CN105400806B - 一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其应用 - Google Patents

一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术及生物医药领域，具体涉及一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其应用。一种嘧啶核苷磷酸化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的嘧啶核苷磷酸化酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因导入大肠杆菌获得含有该基因的基因工程菌。并且通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺，实现重组嘧啶核苷磷酸化酶的大规模生产，并用于催化合成索非布韦中间体(2'R)‑2'‑脱氧‑2'‑氟‑2'‑甲基脲苷，以及其他核苷类原料药及医药中间体的生产。

Description

一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术及生物医药领域，涉及一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其应用，具体涉及一类嘧啶核苷磷酸化酶及其基因，及含有该嘧啶核苷磷酸化酶基因的重组表达载体和基因工程菌，并用于催化合成索非布韦中间体(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷，以及其他核苷类原料药及医药中间体的生产。
背景技术
索非布韦(sofosbuvir，商品名Sovaldi)是美国Gilead Sciences公司研发的口服治疗丙肝(HCV)药物，于2013年12月经FDA批准上市。索非布韦是首个获得批准用于丙型肝炎全口服治疗方案的药物，是全球第一个上市的HCV聚合酶核苷类抑制剂，通过作用于HCVNS5B聚合酶靶点干扰病毒遗传物质RNA的合成，从而终止HCV病毒的RNA链复制，并对多种基因型HCV有治疗效果，单独应用索非布韦或与NS5A蛋白酶抑制剂合用，丙肝患者服用12周持续病毒学应答率达到95％以上，临床效果显著，被医学界视为治疗丙型肝炎的突破性药物。据世界卫生组织统计，全球丙肝的感染率约为3％，约1.8亿人感染HCV，丙肝呈现全球化流行趋势。索非布韦上市仅一年多，其销售额即过百亿美元，成为史上最快达到年销售百亿美元的药品。
索非布韦是尿嘧啶核苷类似物的前药，分子式为C22H29FN3O9P，分子量529.45，CAS登记号为1190307-88-0。中文化学名为(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基]-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(磷酰化苯氧基)氨基)丙酸异丙酯；英文化学名称为(S)-isopropyl 2-{(S)-{{(2R,3R,4R,5R)-5-[2,4-dioxo-3,4-dihydro-pyrimidin-1(2H)-yl]-4-fluoro-3-ydroxy-4-methyltetrahydrofuran-2-yl}methoxy}(phenoxy phospho-ryla-mino}pro-panoate。
核苷类似物的合成主要有化学合成法、碱基修饰法和生物转化法三种，前两种方法工艺步骤多，反应条件苛刻，需要进行异构体的分离；碱基和核糖基团缩合时还需要进行基团的保护和去保护，使合成反应的总收率偏低，成本居高不下(MENG W，ELLSWORTH B A，NIRSCHL A A，et al.J Med Chem，2008，51(5):1145-1149.CARR R，HILDBR AND S，HODGESM L,et al.WO，2013178571A1.2013-11-05)。而酶催化合成方法具有反应条件温和、反应专一性强、副反应少、产物容易分离纯化，可合成复杂的生物分子，无需基团保护等优点。目前，嘧啶核苷磷酸化酶已被广泛用于酶法合成抗肿瘤、抗病毒的核苷类似物。
核苷磷酸化酶(Nucleoside Phosphorylase，NPase)是核苷补救代谢途径中的关键酶，广泛存在于真核或原核生物中，可分为嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleosidephosphorylas，PNPase，EC2.4.2.1)，尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase，UrdPase,EC2.4.2.4)和胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，dThdPase，EC2.4.2.3)。核苷磷酸化酶能可逆地催化核苷(或脱氧核苷)磷酸化反应。目前，利用核苷磷酸化酶已成功合成了阿糖腺苷、利巴韦林、5-甲基尿苷等药物。但利用含有核苷磷酸化酶的天然菌株合成核苷类药物存在酶量小的缺点，构建基因工程菌可从解决酶量问题。
核苷磷酸化酶催化的化学反应如下：
本发明开发了一个具有较高催化活性的嘧啶核苷磷酸化酶，可用于索非布韦中间体的生产，以及相关核苷类原料药及医药中间体的生产。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其编码的蛋白。
本发明的另一目的是提供该基因、含有该基因的重组质粒及基因工程菌的应用。
本发明的又一目的是提供一种催化合成(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种嘧啶核苷磷酸化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中嘧啶核苷磷酸化酶的基因序列来源可以为大肠杆菌(Escherichia Coli)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、芽孢杆菌(Bacillus)、微杆菌(Exiguobacterium)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、乙酰短杆菌(Brevibacterium actylium)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)等。本发明的一个实施例中嘧啶核苷磷酸化酶的基因序列来自大肠杆菌。嘧啶核苷磷酸化酶基因可以通过PCR扩增法、重组法或者化学合成方法获得。
一种嘧啶核苷磷酸化酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
含有本发明所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的重组载体。可通过本领域常规方法将本发明的嘧啶核苷磷酸化酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，如质粒pUC18，pUC19，pET系列等，更优选地选自pET系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pET-28a(+)。
一种生产所述的嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌，所述基因工程菌中包含所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因或所述的重组载体。
所述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
本发明所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因、所述的重组载体、所述的基因工程菌在制备嘧啶核苷磷酸化酶中的应用。
一种嘧啶核苷磷酸化酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述的基因工程菌，获得重组表达的嘧啶核苷磷酸化酶。
所述的方法，优选还包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述嘧啶核苷磷酸化酶的步骤。
本发明所述的嘧啶核苷磷酸化酶在催化合成(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷中的应用。
一种利用本发明所述的嘧啶核苷磷酸化酶催化合成(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷的方法，以(3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-二氢磷酸和尿嘧啶为底物，权利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶为催化剂，催化合成(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷。
有益效果：
本发明通过易错PCR和定点突变方法获得了SEQ ID NO.1所示的嘧啶核苷磷酸化酶基因变体，通过将该基因导入大肠杆菌构建基因工程菌，并进行诱变表达，获得了SEQ IDNO.2所示的重组嘧啶核苷磷酸化酶。重组嘧啶核苷磷酸化酶突变体的酶活为612U/mg，比突变之前提高了30-60％。该重组嘧啶核苷磷酸化酶能够用于催化(3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-二氢磷酸和尿嘧啶合成索非布韦中间体(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷。
生物材料保藏信息
本发明基因工程菌分类命名为大肠杆菌NP1506Escherichia coli NP1506，2015年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015782。
具体实施方式
根据本发明一个实施例的嘧啶核苷磷酸化酶基因，其来源大肠杆菌(Genbank:NC_000913.3)。根据易错PCR和定点突变方法对其进行突变，从而获得该重组氨基转移酶突变体目的基因，其基因序列为SEQ ID NO.1。
根据本发明一个实施例的嘧啶核苷磷酸化酶突变体的蛋白序列为SEQ ID NO.2。
根据本发明一个实施例的重组载体，包括本发明实施例的嘧啶核苷磷酸化酶突变体基因，载体为pET-28a(+)，采用乳糖启动子。基因工程菌摇瓶培养的诱导剂为IPTG，嘧啶核苷磷酸化酶制备的诱导剂为乳糖。
根据本发明一个实施例的生产嘧啶核苷磷酸化酶突变体的基因工程菌具有包括嘧啶核苷磷酸化酶多肽基因突变体的重组载体。
具体地，本发明的基因工程菌为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号为CCTCC NO：M 2015782的基因工程菌。
实施例1基因工程菌的建立
根据Genebank公布的大肠杆菌嘧啶核苷磷酸化酶基因(Genbank:NC_000913.3)，人工合成嘧啶核苷磷酸化酶基因片段，以该基因片段为模版，通过PCR扩增扩展该片段(片段两侧加BamH I和EcoR I内切酶片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3(Genbank:NC_000913.3)所示。并利用HindⅢ和BamH I内切酶位点将基因插入pET-28a(+)质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌。其中PCR扩增嘧啶核苷磷酸化酶基因的引物为：上游引物为5'-GTCTGATGTTTTTCATCTCG-3'(SEQ ID NO.4)，下游引物为5'-CCCGTTTTCCCGCTGGCTTT-3'(SEQ ID NO.5)。
实施例2嘧啶核苷磷酸化酶突变体基因的获得
本研究利用易错PCR和定点突变的方法，对嘧啶核苷磷酸化酶进行了蛋白质工程改造。易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种dNTPs的浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。
本研究采用较低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变的原理，同时利用Mn2+替代天然辅助因子Mg2+增加易错概率。
50μl PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物(上游引物为5'-GTCTGATGTTTTTCATCTCG-3'(SEQ ID NO.4)，下游引物为5'-CCCGTTTTCCCGCTGGCTTT-3'(SEQ ID NO.5))各50pmol，模板DNA 1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg2+2mmol/L，加双蒸水至50μl。
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s，55℃变性30s，72℃变性45s，进行30个循环；于72℃下继续延伸5min，冷却至4℃。
实验流程
按照实施例1的方法PCR扩增嘧啶核苷磷酸化酶基因并利用HindⅢ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入至pET-28a(+)质粒中，作为基因突变模板；
易错PCR扩增嘧啶核苷磷酸化酶的基因，扩增后基因片段链接至pET-28a(+)载体，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立嘧啶核苷磷酸化酶基因突变文库；利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)质粒为载体，表达扩展嘧啶核苷磷酸化酶，高通量筛选高活性突变株；突变后对高活性嘧啶核苷磷酸化酶基因进行鉴定。筛选出的高活性嘧啶核苷磷酸化酶突变体基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
按实施例1所述方法构建表达该嘧啶核苷磷酸化酶多肽突变体的基因工程菌，并将其命名为Escherichia coli NP1506，于2015年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2015782。
实施例3重组大肠杆菌的摇瓶培养
将实施例2所得的重组大肠杆菌E.Coli BL21 NP1506接种至装有50mL含卡那霉素(30μg/mL)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养6小时。转接3％菌体培养液至装有LB培养基(含卡那霉素30μg/mL)的250mL摇瓶中，置于同样条件下振荡培养。当菌液的OD600值达到0.6左右时，加入诱导剂异丙基βD-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，将培养液置于28℃，200rpm的摇床中诱导表达6小时。表达后通过离心(8000rpm，10min，4℃)收集菌体，并用磷酸缓冲液(pH7.5，10mmol/L)清洗两次，分散于同样的预冷的缓冲液中，于冰水浴中进行超声破碎。离心(10000rpm，20min，4℃)，弃菌体碎片，得到嘧啶核苷磷酸化酶粗酶液。
实施例4嘧啶核苷磷酸化酶活力的测定
2mL反应液(25mmol/L(3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-二氢磷酸，25mmol/L尿嘧啶，1mmol/L EDTA，50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH7.5)于55℃水浴预热5min，加入0.025mg粗酶启动反应，HPLC检测产物(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷的浓度。
酶活力单位(U)的定义为：在上述反应条件下，毎分钟生成1μmol(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷所需的酶量。
色谱操作条件：色谱柱Sepax HP-C18 4.6mm×50mm(5μm)；流动相：10％甲醇溶液，pH7.5；紫外检测器波长：UV 220nm；流速3.0mL/min；柱温40℃；进样量：20μL。
经检测，野生型嘧啶核苷磷酸化酶的活力为32.6U/mg。
重组嘧啶核苷磷酸化酶突变体的酶活为612U/mg，比突变之前提高了30-60％。
实施例5嘧啶核苷磷酸化酶的制备
发酵培养基成分为：酵母提取物10g/L，蛋白胨14.5g/L，甘油60g/L，葡萄糖6g/L，NH4Cl4.1g/L，K2HPO411.2g/L，KH2PO42.6g/L，KCl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，EDTA0.001g/L。发酵液通过加入氨水维持pH 7.2，罐温35℃，搅拌转速前2小时500rpm，之后位800rpm。发酵过程中控制DO 40％以上，空气流量1:1.5vvm。接入种子液的OD600为0.5，接入量为发酵液体积的8％，发酵液OD600达20时加入3％的乳糖以诱导嘧啶核苷磷酸化酶的表达，此后继续发酵16小时左右，罐温28-30℃。发酵过程中通过加入含甘油600g/L，NH4Cl15g/L，KCl 3g/L，MgSO4·7H2O 11g/L，EDTA 0.05g/L的溶液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物冷却至4℃保存。
将保存的发酵液经离心、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到嘧啶核苷磷酸化酶冻干粉并于-80℃保存。
实施例6嘧啶核苷磷酸化酶催化合成(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷
在1000L反应釜中，加入150L DMSO，340L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(含2.38kg K2HPO4，1.45kg KH2PO4)，5.53kg(3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-二氢磷酸和5.36kg尿嘧啶，180g EDTA，升温至50-60℃，200rpm搅拌下反应15min后，向釜内投加嘧啶核苷磷酸化酶(本公司生产)粗酶液800g。反应4小时后，将已预热至反应温度、预先溶解了原料(0.98kg(3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-二氢磷酸和0.95kg尿嘧啶)的60L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(含0.42kg K2HPO4，0.26kg KH2PO4)以60mL/min的速度流加至发酵罐内，继续搅拌至反应35小时左右，底物含量降至1％以下时终止反应。反应终止后经脱色、离心、萃取等操作，得到产物。(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷1HNMR(DMSO-d6)d11.44(brs,1H,NH),7.95(d,1H,C-6H),5.97(d,1H,C-1’H),5.64(d,1H,C-5H),3.84-3.77(m,3H,C-5’-Ha,C-3’H,C-4’H),3.63-3.60(m,1H,C5’-Hb),1.23(d,3H,C-2’-CH3).ES-MS M-1,259.经HPLC分析，确定底物转化率90.6％。

Claims (10)

1.一种嘧啶核苷磷酸化酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
2.一种嘧啶核苷磷酸化酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
3.含有权利要求1所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的重组载体。
4.一种生产权利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌中包含权利要求1所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因或权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21(DE3)。
6.权利要求1所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4~5中任一项所述的基因工程菌在制备嘧啶核苷磷酸化酶中的应用。
7.一种嘧啶核苷磷酸化酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：培养如权利要求4~5中任一项所述的基因工程菌，获得重组表达的嘧啶核苷磷酸化酶。
8.根据权利要求7所述的嘧啶核苷磷酸化酶的制备方法，其特征在于还包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述嘧啶核苷磷酸化酶的步骤。
9.权利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶在催化合成(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷中的应用。
10.一种利用权利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶催化合成(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷的方法，其特征在于以(3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-二氢磷酸和尿嘧啶为底物，权利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶为催化剂，催化合成(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷。
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