CN111621436A - 一种适于粘质沙雷氏菌xd1-b-1产灵菌红素的培养液 - Google Patents

一种适于粘质沙雷氏菌xd1-b-1产灵菌红素的培养液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌XD1‑B‑1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18979。该菌的产色素的培养液，为6.0g/L的蛋白胨水溶液。本发明粘质沙雷氏菌发酵液配方简单，生产成本低廉，适宜大规模粘质沙雷氏菌XD1‑B‑1生产色素。

Description

一种适于粘质沙雷氏菌XD1-B-1产灵菌红素的培养液
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种粘质沙雷氏菌及其培养液。
背景技术
粘质沙雷氏菌(Serratia marcecens)属于肠杆菌科沙雷氏属，为革兰氏阴性细菌。粘质沙雷氏菌可产一类红色的灵菌红素，灵菌红素是天然红色色素家族的总称，是微生物产生的一种次级代谢产物，而许多研究表明这类色素具有抗细菌、抗真菌等生物学活性，更有研究发现该物质具有免疫抑制活性和引起肿瘤细胞凋亡的作用，其对多种肿瘤细胞显著的抑制作用使之可能成为一种新的抗肿瘤类药物。因此，这类色素应用前景非常广阔。
在生产灵菌红素的过程中，利用菌体生长通过液体发酵是生产色素的重要渠道，因此成本低廉且色素产量好的发酵培养液就是实现色素量化生产的重要条件。通常用于粘质沙雷氏菌产色素的培养液有以下几种：配方1：蛋白胨10g,酵母粉20g，NaCl 2g，K2HPO42g,水1000mL(南京林业大学学报(自然科学版)，43(1)：76－83，2019)；配方2：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，水1000mL(应用与环境生物学报，24(1)：26-32，2018)；配方3：蛋白胨10g/L,NaCl 5.0g,牛肉浸膏3.0g，水1000mL(浙江农业学报，28(2)：252-258，2016)。目前这些培养液的配方相对复杂，成本高，因此不适宜大规模的利用粘质沙雷氏菌生产色素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种适于粘质沙雷氏菌XD1-B-1产色素的成本低廉的培养液。另一方面，提供了一株高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌。
本发明的技术方案为：粘质沙雷氏菌XD1-B-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18979。
保藏编号CGMCC No.18979粘质沙雷氏菌在生产色素中的应用。
一种用于粘质沙雷氏菌产色素的培养液，该培养液由5.0-7.0g/L的蛋白胨构成。优选由6.0g/L的蛋白胨构成。
进一步地，所述粘质沙雷氏菌为保藏编号CGMCC No.18979粘质沙雷氏菌。
一种粘质沙雷氏菌发酵生产灵菌红素的方法，将保藏编号CGMCC No.18979粘质沙雷氏菌接种到本发明的培养液中发酵，得到灵菌红素。
进一步地，发酵温度为25-35℃，pH值6-8。优选地，发酵温度为30℃，pH值7，培养时间16小时。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明粘质沙雷氏菌发酵液配方简单，生产成本低廉，适宜大规模粘质沙雷氏菌生产色素。本发明的粘质沙雷氏菌产灵菌红素产量高，达到347.52μg/ml。
保藏信息：
粘质沙雷氏菌(Serratia marcecens)XD1-B-1，该菌株已于2019年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18979，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为菌株XD1-B-1菌落形态图；
图2为菌株XD1-B-1显微形态图；
图3为菌株XD1-B-1在不同培养液中产色素的情况对比图；
图4标准曲线；
图5不同蛋白胨浓度条件下产灵菌红素；
图6为不同温度条件下菌株XD1-B-1产灵菌红素的量；
图7为不同pH值条件下菌株XD1-B-1产灵菌红素的量；
图8为不同培养时间条件下菌株XD1-B-1产灵菌红素的量。
具体实施方式
1、菌株分离
⑴倒平板
将高温高压灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，NaCl5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.2。)冷却至50℃～60℃时倒入培养皿中。每皿20mL，冷却凝固备用。
⑵涂布分离
称取10g土样到装有90ml无菌水的三角瓶中，混匀后即为菌悬液，将稀释后的菌悬液吸取100μL接到培养基上，用无菌玻璃棒同时涂布，将稀释液均匀地涂匀后，培养皿置于培养箱中于30℃条件下培养28～36h。挑取其中的菌株进行纯化，由此获得菌株XD1-B-1。
(3)菌株鉴定
该菌株菌落凸起，表面光滑湿润红色，不透明，红色素只产在胞内，培养基内无色素，见图1。在显微镜下菌体呈短杆状，端圆，见图2。
通过生物公司DNA测序对该菌株进行物种鉴定，该菌株为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcecens)。该菌株已于2019年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18979，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2、不同培养液中菌株的生长状态
选取用于粘质沙雷氏菌产色素的几种常用培养液及根据其营养需求配制的培养液共计6种，将配制好的培养液各100ml分装于250ml三角瓶，高温高压灭菌后，接入菌株XD1-B-1，于摇床30℃，160r/min培养18h。观查各培养液中菌株XD1-B-1的产色情况。6种培养液列于后：
①LB培养液：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，蒸馏水定容至1000ml；
②豆芽汁培养液：黄豆芽500g，蒸馏水定容至1000mL；
③查氏培养液：蔗糖15g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、氯化钾0.5g，再定容至1000mL。
④蛋白胨培养液：蛋白胨5g，蒸馏水定容至1000ml。
⑤蛋白胨10g,酵母粉20g，NaCl 2g，K2HPO4 2g,水1000mL。
⑥蛋白胨10g/L,NaCl 5.0g,牛肉浸膏3.0g，水1000mL。
结果如图3所示，根据菌株在不同培养液的培养结果可以看出，菌株在①号培养液中生长且产色素，但由于LB培养液自身颜色较深，影响色素表达；菌株在②号培养液中生长但产色素能力较弱，且培养液含杂质，影响色素表达；菌株在③号培养液中生长但不产生色素；菌株在④号培养液中生长且产色素，发酵液透明无杂质，色素表达较好；菌株在⑤号培养液中生长且产色素，但基础培养液的颜色影响色素表达；菌株在⑥号培养液中生长但无明显色素表达。可以从图片中直接看出，④号培养液最利于菌株的色素表达。
3.培养液优化
⑴标准曲线的绘制
灵菌红素标准品(纯度为100％)，上海甄准生物科技有限公司。将灵菌红素的溶液浓度分别配制为0、1、2、4、6和8μg/mL，在波长535nm处测量吸光度(应用与环境生物学报，24(1)：26-32，2018)。并绘制校正吸光度对灵菌红素含量(μg/ml)作标准曲线，建立如图4所示的回归方程。
⑵不同蛋白胨浓度产灵菌红素的能力
分别配制蛋白胨浓度为3.0g/L、3.5g/L...10.5g/L、11.0g/L共计17个梯度的培养液，将菌株接入其中于摇床发酵培养，将发酵液稀释10倍后测定535nm处吸光度，计算产生灵菌红素的量如图5所示。结果表明，产灵菌红素达到280μg/ml以上对应的蛋白胨浓度范围是5.0-7.0g/L，其中浓度为6.0g/L时，灵菌红素的产量最高，达到347.52μg/ml，其余蛋白胨浓度条件洗下产生的灵菌红素均低于280μg/ml。因此将5.0-7.0g/L界定为培养液中最佳的蛋白胨浓度范围，并优选6.0g/L。
4、不同条件下菌株产色素情况
探索以优化出的培养液配方：蛋白胨6.0g，蒸馏水1000ml条件下培养粘质沙雷氏菌菌株XD1-B-1，将发酵液稀释10倍后在波长535nm处测量吸光度。优化出在不同发酵液pH和培养温度发酵条件下最优的产色素条件。测定在紫外分光光度计535nm处吸光度，并计算产灵菌红素的浓度。
⑴不同温度对菌株产色素的影响
温度范围15℃-45℃范围内，不同温度下菌株XD1-B-1发酵液产灵菌红素的计算结果见图6，菌株在20～45℃下都能产色素，但低于20℃菌株产色素能力很差，在25～35℃范围内菌株产色素能力较强，产灵菌红素的量高于340μg/ml，其产色素的最适温度为30℃，该条件下灵菌红素的产量最高，达到347.81μg/ml。
⑵不同pH对菌株产色素产量的影响
pH范围为2-12，不同pH值下菌株XD1-B-1发酵液的产灵菌红素的结果见图7，pH对菌株的生长及产色素影响较大，菌株在中性和弱酸弱碱环境中生长较好，产色素能力也较强，当pH值小于6或者大于8时，菌株产色素能力较差，因此，当pH值为6-8时较好，产灵菌红素的量高于302.51μg/ml，最适pH值为7。
⑶不同培养时间对菌株产色素产量的影响
选择在不同培养时间测定发酵液产灵菌红素的量，结果见图8，从图中可以看出随着培养时间的增加，菌株在发酵液中产灵菌红素的量也逐渐增加，在第16小时达到最高，产灵菌红素的量为341.22μg/ml，16小时之后产灵菌红素的量有些许减少，其中培养时间为14-18小时是，菌株产灵菌红素的量菌高于320μg/ml，说明培养16小时最适于菌株XD1-B-1产灵菌红素。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (8)

1.粘质沙雷氏菌(Serratia marcecens)XD1-B-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18979。
2.保藏编号CGMCC No.18979粘质沙雷氏菌在生产色素中的应用。
3.一种用于粘质沙雷氏菌产色素的培养液，其特征在于，该培养液为5.0-7.0g/L的蛋白胨水溶液。
4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于，该培养液为6.0g/L的蛋白胨水溶液。
5.根据权利要求3或4所述的培养液，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌为保藏编号CGMCCNo.18979粘质沙雷氏菌。
6.一种发酵生产灵菌红素的方法，将保藏编号CGMCC No.18979粘质沙雷氏菌接种到权利要求3或4所述的培养液中发酵，得到灵菌红素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵温度为25-35℃，pH值6-8。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵温度为30℃，pH值7，发酵时间为16小时。
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