CN115725676A - 一种修饰核苷的酶催化合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种修饰核苷的酶催化合成方法,具体涉及利用胸腺嘧啶核苷磷酸化酶与嘌呤核苷磷酸化酶作为生物催化剂,催化2’‑氟‑2’‑脱氧尿苷(2’F‑dU)与腺嘌呤进行转糖基化反应生成2’‑氟‑2’‑脱氧腺苷,利用生物酶催化合成修饰核苷的方法,相比化学方法大大降低了2’F‑dA的生产成本,消除了副产物处理过程中产生的环境影响。采用双酶催化反应体系,转化效率和最终产率相比化学合成有巨大优势。生产工艺简单,操作方便,是一种环境友好的绿色生物合成工艺。
Description
技术领域
本发明属于酶催化领域,具体涉及一种修饰核苷的酶催化合成方法。
背景技术
嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP),可催化可逆的嘌呤核苷的磷酸解反应。其主要分成两类:低分子量的同源三聚体类(80-100kDa);高分子量的同源六聚体类(110-160kDa)。后一类酶因底物特异性较广,在合成应用中尤为重要,特别是在医药领域有着良好的应用价值和前景。作为单体的核苷类似物已经被广泛应用于癌症和抗病毒治疗。作为抗病毒物质,核苷是通过抑制病毒基因组的复制发挥作用,而作为抗癌化合物则是通过抑制细胞DNA的复制与修复,例如抑制聚合酶活性或者在RNA或DNA合成中充当链终止子。特别是C2’-氟化核苷作为反义寡核苷酸和小干扰RNA的组分效果更好。现有技术中2’-氟-2’-脱氧腺苷是通过各种化学方法制备的,但是修饰核苷的化学合成受限于立体和区域选择性,以及保护和去保护敏感官能团。相比之下,胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase,TP)与嘌呤核苷磷酸化酶可用作生物催化剂,在环境友好条件下有效合成核苷类似物更具有优势,但野生型嘌呤核苷磷酸化酶的活性较低,不够满足生产需求。
公开号为CN101629169A的发明专利申请公开了一种分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法。采用PCR技术从嗜热乳链球菌(Streptococcus thermopHilus)中扩增嘌呤核苷磷酸化酶全长片段,用pET-43.1b(+)质粒构建pET-43.1b(+)-PNP重组载体,用定点突变的方法将片段第230位半胱氨酸突变为丙氨酸,用Escherichia coli BL21(DE3)转化为工程菌,获得的突变酶可提高热稳定性。
公开号为CN103468656A的发明专利申请公开了一种突变的假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷磷酸化酶,与野生型的氨基酸序列相比,所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突变为Tyr,突变酶的最高比活性达到45U/mg。就工业化应用而言,嘌呤核苷磷酸化酶的催化性能仍不能达到需求。
核苷类似物已经被广泛地用于癌症和抗病毒的治疗,但是其昂贵的药物成本阻碍了广泛的生物学研究以及治疗应用。传统的化学合成方法步骤多,耗时长,还需要进行技术难度高的糖基活化以及对糖苷形成的立体和区域选择性控制。因此,能在环境友好的条件下有效合成核苷类似物的生物催化提供了更有吸引力的替代途径,从而使工艺更有效清洁。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足,提供一种修饰核苷的酶催化合成方法。
一种2’-氟-2’-脱氧腺苷的合成方法,包括以下步骤:
1)含有目标酶序列的菌株的构建:将目标酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体进行连接,然后将含有目的基因的载体转载至大肠杆菌中进行发酵培养,通过对菌株的基因序列进行提取和扩增后进行电泳观察结果筛选阳性克隆,获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株;
2)目标酶的表达和提取:将含有目标酶序列的大肠杆菌挑取到培养基中进行培养,然后加入诱导剂进行发酵培养诱导表达,培养结束后将菌液离心收集菌体,将菌体破碎得含酶裂解液,离心后提取上清液,得到目标酶的粗酶溶液;
3)游离酶催化反应:配制腺嘌呤母液和2’-氟-2’-脱氧尿苷母液;向反应体系中依次加入腺嘌呤母液,2’-氟-2’-脱氧尿苷母液,再加入粗酶溶液进行反应制得2’-氟-2’-脱氧腺苷。
其中步骤1)中的目标酶选自胸腺嘧啶核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶。
其中步骤2)中的诱导剂选自IPTG。
其中步骤3)中的反应体系中腺嘌呤与2’-氟-2’-脱氧尿苷的摩尔比为1:1.5。
其中步骤3)中的反应条件为置于将反应体系置于恒温摇床,转速220rpm/min,反应温度为30℃,反应时间为36h。
另一方面,本发明提供一种固定化酶的制备方法,所述的酶选自胸腺嘧啶核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶,包括以下步骤:
i)将氨基树脂用PBS缓冲液清洗后过滤,用PBS溶液配制戊二醛溶液,将氨基树脂与戊二醛混合,随后进行搅拌或振摇,然后过滤并用PBS缓冲液清后过滤获得处理后的氨基树脂;
ii)分别取含PNP的粗酶溶液或TP粗酶溶液,与步骤i)氨基树脂混合,混合后进行振摇;然后过滤收集氨基树脂,用PBS缓冲溶液清洗后过滤即获得含TP的固定化酶或含PNP的固定化酶。
其中步骤i)中戊二醛溶液的浓度为2%,氨基树脂与2%戊二醛的混合的质量体积比为1:4。
其中步骤ii)中PNP的粗酶或TP粗酶与氨基树脂混合比例为1:20。
本发明提供一种固定化酶用于制备2’-氟-2’-脱氧腺苷。
另一方面,本发明提供了利用固定化酶催化制备2’-氟-2’-脱氧腺苷的方法,包括以下步骤:
S1固定化酶的填装:将PNP固定化酶和TP固定化酶分别填装至柱式反应器中,即获得含固定化TP的柱式A反应器和含固定化PNP的柱式B反应器;
S2反应液的配制:取配制的腺嘌呤母液和2’-氟-2’-脱氧尿苷母液,加入PBS缓冲溶液稀释备用;
S3反应:将上述S2反应液流经A反应器,流经时长控制在3h,随后将反应液加入B反应器,置于恒温水浴振荡器,温度设定30℃,反应时长36h;
S4检测:反应完成后,将样品用注射器和滤膜抽滤制样,进行HPLC检测。
本发明的有益效果:利用胸腺嘧啶核苷磷酸化酶与嘌呤核苷磷酸化酶作为生物催化剂,催化2’-氟-2’-脱氧尿苷(2’F-dU)与腺嘌呤进行转糖基化反应生成2’-氟-2’-脱氧腺苷,具有如下效果:
1.利用生物酶催化合成修饰核苷的方法,相比化学方法大大降低了2’F-dA的生产成本,消除了副产物处理过程中产生的环境影响。
2.采用双酶催化反应体系,转化效率和最终产率相比化学合成有巨大优势。
3.生产工艺简单,操作方便,是一种环境友好的绿色生物合成工艺。
相关定义
2’F-dU:2’-氟-2’-脱氧尿苷
2’F-dA:2’-氟-2’-脱氧腺苷
PNP:嘌呤核苷磷酸化酶
TP:胸腺嘧啶核苷磷酸化酶
IPTG:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
U:尿嘧啶
A:腺嘌呤
附图说明
图1为实施例1HPLC检测结果(保留时间U:3.8、A:5.5、2’F-dU:6.8、2’F-dA:15.5)
图2为实施例2HPLC检测结果(保留时间U:3.8、A:5.5、2’F-dU:6.8、2’F-dA:15.7)
图3为实施例3HPLC检测结果(保留时间U:3.8、A:5.5、2’F-dU:6.8、2’F-dA:15.7)
图4为实施例4HPLC检测结果(保留时间U:3.8、A:5.5、2’F-dU:6.8、2’F-dA:15.6)
图5为实施例5HPLC检测结果(保留时间U:3.8、A:5.5、2’F-dU:6.8、2’F-dA:15.6)
图6为实施例6HPLC检测结果(保留时间U:3.8、A:5.5、2’F-dU:6.8、2’F-dA:15.5)
图7为实施例1中TP/PNP凝胶电泳检测结果
图8为TP-PNP催化转糖基反应路线图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明从NCBI数据库中筛选了6种胸腺嘧啶核苷磷酸化酶和6种嘌呤核苷磷酸化酶进行后续的酶催化反应,根据酶的氨基酸序列ID在NCBI数据库中查到相应的氨基酸序列,在网站(http://www.detaibio.com/sms2/rev_trans.html)中进行反向翻译的相应的核苷酸序列,相关序列信息如下表所示:
实施例1
1.1TP酶的克隆构建和表达制备
S1载体构建与克隆:将选用实施例1的胸腺嘧啶磷酸化酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到胸腺嘧啶磷酸化酶-pET28a,取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,随后冰浴30min,42℃热激60s,再冰浴5min,向管中加入37℃无抗生素的LB培养液300μl,37℃、200r摇床修复1h,随后涂在含有卡那霉素的固体LB平板上37℃培育,长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落,先在含卡那抗性的LB平板上画线保种用,将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号;
S2验证:然后将牙签置于已加入T7通用引物的20μl PCR Mix体系中搅拌后取出,进行PCR扩增,PCR反应条件为:95℃、15min,94℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸1min,进行30个循环,最后72℃,保温5min,PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆,获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株:胸腺嘧啶磷酸化酶-大肠杆菌(图7);
S3酶的表达和提取:将含有胸腺嘧啶磷酸化酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素的LB培养基中,于37℃下培养OD至1.0左右后加入终浓度0.1mM的IPTG,置于28℃诱导表达16h,然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体,倒掉上清培养基后按菌体重量:PBS溶液=1g:5ml的比例用100mM PBS溶液将菌体重悬,将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液,35000g/min离心30min后提取上清液,得到目标胸腺嘧啶磷酸化酶的粗酶溶液,保存于-20℃冰箱备用。
1.2PNP酶的克隆构建和表达制备
S1载体构建与克隆:将选用实施例1的嘌呤核苷磷酸化酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到嘌呤核苷磷酸化酶-pET28a,取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,随后冰浴30min,42℃热激60s,再冰浴5min,向管中加入37℃无抗LB培养液300μL,37℃、200r摇床修复1h,随后涂在卡那抗性的固体LB平板上37℃培育,长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落,先在含卡那霉素的LB平板上画线保种用,将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号;
S2验证:然后将有菌种的牙签置于已加入T7通用引物的20μl PCR Mix体系中混合后取出,进行PCR扩增,PCR反应条件为:95℃、15min,94℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸1min,进行30个循环,最后72℃,保温5min,PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆,获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株:嘌呤核苷磷酸化酶-大肠杆菌;
S3酶的表达和提取:将含有嘌呤核苷磷酸化酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素的LB培养基中,于37℃下培养OD至1.0左右后加入终浓度0.1mM的IPTG,置于28℃诱导表达16h,然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体,倒掉上清培养基后按菌体重量:PBS溶液=1g:5ml的比例用100mM PBS溶液将菌体重悬,将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液,35000g/min离心30min后提取上清液,得到目标嘌呤核苷磷酸化酶的粗酶溶液,保存于-20℃冰箱备用。
1.3双酶催化反应结果
S4 15mM腺嘌呤母液的配制:称取腺嘌呤0.081g,溶于40ml pH8的PBS buffer。
50mM 2’F-dU母液的配制:称取0.246g 2’F-dU,溶于20ml pH8的PBS buffer。
S5在50ml离心管中,依次加入S4所述腺嘌呤母液5ml,2’F-dU母液1ml,再加入S3所述TP粗酶液2ml,PNP酶液2ml;开始反应,将离心管置于恒温摇床,转速220rpm/min,反应温度为30℃,反应36h后取样检测。
S6反应完成后,将样品用1ml注射器过滤膜制样,通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达43%。
1.4固定化酶
S7采用S3步骤制得TP和PNP粗酶溶液,将氨基树脂用20mM PBS缓冲液清洗2-4次后过滤,用20mM PBS溶液配制2%戊二醛溶液,将氨基树脂与2%戊二醛混合,比例为氨基树脂:2%戊二醛=1:4(质量/体积比),随后在20-25℃条件下搅拌/振摇1小时,然后过滤获得氨基树脂;用20mM PBS缓冲液清洗2-4次后过滤,再分别取约含200mg PNP粗酶和200mg TP粗酶的粗酶溶液与4g氨基树脂混合,混合后在20℃-30℃下以70-80rpm的转速振摇18小时;然后过滤收集氨基树脂,用20mM PBS缓冲溶液清洗2-4次后过滤即获得TP固定化酶和PNP固定化酶。
1.5固定化催化结果
S8固定化酶的填装:将两种固定化酶分别填装至柱式反应器中,即获得含固定化TP的柱式反应器(A反应器)和含固定化PNP的柱式反应器(B反应器)。
S9反应液的配制:取5ml配制的腺嘌呤母液和1ml 2’-dU母液,加入4ml pH8的PBS缓冲溶液备用。
S10反应:将上述S9反应液流经A反应器,流经时长控制在3h,随后将反应液加入B反应器,置于恒温水浴振荡器,温度设定30℃,反应时长36h。
S11检测:反应完成后,将样品用1ml注射器和滤膜抽滤制样,通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达45%。所述的HPLC检测方法是:色谱柱Ultimate XB-C18(4.6×250mm,5μm),乙腈/TEAA(5/95,V/V)为流动相,流速是1mL/min,柱温40℃,检测波长254nm,检测时间为20min。
实施例2
1.1TP酶的克隆构建和表达制备
S1载体构建与克隆:将选用实施例1的胸腺嘧啶磷酸化酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到胸腺嘧啶磷酸化酶-pET28a,取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,随后冰浴30min,42℃热激60s,再冰浴5min,向管中加入37℃无抗生素的LB培养液300μl,37℃、200r摇床修复1h,随后涂在含有卡那霉素的固体LB平板上37℃培育,长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落,先在含卡那抗性的LB平板上画线保种用,将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号;
S2验证:然后将牙签置于已加入T7通用引物的20μl PCR Mix体系中搅拌后取出,进行PCR扩增,PCR反应条件为:95℃、15min,94℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸1min,进行30个循环,最后72℃,保温5min,PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆,获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株:胸腺嘧啶磷酸化酶-大肠杆菌;
S3酶的表达和提取:将含有胸腺嘧啶磷酸化酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素的LB培养基中,于37℃下培养OD至1.0左右后加入终浓度0.1mM的IPTG,置于28℃诱导表达16h,然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体,倒掉上清培养基后按菌体重量:PBS溶液=1g:5ml的比例用100mM PBS溶液将菌体重悬,将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液,35000g/min离心30min后提取上清液,得到目标胸腺嘧啶磷酸化酶的粗酶溶液,保存于-20℃冰箱备用。
1.2PNP酶的克隆构建和表达制备
S1载体构建与克隆:将选用实施例1的嘌呤核苷磷酸化酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到嘌呤核苷磷酸化酶-pET28a,取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,随后冰浴30min,42℃热激60s,再冰浴5min,向管中加入37℃无抗LB培养液300μL,37℃、200r摇床修复1h,随后涂在卡那抗性的固体LB平板上37℃培育,长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落,先在含卡那霉素的LB平板上画线保种用,将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号;
S2验证:然后将有菌种的牙签置于已加入T7通用引物的20μl PCR Mix体系中混合后取出,进行PCR扩增,PCR反应条件为:95℃、15min,94℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸1min,进行30个循环,最后72℃,保温5min,PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆,获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株:嘌呤核苷磷酸化酶-大肠杆菌;
S3酶的表达和提取:将含有嘌呤核苷磷酸化酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素的LB培养基中,于37℃下培养OD至1.0左右后加入终浓度0.1mM的IPTG,置于28℃诱导表达16h,然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体,倒掉上清培养基后按菌体重量:PBS溶液=1g:5ml的比例用100mM PBS溶液将菌体重悬,将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液,35000g/min离心30min后提取上清液,得到目标嘌呤核苷磷酸化酶的粗酶溶液,保存于-20℃冰箱备用。
1.3双酶催化反应结果
S4 15mM腺嘌呤母液的配制:称取腺嘌呤0.081g,溶于40ml pH8的PBS buffer。
50mM 2’F-dU母液的配制:称取0.246g 2’F-dU,溶于20ml pH8的PBS buffer。
S5在50ml离心管中,依次加入S4所述腺嘌呤母液5ml,2’F-dU母液1ml,再加入S3所述TP粗酶液2ml,PNP酶液2ml;开始反应,将离心管置于恒温摇床,转速220rpm/min,反应温度为30℃,反应36h后取样检测。
S6反应完成后,将样品用1ml注射器过滤膜制样,通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达49%。
1.4固定化酶
S7采用S3步骤制得TP和PNP粗酶溶液,将氨基树脂用20mM PBS缓冲液清洗2-4次后过滤,用20mM PBS溶液配制2%戊二醛溶液,将氨基树脂与2%戊二醛混合,比例为氨基树脂:2%戊二醛=1:4(质量/体积比),随后在20-25℃条件下搅拌/振摇1小时,然后过滤获得氨基树脂;用20mM PBS缓冲液清洗2-4次后过滤,再分别取约含200mg PNP粗酶和200mg TP粗酶的粗酶溶液与4g氨基树脂混合,混合后在20℃-30℃下以70-80rpm的转速振摇18小时;然后过滤收集氨基树脂,用20mM PBS缓冲溶液清洗2-4次后过滤即获得TP固定化酶和PNP固定化酶。
1.5固定化催化结果
S8固定化酶的填装:将两种固定化酶分别填装至柱式反应器中,即获得含固定化TP的柱式反应器(A反应器)和含固定化PNP的柱式反应器(B反应器)。
S9反应液的配制:取5ml配制的腺嘌呤母液和1ml 2’-dU母液,加入4ml pH8的PBS缓冲溶液备用。
S10反应:将上述S9反应液流经A反应器,流经时长控制在3h,随后将反应液加入B反应器,置于恒温水浴振荡器,温度设定30℃,反应时长36h。
S11检测:反应完成后,将样品用1ml注射针头抽滤制样,通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达53%
实施例3
TP酶的克隆构建和表达制备和PNP酶的克隆构建和表达制备方法参照实施例1,按照表1,将实施例1的核苷酸序列换成实施例3的序列即可
双酶催化反应方法参照实施例1,将使用实施例3表达的酶进行催化,反应完成后,通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达36%。
双酶的固定化方法参照实施例1,将实施例3表达的酶替换实施例1中的酶。固定化催化方法参照实施例1,将实施例3的固定化酶替换实施例1中的固定化酶,反应完成后通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达40%
实施例4
TP酶的克隆构建和表达制备和PNP酶的克隆构建和表达制备方法参照实施例1,按照表1,将实施例1的核苷酸序列换成实施例3的序列即可
双酶催化反应方法参照实施例1,将使用实施例3表达的酶进行催化,反应完成后,通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达45%。
双酶的固定化方法参照实施例1,将实施例3表达的酶替换实施例1中的酶。固定化催化方法参照实施例1,将实施例3的固定化酶替换实施例1中的固定化酶,反应完成后通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达40%。
实施例5
TP酶的克隆构建和表达制备和PNP酶的克隆构建和表达制备方法参照实施例1,按照表1,将实施例1的核苷酸序列换成实施例3的序列即可
双酶催化反应方法参照实施例1,将使用实施例3表达的酶进行催化,反应完成后,通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达39%。
双酶的固定化方法参照实施例1,将实施例3表达的酶替换实施例1中的酶。固定化催化方法参照实施例1,将实施例3的固定化酶替换实施例1中的固定化酶,反应完成后通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达38%
实施例6
TP酶的克隆构建和表达制备和PNP酶的克隆构建和表达制备方法参照实施例1,按照表1,将实施例1的核苷酸序列换成实施例3的序列即可
双酶催化反应方法参照实施例1,将使用实施例3表达的酶进行催化,反应完成后,通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达49%。
双酶的固定化方法参照实施例1,将实施例3表达的酶替换实施例1中的酶。固定化催化方法参照实施例1,将实施例3的固定化酶替换实施例1中的固定化酶,反应完成后通过HPLC检测,经过HPLC检测结果计算,转化率可达52%。
Claims (10)
1.一种2’-氟-2’-脱氧腺苷的合成方法,包括以下步骤:
1)含有目标酶序列的菌株的构建:将目标酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体进行连接,然后将含有目的基因的载体转载至大肠杆菌中进行发酵培养,通过对菌株的基因序列进行提取和扩增后进行电泳观察结果筛选阳性克隆,获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株;
2)目标酶的表达和提取:将含有目标酶序列的大肠杆菌挑取到培养基中进行培养,然后加入诱导剂进行发酵培养诱导表达,培养结束后将菌液离心收集菌体,将菌体破碎得含酶裂解液,离心后提取上清液,得到目标酶的粗酶溶液;
3)游离酶催化反应:配制腺嘌呤母液和2’-氟-2’-脱氧尿苷母液;向反应体系中依次加入腺嘌呤母液,2’-氟-2’-脱氧尿苷母液,再加入粗酶溶液进行反应制得2’-氟-2’-脱氧腺苷。
2.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,步骤1)中的目标酶选自胸腺嘧啶核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶。
3.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,步骤2)中的诱导剂选自IPTG。
4.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,步骤3)中的反应体系中腺嘌呤与2’-氟-2’-脱氧尿苷的摩尔比为1:1.5。
5.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,步骤3)中的反应条件为置于将反应体系置于恒温摇床,转速220rpm/min,反应温度为30℃,反应时间为36h。
6.一种固定化酶的制备方法,所述的酶选自权利要求2中的胸腺嘧啶核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶,包括以下步骤:
i)将氨基树脂用PBS缓冲液清洗后过滤,用PBS溶液配制戊二醛溶液,将氨基树脂与戊二醛混合,随后进行搅拌或振摇,然后过滤并用PBS缓冲液清后过滤获得处理后的氨基树脂;
ii)分别取含PNP的粗酶溶液或TP粗酶溶液,与步骤i)氨基树脂混合,混合后进行振摇;然后过滤收集氨基树脂,用PBS缓冲溶液清洗后过滤即获得含TP的固定化酶或含PNP的固定化酶。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,步骤i)中戊二醛溶液的浓度为2%,氨基树脂与2%戊二醛的混合的质量体积比为1:4。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,步骤ii)中PNP的粗酶或TP粗酶与氨基树脂混合比例为1:20。
9.权利要求6制备的固定化酶用于制备2’-氟-2’-脱氧腺苷。
10.权利要求6制备的固定化酶催化制备2’-氟-2’-脱氧腺苷的方法,包括以下步骤:
S1固定化酶的填装:将PNP固定化酶和TP固定化酶分别填装至柱式反应器中,即获得含固定化TP的柱式A反应器和含固定化PNP的柱式B反应器;
S2反应液的配制:取配制的腺嘌呤母液和2’-氟-2’-脱氧尿苷母液,加入PBS缓冲溶液稀释备用;
S3反应:将上述S2反应液流经A反应器,流经时长控制在3h,随后将反应液加入B反应器,置于恒温水浴振荡器,温度设定30℃,反应时长36h;
S4检测:反应完成后,将样品用注射器和滤膜抽滤制样,进行HPLC检测。
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