷的产率。

图6显示底物浓度递增时生物催化反应的产率和产量(如实施例8中所述)。符号▲代表5-甲基尿苷的反应器产量；◆代表鸟苷的转换率；■代表5-甲基尿苷的产率。

图7显示随着时间所得到的转糖基反应回收百分比和产量(以1升的规模)，见实施例9。符号▲代表5-甲基尿苷的反应器产量；◆代表鸟苷转换率；■代表5-甲基尿苷的产率。

图8显示3次重复实验中随着反应时间鸟苷的转换率(以20升的规模)(如实施例9中所述)。符号▲代表鸟苷转换率1；◆代表鸟苷转换率2；■代表鸟苷转换率3。

图9显示3次重复实验中随着反应时间5-甲基尿苷的产率(以20升的规模)(如实施例9中所述)。符号▲代表5-甲基尿苷产率1；◆代表5-甲基尿苷产率2；■代表5-甲基尿苷产率3。

图10显示3次重复实验中随着反应时间5-甲基尿苷的反应器产量(以20升的规模)(如实施例9中所述)。符号▲代表5-甲基尿苷反应器产量1；◆代表5-甲基尿苷反应器产量2；■代表5-甲基尿苷反应器产量3。

序列列表

序列ID No.1：耐盐芽孢杆菌BH1531的氨基酸序列

序列ID No.2：大肠杆菌UPase的氨基酸序列

序列ID No.3：耐盐芽孢杆菌BH1533的氨基酸序列

序列ID No.4：耐盐芽孢杆菌BH1531基因的核苷酸序列，其编码序列IDNo.1的蛋白质序列

序列ID No.5：大肠杆菌UPase基因的核苷酸序列，其编码蛋白质序列IDNo.2的大肠杆菌UPase酶。

序列ID No.6：耐盐芽孢杆菌BH1533基因的核苷酸序列，其编码序列IDNo.3的蛋白质序列

在下面的实施例中，对于生物催化反应来说，首先将磷酸盐缓冲液加入适当的反应器中，随后加入固体颗粒状鸟苷和额外的缓冲液。在胸腺嘧啶被转移至反应器皿之前用磷酸盐缓冲液预先润湿。在加入生物催化剂之前，将磷酸盐缓冲液中的这些底物在反应器中在最终反应温度下加热2小时。生物催化剂(PNPase和PyNPase)在被加至反应器皿之前在磷酸盐缓冲液中预先溶解。

实施例1

利用市售的酶生产胸苷(司他夫定和AZT的前体)(以脱氧鸟苷和脱氧次黄嘌呤核苷作为供体)，并且可以通过加入黄嘌呤氧化酶来调整反应平衡。

PNPase(来自纤维单胞菌属物种(Cellumonas sp.))、胸苷磷酸化酶(TPase)和黄嘌呤氧化酶(XO)购自Sigma-Aldrich(Pty)Ltd.。核苷也购自Sigma-Aldrich(Pty)Ltd.。

在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中制备3ml反应物。将各种核苷和酶于25℃振摇孵育1～3小时。在设定的时间点取样，并用HPLC进行分析。除非另外指明，将所有核苷储液均制备成50mM浓度，其在反应中的终浓度为2.5mM。

利用Chromolith speed rod 18e Column以及由5％甲醇和95％的0.1％磷酸钠缓冲液(pH 7.5)组成的洗脱液进行HPLC分析。所使用的流速为0.5ml/min。利用二极管阵列分光光度计在260nm处检测核苷和碱基。结果示于表1中。

表1：所得反应结果的总结

¹-显示目的产物

反应1和反应2证实，当使用TPase时可以发生正向和逆向嘧啶反应。反应3和反应4证实，当使用XO和PNPase时可以发生正向和逆向嘌呤反应。

本发明人的目的是从鸟苷转移核糖基团至胸腺嘧啶(即从嘌呤到嘧啶)，产生5-甲基尿苷(反应5和6)。由于没有产生5-甲基尿苷，因此这些反应是不成功的。反应5至9显示，由于不产生5-甲基尿苷，因此使用市售的酶不容易实现所述反应。

尝试了另一种嘌呤，以胸腺嘧啶和肌苷作为试剂来生产5-甲基尿苷，其中肌苷提供了核糖-1-磷酸，将次黄嘌呤转换成尿酸以阻止逆向反应的发生(反应10)。成功地进行了从5-甲基尿苷到胸腺嘧啶和核糖-1-磷酸的逆向反应(反应11)。

改变在使用2’-脱氧肌苷形成胸苷中所使用的缓冲液条件使得胸苷的相对比例增加。减少存在的磷酸盐的量或者在反应中使用Tris缓冲液使得反应平衡从形成胸腺嘧啶和2’-脱氧核糖-1-磷酸向形成胸苷移动，这与胸苷降解成胸腺嘧啶同时释放磷酸基团的方向相反(反应12至15)。

因此，使用PNPase和TPase市售酶的组合，不可能用核糖-1-磷酸实现转糖基反应。基于此，本发明人决定从其它来源分离核苷磷酸化酶。

实施例2

大肠杆菌和耐盐芽孢杆菌的生物质通过于37℃在LB液体培养基中培养每种生物而获得。通过超声作用破碎该生物质，并通过离心(13000×g)从细胞碎片中分离胞质级分。该胞质级分用作每种生物的粗提取物。

在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中制备3ml反应物。将各种核苷、酶和粗提取物制备物于25℃振摇孵育1～16小时。在设定的时间点取样，并用HPLC进行分析。将所有核苷储液均制备成50mM浓度，其在反应中的终浓度为2.5mM。

使用Chromolith speed rod 18e Column以及由5％甲醇和95％的0.1％磷酸钠缓冲液(pH 7.5)组成的洗脱液进行HPLC分析。所使用的流速是0.5ml/min。利用二极管阵列分光光度计在260nm处检测核苷和碱基。

通过使用经部分纯化的大肠杆菌或耐盐芽孢杆菌细胞提取物(其中包含固有的PNPase和PyNPase活性)，可以产生胸苷和5-甲基尿苷。大肠杆菌和耐盐芽孢杆菌粗提取物显示均能够利用肌苷或鸟苷作为核糖-1-磷酸之供体产生5-甲基尿苷。反应产率总结于表2中。

表2：利用核苷酶进行的核苷转糖基反应

实施例3

对多种酶及其组合通过转糖基反应产生5-甲基尿苷的能力进行了测试，所测试的酶包括：

嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)

·重组大肠杆菌PNP(PNP)

·重组大肠杆菌黄嘌呤核苷磷酸化酶(XapA)

·重组耐盐芽孢杆菌PNP(BH1531)

嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)

·重组大肠杆菌尿苷磷酸化酶(rUP)

·天然耐盐芽孢杆菌PyNPase(BH1533)

·天然肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)PyNPase(KP PyNP)

·天然地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PyNPase(BL PyNP)

每个反应中酶的总浓度保持在0.004U/ml。酶溶液和测定试剂(100μl，在50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中含有5mM鸟苷和5mM胸腺嘧啶)等分至96孔微量滴定板中。将该微量滴定板于40℃以900rpm振摇孵育1小时。通过TLC对反应进行分析(5μl点样，85∶15氯仿∶甲醇流动相，10cm UV₂₅₄硅胶板)。结果显示于图1中。

在图1中，当比较嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的组合时，很明显，PNP:rUP(泳道1)和BH1531:rUP(泳道9)组合在40℃合成了最多的5-甲基尿苷。XapA对于产生5-甲基尿苷几乎没有作用。类似地，与来自肺炎克雷伯氏菌和地衣芽孢杆菌的酶相比，来自大肠杆菌的PyNPase(rUP)和来自耐盐芽孢杆菌的PyNPase(BH1533)似乎是极佳的生物催化剂。

实施例4

来自大肠杆菌和耐盐芽孢杆菌之核苷磷酸化酶的表达和纯化

基因组DNA的分离

将大肠杆菌XL1 blue在10ml培养体积中培养过夜。对其中的1.5ml等份进行离心，并利用Qiagen DNeasy plant mini kit(Qiagen)用标准方案分离基因组DNA。耐盐芽孢杆菌基因组DNA也用类似的方法分离。所述耐盐芽孢杆菌是革兰氏阳性耐盐芽孢杆菌Alk36细菌的菌株，其保藏号为NCIMB43148。

PCR扩增

基于已公开的序列(Esipov等人，2002)设计了扩增来自大肠杆菌之UPase、PNPase、XapA和TPase基因的寡核苷酸。由于耐盐芽孢杆菌Alk36和耐盐芽孢杆菌C-125基因组之间高度的序列同一性，因此根据耐盐芽孢杆菌C-125的基因组序列(GenBank登记号BA000004)设计了克隆嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶基因的引物。所述嘌呤核苷磷酸化酶基因标注为BH1531和BH1532，所述嘧啶核苷磷酸化酶基因标注为BH1533。使用基因组DNA作为模板并使用高保真扩增试剂盒(Roche)进行PCR。同样地，按照标准方案进行实验。PCR循环参数如下：95℃5分钟；继而95℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟进行30个循环。所得产物维持在4℃，直至利用0.8％琼脂糖凝胶进行分析。

PCR成功地扩增了BH1531和大肠杆菌UPase的编码区(分别是序列ID No.4，序列ID No.5)，相关氨基酸序列分别如序列ID No.1和序列ID No.2所示。

核苷磷酸化酶基因的克隆

利用标准方案将PCR产物连接到pGEM-T easy(Promega)中。使用不同的限制性酶切出编码目的基因的片段(表3)，并将其连接到经限制性酶切的pET20b(Novagen)中。通过测序验证所得质粒。利用电穿孔将正确的构建体转化到大肠杆菌BL21中，用于随后的表达分析。

表3：制备表达不同核苷磷酸化酶之构建体的克隆策略

基因	生物	克隆名称	限制性酶
				Up	大肠杆菌	pETUP	NdeI，SalI
BH1531	耐盐芽孢杆菌	pMS-1531	NdeI，HindIII

核苷磷酸化酶的表达

将表达BH1531或UPase的大肠杆菌BL21单克隆接种于含有100μg/ml氨苄青霉素(终浓度)的5ml LB液体培养基中。

该培养物于37℃振动培养过夜。将1ml培养物以1∶100稀释于新鲜的LB液体培养基中。该新鲜培养物于37℃生长至OD₆₀₀达到0.4。用1mMIPTG(终浓度)诱导核苷磷酸化酶表达3～14小时(图2和3)。

核苷磷酸化酶的生产和制备

将800ml接种物接种到含有GMO 20培养基的分批发酵罐(BraunBiostat C)中。所述GMO 20培养基的组成如下：K₂HPO₄，14.6g/l；(NH₄)₂SO₄，2g/l；Na₂HPO₄，3.6g/l；柠檬酸，2.5g/l；MgSO₄，1.2g/l；NH₄NO₃，5g/l和酵母提取物，20g/l。

将30.0g/l葡萄糖和5ml/l微量元素溶液分别灭菌，并在接种前加入发酵罐中。所述微量元素溶液由如下组成：CaCl₂·2H₂O，0.4g/l；FeCl₃·6H₂O，16.7g/l；MnCl₂·4H₂O，0.15g/l；ZnSO₄·7H₂O，0.18g/l；CuCl₂·2H₂O，0.125g/l；CoCl₂·6H₂O，0.18g/l；Na₂EDTA，20.1g/l。

将氨素苄青霉(100mg/ml经过滤灭菌的储液)加入到培养基中，使其终浓度为100μg/ml。

根据需要，在无菌条件下将消泡剂加入到发酵培养基中。

用33％(质量/体积)的NH₄OH和20％(质量/体积)的H₂SO₄使发酵的pH值维持在pH 7.2。

使温度维持在37℃，并将通风设置为1v/v/min。初始搅动设为300rpm并逐渐加快(自动复叠)，以控制pO₂饱和度在30％以上。随后以1小时为间隔取10ml样品测定生长、酶活性和葡萄糖利用度。当OD₆₆₀达到7～8个OD单位时，加入IPTG至终浓度为0.5mM以诱导酶的表达。诱导4小时后收集液体培养基(20升)并冷却至4℃。通过连续离心(Beckman Avante，JCF-Z转子，14000×g)从上清液中分离生物质。所得的沉淀用2升50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)重悬，并用ConstantSystems Cell Disruptor破碎细胞(20kpsi下破碎2次)。通过离心(Beckman Avante，JA-10转子，14000×g)除去细胞碎片。所得的蛋白质溶液在2％(质量/体积)麦芽糖、1％PEG 8000(抗冻剂)存在下冻干处理。利用Vertis Genesis 25I进行的冻干过程如下：-35℃，10小时；5小时内升至-5℃；保持在-5℃，5小时；20小时内升至15℃；保持在15℃，直至干燥。

实施例5

利用耐盐芽孢杆菌PNPase和大肠杆菌PyNPase生产5-甲基尿苷

将鸟苷(0.030g，0.106mmol和1.5％(质量/质量))、胸腺嘧啶(0.031g，0.246mmol和1.55％(质量/质量))和磷酸钠缓冲液(50mM，0.6％(质量/质量)，pH 7.5～8.0，约1.8ml)注入样品瓶(～5ml)中。使用磷酸盐缓冲液制备PNPase和PyNPase酶的储液，并加入所需等份的PNPase(约30～200μl)和PyNPase(约30～200μl)。以如下加样量加入酶：PNPase 0.27U和PyNPase 0.27U，使PNPase/PyNPase酶比率维持在1∶1。使用搅拌棒搅拌反应混合物，并加热至所需温度(40℃)。反应通常进行24小时以上，然后使用氢氧化钠溶液(NaOH 10M)进行后处理(work up)。随后通过HPLC对反应混合物中的鸟苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和5-甲基尿苷进行定量分析。所获得的典型结果显示，在上述条件下实现了＞90％的鸟苷转化率以及约80％的5-甲基尿苷产率。

实施例6

pH对由耐盐芽孢杆菌PNPase和大肠杆菌PyNPase组合生产5-甲基尿苷的影响

使用与实施例5中描述之条件相似的实验条件，除了改变反应的pH以确定该反应的有效范围以外。为了获得所需的pH，50mM磷酸盐或碳酸盐缓冲液与磷酸氢二钠联合使用。结果示于图4中。

实施例7

温度对由耐盐芽孢杆菌PNPase和大肠杆菌PyNPase组合生产5-甲基尿苷的影响

将鸟苷(15g，0.0530mol和1.5％(质量/质量))、胸腺嘧啶(15.4g，0.122mol和1.54％(质量/质量))和磷酸钠缓冲液(50mM，0.6％(质量/质量)，pH 7.5～8.0，0.969g)注入长颈玻璃反应器(2升)中。利用磷酸盐缓冲液制备PNPase和PyNPase酶的储液，并加入所需等份的PNPase(10～30ml)和PyNPase(10～30ml)。以如下加样量加入酶：PNPase 200U和PyNPase 200U，使PNPase/PyNPase酶比率保持在1∶1。使用搅拌棒搅拌反应混合物，并加热至所需温度(40～70℃)。反应通常进行24小时以上，然后用氢氧化钠溶液(NaOH 10M)进行后处理。随后通过HPLC对反应混合物中的鸟苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和5-甲基尿苷进行定量分析。结果示于图5中。

实施例8

利用耐盐芽孢杆菌PNPase和大肠杆菌PyNPase于60℃在高底物浓度下制备5-甲基尿苷

将鸟苷(17.5g，61.8mmol，12.9％(质量/质量))、胸腺嘧啶(17.4g，138mmol和12.9％(质量/质量))和磷酸缓冲液(101g，50mM，pH7.5～8)注入反应器中。将反应混合物加热至60℃，并用磁性搅拌棒以1000rpm搅拌。接着将所需量的PNPase(204U)和PyNPase(199U)注入反应器中。反应进行24小时以上。在反应过程中5-甲基尿苷的产量为4.5～14g/l/h。24小时后获得鸟苷的转化率(＞90％)、5-甲基尿苷的产率(约90％)以及5-甲基尿苷的产量(约4.5g/l/h)。结果示于图6中。

实施例9

最佳的生物催化反应

将磷酸盐缓冲液(1620g，50mM，pH 7.5～8)加至合适的反应器中，随后加入鸟苷固体(1040.09g，3.67摩尔，8.9％(质量/质量))和额外的986g磷酸盐缓冲液。用50mM磷酸盐缓冲液(2000g，pH 7.5～8)将胸腺嘧啶(535.04g，4.2摩尔，4.8％(质量/质量))预先润湿，并接着将其移至反应器皿中。随后将另外的磷酸盐缓冲液(5794g)加入到反应器中。利用锚式搅拌器以100rpm搅拌反应混合物，并在加入生物催化剂之前加热至60℃并保持2小时。在加热过程中，预先称好所需量的PNPase(3.1119g，16006U)和PyNPase(3.752g，16013U)，并预先溶解于磷酸盐缓冲液(约200g，包括清洗体积)中。反应进行24小时以上，但是以所需的鸟苷转化率(＞90％)和5-甲基尿苷产率(约80～90％)，反应通常在8～12小时内完成。

最佳的生物催化反应在1升(图7)至20升(图8～10)的规模范围进行。重复反应以确定20升反应的再现性和活力(robustness)。这些结果示于图8～10中。

实施例10

5-甲基尿苷的纯化

将反应混合物在高温下(＞90℃)离心，用以回收鸟嘌呤(约90％)，且其纯度约为90％(质量/质量)。接着通过水结晶和水汽提方法对粗制5-甲基尿苷进行回收。随后使粗制5-甲基尿苷残留物干燥，并利用热的异丁醇过滤和结晶方法除去无机盐(磷酸盐)和其它有机物(例如胸腺嘧啶)，以进一步纯化。DSP方法后5-甲基尿苷的回收率约为90％，其纯度＞90％(质量/质量)。

经分离之5-甲基尿苷的总体产率为64～80％。

实施例11

胸苷的合成

3’，5’-二乙酰-2’-溴代胸苷(DABT)的制备

将乙腈(389g)加入到配有温度计、回流冷凝器和滴液漏斗之三颈圆底瓶中的5-甲基尿苷(10.0g，39mmol)中。对该浆体进行加热使其回流，并在30分钟内逐滴加入乙酰溴(27.32g，222mmol，5.7当量)。在加入过程中，固体溶解，形成黄色溶液。将反应物加热额外30分钟，并接着在减压下通过NaOH溶液捕集器和NaOH固体捕集器除去溶剂。残留物在二氯甲烷中进行提取(take up)，并用盐水清洗2次。有机层用MgSO₄(2g)干燥、过滤并除去溶剂，余下的浅褐色残留物是DAT(90％产率)。

3’，5’-二乙酰胸苷(DAT)的制备

将如上制备的DABT溶解于足以得到20％反应浓度的甲醇中。例如，将来自上述反应的16.1g固体溶解于MeOH(64.4g)中并转移至Parr反应器中。加入碳酸氢钠(4.6g，1.5当量)和Ni催化剂A-5000(4.5g，15％(质量/质量)催化剂加样，呈现为50％的浆体)。H₂压力设定为9bar，初始温度设定为35℃。反应是放热的，并在反应最初30分钟内进行冷却。此后反应温度设定为40℃。3h后使反应停止并通过硅藻土(优选硅藻土535)进行过滤，以除去催化剂。除去溶剂，残留物在乙酸乙酯(90ml)中进行提取。在该阶段，从乙酸乙酯溶液中沉淀出白色固体，并通过过滤将其去除。在真空中去除溶剂，余下的浅褐色残留物是DAT(90％产率)。

胸苷的制备

将MeOH(37ml)和NaOMe(1.4g，1.1当量)加至上述制备的DAT中。反应于40℃温热2小时。此后加入额外的MeOH(50ml)并加入Amberlite树脂(IR-120，30g)，在室温下搅拌。过滤除去珠子，并在真空中除去溶剂，余下的白色固体是胸苷(90％产率)。用MeOH进行重结晶使得产生高纯度的产物(＞98％)。

实施例12

从生物催化反应中直接获得的5-甲基尿苷仅经干燥后(不进一步纯化)来合成胸苷

3’，5’-二乙酰-2’-溴代胸苷(DABT)的制备

将乙腈(389g)加入到配有温度计、回流冷凝器和滴液漏斗之三颈圆底瓶中的5-甲基尿苷(80％(质量/质量)纯度，12.5g，39mmol)中。对该浆体进行加热使其回流，并在30分钟内逐滴加入乙酰溴(27.32g，222mmol，5.7当量)。在加入过程中，溶液变为绿色并保持轻微浑浊。将反应物加热额外30分钟，并接着在减压下通过NaOH溶液捕集器和NaOH固体捕集器除去溶剂。残留物在二氯甲烷中进行提取，并用盐水清洗2次。除去溶剂，余下的深棕色残留物是DAT(85％产率)。

3’，5’-二乙酰胸苷(DAT)的制备

将如上制备的DABT溶解于足以得到20％反应浓度的甲醇中并转移至Parr反应器中。加入碳酸氢钠(4.6g，1.5当量)和Ni催化剂A-5000(4.6g，15％(质量/质量)催化剂加样，呈现为50％的浆体)。H₂压力设定为9bar，初始温度设定为35℃。反应是放热的，并在反应最初30分钟内进行冷却。此后反应温度设定为40℃。3小时后使反应停止并通过硅藻土(优选硅藻土535)进行过滤，以除去催化剂。除去溶剂，残留物在乙酸乙酯(90ml)中进行提取并加入MgSO₄(2.5g)。在该阶段，从乙酸乙酯溶液中沉淀出白色固体，并通过过滤将其除去。在真空中除去溶剂，余下的深棕色残留物是DAT(71％产率)。

胸苷的制备

将MeOH(37ml)和NaOMe(1.4g，1.1当量)加入到如上制备的DAT中。反应于40℃温热2小时。此后加入额外的MeOH(50ml)并加入Amberlite树脂(IR-120，30g)，在室温下搅拌。过滤除去珠子，并在真空中除去溶剂，余下的白色固体是胸苷(91％产率)。用MeOH进行重结晶使得产生高纯度的产物，其熔点为187.8℃。

实施例13

将耐盐芽孢杆菌PNPase和大肠杆菌PyNPase制备物固定(分别固定和共固定)于聚乙烯亚胺骨架颗粒(ZA 2007/09300)上。在每种情形下，将200μl酶制备物(100μl的每种制备物用于共固定)加至200μl骨架(5mg/ml)，并用去离子水补充至1.0ml。溶液在温和搅拌下孵育30分钟。接着用去离子水清洗颗粒3次。经固定的PNPase显示出每毫克颗粒0.26U的活性(1U是在黄嘌呤氧化酶存在下每分钟从肌苷释放1μmol尿酸所需的酶量)，而经固定的PyNPase显示出每毫克颗粒0.055U的活性(1U是在1分钟内从尿苷释放1μmol尿嘧啶所需的酶量)。经共固定的制备物显示PNPase和PyNPase分别具有每毫克颗粒1.13和1.49U的活性。

总结

生物催化剂可以提供高反应速率、高立体选择性和区域选择性。由于具有特异性，因此还可以减少合成中的合成步骤和产物分离(需要分离的副产物较少，无需保护步骤)。在本发明中同时使用多聚体酶PNPase和UPase/PyNPase来合成核苷。

在本发明的生物催化转糖基反应中使用低磷酸盐水平，这使得反应平衡向形成产物的方向而非核糖磷酸盐中间产物的方向移动。

有效的核苷转糖基反应对于生成胸苷和5-甲基尿苷来说十分重要，如上文所指出地，所述胸苷和5-甲基尿苷是生成抗逆转录病毒(ARV)AZT和司他夫定的重要前体。

嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)用于从鸟苷中移除核糖-1-磷酸部分。接着利用嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)将核糖-1-磷酸转移至胸腺嘧啶，从而产生5-甲基尿苷。因此，根据本发明，使用两种酶的生物催化系统高效地实现了核苷转化。根据本发明，同时使用经纯化的酶由廉价的起始材料鸟苷合成5-甲基尿苷。所使用的方法包括利用PNPase将鸟苷酶促切割成不溶性鸟嘌呤和高溶解性核糖-1-磷酸。随后利用UPase将核糖-1-磷酸共价连接至胸腺嘧啶，从而产生5-甲基尿苷。结果显示，由鸟苷产生5-甲基尿苷的产率大于80％，通常约为80～90％的产率。

在生成AZT或司他夫定中，5-甲基尿苷是相对昂贵的中间产物。只有降低该中间产物的成本，降低几种抗逆转录病毒药物的成本才是可行的。使用生物催化剂得到高特异性的催化反应，且生成副产物较少。使用所选的耐盐芽孢杆菌酶使得产率和反应动力学提高。

因此，本发明提供了用于由鸟苷和胸腺嘧啶制备β-胸苷的高产率且快速的化学酶促方法。通过利用嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶进行生物催化反应，将鸟苷和胸腺嘧啶转换为5-甲基尿苷和鸟嘌呤，使得能够以高产率制备中间产物5-甲基尿苷。所述催化酶通过在大肠杆菌宿主中过表达大肠杆菌嘧啶核苷磷酸化酶和耐盐芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶而产生。已显示，在各菌株的分批发酵中，两种生物催化剂均以高产率产生。这两种酶的组合使得在60℃时由鸟苷生成5-甲基尿苷的产率达到80～90％，通常产量为7～11g/l/h。随后在3个步骤中，5-甲基尿苷的化学转换得到高纯度的β-胸苷。

参考文献

Esipov，R.S.，Gurevich，A.I.，Chuvikovsky，D.V.，Chupova，L.A.，Muravyova，T.I.and Miroshnikov，A.I.(2002)Overexpression of Escherichla coli GenesEncoding Nucleoside Phosphorylases in the pET/BI21(DE3)System Yields ActiveRecombinant Enzymes.Protein Expr Purif.24，56-60.

Claims

1.操作核苷的方法，其包括利用生物催化剂通过生物催化的转糖基反应将鸟苷转换成5-甲基尿苷，所述生物催化剂包含如下组合：来自耐盐芽孢杆茵(Bacillus halodurans)之嘌呤核苷磷酸化酶——序列ID NO.1的PNPase(BH1531)，以及来自大肠杆茵(Escherichia coli)的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)，所述嘧啶核苷磷酸化酶为序列ID No.2的UPase。

2.权利要求1的方法，其中所述嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶分别通过大肠杆菌JM109(DE3)[pMS1531]和大肠杆菌BL21(DE3)[pETUP]分批发酵产生。

3.权利要求1的方法，其中所述转糖基反应在30℃至70℃之间的温度下进行。

4.权利要求1的方法，其中所述转糖基反应在pH6至11的范围内进行。

5.权利要求1的方法，其中所述5-甲基尿苷的摩尔产率是80％至90％。

6.权利要求1的方法，其中所述转糖基反应的产量为0.5～27g/l/h。

7.权利要求1的方法，其中所述生物催化剂固定于骨架上。

8.权利要求1的方法，其包括利用化学方法操作5-甲基尿苷，以由其获得β-胸苷。

9.权利要求8的方法，其中所述5-甲基尿苷在通过转换鸟苷而获得后不经任何纯化来对其实施化学操作。

10.权利要求8的方法，其中所述5-甲基尿苷的化学操作包括使5-甲基尿苷在乙腈中与溴化氢或乙酰溴反应。

11.生物催化剂，其包含如下组合：来自大肠杆菌的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)以及来自耐盐芽孢杆菌之嘌呤核苷磷酸化酶——序列IDNO.1的PNPase(BH1531)，所述嘧啶核苷磷酸化酶为序列ID No.2的UPase。