CN104726510B - 一种发酵制备赖氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵制备赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成赖氨酸的条件下，将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氯化铵的条件下，进行发酵培养，初始培养基中SO₄ ^2‑的含量为10‑16克/升。本发明方法，发酵结束后收集得到的赖氨酸发酵液可去除菌体后直接浓缩结晶得到赖氨酸成品，不需要经过离子交换、脱氨等工序，缩短了提取工艺路线，降低了原辅料消耗，不产生废水，降低了提取成本，且不影响赖氨酸的生产能力。

Description

一种发酵制备赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵制备赖氨酸的方法。

背景技术

赖氨酸作为动物体的第一限制性氨基酸，不仅是合成蛋白质不可缺少的成分，而且参与体内的能量代谢，能促进生长发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。

由于纯赖氨酸在空气中难以结晶，易潮解，所以市场上的赖氨酸产品一般是以赖氨酸盐酸盐的形式存在。

赖氨酸主要是通过发酵法生产，在发酵过程中需要补充一定量的碳源和氮源，以满足菌体生长和代谢生成赖氨酸的需要。无机氮源对于微生物的生长相当重要，尤其是铵态氮是微生物的速效氮源。现有技术中通常采用硫酸铵配制发酵培养基，一般每升发酵培养基中，硫酸铵的用量为20-40克，并且在发酵过程中一般单独流加硫酸铵作为赖氨酸发酵的无机氮源，以保证发酵过程中发酵液中的氮的浓度为0.35-0.8克/升。

目前赖氨酸发酵液提取工艺普遍采用连续离交分离的方法提取赖氨酸，该方法包括先将赖氨酸发酵液去除菌体，然后向赖氨酸清液中加入大量的浓硫酸调节pH为1.5-3.0，然后用铵型阳离子交换树脂进行吸附交换，水洗涤以漂洗杂质，用稀氨水对赖氨酸进行洗脱，洗脱下来的赖氨酸经浓缩、调节pH、结晶、烘干后得到赖氨酸成品。

在现有的提取赖氨酸的工艺中，调节赖氨酸清液的pH时，需要消耗大量的硫酸，用氨水洗脱时又要消耗大量的液氨，对树脂进行水洗涤的时候又会产生大量的废水，增加了环保的负担，并造成了资源的浪费，而且在分离过程中会造成树脂破碎流失，对分离设备性能要求高。此工艺路线长，原辅料消耗大，且产生大量难处理的废水，造成成本高，制约了赖氨酸行业的发展。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中赖氨酸发酵液提取工艺的工艺路线长，原辅料消耗大，且产生大量难处理的废水，成本高等缺陷，提供一种新的发酵制备赖氨酸的方法，采用该方法发酵结束后收集得到的发酵液可缩短提取工艺路线，降低原辅料消耗，不产生废水，降低提取成本。

本发明的发明人在研究中意外发现，当在流加碳源和流加氯化铵的条件下进行发酵培养，初始培养基中SO₄ ^2-的含量为10-16克/升时，发酵结束后收集得到的赖氨酸发酵液去除菌体后直接浓缩结晶即可得到赖氨酸成品，不需要经过离子交换、脱氨等工序，且不影响赖氨酸的生产能力。

因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种发酵制备赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成赖氨酸的条件下，将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氯化铵的条件下，进行发酵培养，初始培养基中SO₄ ^2-的含量为10-16克/升。

优选地，所述流加碳源的量使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在5-10克/升，所述流加氯化铵的量使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.35-0.8克/升。

本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法，发酵结束后收集得到的赖氨酸发酵液可去除菌体后直接浓缩结晶得到赖氨酸成品，不需要经过离子交换、脱氨等工序，缩短了提取工艺路线，降低了原辅料消耗，不产生废水，降低了提取成本，且不影响赖氨酸的生产能力。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种发酵制备赖氨酸的方法，该方法包括在生成赖氨酸的条件下，将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氯化铵的条件下，进行发酵培养，初始培养基中SO₄ ^2-的含量为10-16克/升。

本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的液体培养基（该液体培养基也即本发明中所称发酵培养基），经过一段时间的培养后所得产物。

本发明中，初始培养基指的是接种前的发酵培养基。对于初始培养基，只要保证其中SO₄ ^2-的含量为10-16克/升即可，对于其他成分和含量无特殊要求，可以采用本领域常用的赖氨酸发酵培养基的常规组分和用量，例如，可以用淀粉质原料糖化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制发酵培养基。根据本发明，硫酸铵和硫酸镁的用量使初始培养基中SO₄ ^2-的含量为10-16克/升，硫酸铵和硫酸镁的重量比为1:0.01-0.03，除了硫酸铵和硫酸镁以外的各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升发酵培养基中，淀粉质原料糖化清液的用量可以为40-60克，糖蜜的用量可以为30-50克，玉米浆（干重为20-50重量%）的用量可以为20-40克，磷酸氢二钾的用量可以为0.5-1.5克，苏氨酸的用量可以为0.1-0.3克，蛋氨酸的用量可以为0.1-0.3克，谷氨酸的用量可以为0.2-0.4克。

本发明中，对于流加碳源和流加氯化铵的量无特殊要求，可以采用本领域常规的流加量，例如，流加碳源的量使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在5-10克/升，流加氯化铵的量使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.35-0.8克/升。

此处“流加碳源的量使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在5-10克/升，流加氯化铵的量使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.35-0.8克/升”是指通过控制流加碳源和流加氯化铵的速度来使在整个发酵培养过程中培养基中还原性糖的浓度维持在5-10克/升，使培养基中氮的浓度维持在0.35-0.8克/升。

本发明中，发酵液中氮的浓度以铵根离子的浓度表示时，氮的浓度控制在0.35-0.8克/升，则铵根离子的浓度控制在0.5-1.0克/升。

发酵过程就其本质来说是由微生物参与的生物化学反应过程，因此微生物细胞的数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响。菌体浓度的大小对发酵产物的产率有着重要的影响。理论上菌体浓度越大，产物的产量也越大，但是菌体浓度过高会产生其他影响，如营养物质消耗过快，发酵液中的营养成分发生明显的改变，如有毒物质的积累等，这些可能改变菌体的代谢途径。因此，本发明中，以接种后且流加碳源和流加氯化铵之前的发酵培养基为基准，赖氨酸发酵菌种的接种量优选为12-18体积%。

本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸发酵菌种在被接种至发酵培养基中之前，采用常规方法将赖氨酸发酵菌种经过种子罐培养，在种子罐培养的培养程度可以通过取样显微镜镜检、OD（optical density）值测定对产赖氨酸微生物的生长进行观察，当通过上述方法观察菌体形态正常、测定OD值达到0.75以上时停止培养，将此时种子罐中的种子液称为成熟种子液。然后再将成熟种子液接入发酵培养基中。因此，本发明中，赖氨酸发酵菌种的接种量为12-18体积%，指的是接入发酵培养基中的成熟种子液的体积占接入成熟种子液后发酵培养基体积的12-18%。

本发明中，OD值为被测种子液吸收的光密度，可以反映种子液中赖氨酸发酵菌种的数量，因此，本领域中一般均采用OD值来表示种子液中赖氨酸发酵菌种的数量，本发明也沿用本领域的采用OD值来表示种子液中赖氨酸发酵菌种的数量的习惯。且本发明中，OD值为将种子液进行26倍稀释，采用722N可见光分光光度计，在波长562纳米可见光下测定的吸光值。

种子罐培养可以采用一级种子罐培养也可以采用二级种子罐培养，一级种子罐培养即将赖氨酸发酵菌种在一个种子罐中一直培养到所需的培养程度；二级种子罐培养即先将赖氨酸发酵菌种在一个种子罐中培养一段时间后再转入另一个种子罐继续培养，培养到所需的培养程度。二级种子罐培养在各个种子罐的培养时间没有具体限定，只要最终能培养到所需的培养程度即可。为了操作方便，本发明的种子罐培养优选采用一级种子罐培养。

本发明中，对于种子罐培养基的成分无特殊要求，可以采用本领域常用的种子罐培养基，例如，可以用淀粉质原料糖化清液、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵、苏氨酸和蛋氨酸等配制种子罐培养基。根据本发明，每升种子罐培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升种子罐培养基中，淀粉质原料糖化清液的用量可以为30-40克，玉米浆（干重为20-50重量%）的用量可以为70-90克，磷酸氢二钾的用量可以为0.5-1.5克，硫酸镁的用量可以为0.4-1.1克，硫酸铵的用量可以为5-15克，苏氨酸的用量可以为0.1-0.6克，蛋氨酸的用量可以为0.1-0.3克。

本领域技术人员应该理解的是，接入种子罐进行培养的菌种为经过活化后进行增殖培养后的菌种。活化和增殖培养为本领域的公知常识，在此不再赘述。

本发明的发明人在实验中发现，发酵过程中，对于碳源和氯化铵的流加方式，连续流加比间歇流加的发酵效果好，因此，本发明中碳源和氯化铵的流加方式均优选为连续流加。

本发明中，发酵培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行发酵培养。为了有效利用发酵罐的产能，接种后且流加碳源和流加氯化铵之前发酵罐中的培养基的体积优选为发酵罐体积的40-60%，随着流加碳源和流加氯化铵，发酵罐中的发酵液的体积逐渐增大，为了保证发酵罐中的空气量，优选为流加碳源和流加氯化铵至发酵罐体积的70-80%时放料，为了保证放料后发酵罐中的菌种数量，不影响放料后发酵罐中的发酵培养，放料体积优选为放料前发酵罐中发酵液体积的5-10%。

本发明中，优选发酵培养42-54小时后放罐。本发明中的放罐是指将发酵罐中的发酵液全部从发酵罐中放出，即停止发酵。

本领域技术人员应该理解的是，由于放料和放罐的发酵液中均含有发酵产生的赖氨酸，发酵结束后，应该将放料的发酵液和放罐的发酵液混合用于后续提取赖氨酸。因此，本发明中，“发酵结束后收集得到的发酵液”指的是发酵结束后，将放料的发酵液和放罐的发酵液混合得到的混合物。

由于本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法相对于现有技术的改进主要在于在流加碳源和流加氯化铵的条件下进行发酵培养，初始培养基中SO₄ ^2-的含量为10-16克/升，因此对于本发明方法的其他条件和操作没有特别的要求。例如，对于发酵培养的条件可以采用本领域常用的条件，优选为：温度为35-38℃，压力为0.05-0.1MPa，pH值为6.7-7.0，通气量为0.5-1.2立方米空气/立方米的培养基/分钟。

本发明中，对赖氨酸发酵菌种的种类无特殊要求，可以采用本领域常用的菌种，优选为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和黄色短杆菌中的至少一种。

本发明中，碳源优选为淀粉质原料糖化清液。

本发明中，淀粉质原料糖化清液既可以采用干法制糖工艺制备，也可以采用湿法制糖工艺制备。从工艺简单、设备投资少，生产成本较低的方面考虑，优选通过干法制糖工艺制备。干法制糖工艺是指淀粉质原料不经浸泡直接进行破碎和酶解。

干法制糖工艺可以包括：将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。优选地，粉碎使淀粉质原料过30目筛的通过率大于75%，更优选过30目筛的通过率为100%。调浆的方法为本领域技术人员所熟知，但优选地，调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17Bé°。术语“波美度”是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数。

根据本发明，在第一次水解中，以每克粉碎后的产物的干重计，淀粉酶的用量可以为10-30酶活力单位，酶解的温度可以为88-92℃，酶解的时间可以为90-120分钟，酶解的pH值可以为5.5-6.0。固液分离的条件没有特别的限定，优选地，固液分离的条件使得到的液相组分中的固含量为19-22重量%，更优选为20-21重量%。

根据本发明，在第二次水解中，以每克液相组分计，糖化酶的用量可以为110-130酶活力单位，酶解的温度可以为55-65℃，酶解的时间可以为420-600分钟，酶解的pH值可以为4.0-4.5。

本发明酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原性糖所需的酶量为一个酶活力单位。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1,4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶。

根据本发明，糖化酶优选为α-1,4-葡萄糖水解酶。

按照本发明，淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类（如木薯）和小麦中的一种或几种。

根据本发明方法发酵结束后收集得到的发酵液可去除菌体后直接浓缩结晶得到赖氨酸成品，不需要经过离子交换、脱氨等工序，具体方法例如可以为：将本发明方法发酵结束后收集得到的发酵液调pH值至5.0-6.0后通过陶瓷膜或碟片离心机去除菌体，得到浊度为10-30NTU的赖氨酸清液，将得到的赖氨酸清液调pH值至4.5-6.0，然后在温度为35-60℃，真空度为-0.07至-0.1Mpa的条件下蒸发浓缩结晶，控制晶体含量为30-65重量%，然后固液分离并将所得固体在80-100℃下烘干至含水量小于等于1.0重量%，即得赖氨酸盐酸盐成品。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

在下述实施例和对比例中：

OD值测定：将种子液进行26倍稀释，采用722N可见光分光光度计，在波长562纳米可见光下测定吸光值，即为OD值。

按照GB/T5009.7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度。

按照GB3595-83的方法测定发酵液中铵根离子的浓度。

采用戴安公司ICS-2500型离子色谱仪测定发酵液中SO₄ ^2-的含量。

按照GB10794-89标准检测发酵液中的赖氨酸浓度（以赖氨酸盐酸盐计）。

单罐供酸量=（放罐的赖氨酸浓度×放罐体积+中间放料赖氨酸浓度×中间放料体积）。

转化率（%）=单罐供酸量/总糖的重量×100%，其中总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。

按照GB8245-87标准检测L-赖氨酸盐酸的干燥失重和赖氨酸盐酸盐含量。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

（1）将收获的100重量份玉米通过机械加工将玉米颗粒粉碎，使玉米粉过30目筛的通过率为80%。

（2）将粉碎后的产物加水调浆至12Bé°，相对于每克粉碎产物的干重，加入20个酶活力单位的淀粉酶（α-淀粉酶，诺维信公司），在90℃、pH为5.5的条件下酶解100分钟，得到酶解产物。其中，将酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液（固含量为20重量%）；之后加入115个酶活力单位的糖化酶（α-1,4-葡萄糖水解酶，诺维信公司），在60℃、pH为4.5的条件下酶解420分钟，得到淀粉质原料糖化清液。

（3）使用步骤（2）得到的淀粉质原料糖化清液配制种子罐培养基，具体组成为：相对于每升种子罐培养基，淀粉质原料糖化清液的用量为35克，玉米浆（干重为35重量%）的用量为80克，磷酸氢二钾的用量为1.0克，硫酸镁的用量为0.5克，硫酸铵的用量为10克，苏氨酸的用量为0.2克，蛋氨酸的用量为0.2克。将培养基加热到121℃消毒，维持20分钟后降温至31℃并保持恒定。开启搅拌，调节罐压为0.1MPa，按照通风量与培养基1:0.5体积比通入无菌空气，用氨水调节pH至6.8并保持恒定。然后将黄色短杆菌（菌株原种FB42购自江南大学）活化和增殖后接入种子罐中进行培养，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养，得到成熟种子液。

（4）使用步骤（2）得到的淀粉质原料糖化清液配制发酵培养基，具体组成为：相对于每升发酵培养基，淀粉质原料糖化清液的用量为50克，糖蜜（产地新疆）的用含量为40克，玉米浆（干重为35重量%）的用量为30克，硫酸铵的用量为18克，磷酸氢二钾的用量为1.0克，硫酸镁的用量为0.54克，苏氨酸的用量为0.2克，蛋氨酸的用量为0.2克，谷氨酸的用量为0.3克。培养基加热到121℃消毒30分钟后降温至31℃并保持恒定，用氨水调节pH至6.9。测定配制好的发酵培养基（即初始培养基）中SO₄ ^2-的含量为13.52克/升。

（5）在发酵罐中装入步骤（4）配制好的发酵培养基，发酵培养基体积为发酵罐体积的50%。使用步骤（3）所得的成熟种子液，接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，步骤（3）所得的成熟种子液的接种量为15体积%。接种后连续流加步骤（2）得到的淀粉质原料糖化清液和氯化铵，流加步骤（2）得到的淀粉质原料糖化清液的量使发酵过程中培养基中的还原性糖的浓度控制在6-8克/升，流加氯化铵的量使发酵过程中培养基中铵根离子的浓度控制在0.6-0.8克/升，将罐压控制为0.1MPa，发酵温度控制为37℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节pH维持在6.9进行发酵培养，流加步骤（2）得到的淀粉质原料糖化清液和氯化铵至发酵罐体积的75%时放料，放料体积为放料前发酵罐中发酵液体积的8%。发酵培养48小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度（即终点赖氨酸含量，下同）和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

（6）将放罐的发酵液和中间放料的发酵液混合得到发酵结束后收集得到的发酵液，加盐酸调pH至5.5，利用碟片离心机进行固液分离，得到pH5.4、浊度12NTU的赖氨酸清液，将赖氨酸清液加盐酸微调pH至4.9，加入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度40℃、真空度为-0.09Mpa，当浓缩的赖氨酸晶浆液中的晶体含量达到50重量%时，进行离心分离，将湿晶体在100℃下烘干至含水量为1.0重量%，得到赖氨酸盐酸盐成品，测定赖氨酸盐酸盐成品的含量见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

淀粉质原料糖化清液的制备方法、种子罐培养基配方、种子罐成熟种子液培养方法均与实施例1相同。

使用制得到的淀粉质原料糖化清液配制发酵培养基，相对于每升发酵培养基，硫酸铵的用量为15克，硫酸镁的用量为0.15克，其他组分及其用量均与实施例1相同。培养基加热到121℃消毒30分钟后降温至31℃并保持恒定，用氨水调节pH至6.9。测定配制好的发酵培养基（即初始培养基）中SO₄ ^2-的含量为11.03克/升。

发酵罐中的培养基体积为发酵罐体积的40%。将成熟种子液接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，种子液的接种量为12体积%。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和氯化铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使发酵过程中培养基中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加氯化铵的量使发酵过程中培养基中铵根离子的浓度控制在0.5-0.7克/升，将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为38℃，通气量为0.8立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节pH维持在6.7进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和氯化铵至发酵罐体积的70%时放料，放料体积为放料前发酵罐中发酵液体积的5%。发酵培养42小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

将放罐的发酵液和中间放料的发酵液混合得到发酵结束后收集得到的发酵液，加盐酸调pH至5.7，利用碟片离心机进行固液分离，得到pH5.5、浊度13NTU的赖氨酸清液，将赖氨酸清液加盐酸微调pH至5.1，加入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度48℃、真空度为-0.07Mpa，当浓缩的赖氨酸晶浆液中的晶体含量达到45重量%时，进行离心分离，将湿晶体在80℃下烘干至含水量为0.9重量%，得到赖氨酸盐酸盐成品，测定赖氨酸盐酸盐成品的含量见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

淀粉质原料糖化清液的制备方法、种子罐培养基配方、种子罐成熟种子液培养方法均与实施例1相同。

使用制得到的淀粉质原料糖化清液配制发酵培养基，相对于每升发酵培养基，硫酸铵的用量为21克，硫酸镁的用量为0.42克，其他组分及其用量均与实施例1相同。培养基加热到121℃消毒30分钟后降温至31℃并保持恒定，用氨水调节pH至6.9。测定配制好的发酵培养基（即初始培养基）中SO₄ ^2-的含量为15.61克/升。

发酵罐中的培养基体积为发酵罐体积的60%。将成熟种子液接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，种子液的接种量为18体积%。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和氯化铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使发酵过程中培养基中还原性糖的浓度控制在8-10克/升，流加氯化铵的量使发酵过程中培养基中铵根离子的浓度控制在0.8-1.0克/升，将罐压控制为0.05MPa，发酵温度控制为35℃，通气量为0.6立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节pH维持在7.0进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和氯化铵至发酵罐体积的80%时放料，放料体积为放料前发酵罐中发酵液体积的10%。发酵培养54小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

将放罐的发酵液和中间放料的发酵液混合得到发酵结束后收集得到的发酵液，加盐酸调pH至6.0，利用碟片离心机进行固液分离，得到pH5.7、浊度11NTU的赖氨酸清液，将赖氨酸清液加盐酸微调pH至5.3，加入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度55℃、真空度为-0.1Mpa，当浓缩的赖氨酸晶浆液中的晶体含量达到40重量%时，进行离心分离，将湿晶体在90℃下烘干至含水量为0.8重量%，得到赖氨酸盐酸盐成品，测定赖氨酸盐酸盐成品的含量见表1。

对比例1

按照实施例1的方法制备赖氨酸发酵液，不同的是，使用制得到的淀粉质原料糖化清液配制发酵培养基，相对于每升发酵培养基，硫酸铵的用量为30克，硫酸镁的用量为0.5克，其他组分及其用量均与实施例1相同。测定配制好的发酵培养基（即初始培养基）中SO₄ ^2-的含量为22.21克/升。接种后连续流加步骤（2）得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加硫酸铵的量使发酵过程中培养基中铵根离子的浓度控制在0.6-0.8克/升。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

将放罐的发酵液和中间放料的发酵液混合得到发酵结束后收集得到的发酵液，向发酵结束后收集得到的发酵液中加盐酸调pH至5.5，利用碟片离心机进行固液分离，得到pH5.4、浊度12NTU的赖氨酸清液。向赖氨酸清液中加入大量的浓硫酸调节pH为2.0，用铵型阳离子交换树脂进行吸附交换，树脂吸附饱和后用水洗涤以漂洗杂质，然后用稀氨水对树脂中吸附的赖氨酸进行洗脱，洗脱下来的赖氨酸在90℃、-0.09Mpa下经脱氨塔浓缩脱氨，然后加盐酸调pH至4.9，加入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度40℃、真空度为-0.09Mpa，当浓缩的赖氨酸晶浆液中的晶体含量达到50重量%时，进行离心分离，将湿晶体在100℃下烘干至含水量为1.0%，得到赖氨酸盐酸盐成品，测定赖氨酸盐酸盐成品的含量见表1。

对比例2

将对比例1得到的发酵结束后收集得到的发酵液加盐酸调pH至5.5，利用碟片离心机进行固液分离，得到pH5.4、浊度12NTU的赖氨酸清液，将赖氨酸清液加盐酸微调pH至4.9，加入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度40℃、真空度为-0.09Mpa，当浓缩的赖氨酸晶浆液中的晶体含量达到50重量%时，进行离心分离，将湿晶体在100℃下烘干至含水量为1.0%，得到赖氨酸盐酸盐成品，测定赖氨酸盐酸盐成品的含量见表1。

对比例3

按照实施例1的方法制备赖氨酸发酵液，不同的是，使用制得到的淀粉质原料糖化清液配制发酵培养基，相对于每升发酵培养基，硫酸铵的用量为23克，硫酸镁的用量为0.69克，其他组分及其用量均与实施例1相同。测定配制好的发酵培养基（即初始培养基）中SO₄ ^2-的含量为17.27克/升。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。按照实施例1的方法从发酵结束后收集得到的发酵液中提取赖氨酸，测定赖氨酸盐酸盐成品的含量见表1。

表1

将实施例1与对比例1进行比较可以看出，采用本发明方法发酵结束后收集得到的发酵液，去除菌体后直接浓缩结晶，不经过离子交换、脱氨等工序，得到的赖氨酸盐酸盐的含量与现有技术采用常规发酵培养基并流加硫酸铵发酵结束后收集得到的发酵液经过离子交换、脱氨等工序得到的赖氨酸盐酸盐的含量相当，且不影响赖氨酸的生产能力；从对比例2可以看出，现有技术流加硫酸铵得到的赖氨酸发酵液不经过离子交换、脱氨等工序，将极大降低得到的赖氨酸盐酸盐的含量；将实施例1与对比例3进行比较可以看出，从发酵结束后收集得到的发酵液中提取赖氨酸，去除菌体后直接浓缩结晶得到赖氨酸成品，不经过离子交换、脱氨等工序，只有在流加碳源和流加氯化铵的条件下，进行发酵培养，初始培养基中SO₄ ^2-的含量为10-16克/升，才不会影响得到的赖氨酸盐酸盐的含量。

本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法，发酵结束后收集得到的赖氨酸发酵液可去除菌体后直接浓缩结晶得到赖氨酸成品，不需要经过离子交换、脱氨等工序，缩短了提取工艺路线，降低了原辅料消耗，不产生废水，降低了提取成本，且不影响赖氨酸的生产能力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.一种发酵制备赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成赖氨酸的条件下，将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氯化铵的条件下，进行发酵培养，硫酸铵和硫酸镁的用量使初始培养基中SO₄ ^2-的含量为10-16克/升，硫酸铵和硫酸镁的重量比为1:0.01-0.03，所述流加碳源的量使发酵过程中发酵液中的还原性糖的浓度控制在5-10克/升，所述流加氯化铵的量使发酵过程中发酵液中的氮的浓度控制在0.35-0.8克/升，所述赖氨酸发酵菌种为黄色短杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，以接种后且流加碳源和流加氯化铵之前的发酵培养基为基准，所述赖氨酸发酵菌种的接种量为12-18体积％。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，碳源和氯化铵的流加方式均为连续流加。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养在发酵罐中进行，接种后且流加碳源和流加氯化铵之前发酵罐中的培养基的体积为发酵罐体积的40-60％，流加碳源和氯化铵至发酵罐体积的70-80％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养基体积的5-10％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，发酵培养42-54小时后放罐。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养的条件为：温度为35-38℃，压力为0.05-0.1MPa，pH值为6.7-7.0，通气量为0.5-1.2立方米空气/立方米的培养基/分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述碳源为淀粉质原料糖化清液。