CN101137745A - 化合物在生物合成核酸以增加细菌培养物的产率中的应用 - Google Patents
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Abstract
微生物引子培养物。更具体的,制备微生物发酵剂培养物的方法,其中,微生物在包含至少一种产率增加剂的培养介质中被接种,该产率增加剂是选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸以及它们的衍生物组成的组。该微生物引子培养物可用于生产食物制品、饲料制品和医药制品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物引子培养物。更具体的,本发明提供了乳酸菌(LAB)引子培养物的制备方法,其中,乳酸菌被接种到含有至少一种产率增加剂的培养介质中培养,该产率增加剂是选自由一种或多种用于核酸的生物合成中的化合物或其一种或多种衍生物组成的组。该引子培养物可用于食品、饲料和医药制品的制造中。
背景技术
微生物培养物被广泛用于食品、饲料和医药工业,用以生产发酵制品,包括绝大多数奶制品,例如奶酪、酸奶和黄油,以及还包括肉类、焙烤、酒或蔬菜制品中。另外,微生物培养物还被用于产生蛋白质,包括酶和多种有用的化合物。这些微生物培养物通常被称作引子培养物,并在工业化繁殖工厂中被生产和分发到发酵产业,如乳制品工厂中,其中,引子培养物被用于它们的生产过程。乳酸菌培养物尤其被广泛用作引子培养物。
这里所用的术语“乳酸菌”(LAB)是指由革兰氏阳性、微嗜氧菌或厌氧菌,其对糖进行发酵,所产生的酸中包括乳酸(为主要产生的酸)、醋酸和丙酸。工业上最为有用的乳酸菌是属于乳球菌属(Lactococcus species(spp.))、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostocspp.)、乳酸片球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)和丙酸菌属(Propionibacterium spp.)中的乳酸菌。此外,属于严格厌氧菌群的产乳酸的菌中的双歧杆菌(bifidobacteria),即双歧杆菌属,其常被单独用作食物引子培养物或与乳酸菌结合使用,通常被包括在乳酸菌组中。甚至是某些葡萄球菌(例如,肉葡萄球菌(S.carnosus)、马胃葡萄球菌(S.equorum)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、小牛葡萄球菌(S.vitulinus)、木糖葡萄球菌(S.xylosus))属中的细菌也被称为LAB(Mogensen等(2002)Bulletin ofthe IDF No.377,10-19)。
LAB引子培养物的生产涉及将适当数量的LAB细胞接种到特异性的发酵介质中,在适当的发酵条件下进行繁殖。在工业化生产中,需竭力做到在发酵过程结束时获得高浓度的繁殖的细胞。这就对支持细胞生长以获得期望的高的生物质量产率的发酵条件和发酵介质产生较高要求。
液体介质在600nm的光学密度(OD600)是一种评价培养物样品中细菌细胞密度的精确方法。术语“高光学密度条件”是指在发酵过程结束时,繁殖的细胞浓度高达OD600为10或以上的发酵。
为了降低生产成本,工业化的发酵通常使用复杂的不明确的发酵介质进行。这样的介质的主要成分可以是酵母提取物、玉米淀粉、乳清蛋白质或其它基于乳汁的介质,它们都具有复杂的成分。对于选择的发酵而言,是使用通常由纯的化学物质制成的化学成分来确定的介质。纯的化学物质,例如特异性的能量源或碳源,也通常被添加到复合发酵介质中用于特异性的用途。无论在哪种情况下,对微生物细胞的存活能力而言发酵介质的组合物可能是最优化的,但对于获得高的微生物的生物质量产率而言就不一定是最优化的。
多数细胞生长所需的化合物,是需要消耗能量以提供细胞生产。这通常需要通过表达编码相应生物合成的酶的基因。这些酶的合成需要氨基酸和能量。由于必须合成相对更多的酶来生长,这样就对细胞施加了“蛋白质负担”。由于形成细胞成分所需的前体必须从其它途径获得,这又给细胞带来了额外的负担。
在核酸生物合成中所用到的一些化合物被发现是用于所谓的冷冻保护剂,以及减少冷冻和解冻过程中对活细胞的存活性带来的破坏性影响。WO
00/39281描述了在DNA的生物合成中,使用肌苷酸盐(IMP)和其它化合物来稳定储存中的液体引子培养物的代谢活性。
已知的是LAB具有复杂的生长因子需要,且在DNA和/或RNA的生物合成中涉及的化合物在具有确定了化学组成的介质中激发LAB的生长。但是,一些报道显示,尽管添加这些化合物产生了较短的停滞期或较高的初始生长速率,但却没有或仅略微提高产率(Klistrup(2005)FEMS Microbiol Rev.29,555-590;Nygaard(1951)J Bact61,497-505;Weinman(1964)J Bact87,263-269)。添加涉及在DNA生物合成中的化合物甚至可能抑制产率(Weinman(1964)J Bact87,263-269)。
如在实施例3和4中所示,添加涉及在DNA生物合成中的化合物也没有增加达到了高光学密度条件的发酵的生物质量的产率。
因此,需要提供一种新的方法来提高在高光学密度条件下进行的发酵的生物质量的产率。
发明内容
本发明解决的问题可通过提供一种方法来制备LAB的微生物培养物,以在高光学密度条件下提高生物质量的产率。
Richardson在1936年(Biochem J.30,2186)曾经报道,尿嘧啶对于葡萄球菌的厌氧生长至关重要,当对相同有机体的好氧生长无关紧要。因此,当将核酸生物合成中涉及的化合物添加到复杂的发酵介质中,而令人感到十分惊奇是发现LAB引子培养物在有氧培养或生产中有可能提高生物质量的产率。
因此,本发明的第一方面涉及在通气和高光学密度条件下发酵,获得增加的乳酸菌培养物的产率的方法,该方法包括以下步骤:
i)在培养介质中培育乳酸菌,并在一定条件下使得发酵进行到在600nm测量的光学密度(OD600)为10,其中,所述培养介质包含至少一种产率增加剂,其选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组,浓度为确保在发酵结束时培养介质含有至少1μM的所述至少一种产率增加剂;以及
ii)收集所述乳酸菌以获得乳酸菌培养物,
其中,比起在相同条件下和相似介质中但在发酵结束时含有少于1μM的各产率增加剂来培养微生物的情况下,产率增加剂增加了收集到的乳酸菌的产率。
优选的,所述培养介质含有至少5μM的至少一种产率增加剂,例如,至少10μM,如至少50μM的至少一种产率增加剂。特别的,所述培养介质含有至少5μM的选自IMP、GMP、肌苷和鸟嘌呤的组的试剂。
优选的,所述相似介质含有少于5μM的各产率增加剂,例如少于1μM,如少于0.5μM的各产率增加剂。特别的,所述相似介质含有少于5μM的选自IMP、GMP、肌苷和鸟嘌呤的组的试剂。
本发明的第二方面涉及根据在此描述的本发明第一方面和其实施方式获得的引子培养物。
本发明的第三方面涉及培养介质,其包含至少一种产率增加剂,该产率增加剂选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组。
本发明的第四方面涉及制备食品、饲料制品、医药制品、奶味制品和奶酪味制品的方法,所述方法包括向食物、饲料或医药制品的起始材料中加入根据本发明第二方面和其实施方式的有效量的微生物引子培养物,并使该接种的起始材料处于微生物体保持代谢活性的条件下。
本发明的第五方面涉及由按此处描述的本发明第四方面和其实施方式获得的发酵的食物、饲料或医药制品。
定义
在对发明的详细实施方式作描述前,先对这里所用的特定术语提供进一步定义。
这里,术语“嘌呤碱基”意在包括具有嘌呤核心结构的含环氮的碱基。因此,在本文中,术语“嘌呤碱基”意为任选取代的嘌呤。具体的嘌呤碱基的例子包括腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤。
类似地,术语“嘧啶碱基”意在包括具有嘧啶核心结构的含环氮的碱基。因此,在本文中,术语“嘧啶碱基”意为任选取代的嘧啶。具体的嘧啶碱基的例子包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
本文中,术语“核苷酸”意指2-脱氧核糖(DNA)单体或核糖(RNA)单体,其通过1号碳原子连接到嘌呤碱基,如腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤上,或通过1号碳原子连接到嘧啶碱基,如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶上。另外,DNA或RNA单体通过其5号碳原子连接到磷酸基上。具体的核苷酸的例子包括腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞苷单磷酸(CMP)、黄嘌呤单磷酸(XMP),肌苷单磷酸(IMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧黄嘌呤单磷酸(dXMP)和脱氧肌苷单磷酸(dIMP)。IMP尤为优选。
这里所用的术语“核苷”意指2-脱氧核糖(DNA)单体或核糖(RNA)单体,其通过1号碳原子连接到嘌呤碱基,如腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤上,或通过1号碳原子连接到嘧啶碱基,如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶上。具体的核苷例子包括腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧肌苷。肌苷尤为优选。
由以上对术语“核苷”和“核苷酸”的定义可以理解,核苷酸可被认为是包含通过糖单元的第5号碳原子连接的磷酸基的核苷。因此,这里描述的核苷酸也可认为是“核苷”-5′-单磷酸。例如,肌苷酸(IMP)可指肌苷-5′-单磷酸,脱氧肌苷酸(dIMP)可指脱氧肌苷-5′-单磷酸等。
本文中,术语“衍生物”当与术语“核苷酸”或“核苷”连用时,意指那些在其糖(即2-脱氧核糖或核糖)单元发生了改性的核苷酸或核苷,或那些在其含环氮碱基发生了改性的核苷酸或核苷,或者是那些在其糖单元和其含环氮碱基都发生了改性的核苷酸或核苷。例如,脱氧核糖单元的2′-H基或核糖单元的2′-OH基可发生改性,例如,加入2′-F基、2′-O-甲基等。类似的,含环氮的碱基可含有一个或多个通常不出现在腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶上的取代基。具体的例子包括5-甲基胞嘧啶(MeG)、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
这里使用的术语“发酵”是指在有氧或厌氧条件下繁殖或培育微生物细胞的过程。
这里使用的术语“引子培养物”是指用于发酵的培养介质的含微生物细胞的配置物。
在本文中,术语“产率”是指在给定体积的发酵中所产生的生物质量。产率可通过多种途径计算;这里,采用两种不同方法来测量产率。1)为体积的每单位的生物质量(减去背景),在发酵结束时通过1cm光程测量发酵介质的600nm的光学密度(OD600),或者2)通过在实施例2:发酵结束时的分析过程QAm-043中描述的Pearce测试中的具有“酸化活性”为4.8-5.1的F-DVS培养物来测量其kg数。
术语“F-DVS”是指在实施例1中描述的所谓的冷冻直投式培养物。
术语“卟啉化合物”是指环状四吡咯衍生物,这些衍生物的结构延伸自卟啉,由各种功能基团取代位于吡咯核心的顶点处的碳原子而得。它们也指所述衍生物的复合物,其中,由金属原子与卟啉环的四个氮原子中的两个形成配位键。该定义包括但不限于:尿卟啉、粪卟啉、原卟啉和血卟啉,以及它们的盐和酯及与金属原子的复合物。特别优选的卟啉化合物是原卟啉IX和它与铁原子的复合物,特别是血红素和氯化血红素,以及叶绿素的衍生物,如叶绿酸。
在本文中,词句“乳酸菌”(LAB)是指由革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非运动的、微嗜氧或厌氧菌组成的一组细菌,它们对糖进行发酵,所产生的酸中包括乳酸为主要产生的酸,并包括醋酸、甲酸和丙酸。工业上最为有用的乳酸菌是属于乳球菌属(Lactococcus species(spp.))、链球菌属(Streptococcusspp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、乳酸片球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)和丙酸菌属(Propionibacterium spp.)中的乳酸菌。此外,属于严格厌氧菌群的产乳酸菌中的双歧杆菌(bifidobacteria),即双歧杆菌属,常被单独用作食物引子培养物或与乳酸菌结合使用,通常被包括在乳酸菌组中。甚至是某些葡萄球菌(例如,肉葡萄球菌(S.carnosus)、马胃葡萄球菌(S.equorum)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、小牛葡萄球菌(S.vitulinus)、木糖葡萄球菌(S.xylosus))属中的细菌也被称为LAB(Mogensen等(2002)Bulletin oftheIDF No.377,10-19)。
通常用作LAB引子培养物菌株的乳酸菌被大致分为嗜温有机物,其最适宜的生长温度在约30℃,以及嗜热有机物,其最适宜的生长温度范围是在约40到约45℃之间。典型的属于嗜温性的有机物包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacasei subsp.paracasei)。嗜热性乳酸菌的菌种包括如,嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lacti s)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
在介质中的产率增加剂的浓度可由于如进入到微生物细胞中的含量而随着时间而发生改变,因此有必要指明要进行测量或确定产率增加剂的浓度的特定的时间点。因此,用于描述介质中的产率增加剂的浓度的术语“起始”是指在介质中加入微生物细胞进行培养前的介质中的产率增加剂的浓度,或者是指在介质中刚加入微生物细胞进行培养后的介质中的产率增加剂的浓度。
根据本发明的引子培养物的一个重要的应用是作为所谓的益生菌。在本文中,术语“益生菌”应被理解为那些以活细胞的形式而被人或动物摄食后,可提供改善的健康条件,例如通过增强免疫系统或帮助消化营养物而抑制胃肠道中有害的微生物。这样的有益生作用的产物的一个典型例子是“甜酸奶”。
以下仅通过实施例对本发明的实施方式进行描述。
附图说明
图1示出了在厌氧条件下进行3个嗜热链球菌(S.thermophilus)的发酵的产率;附图示出了在发酵器中,测量的生物质量为非浓缩的发酵介质样品的OD600对时间(小时)的函数。实心三角表示加入了0.2%w/w IMP,实心圆表示加入了0.2%w/w的肌苷,实心方块表示没有加入产率增加剂。0.2%w/w的肌苷大约为7mM的肌苷;
图2在包含相对大量的嘌呤的富含复合物的介质中,在发酵过程中的多种核化合物和光学密度的水平;简言之,乳酸乳球菌(菌株CHCC2862)在包含酵母提取物和其它复合物成分的复合物介质中进行有氧生长。以μM表示的浓度(主轴)和OD600(次轴)对时间作图。缩写:G,鸟嘌呤;A,腺嘌呤;Hx,次黄嘌呤;X,黄嘌呤;IR,肌苷;GR,鸟苷;GdR,脱氧鸟苷;AR,腺苷;
图3在加入了2g/L的肌苷的介质中的发酵过程中的嘌呤化合物的水平;简言之,除了向每升介质中加入了2g的肌苷外,乳酸乳球菌(菌株CHCC2862)在与图2相同的复合物介质中进行有氧生长。以μM表示的浓度(主轴)和OD600×100(次轴)对时间作图。注意,肌苷的水平是由次轴表示。缩写:G,鸟嘌呤;A,腺嘌呤;Hx,次黄嘌呤;X,黄嘌呤;IR,肌苷;GR,鸟苷;GdR,脱氧鸟苷;AR,腺苷,和IR,肌苷(注意以不同的轴表示肌苷)。
具体实施方式
根据本发明的解决问题的方案是提供制备LAB的微生物培养物的方法,以获得在高光学密度条件下增加的产率,该方法是在有氧条件下,在含有至少一种产率增加剂的介质中发酵培养物,该产率增加剂选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。
并不限于任何理论,可以认为产率的增加与至少一种产率增加剂在整个发酵的过程中一直存在于发酵介质中的情况有关。观察到当介质中的产率增加剂被耗尽时,导致了多种酶系统的重新合成(见实施例6),并可以认为这种耗能的重新合成导致了产率的降低。
这种至少一种产率增加剂在整个发酵的过程中一直存在于发酵介质中的情况可通过起始的含有足量的产率增加剂的介质中培育LAB,从而保证至少一种这样的试剂在整个发酵的过程中始终保留于介质中。这样的介质例如可以是起初含有至少1mM,优选至少3mM,更优选至少3mM的至少一种产率增加剂的培养介质,这些产率增加剂选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。
这样的介质可通过使用那些特别是富含产率增加剂的成分来配置,这些产率增加剂选自由一种或多种涉及核酸的生物的化合物或者是由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。一种这样的成分可以是酵母提取物,特别是所谓的“富集的”或“增强的”酵母提取物制剂,其特别富含嘌呤和/或嘧啶。
除了使用富含产率增加剂的制剂来配置介质外,也可向标准的介质配方中加入纯的制剂。例如,培养介质可以是复合发酵介质,向每升介质中加入至少0.2g,优选为至少0.8g,更优选为至少2g的至少一种产率增加剂。
也可通过在发酵中一次或多次加入所述至少一种产率增加剂,从而保证在整个发酵的过程中至少有一种产率增加剂保留于介质中。
本发明在许多工业界采用的高光学密度条件下尤为有用。在本发明的选择的实施方式中,所述高光学密度条件的特征是在发酵结束时,OD600高于15,优选高于20,更优选高于30,进一步优选高于40,最优选高于50。
在优选的实施方式中,其中所述本发明第一方面方法中获得的微生物的产率增加至少1.2倍,优选为增加至少1.3倍,更优选为增加至少1.4倍,进一步优选为增加至少1.5倍,最优选为增加至少1.6倍。
根据本发明,微生物是在有氧条件下进行发酵。优选的,微生物培养物在通气和营养介质中进行发酵,介质中含有或加入了至少一种卟啉化合物。在优选的实施方式中,LAB在通气条件下于含卟啉的营养介质中培育,这在WO00/0542中有描述,其中,所述介质进一步含有至少一种产率增加剂,其选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。WO00/0542作为参考附件。本领域的技术人员可用熟知的技艺进行通气,例如,通过摇动或搅拌培养介质,或通过向培养介质中通入含有氧的如空气的气体混合物。
在优选的实施方式中,所述产率增加剂是选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸,以及它们的衍生物组成的组。
所述产率增加剂可以是嘌呤碱基,优选是选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤组成的组。
所述产率增加剂可以是嘧啶碱基,优选是选自由胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的组。
所述产率增加剂可以是核苷,优选的是,其中所述核苷是选自由腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧肌苷组成的组。
在优选的实施方式中,所述核苷是选自由腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、胸苷和肌苷组成的组。最优选的是,其中所述的核苷是肌苷。
所述产率增加剂可以是核苷酸,优选的,所述核苷酸是选自由腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞苷单磷酸(CMP)、黄嘌呤单磷酸(XMP)、肌苷单磷酸(IMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧黄嘌呤单磷酸(dXMP)和脱氧肌苷单磷酸(dIMP)组成的组。
在优选的实施方式中,所述核苷酸是选自由AMP、GMP、UMP、CMP、XMP和IMP组成的组。最优选的,所述核苷酸是IMP。
一优选的实施方式是,所述培养介质包含至少两种产率增加剂,优选是选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组。
优选的,所述培养介质包含至少两种产率增加剂,选自由核苷和核苷酸组成的组。最优选的是,其中所述核苷是肌苷,所述核苷酸是IMP。
一优选的实施方式是,其中所述培养介质起始为包含1-70mM的各产率增加剂。
更优选的,其中所述培养介质起始为包含1-60mM的各产率增加剂,例如1.3-60mM,如1.5-50mM,优选为2-40mM,如2.5-30mM,例如3-20mM,更优选为3-15mM,例如4-10mM,如约7mM。
令人吃惊的是,通过本发明的方法,有时可获得浓度足以用于生产F-DVS而无需浓缩培养物的LAB培养物。但是,即使采用本方法,但大多数培养物需经过浓缩而获得商用的引子培养物。这样的培养物可优选通过离心或超过滤而收集和浓缩。
在一优选的实施方式中,微生物的培养是在高光学密度条件的工业相关条件下进行的。
因此,一优选的实施方式是培养物的高光学密度(OD)在600nm的1cm光程介质中达到OD600=10-OD600=200,更优选的是OD600=15-OD600=100,进一步优选的是OD600=20-OD600=90,最优选的是OD600=25-OD600=80。
另外,优选的实施方式中,培养过程是在含有5L-100,000L,优选300L-20,000L的培养介质的大式发酵器中进行。
一优选的实施方式中,培养过程包括控制温度和/或pH。
优选的,培养物包括一种或多种有机物,选自由双歧杆菌属(Bifidobacteriumspp.)、短杆菌属(Brevibacterium spp.)、丙酸菌属(Propionibacterium spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)(包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris,))、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)(包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus))、链球菌属(Streptococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、乳酸片球菌属(Pediococcus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)和酒球菌属(Oenococcusspp.)。
培养物可包含一种或多种最适宜的生长温度在约30℃的嗜温有机物,优选一种或多种选自由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostocmesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)和副干酪乳酸杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)组成的组中的嗜温有机物。
培养物可包含一种或多种最适宜的生长温度在约40℃到约45℃的嗜热有机物,优选一种或多种选自由嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)组成的组中的嗜热性有机物。
优选的培养物是LAB-培养物,其包含一种或多种选自由乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcusspp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、乳酸片球菌属(Pediococcus spp.)和双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)组成的组中的有机物。
培养物可以是LD-培养物,其包含一种或多种选自由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)和肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp.cremoris)组成的组中的有机物。
培养物可以是O-培养物,其包含一种或多种选自由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactissubsp.cremoris)组成的组中的有机物。
在优选的实施方式中,培养物中含有乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
商业的引子培养物通常可以冷冻的培养物的形式供给。在低温下,在这样的冷冻的培养物中,通常细胞的大部分代谢活动停止,但细胞可在该悬浮液中在一段延长的时间内维持其活力。
由于浓缩的冷冻培养物可直接在生产容器中进行培养,从而在商业上非常吸引人。通过使用这样的浓缩的冷冻培养物,最终用户消除了费时费力的中间发酵步骤,在该步骤中,引子培养物经扩增,且最终用户还进一步减少了烈性污染的危险。这样的浓缩的培养液可被称为DVS-直投式TM培养物。
也可以制备FD-DVSTM,浓缩的冻干的直投式TM培养物来代替浓缩的冷冻培养物。这样的培养物具有额外的优势,它们的优点是可不用冷冻而进行运输。
因此,在一优选的实施方式中,用于制备产率增加的微生物培养物的方法如下所述并进一步包括:
iii)冷冻所述收集的微生物以获得冷冻的微生物细胞。
所述方法可进一步包括:
iv)从所述冷冻的细胞中使水分升华以获得冻干的细胞。
换句话说,其中所收集的微生物培养物转化为冻干的细胞培养物。
该方法可进一步包含:
v)包装由上述步骤iii)或i v)中获得的细胞。
通常观察到冷冻和解冻对活的细胞的存活能力会产生破坏性影响。这些影响一般被描述为细胞脱水和在冷冻过程中在细胞溶质中形成冰晶。
然而,可使用若干冷冻保护剂来保证在可控的和造成最低伤害的形式下进行冷冻,例如保证在冷冻过程中细胞溶质中不发生冰晶化或将冰晶化抑制到最小。
优选的,向收集的微生物中加入至少一种冷冻保护剂。
优选的,冷冻保护剂是选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。优选的适合于加入到收集的微生物中的优选的冷冻保护剂的例子基本上对应于在此描述的优选的产率增加剂。向收集的微生物中加入冷冻保护剂在早先提出的专利申请PCT/DK2004/000477中有过描述。在PCT/DK2004/000477中描述的优选的冷冻保护剂也是本发明中的优选的冷冻保护剂。PCT/DK2004/000477的全部内容在此并入作为参考。
本发明的另外的实施方式是在此描述的制备产率增加的微生物培养物的方法,并进一步包含通过喷雾干燥、真空干燥、空气干燥或任何适用于干燥细菌培养物的干燥方法来干燥收集的微生物。
优选的本发明的第二方面的引子培养物是以引子培养物浓缩物的形式提供,例如含有至少108CFU的引子培养物有机物。
本发明的第三方面涉及一种培养介质,其包含至少一种产率增加剂,选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸以及它们的衍生物组成的组。尽管在发酵过程中大量的产率增加剂被消耗,仍有足够量的保留于培养物的上清液中以确保浓缩的培养物可被确认为本方法得出的介质(见实施例5或6)。
优选的本发明的第四方面的食物制品是选自由奶制品、蔬菜制品、肉制品、饮料、果汁、酒和焙烤制品组成的组。
优选的奶制品是选自由奶酪、酸奶、黄油和接种的甜奶和液体发酵乳制品组成的组。
在一有趣的方面,本发明提供了获得产率增加的由微生物产生的化合物的方法,所述方法包含以下步骤:
i)在含有至少一种选自由一种或多种涉及核酸的生物合成的化合物或任何这样的化合物的一种或多种衍生物组成的组中的产率增加剂的培养介质中培养微生物;以及
iii)获得所述由微生物产生的化合物,
其中,与在相同介质中当没有可测量的产率增加剂条件下培养微生物的情况相比,产率增加剂导致了由微生物产生的化合物的产率的增加。
由所述的微生物产生的化合物包括但不限于:酶、蛋白质、代谢物、糖脂类、抗生素、细菌素、氨基酸、味素、挥发物。这些化合物可通过重组DNA技术或其它传统方法生产。
本发明进一步通过以下的非限制性实施例和附图加以说明。
实施例
实施例1:在三种不同类型的培养介质中进行发酵的产率
为了说明向已经富集的并优化的介质中加入额外的含嘌呤的化合物的作用,比较了三种类型的工业级规模的培养物。
所有的三种类型的培养物菌株营养介质中进行有氧培育,在该介质中,至少有一种卟啉化合物存在,或如在国际专利申请WO00/05342(EMIL方法)那样被添加,并且,在所有的情况下,这种培养物是所谓的“O-培养物”,其包含乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)。O-培养物通常被用于制作无孔奶酪(Cheddar,Cheshire,Feta)。具体的培养物可通过商业渠道获得,商品名为R604,由Hansen A/S,Hoersholm,Denmark(目录号:200113)提供。
三种介质示于表1中。
指定的培养物 | 基础培养介质 | 加入的酶提取物 | 其它添加物 |
旧的EMIL(Old EMIL) | BD-5-ex3* | 1.7%w/w标准酵母提取物** | |
新的EMIL(New EMIL) | BD-5-ex3* | 1.7%w/w新的酵母提取物** | |
超级EMIL(Super EMIL) | BD-5-ex3* | 1.7%w/w新的酵母提取物** | 0.2%w/w IMP***0.2%w/w肌苷 |
*BD-5-ex3是根据WO00/05342和WO01/52668的优化的含卟啉的培养介质。
**标准酵母提取物和新的酵母提取物是两种可通过商业渠道获得的酵母提取物。
***IMP是:肌苷-5′-单磷酸(IMP)(Alsiano A/S,Birkeroed,DK)。
肌苷是:肌苷(Alsiano A/S,Birkeroed,DK)。
培养过程是在550L或10,000L的工业发酵槽中在30℃下,使用0.5%(w/w)的上述作为接种体的培养物进行的。发酵是按WO00/05342中所描述那样在有氧条件下进行。发酵物可酸化到pH为6.2。然后,通过可控地添加13.4NNH4OH而将pH维持在6.2。
当没有进一步的碱的消耗被检测出时,冷却相应的培养物到约10℃。
冷却后,培养介质中的细菌通过离心被浓缩到6-18倍,然后在液氮中1个大气压下冷冻成小球,制成所谓的冷冻直投式培养物(F-DVS)。F-DVS小球被储存在-50℃待进一步分析。
通过两种不同方式来确定发酵的产率,1)通过以在600nm测量的光学密度(OD600)表示的获得的生物质量,或者2)通过在实施例2:分析过程QAm-043中描述的Pearce测试中的具有“酸化活性”为4.8-5.1的F-DVS培养物的kg数。
结果示于下表2中。
表2.以OD600测量的发酵产率
指定的培养物 | 增强剂 | 菌体量(OD600) | 每kg F-DVS每100L介质的产率* |
旧的EMIL(Old EMIL) | 32 | 5.56 | |
新的EMIL(New EMIL) | 45 | 8.33 | |
超级EMIL(Super EMIL) | 0.2%w/w IMP0.2%w/w肌苷 | 76 | 16.67 |
*根据Pearce测试,F-DVS的酸化活性为4.8-5.1
结论:
从这些结果可以看出,在培养介质中于有氧发酵开始前加入由0.2%w/wIMP和0.2%w/w肌苷组成的增强剂,可增加产率。
实施例2:分析过程QAm-043,酸化活性-“程序化温度分布”Chr.Hansen A/S(Denmark)。
应用
本方法被用于根据Pearce测试的酸化活性的确定。Pearce测试被IDF标准(国际乳制品标准)采用。
原理
酸化是根据反应出温变过程的温度分布而进行的,这是培养物被用作生产乳制品时通常会遇到的。
对于Pearce测试而言,这是在生产切达干酪(Cheddar)时的干酪生产温度。pH在固定时间测量
对于那些在分析过程中不加入粗制凝乳酶的培养物,可采用连续的pH测量。
分析参数
分析参数根据产品的特异性,其在LIMS中给出。
温度分布的定义(对于不使用Pearce测试的产品而言)。
使用对照物标准。
pH测量的类型。
对样品和对照物标准的接种百分比。
稀释牛奶:206.9g冷(4℃)LAB-奶(即,UHT-灭菌的重建脱脂奶(RSM),其含有9.5%(w/w)固体物质,并在99℃加热30分钟)。
活性奶:200g冷(4℃)的灭菌全脂奶,脂肪含量3.5%。
粗制凝乳酶:Naturén标准190用水稀释成1∶40。
装置和试剂
pH仪/用于半连续pH测量的pH仪eks.RadiometerPHM92。
pH电极放射计PFC2401。
缓冲剂:pH7.00±0.01和pH4.01±0.01。
水浴,带恒温程序在预测的温度分布±0.2℃下加热。
温度传感器。
秤,精确到0.01g(至少两位小数)。
计时器。
磁搅拌器。
磁铁。
烧杯,50ml。
小塑料杯。
旋转装置。
过程
分析准备
所有瓶子均为统一批号,即同一天生产。
水浴先调节到要使用的温度分布的起始温度。
用于稀释的瓶子(=第一称重)以及用于活性(第二称重)在使用前放置在4℃。
在校准pH仪前,pH4.01和pH7.00的缓冲液先放置在特定温度±0.2℃的水浴中至少30分钟。
分析前样品的准备。
冷冻培养物:
冷冻样品/对照标准在首次称重前置于在带有干冰的泡沫盒子中,并保存于其中,直到所有的称重完成。
冷冻的培养物在使用前先解冻:
对于冷冻产品,当整盒被用时,根据当前的指示对产品解冻。
融化后,使用前的样品可在4℃最长保持30分钟。
冻干的培养物:
冻干的样品和对照标准置于室温下至少15分钟再进行分析。
如果样品要在次日再次测试,可在+8℃储存。
接种过程
直接在奶中称量产品/对照标准的重量。
接种体(第一次称重)的实际量至少取到小数点后两位。
小心翻转冷冻的和解冻的产品4次,然后,让瓶子站立约50秒。
对冻干的产品,必须使用旋转装置。必须以常速驱动5分钟或直到产品完全溶解。这可通过将瓶子留在桌子上一段时间,然后观察瓶底来检查溶液进行控制。
注意:
如果工作起来方便的话,在第二次称重前,冷的首次称重的瓶子可在室温下放置最多15分钟。
第二次称重:
在进行第二次称重前,翻转稀释瓶。
接种体(第二次称重)的实际量至少取到小数点后两位。
翻转活性瓶,并按样品/对照物标准反复进行接种过程。
那些从相同的第一次称重开始接种的活性瓶接着进行接种。
在第二次称重之前或之后向每个瓶中加入2ml的粗制凝乳酶。在翻转这些瓶子的同时,粗制凝乳酶也被搅动。
然后,如6中所描述的那样,同时对瓶子进行接种。
最后,将2个未接种的奶瓶放在水浴中;一个用于测量水浴温度,另一个用于测量空白奶的pH。
培育
注意:当需要更多的水浴时,对照物标准和相应的样品必须在相同水浴中进行培育。
所有的活性瓶都在同一时间,在预热到预定起始温度的水浴中进行培育。
温度分布在放入瓶子到水浴中的时候开始启用。
此后,培育温度通过恒温程序控制,该程序对应于以后的特定的温度分布。对于Pearce测试,见表3.
水浴中的水平面应当比奶的表面高出至少2cm。
表3.在Pearce谱中的温度程序(IDF之后)
时间,分钟 | 温度,℃ | 误差 |
0 | 31.0 | ±0.2℃ |
50 | 31.0 | ±0.2℃ |
54 | 31.7 | ±0.5℃ |
58 | 32.2 | ±0.5℃ |
62 | 32.8 | ±0.5℃ |
66 | 33.3 | ±0.5℃ |
70 | 33.9 | ±0.5℃ |
73 | 34.4 | ±0.5℃ |
76 | 35.0 | ±0.5℃ |
79 | 35.6 | ±0.5℃ |
82 | 36.1 | ±0.5℃ |
85 | 36.7 | ±0.5℃ |
87.5 | 37.2 | ±0.5℃ |
90 | 37.8 | ±0.2℃ |
360 | 37.8 | ±0.2℃ |
pH电极的校准
根据当前关于电极校准和维护的指示,对起始温度进行校准。pH的测量
培育后,瓶子充分摇动并测量pH。
pH的测量在瓶子中或将样品倒入到50ml的烧杯中,在磁铁搅拌下进行。
pH值取到小数点后两位。
可记下测量中可能的注释。
测量过程持续到所有的样品/对照标准和未培育的奶均被测量过为止。
最后缓冲液中的pH经测量并记下。
连续的pH的测量
从温度分布开始时采集瞬间的pH值。在培育完成后,记录在起始温度下两种缓冲液中的pH测量值。
实施例3:标准厌氧的高-OD条件下进行的乳酸乳球菌发酵的产率
为了说明向已经富集的并优化的介质中加入额外的含嘌呤的化合物的效果,比较了两种不同类型的工业级规模的发酵,一种中加入了0.3%w/w的肌苷,另一种中没有。
培养物:
该试验使用可通过商业渠道获得的R604培养物(Chr.Hansen A/S,Hoersholm,Denmark(目录编号:200113))进行。
发酵介质:
发酵物在具有以下组合物的介质中进行培养:干酪素水解物(Oxoid,Basingstoke,UK,产品代号L41),30g/l;Primatone RL(Quest,Naarden,TheNetherlands,产品代号5X59051),30g/l;大豆胨(Oxoid,Basingstoke,UK,产品代号L44),30g/l;酵母提取物(Oxoid,Basingstoke,UK,产品代号L21),15g/l;MgSO4,1.5g/l;抗坏血酸钠,3g/l;和乳糖50g/l。
介质用UHT-处理进行灭菌(143℃8秒)。完成的介质的pH为6.5。
培养物的发酵条件:
培养是在550L的工业发酵槽中在30℃下,使用1%(w/w)的上述作为接种体的培养物进行的。在高OD条件下,发酵基本上是厌氧的。培养物允许酸化到pH为6.0。然后,通过可控地添加13.4NNH4OH而将pH维持在6.0。当没有进一步的碱的消耗被检测出时,冷却相应的培养物到约10℃
冷却后,培养介质中的细菌通过离心被浓缩到6-18倍,然后在液氮中1个大气压下冷冻成小球,制成所谓的冷冻直投式发酵剂培养物(F-DVS)。F-DVS小球被储存在-50℃待进一步分析。
通过两种不同方式来确定发酵的产率:
1)通过以在600nm测量的光学密度(OD600)表示的获得的生物质量,或者
2)通过每100L发酵介质中F-DVS培养物的kg数,其中培养物通过在实施例2:分析过程QAm-043中描述的Pearce测试中的具有“酸化活性”为4.8-5.1。
结果示于下表4中。
表4.
指定的培养物 | 发酵介质中额外的添加物 | 以OD600表示的产率 | 根据Pearce§的产率 |
PP11145 | 无 | 25.1 | 4.95 |
PP11146 | 0.3%w/w肌苷@ | 25.2 | 4.98 |
@肌苷是:肌苷(Alsiano A/S,Birkeroed,DK)。
§见实施例2
结论:
从这些结果可以看出,在培养介质中于压氧发酵开始前加入由0.3%w/w肌苷组成的增强剂,未导致产率的增加。
实施例4:标准厌氧的高-OD条件下进行的嗜热链球菌发酵的产率
本试验是为研究向用于高OD-条件下厌氧发酵的已经富集的并优化的介质中加入额外的含嘌呤的化合物的效果。在当前的试验中,制备了三种嗜热链球菌的培养物,一种是向介质中加入了0.2%w/w的肌苷,另一种是向介质中加入了0.2%w/w的IMP,而最后一种是没有向介质中加入额外的含嘌呤的化合物。
培养物:
本试验使用可通过商业渠道获得的嗜热链球菌的培养物CHQ-18(Chr.Hansen A/S,Hoersholm,Denmark)进行。
发酵介质:
发酵物是在基于复合物介质的组分、BioSpringer酶提取物207、Arla脱脂奶粉(Milex240)和乳糖的富集的介质中进行培养。
介质通过UHT-处理进行灭菌(143℃8秒)。完成的介质的PH值为6.0。
培养物的发酵条件:
培养过程是在3L的搅动式发酵槽中在40℃下,使用0.1%(w/w)的上述作为接种体的培养物进行的。pH通过添加13.4N NH4OH而维持在6.0。通过从顶部空间通入氮气(1.51/min)而确保厌氧条件。搅拌条件是300rpm。
发酵的产率通过以采集的未浓缩样品在600nm测量的光学密度(OD600)表示的获得的生物质量计算。
这3种发酵的结果示于下图1中。
结论:
从这些结果可以看出,加入由0.2%w/w肌苷或0.2%w/w IMP组成的增强剂,未导致产率的增加。
实施例5:采用化学分析方法检测发酵中多余核化合物的存在
虽然乳酸菌通常对嘌呤和嘧啶而言是原养型的,但仍可合成这些化合物,从而细胞可在发酵中利用可获得的外生的嘌呤和嘧啶源。具体的,所有的常规嘌呤核化合物均可在约OD15时就被完全消耗(见图2)。有趣的是,尽管嘌呤化合物已被耗尽,生物质量的增加仍可持续到约OD45。类似的结果也在嘧啶化合物中出现(数据未示出)。这表明,发酵液(即无细胞的发酵物)在生产结束时是不含嘌呤和嘧啶化合物的。
在另一方面,在生长介质中加入了过量的肌苷,该化合物,和/或相应的核碱基次黄嘌呤(由于肌苷的水解而产生)将会在生长结束时出现在发酵液中(见图3)。该过量的核化合物可在发酵液中轻易地探测出。
为了生产如F-DVS等,细胞在发酵物中需要浓缩若干倍。尽管F-DVS中的细胞水平是发酵物中的几倍高,在F-DVS中仍存在很大量的发酵液。该纯的发酵液可通过进一步浓缩细胞而获得。用于分离发酵液的方法可以是通过除霜F-DVS,然后使用过滤器或在离心中使用比生产F-DVS更高的g-力。
用少量的可获得的纯液可测试在发酵物中是否有核化合物的存在,从而得知是否该化合物被过量加入到发酵介质中。该检测方法可是传统的HPLC(如见http://www.laubscherlabs.com/Presentation/YMC%20ODS-AQ.pdf),其中,常用的核碱基和核苷(胞嘧啶、胞苷、尿嘧啶、脱氧胞苷、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、黄嘌呤、胸腺嘧啶、肌苷、鸟苷、脱氧肌苷、脱氧鸟苷、黄嘌呤核苷、胸苷、腺苷和脱氧腺苷)可容易地被探测出。其它的可用的方法可用于探测相应的核苷酸。在发酵液中任何这些化合物的存在将清楚表明发酵是在根据本发明进行的。
实施例6:使用蛋白体学(proteomics)来探测发酵物中过量核化合物的存在
在生长过程中,细胞需要嘌呤和嘧啶核苷酸的持续流动来合成RNA和DNA。这些核苷酸可从介质(回收)进行外生地供给,或从更简单的化合物进行重新合成。对于重新合成,特异性的重新合成基因必须被表达。相反,当存在外生源时,这些基因不需要被表达。
在嘌呤的重新合成中,大约涉及10个基因产品。以前发现与在乳酸乳球菌的嘌呤的重新合成有关的purDEK操纵子受到约35倍的调节,而这取决于存在/不存在外生嘌呤源(Nilsson和Kilstrup1998)。并且,还发现在2D蛋白质凝胶上的若干嘌呤重新合成蛋白的存在/不存在取决于是否有外生嘌呤源(Gitton等2005)。
为了确立检测在介质中存在/不存在外生嘌呤的具体方法,我们在含1%葡萄糖的确定的SA介质中接种乳酸乳球菌乳酸亚种CHCC2862。该介质中不含核化合物(Jensen和Hammer1993)。将培养物设定在30℃,在有和没有0.2%肌苷的情况下过夜培育。然后,呈指数生长的细胞在新鲜介质中进行接种,其OD600约为0.1。在OD为0.8(指数生长)时,且在静止阶段,收集细胞,并产生2D蛋白质凝胶。
通常,在pH范围4-7下,在凝胶上可检测到约3-400个蛋白质点。在OD0.8时,在没有肌苷时,少于10个点是从培养物中获得的,当在有肌苷时,没有(或非常微弱的)点是从培养物中获得的。这些点出现/不出现的模式表明相应的蛋白质仅在没有外生嘌呤源时才存在。仅出现在由无嘌呤的培养物中产生的凝胶上的4个最强的点被进行凝胶内消化和质谱确认。这些蛋白质被确认为:purH(双功能嘌呤生物合成蛋白质),purM(磷酸核糖基氨基咪唑合成酶(phosphoribosylaminoimidazole synthase)),yphF(磷酸核糖基甲酰甘氨脒合成酶(phosphoribosylformylglycinamidine synthase PurS)和fhs(甲酰四氢叶酸合成酶(formyltetrahydrofolate synthetase))。这三种基因purH,purM和yphF(purS)的基因产物均直接与嘌呤的重新生物合成有关,其中,fhs涉及一个碳原子单元的形成,其用于嘌呤的重新合成。对于处于静止阶段的细胞,这与F-DVS中的情况类似,也获得了类似的无/有模式。总而言之,这表明在介质中存在过量的核化合物可使用蛋白体学探测出。
尽管本实施例展示了如何探测产率增加的嘌呤,对过量嘧啶的存在也可类似地进行。因此,蛋白体学可用于提供强而有力的证据来证明发酵是否是根据本发明所述进行。
材料和方法
以下描述的方法是基于以前公布的标准方法(Fey等1998;Vido等2004;Gitton等2005)。
无细胞的提取物的制备。细胞通过离心和在冰冷的10mM Tris-HCl,pH7,0.25M庶糖中洗两次而收集。细胞被转移到2mL的Eppendorf管,其中含有约1.0g玻璃珠(0.25-0.50mm),并在混合器中摇动6分钟两次。然后,在10,000rpm下离心提取物5分钟,并将250-300μL的上清液转移到新的Eppendorf管中。上清液再次在15,000rpm下离心5分钟,除了试管底部的10-20μl外,全部转移到另一个新的Eppendorf管中。从1M的原液中加入DTT到最终浓度为10mM,并将溶解产物冷冻储存在-20℃。
2D凝胶电泳(等电子聚焦和凝胶电泳)。对每个凝胶,通过氯仿/甲醇沉淀75-300μg的蛋白质,并再次悬浮到190μl的再水合的缓冲液(8M尿素,50mMDTT,4%CHAPS,0.2%载体两性电解质)中。一维是在pH4-7和pH4.7-5.9的11cm IPG带(Bio-Rad)上,在有活性再水合之下运行12小时,然后对11cm带在Protean IEF槽(Bio-Rad)上进行标准程序。对pH3.9-5.1的带,在带被再水合后重新将蛋白质以杯状加载。经过IEF电泳后,带或者在-20℃冷冻储存,或者直接备用于二维的电泳。
在二维PAGE前,用SDS缓冲液处理带,第一次在DTT下15分钟,第二次在过量IAA下15分钟。然后,通过琼脂糖封粘,将带附着于10-20%和12.5%的聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad的Criterion Tris-HCl),二维在通量电泳槽(Criterion Dodeca Cell)上在200V下运行1小时。凝胶在BioSafe Coomassie中染色,并在显像密度计GS-800(Bio-Rad)上扫描。
蛋白质的确认。对所选点的蛋白质的确认通过凝胶内消化和用质谱进行肽谱和氨基酸含量的分析达到。产生的数据进一步被用于在公众数据库中检索具有类似性能的蛋白质(AlphalyseA/S,Odense,Denmark)。
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Claims (48)
1.有氧和高光学密度条件下发酵,获得增加产率的乳酸菌培养物的方法,该方法包括以下步骤:
i)在培养介质中于一定条件下培育乳酸菌,使得发酵进行到在600nm测定的光学密度(OD600)为10,其中,所述培养介质包含至少一种产率增加剂,其选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组,其浓度为确保在发酵结束时培养介质含有至少1μM的所述至少一种产率增加剂;以及
ii)收集所述乳酸菌以获得乳酸菌培养物,
其中,比起在相同条件下和相似介质中的在发酵结束时含有少于1μM的各产率增加剂来培养微生物的产率,产率增加剂增加了收集到的乳酸菌的产率。
2.根据权利要求1的方法,其中,所述培养介质最初含有至少1mM的至少一种产率增加剂,其选自由一种或多种用于核酸的生物合成中的化合物或者由任何这样的化合物的一种或多种衍生物所组成的组。
3.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,所述培养介质是复合物发酵介质,向每升该介质中加入至少0.2g的至少一种产率增加剂。
4.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,所述至少一种产率增加剂是在发酵过程中加入的。
5.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,所述高光学密度的条件的特征是在发酵结束时OD600高于15。
6.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,所述产率增加至少1.2倍。
7.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,微生物培养物在通气和营养介质中进行发酵,介质中至少含有或加入一种卟啉化合物。
8.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,所述产率增加剂是选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸,以及它们的衍生物组成的组。
9.根据权利要求8的方法,其中,所述产率增加剂是嘌呤碱基,该嘌呤碱基优选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤组成的组。
10.根据权利要求8的方法,其中,所述产率增加剂是嘧啶碱基。
11.根据权利要求10的方法,其中,所述嘧啶碱基是选自由胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的组。
12.根据权利要求1-7的方法,其中,所述产率增加剂是核苷。
13.根据权利要求12的方法,其中,所述核苷是选自由腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧肌苷组成的组。
14.根据权利要求13的方法,其中,所述核苷是选自由腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷和肌苷组成的组。
15.根据权利要求14的方法,其中,所述核苷是肌苷。
16.根据权利要求1-7的方法,其中,所述产率增加剂是核苷酸。
17.根据权利要求16的方法,其中,所述核苷酸是选自由腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞苷单磷酸(CMP)、黄嘌呤单磷酸(XMP)、肌苷单磷酸(IMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧黄嘌呤单磷酸(dXMP)和脱氧肌苷单磷酸(dIMP)组成的组。
18.根据权利要求17的方法,其中,所述核苷酸是选自由AMP、GMP、UMP、CMP、XMP和IMP组成的组。
19.根据权利要求18的方法,其中,所述核苷酸是IMP。
20.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,所述培养介质包含至少两种产率增加剂,选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸和它们的衍生物组成的组。
21.根据权利要求20的方法,其中,所述培养介质包含至少两种产率增加剂,选自由核苷和核苷酸组成的组。
22.根据权利要求21的方法,其中,所述核苷是肌苷,所述核苷酸是IMP。
23.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,所述培养介质起始包含1-70mM的各产率增加剂。
24.根据权利要求23的方法,其中,所述培养介质起始包含1-60mM的各产率增加剂,例如1.3-60mM,如1.5-50mM,优选为2-40mM,如2.5-30mM,例如3-20mM,更优选为3-15mM,例如4-10mM,如约7mM。
25.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养介质的OD600达到一光学密度为OD600=10-OD600=200,更优选的是OD600=15-OD600=100,最优选的是OD600=20-OD600=80。
26.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养过程是在含有5L-100,000L,优选300L-20,000L的培养介质的大式发酵器中进行。
27.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养过程包括控制温度和/或pH。
28.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养物包括一种或多种有机物,选自由双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸菌属、包括乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的乳球菌属、包括嗜酸乳杆菌的乳酸杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳酸片球菌属、明串珠菌属和酒球菌属组成的组。
29.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养物包含一种或多种具有最适宜的生长温度在约30℃的嗜温有机物。
30.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养物包含一种或多种选自由乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜明串珠菌乳脂亚种、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种、干酪乳杆菌干酪亚种和副干酪乳杆菌副干酪亚种组成的组中的嗜温有机物。
31.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养物包含一种或多种具有最适宜的生长温度在约40℃到约45℃的嗜热有机物。
32.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养物包含一种或多种选自由嗜热链球菌、屎肠球菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜酸性乳杆菌组成的组中的嗜热有机物。
33.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养物是LD-培养物,其包含一种或多种选自由乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种和肠膜明串珠菌乳脂亚种组成的组中的有机物。
34.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养物是O-培养物,其包含一种或多种选自由乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种组成的组中的有机物。
35.根据前述任意一项权利要求的方法,其中,培养物包含乳酸乳球菌。
36.根据前述任意一项权利要求的方法,所述方法进一步还包括:
iii)冷冻所述收集的微生物以获得冷冻的微生物细胞。
37.根据权利要求36的方法,所述方法进一步还包括:
iv)从所述冷冻的细胞中使水分升华以获得冻干的细胞。
38.根据权利要求36或37的方法,所述方法进一步还包括:
v)包装由上述步骤iii)或iv)中获得的细胞。
39.根据权利要求35-38中任意一项的方法,其中,向收集的微生物中加入至少一种冷冻保护剂。
40.根据权利要求1-39中任何一项的方法可获得的引子培养物。
41.根据权利要求38的引子培养物,其中,引子培养物是以引子培养物浓缩物的形式提供。
42.根据权利要求40-41的引子培养物,其包含至少108CFU的引子培养物有机物。
43.一种培养介质,其包含至少一种产率增加剂,选自由嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷、核苷酸以及它们的衍生物组成的组。
44.根据权利要求43的培养介质,其中,所述介质如前述任何权利要求所定义。
45.一种制备食物制品、饲料制品、医药制品、奶味制品和奶酪味制品的方法,该方法包括向食物制品、饲料制品或医药制品的起始材料中加入根据权利要求38-44的有效量的微生物引子培养物,并使如此接种的起始材料保持在微生物具有代谢活性的条件下。
46.根据权利要求45的方法,其中,食物制品是选自由奶制品、蔬菜制品、肉制品、饮料、果汁、酒和焙烤制品组成的组。
47.根据权利要求44的方法,其中,奶制品是选自由奶酪、酸奶、黄油、接种的甜奶和液体发酵的奶制品组成的组。
48.由权利要求45-47中任意一项的方法可获得的发酵的食物制品、饲料制品或医药制品。
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