WO1999011810A1

WO1999011810A1 - Procede de production d'uridine diphosphate-n-acetylglucosamine

Info

Publication number: WO1999011810A1
Application number: PCT/JP1998/003561
Authority: WO
Inventors: Kenji Takenouchi; Kazuya Ishige; Yuichiro Midorikawa; Kiyoshi Okuyama; Tomoki Hamamoto; Toshitada Noguchi
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 1999-03-11
Also published as: JP3545425B2; EP0971035A4; DE69811871D1; KR100481763B1; EP0971035A1; CA2270211A1; KR20000068859A; EP0971035B1; DE69811871T2; CN1276837A; CN1167804C; CA2270211C; US6287819B1

Description

明細書ゥリジンニリン酸— N—ァセチルグルコサミンの製造法技術分野

本発明は、オリゴ糖合成の重要な基質であるゥリジンニリン酸一 N—ァセチルグルコサミン（U D P A G ) の製造法に関するものである。背景技術

近年、糖鎖についての研究が急速に進み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有するオリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発が注目を集めている。しかし、現在市販されているオリゴ糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでしか製造できず、必ずしもその大量製造法が確立されているとは限らない。

従来、オリゴ糖の製造は天然物からの抽出法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれらの併用により行われていたが、その中でも酵素合成法が大量製造に適した方法であると考えられている。すなわち、（ 1 ) 酵素合成法が化学合成法にみられる保護、脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的のォリゴ糖を合成できる点、（ 2 ) 酵素の基質特異性により、きわめて構造特異性の高いオリゴ糖を合成できる点などが他の方法より有利と考えられるためである。さらに、近年の組換え D N A技術の発達により種々の合成酵素が安価にしかも大量に生産できるようになりつつあることが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げる結果となっている。

酵素合成法によりオリゴ糖を合成する方法としては、ォリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の 2通りの方法が考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い単糖を用いることができるという利点はあるものの、反応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点では必ずしも最良の方法とは考えられていない。

一方、後者は糖転移酵素を用いる合成法であり、合成収率や複雑な構造を持つォリゴ糖合成への応用といった点で前者の方法よりも有利であると考えられており、また、近年の組換え D N A技術の進歩により各種糖転移酵素の量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。

しかしながら、糖転移酵素を用いる合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部のものを除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないのが現状である。多くの生理活性糖鎖のコア部分に含まれる N—ァセチルグルコサミンの供与体である U D P A Gについても耐浸透圧性酵母を用いる方法などが報告されているものの（特開平 8 - 2 3 9 9 3号公報）、工業的生産の現実化までにはまだまだ検討の余地が残されている。

本発明者らは、酵母中での U D P A Gの生合成経路に関して詳細に検討した結果、グルコサミンがグルコサミン一 6 リン酸、 N—ァセチルグルコサミン一 6 リン酸を経て N—ァセチルグルコサミンー 1 リン酸まで活性化される一連の反応経路の中でグルコサミン— 6 リン酸から N—ァセチルグルコサミンー 6 リン酸へのァセチル化反応が律速段階となっているのではないかと考えた。このため、 N— ァセチルグルコサミンー 6 リン酸を基質とすれば U D P A Gの合成効率は向上できるものと考えられるものの、この物質を安価にしかも大量に入手することは現時点では不可能である。

そこで、現時点において安価にしかも大量に入手可能な N -ァセチルグルコサミンを基質として用いることができれば、律速段階であるァセチル化反応を経なくてすみ、グルコサミンよりも理想的な基質となり得ると考え、栃倉らにより報告されているゥリジル酸（U M P ) と N—ァセチルグルコサミンを基質として用いた酵母による U D P A Gの製造方法（特公昭 4 9 - 8 2 7 8号公報：栃倉法）について検討を行った。しかしながら、グルコサミンよりも N—ァセチルグルコサミンを基質として用いた方が UDPAGの生成量が減少し、全く生成しないか、ごく僅かの U D P A Gしか製造できないという栃倉らの報告を再確認したに過ぎないものであった。

したがって、本発明は、 N ァセチルグルコサミンを基質として用いた場合であっても収率よく UDPAGを製造できる方法を提供することを目的とするものである。発明の開示

本発明者らは上記目的を達成すべく研究を重ねた結果、（ 1 ) N -ァセチ儿グルコサミンをリン酸化する酵素活性が酵母中にはほとんどないか、あってもごく微弱であり、このために N ァセチルグルコサミンは基質となりえないが、反応系に N ァセチルグルコサミンのリン酸化酵素である N ァセチルグルコサミンキナーゼを共存させることで効率的に UDPAGが合成できること、（2) さらに N ァセチルグルコサミン · ホスフヱ一トムターゼ及び/またはゥリジンニリン酸— N ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを添加することにより、 N —ァセチルグルコサミンキナ一ゼ単独の時よりも UD P AGの収率を向上させることができること、（3) N ァセチルグルコサミンキナーゼ、 N ァセチ几グルコサミン · ホスフェートム夕一ゼ及びゥリジンニリン酸 N ァセチルク' '儿コサミンピロホスホリラーゼを用いることにより、ゥリジン三リン酸（UTP) から UDPAGが効率的に合成できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、微生物菌体を用いて UMP及び N ァセチルグルコサミンから UDPAGを製造する方法において、 N ァセチルグルコサミンキナーゼを共存せしめることを特徴とする UDPAGの製造法を提供するものである。また、本発明は、酵素を用いて UT P及び N ァセチルグルコサミンから UDPAGを製造する方法において、酵素として N ァセチルグルコサミンキナ —ゼ、 N—ァセチルグルコサミン ' ホスフエ一トム夕一ゼ及びゥリジン二リン酸 —N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを併用することを特徴とする UDPA Gの製造法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、 Bacillus stearothermophi lus ATCC15952 由来の N—ァセチルグルコサミンキナーゼを共存させたときの UDP AG生成量の経時変化を示したものでめる。

図 2は、 Escherichia coli I AMI 268 由来の N—ァセチルグルコサミンキナーゼを共存させたときの UD P AG生成量の経時変化を示したものである。

図 3は、 Klebsiella planticola IF03317 由来の N—ァセチルグルコサミンキナ一ゼを共存させたときの UDP AG生成量の経時変化を示したものである。図 4は、枯草菌 Ml 68株由来の組換え N—ァセチルグルコサミンキナ一ゼを共存させたときの UD P AG生成量の経時変化を示したものである。

図 5は、枯草菌 Ml 68株由来の組換え N—ァセチルグルコサミンキナーゼ、パン酵母由来の組換え N—ァセチルグルコサミン ' ホスフエ一トムターゼ、および Zまたは大腸菌 E 1 02株由来の組換え UDP AGピロホスホリラーゼを共存させたときの UDP AG生成量の経時変化を示したものである。なお、図中、 ① は酵母と N—ァセチルグルコサミンキナーゼ、 ②は酵母と N—ァセチルダルコサミンキナ一ゼと N—ァセチルグルコサミン · ホスフエ一トム夕一ゼ、 ③は酵母と N—ァセチルグルコサミンキナーゼと UDP AGピロホスホリラ一ゼ、 ④は酵母と N—ァセチルグルコサミンキナーゼと N—ァセチルグルコサミン · ホスフヱ一トム夕一ゼと U D P A Gピロホスホリラ一ゼを組み合わせたときの結果を示したものである。

図 6は、枯草菌 Ml 68株由来の組換え N—ァセチルグルコサミンキナーゼ、 '酵母由来の組換え N—ァセチルグルコサミンホスフエート ·厶夕一ゼ、および/または大腸菌 E 1 0 2株由来の組換え UD PAGピロホスホリラ一ゼを共存させた時の UDP AG生成量の経時変化を示したものである。発明を実施するための最良の形態

本発明は、上述したように、微生物菌体を用いて UMP及び N—ァセチルグルコサミンから UDP AGを製造する方法において、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼを共存せしめて UDP AGを製造する方法に関するものである。

反応に使用する微生物菌体としては、糖ヌクレオチドの製造に使用されるものであれば特に制限されない。具体的には、サッカロミセス（Saccharomyces) 属、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces) 属、カンディダ（Candida) 属、トルロプシス（Torulopsis) 属、ハンセヌラ（Hansenula) 属、デバリオミセス (Debaryomyces) 属などの酵母由来の菌体を例示することができる。このような酵母菌体は、生酵母菌体、乾燥酵母菌体いずれであってもかまわないが、反応収率、取扱いの容易性などの点から乾燥酵母菌体を用いるのが好ましい。

反応系に添加する N—ァセチルグルコサミンキナーゼとしては、動物由来、植物由来、微生物由来など、特定の由来のものに限定されず、すべての由来のものを使用することができる。しかし、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来の酵素を使用するのが好都合である。

N _ ァセチルグルコサミンキナーゼは、カンディダ（Candida) 属 (Biochemica et Biophysica Acta, 614,350(1980)) 、ストレプトコッカス (Streptococcus) 属 (Methods in Enzymology, 9， 415(1966)) 、エッシェリヒァ（Escherichia) 属（Methods in Enzymology, 9, 421 (1966)) 、バンラス (Bacillus) 属、クレブシエラ（Klebsiella) 属など多くの微生物に普遍的に存在し、培養菌体から容易に調製可能である。

また、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼは、常法に従って N—ァセチルグルコサミンキナーゼ遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させる、いわゆる組換え D N A手法により調製することも可能である。

反応系に添加する N—ァセチルグルコサミンキナーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。

微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、バシラス ' ステァロサ一モフィラス（Baci l lus stearothermophi lus) またはクレブシヱラ ' プランティコラ（Klebsiel la plant i cola) に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、 L B培地（ 1 %トリプトン、 0 . 5 %イーストェキストラクト、 1 %食塩）または 2 X Y T培地（ 1 . 6 %トリプトン、 1 %ィ一ストエキストラクト、 0 . 5 %食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、約 3 0〜5 0 °Cで約 1 0〜5 0時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより N—ァセチルグルコサミンキナーゼ活性を有する微生物菌体を調製することができる。

微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壤（ワーリングブレンダ一、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。

酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。

微生物菌体からの N—ァセチルグルコサミンキナーゼの調製法を具体的に説明すれば、集菌して得られた菌体を超音波処理により菌体を破砕し、菌体破壊液を遠心して上清を得、この上清に硫酸アンモニゥ厶を添加し、約 3 0〜5 4 %飽和画分を回収する。回収した沈澱を脱塩後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィ一などの各種クロマトグラフィ一処理を施し、 N—ァセチ儿グルコサミンキナ一ゼ活性画分を濃縮、脱塩することで目的とする酵素調製物を取得することができる。

N—ァセチルグルコサミンキナーゼは反応液に約 0 . 0 0 1ュニット以上、特に約 0 . 0 0 1〜 1 0 0ュニット /m添加するのが好ましい。

本発明の反応に使用する U M Pと N—ァセチルグルコサミンは、市販品を使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約 i〜 2 0 O m M、好ましくは約 1 0〜 1 0 0 m Mの範囲から適宜設定することができる。

本発明においては、無機リン酸とエネルギー源を反応系に添加するのが好ましい。無機リン酸は、リン酸カリウムなどをそのまま使用することもできる力 \ リン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。リン酸緩衝液の P Hは約 6 . 0〜 9 . 0の範囲から適宜設定すればよい。使用濃度は、特に制限されないが、約 1 0〜5 0 O m M、好ましくは約 1 0 0〜 3 0 0 m Mの範囲から適宜設定することができる。エネルギー源としては、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クェン酸などの有機酸を使用することができる。

また、本発明の製造法においては、 N—ァセチルダルコサミンキナーゼの他に反応系に N—ァセチルグルコサミン · ホスフエ一ト厶夕一ゼ及び/またはゥリジンニリン酸ー N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを添加共存させると U D P A Gの収率をさらに向上させることができる。

反応系に共存させる N—ァセチルグルコサミン · ホスフエ一トム夕ーゼまたはゥリジンニリン酸一 N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラ一ゼとしては、動物由来、植物由来、微生物由来など、特定の由来のものに限定されず、すべての由来のものを使用することができる。し力、し、上述した N—ァセチルダルコサミンキナーゼと同様に酵素調製の簡便性などの点から微生物由来の酵素を使用するのが好都合である。また、これらの酵素は、それぞれの酵素の遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させる、いわゆる組換え DNA手法を用いて調製することも可能である。

微生物由来の N—ァセチルグルコサミン · ホスフエ一トム夕一ゼとしては、サッカロミセス (Saccharomyces) 属 (European Journal of Biochemistry, 221, 741(1994)) 、ニューロスポラ（Neurospoa) 属（ Journal of Biolo ical Chemistry, 219, 753(1956)) 、ブラストクラディエラ（Blastocladiel la) 属 (Biochemica et Biophysica Acta, 451, 408(1976)) に属する微生物のほか、市販の乾燥パン酵母から分離した酵母菌などが挙げられる。

また、微生物由来のゥリジン二リン酸— N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼとしては、エッシェリヒァ（Escherichia) 属（Journal of Bacteriology, 175， 6150(1993) ) 、ス夕フイロコッカス（Staphylococcus) 属 (Journal of Biological Chemistry, 234, 1822(1959)) 、サッカロミセス (Saccharomyces) 属 (Agricultural Biological Chemistry, 40， 2275(1976 、ニューロスボラ（Neurospoa) 属（Can. J. Microbiology, 25， 1381(1979)) に属する微生物、大腸菌などが挙げられる。

N—ァセチルグルコサミン ' ホスフエ一トム夕ーゼ、ゥリジンニリン酸一 N— ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼとも N—ァセチルグルコサミンキナーゼと同様に多くの微生物に普遍的に存在し、培養菌体から容易に調製可能である _c 反応系に添加する N—ァセチルグルコサミン · ホスフヱートムタ一ゼ及びゥリジンニリン酸— N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができ、前述した N—ァセチルグルコサミンキナーゼの調製法と同様の方法で調製することかできる。 N—ァセチルグルコサミン · ホスフエ一トムターゼ及び Zまたはゥリジンニリン酸—N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラ一ゼは反応液に約 0. 0 0 1ュニット以上、特に約 0. 1〜 1 0ュニット添加するのが好ましい。

UDPAGは、例えばリン酸緩衝液中に酵母、 UMP、 N—ァセチルグルコサミン、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼ、および必要によりエネルギー源として糖類を添加した反応液に、任意で N—ァセチルグルコサミン . ホスフヱ一トムターゼ及び Zまたはゥリジンニリン酸ー N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを添加し、約 5〜3 0て、好ましくは約 5〜2 5°C中で 1〜5 0時間程度必要により攪拌しながら反応させることにより製造できる。

このようにして得られた UDPAGは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段 (イオン交換ク πマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。

次に、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼ、 N—ァセチルグルコサミン ' ホスフエ一トム夕一ゼおよびゥリジンニリン酸ー N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラ一ゼを用いて UTPと N—ァセチルグルコサミンから UD P AGを製造する方法について説明する。

反応系に添加する N—ァセチルグルコサミンキナーゼ、 N—ァセチルグルコサミン · ホスフェ一トム夕一ゼおよびゥリジンニリン酸— N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼは上述のものを使用することができる。

また、本発明の反応に使用する UTPと N—ァセチルダルコサミンは、市販品を使用することができる。使用濃度としては、たとえばそれぞれ約 1〜2 0 0 mM、好ましくは約 1 0〜 1 0 OmMの範囲から適宜設定することができる。

UDPAGの合成反応は、例えば pH約 6. 0〜9. 0の酸緩衝液中に UTP、 N—ァセチルグルコサミンを添加し、この反応液に上記 3種類の酵素を約 0. 0 0 1ユニット Ζτ^以上、好ましくは約 0. 0 0 1〜 1 0 0ユニット添加共存させ、約 5〜 3 0 °C、好ましくは約 5〜 2 5 で 1〜 5 0時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。

また、得られた UDPAGは、前述したように、糖ヌクレオチドの通常の手段により単離精製することができる。

さらに、本発明方法においては、 UTPの代わりに UTP生成系を UDP AG の反応系に共存させて行うことも可能である。

そのような UTP生成系としては、反応系に UTPを供給できる系であれば特に制限されるものではなく、公知の方法、例えば微生物菌体を用いる方法、酵素を用いる方法等から適宜選択して使用すればよい。

具体的に UTP生成系を例示すれば、微生物菌体を用いる方法としては、ォロチン酸からの UTP生成系（特開平 5— 276974号）等を利用することができる。また、酵素を用いる方法としては、 UTP生成系と ATP再生系とが共役したものを用いるのが好ましく、アデニル酸（AMP) にポリリン酸キナーゼ、アデニレ一トキナ一ゼ及びポリリン酸を作用せしめて AT Pを再生しながら UMPにゥリジル酸キナーゼ、および必要によりヌクレオシドニリン酸キナーゼを作用せしめて U TPを生成する系などを利用することができる。

UT P生成系を利用した UD P AGの合成反応は、基本的には上記の UDP AGの合成反応条件と同じであり、最終的な反応条件は U T P生成反応と UDPAG合成反応がスムーズに進行する条件を小規模試験にて適宜決定すればよい。実施例

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例において、反応液中の UDPAGの定量には HPLC法により行った。すなわち、分離には YMC社製の ODS - AQ 3 1 2カラムを用い、溶出液として 0. 5 Mリン酸一力リゥ厶溶液を用いた。 DNAの調製、制限酵素による切断、 T 4 DNAリガ一ゼによる DNA連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular cloningj (Maniatisら編、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) に従つて行った。制限酵素、 Amp 1 i T a qDNAポリメラ一ゼ、 T4 DNAリガ一ゼは宝酒造（株）より入手した。

実施例 1

( 1 ) N—ァセチルグルコサミンキナーゼの調製

1 07^の 2 丁（ 1. 6 %トリプトン、 1 %イーストエキストラクト、 0. 5 %食塩）に一白金耳の Bacillus stearothermophi lus ATCC15952 を植菌して、 5 0°Cにて 24時間振とう培養した。これを前培養菌体として 5 0 0 容フラスコに入った 1 0 Οτηβの 2 ΧΥΤに植菌して 5 0 °Cにて 1 8時間振とう培養した。 3 リットル（L) の培養液から遠心分離によって菌体を回収し、 5 0 Οττ^ の 1 0 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 0) に菌体を再懸濁した。遠心分離により回収した菌体を、 3 0 Οττ^の PEN ( 5 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 6) 、 1 mM EDTA、 0. 1 mM N—ァセチルグルコサミン）に懸濁したのち、超音波破砕処理により菌体を破砕した。遠心分離により得た上清を粗酵素液とした: 回収された 2 7 0 の粗酵素液には 1. 0 5ュニットの N—ァセチルグルコサミンキナーゼ活性が含まれており、タンパク質あたりの活性は 0. 0 7ュニット Zmgであった。粗酵素液に硫酸アンモニゥ厶 9 0 %飽和溶液を 2 7 0 τηβ添加して冷所で 1時間放置したのち遠心分離にて上清を回収した。回収液に対してさらに 1 3 5 の硫酸アンモニゥム 9 0 %飽和溶液を添加して得た沈殿を回収、

3 0 の Ρ ΕΝに溶解したものを Ρ ΕΝに対して透析して 4 3. の酵素調製物を得た。この酵素標品には 4. 5ユニット 7 の Ν—ァセチルグルコサミンキナーゼ活性が含まれており、タンパク質あたりの活性は 0. 2 1ュニット/ mg であった。

なお、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼ活性は、公知の方法（Methods in Enzymology IX, p415- 425 (1966)) に準じて測定、算出したものである。すなわち、 1 0mM N—ァセチルグルコサミン溶液、 5 0 0mMトリス—塩酸緩衝液（pH 7. 8) 、 l O OmM ATP溶液、 1 0 0 mM塩化マグネシゥム溶液を各々 5 0 ^ずつ分注後、 5 0 _g酵素調製液を添加し、 3 7°Cで 2 0 〜3 0分間反応させる。また、 ATP溶液の代わりに水を用いて同様の反応を行わせ、コントロールとする。

反応液に 5 %硫酸亜鉛溶液および 1 5 O mM水酸化バリウム溶液各々 5 0 0 ^を添加して反応を停止させ、遠心分離にて沈殿を除去後、別の容器に上清 1 6 6〃 ^を分取し、これに 3 3 / ^ホウ酸塩溶液（ 4. 9 5 gのホウ酸を 5 0 の水に溶解し、 1 N水酸化カリウムで p H 9. 1に調整したものを水で 1 0 0 とする）を添加後、 3分間煮沸する。

煮沸後、水で室温まで冷却してから 1 DM B A試薬（ 1 O gの p—ジメチルァミノベンズアルデヒドを 1 0 N塩酸を 1 2. 5 %含む氷酢酸 1 0 0 m に溶解し、これを使用直前に氷酢酸で 1 0倍希釈したもの）を混和し、 3 7 °Cで 2 0分間放置した後、分光光度計で 5 8 5 nmの吸収を測定する。濃度既知の N -ァセチルグルコサミン溶液により作成した検量線より反応液中の残存する N—ァセチルグルコサミンの量を算出し、 3 7でで 1分間に 1 //mo^e の N—ァセチルグルコサミンが消費される活性を 1単位（ュニット）とする。

次に DE AE— トヨパール 6 5 0 M ( 2. 2 x 2 5 cmカラム）による分画を行った。 0〜0. 5 Mの食塩の濃度勾配で溶出して得たフラクションから活性画分を回収したところ、 4 7. の回収液を得た。これに 9 5^の硫酸アンモニゥム 9 0 %飽和溶液を添加して冷所に放置後、遠心分離により沈殿を回収した。 1 5 の PENに沈殿を溶解後、 P ENに対して透析して部分精製酵素 2 1 を得た。これには 6. 8 4ユニットの N—ァセチルグ儿コサミンキナーゼ活性が含まれており、タンパク質あたりの活性は 0.. 9 9ユニット Zmgであった。 (2) UDPAGの合成

2 0 0 mMリン酸緩衝液（p H 8. 0 ) 、 2 0 mM塩化マグネシウム、 3 0 mM 5 ' — UMP、 20 mM N—ァセチルグルコサミン、 l O OmMグルコースおよび所定の活性を含む Bacillus stearothermophi lus ATCC15952 由来の N—ァセチルグルコサミンキナーゼ調製物（部分精製酵素）を含む反応液 1 0 に乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業） l gを添加し、 20°Cで撹拌しつつ反応をつた。

経時的に反応液の分析を行った結果を図 1に示す。図 1から明らかなように、反応液中に Ν—ァセチルグルコサミンキナ一ゼを添加しない時には UD P AGはほとんど生成しなかったが、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼを添加することにより反応開始 6時間後には 0. 1ユニット添加で 9. 2mM、 0. 2ュニット添加で 1 1. 5mMの UDP AGが反応液中に生成しているのが明らかとなつた。

実施例 2

2 0 0 mMリン酸緩衝液（p H 8. 0) 、 20 mM塩化マグネシウム、 30 mM 5 ' 一 UMP、 20 mM N—ァセチルグ儿コサミン、 l O OmMダルコースおよび実施例 1の（ 1 ) と同様にして調製した Escherichia coli IAM1268 由来の N—ァセチルグルコサミンキナーゼ 2ュニットを含む反応液（ 1 Qmi) に乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）を 1 g添加し、 20°Cで撹拌しつつ反応を行った。

経時的に反応液の分析を行った結果を図 2に示す。図 2から明らかなように、反応液中に N—ァセチルグルコサミンキナ一ゼを添加しない時には UD P AGは全く生成しなかったが、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼを添加する二とにより反応開始 8時間後に 7. 3 mMの U D P A Gが生成した。

実施例 3

2 0 0 mMリン酸緩衝液（p H 8. 0) 、 20 m M塩化マグネシウム、 3 0 mM 5 ' — UMP、 20 mM N—ァセチルグルコサミン、 l O OmMグ儿コ —スおよび実施例 1の（ 1) と同様にして調製した Klebsiella planticola IF0 3317 由来の N—ァセチルグルコサミンキナーゼ 2ュニットを含む反応液（ 1 0 τηβ) に乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）を 1 g添加し、 2 0でで撹拌しつつ反応を行った。

経時的に反応液の分析を行った結果を図 3に示す。図 3から明らかなように、反応液中に N—ァセチルグルコサミンキナーゼを添加しない時には UD P AGは全く生成しなかったが、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼを添加することにより反応開始 8時間後に 7. 8 mMのUDPAGが生成した。

実施例 4

実施例 1 と同様の反応液組成で液量を 1 0 0 として 2 4時間反応を行った後、反応液の pHを塩酸により 3. 0として、遠心により上清を回収した。回収液中の UDPAGを定量したところ、 7. 2 gの UD P AGが含まれていた。実施例 5

( 1 ) 枯草菌由来 N—ァセチルグルコサミンキナーゼをコードする y q gR遺伝子のクローン化

枯草菌 M 1 6 8株（東大 ·分子細胞生物学研究所 ·分子遺伝育種部門より入手）の染色体 DN Aを斉藤と三浦の方法（Biochemica et Biophysica Acta. , 72, 619 (1963)) で調製した。この DNAを鐯型として、以下に示す 2種類のプライマー DNAを常法に従って合成し、 P C R法により枯草菌 y q g R遺伝子 (Submitted to EMBL/GENEBANK/DDBJ DATA BANKS, Accession No. D84432, 小林ら）を増幅した。

プライマー（ A ) ： 5' -TATCTAGAACCACATGATTGAAAAGGAGCA-3'

プライマー（ B ) ： 5' -TGAAGCTTCGCATTTCAACCTCCTATGCAG-3'

P CRによる y q gR遺伝子の増幅は、反応液 1 0 0〃（ 5 0 mM塩化力リゥ厶、 1 0 mMトリス塩酸（ p H 8. 3 ) 、 1. 5 mM塩化マグネシウム、 0. 0 0 1 %ゼラチン、 0. 2mM d ATP. 0. 2 mM d GTP、 0. 2 mM d CTP、 0. 2mM d TTP、铸型 DNA 0. l / g、プライマ — DNA (A) および（B) 各々 0. 2 /M、 Amp 1 i Ta qDNAポリメラ —ゼ 2. 5ュニット）を Perkin- Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（ 94°C、 1分）、アニーリング（ 55 °C、 1. 5分）、伸長反応（72°C、 3分）のステップを 25回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後、反応液をフノール Zクロ口ホルム（ 1 : 1) 混合液で処理し、水溶性画分に 2倍容のエタノールを添加し、 DNAを沈殿させた。沈殿回収した DNAを文献（Molecular cloning, 前述）の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、 1. 0 kb相当の DNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 Xb a I及び H i n d IKで切断し、同じく制限酵素 Xb a I及び H i n dHIで消化したプラスミド p T r c 9 9 A (Pharmacia Biotech.社より入手）と T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌 K 1 2株 JM

1 0 9菌（宝酒造株式会社より入手）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pTr c YQG— ABを単離した。 pTr c YQG— ABは、 pTr c 9 9 Aの t r cプロモ一夕一下流の Xb a I— H i n d IE切断部位に枯草菌 y q g R構造遺伝子および S D配列を含有する X b a I — H i n d HI DNA断片が挿入されたものである。

(2) 枯草菌由来 y q gR遺伝子産物の調製

プラスミド pT r c YQG— A Bを保持する大腸菌 J M 1 0 9菌を、 1 0 0 / gZ のアンピシリンを含有する 2 x YT培地 1 0 に植菌し、 37°Cで振とう培養した。 4 X 1 0⁸ 個に達した時点で培養液に最終濃度 1 mMになるように I PTGを添加し、さらに 37 °Cで 5時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（9, 000 X g, 1 0分）により菌体を回収し、 2 Οτ ^の緩衝液

(5 OmMトリス塩酸（pH7. 5) 、 5 mM EDTA、 0. 1 %トライトン X— 1 00、 0.

リゾチ一厶）に懸濁した。 37°Cで 1時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（ 2 0, 0 0 0 X g,

1 0分）により菌体残渣を除去した。このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品における N—ァセチルグルコサミンキナーゼ活性を実施例 1に記載の方法で測定した。その結果を対照菌（pT r c 9 9 Aを保持する大腸菌 JM 1 0 9菌）と共に下記表に示す。

菌 Zプラスミド N—ァセチルグルコサミンキナ一ゼ活性

(Units/mg protein;

JM109/pTrc99A 0.012

JM109/pTrcYQG-AB 0.571

(3) UDPAGの合成

2 0 0 mMリン酸緩衝液（p H 8. 0 ) 、 1 0 m M塩化マグネシウム、 5 0 mM 5 ' 一 UMP、 5 0 mM N—ァセチルグルコサミン、 2 0 0 mMグ儿コースを含む溶液に上記（2) で調製した所定活性量の N-ァセチルグルコサミンキナーゼ酵素液および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業） 0. 5 gを添加し、 1 6 °Cで撹拌しつつ反応を行った。

反応途中の反応液から 0. 2^を採取し、 5分間煮沸後遠心分離してその上清の 2 5 0倍希釈液を 0. 4 5 mのフィルターで膜濾過したものを HP L C分析に供した。

経時的に反応液の分析を行った結果を図 4に示す。図 4から明らかなように、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼを添加しない反応液中には UD P AGは全く検出されなかったが、該酵素液を添加することにより、反応開始 24時間後には 0. 2ユニット添加で 1 2. 2mMUDPAG力、、 1ユニット添加では 1 3. 6 mMの UDPAGがそれぞれ蓄積したことを確認した。

実施例 6

( 1 ) 酵母由来 N—ァセチルグルコサミン · ホスフエ一トムターゼ遺伝子のク口オリエン夕ル酵母工業から購入した乾燥パン酵母を Y P D培地で起こして分離したオリコィーストを YPD培地で培養後、常法により染色体 DNAを調製した _c この DN Aを铸型に、以下に示す 2種類のプライマー DN Aを用いて P CR法により酵母由来 N—ァセチルグルコサミン . ホスフェート厶夕一ゼ（E C 5. 4. 2. 3) 遺伝子（a gm l ) (Eur. J. Biochem. , 221, 741 -747(1994)) を含む DNA断片を増幅した。

プライマ— （ C ) ： 5' -TTGGCTGTTTGCTTGCTTGTGCGT-3'

プライマ— （ D ) ： 5' -CGATTGCAGAGCGAAACGACGAAA-3'

P CR反応は実施例 5 と同じ反応組成、同じ反応器を用い、熱変性（ 9 4° (， 1分）、アニーリング（ 3 7°C, 2分）、伸長反応（ 7 2°C, 3分）のステップを 2 5回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後、反応液から 2. 2 k b相当の DNA断片を実施例 1 と同様に精製した。この DNAを鎵型に、以下に示す 2種類のプライマー DNAを用いて P CR法により酵母由来 N—ァセチルグルコサミンホスフエートム夕一ゼ遺伝子 (a gm l ) を含む DNA断片を再度増幅した。なお、 2度目の P CR反応条件は 1回目と同じである。

プライマ一（ E ) ： 5' -AAGGTTGATTACGAGCAATTGTGC-3'

プライマー (F) ： 5' -TCAAGCAGATGCCTTAACGTGCTC-3'

遺伝子増幅後、前述と同様の手法により 1. 7 k bの DNA断片を精製した。回収した DNAを DNAブランティングキット（宝酒造より入手）により末端平滑化した。これを制限酵素 N c o Iで消化後、末端平滑化したプラスミド P T r c 9 9 A (Pharmacia Biotech.社より入手）と T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。この反応液を用いて大腸菌 K 1 2株 JM 1 0 9菌を形質転換し、得られたァンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド p T r c— a gm 1を単離した。プラスミド p T r c— a gm 1は、 p T r c 9 9 Aの t r cプロモーター下流の N c o I切断部位の ATGに酵母 a gm 1遺伝子の開始コドンの ATGが揃うように挿入されたものである。また、得られた形質転換体を JM 1 0 9 [p T r c - a gm 1 ] と命名した。

(2) 酵母由来 N—ァセチルグルコサミンホスフヱ一トムタ一ゼの調製

JM 1 0 9 [pTr c— a gm l ] をアンピシリンを 1 0 0〃 g 含む 2 x YT培地 2 で一夜 3 7°Cで培養した。これをアンピシリンを 1 0 0 /m 含む 2 X YT培地 5 0 0 に植菌した。 3 7でで 2時間培養後、 I PTGを終濃度 I mMになるように添加し、 3 7 °Cで 5時間、引き続き 2 0 °Cで一夜培養した _c 培養終了後、遠心分離（ 9, 0 0 0 X g, 2 0分）により菌体を回収した。回収した菌体を 5 0 mMィミダゾ一ル緩衝液（ p H 6. 8 ) に懸濁した。ブランソン社製超音波破砕機（モデル 4 5 0フニファー）を用いて菌体を破砕後（ 5 0 W, 5分， 3回）、 1 5， 0 0 0 r pmで 3 0分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。

このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品における N—ァセチルグルコサミン · ホスフェート厶夕ーゼ活性を測定した。その結果を対照菌 (pTr c 9 9 Aを保持する大腸菌 JM 1 0 9菌）と共に下記表 2に示す。

なお、 N—ァセチルグルコサミン · ホスフェート厶夕ーゼ活性は、公知の文献 (European Journal of Biochemistry, No.221, 741(1994)) に従い、以下に示す方法で N—ァセチルグルコサミン— 1 リン酸から N—ァセチルグルコサミン一 6 リン酸への転換活性を測定、算出したものである。

すなわち、 5 0 mMイミダゾ一ル（p H 6. 8) 、 l O OmM塩化カリウム、 1 OmM塩化マグネシウム、 0. I mM EDTA、 2 0 Mグルコース一 1， 6—ビスリン酸、 2mM N—ァセチルグルコサミン— 1 リン酸に N—ァセチ儿グルコサミン ' ホスフヱ一トムターゼ酵素標品を添加し、 3 0°Cで反応させる。また、グルコース— 1， 6—ビスリン酸の代わりに水を用い同様の反応を行わせ、コントロールとする。

反応液量と等量の 1 M硫酸溶液と混合することで酵素を失活させ、 1 0分間煮沸後、 2 5 °Cに冷却する。これにより、熱に弱い N—ァセチルグルコサミン— 1 リン酸は分解し、リン酸を遊離する。遊離した無機リン酸を次の方法で定量するすなわち、 2 5 °Cに冷却したサンプル 2 0 0〃 £に蒸留水 7 0 0〃、アミド一ル試薬（亜硫酸水素ナトリウム 1 0 0 gとアミドール 5 gを溶解して 5 0 0 水溶液としたもの） 1 0 0 、および 8 . 3 %モリブデン酸アンモニゥム（モリブデン酸アンモニゥ厶 4 1 . 5 gを溶解し、アンモニア水を滴下してよく溶解して 5 0 0 水溶液としてもの） 7 0 / を添加する。室温に 1 0分間放置後、分光光度計で 7 5 0 n mにおける吸光度を測定する。無機リン酸 1 m Mのときの吸光度を 0 . 3 8 6 7とし、無機リン酸の濃度から酵素反応で減少した N—ァセチルグルコサミン— 1 リン酸の量を換算し、 3 0 °Cで 1分間に 1 〃m 0 £ eの N— ァセチルグルコサミンー 1 リン酸を N—ァセチルグルコサミン— 6 リン酸に転換する活性を 1単位（ユニット）とする。

表 2 菌/プラスミド N—：セチルグルコサミンホス 'フエ一ト

ム夕- -ゼ活性

(Uni t s/mg pro te i n)

JM109/pTrc99A 0. 01以下

JM109/pTrc-agml 5. 70

後述する U D P A Gの合成には N—ァセチルダ儿コサミン ' ホスフエ一 —ゼの N—ァセチルグルコサミン— 6 リン酸から N—ァセチルグルコサミン一 1 リン酸への転換活性を利用する。したがって、この転換反応の活性測定は、上記反応液のうち N—ァセチルダルコサミン一 1 リン酸を N—ァセチルダルコサミン一 6 リン酸に代えて行い、反応によって生じた N—ァセチルグルコサミン一 1 リン酸の量を上述の方法から算出し、酵素活性を求めた。その結果、 N -ァセチルグルコサミン— 6 リン酸から N—ァセチルグルコサミンー 1 リン酸への転換活性の比活性は， N—ァセチルグルコサミン— 1 リン酸から N—ァセチルダルコサミン— 6 リン酸への転換活性のそれの約 3 0分の 1であった。

( 3 ) 大腸菌由来 U D P A Gピロホスホリラ一ゼ遺伝子の調製

大腸菌の UD P AGピロホスホリラーゼはグルコサミン . ゥリジル · トランスフェラ一ゼ（EC 2. 7. 7. 2 3) (g 1 mU) と同一であることが知られている（Journal of Bacteriology, 175， 19， 6150(1993)) 。そこで、大腸菌 I F 0 3 9 7 2の染色体 D N Aを斎藤と三浦の方法（Biochemica et Biophysica Acta, 72， 619 (1963)) で調製し、これを铸型に以下に示す 2種類のプライマー DNAを用いて、 PCR法により UDPAGピロホスホリラ一ゼ遺伝子（Biochem. J. , (1984), 224, 799-815) を含む D Ν Α断片を増幅した。

プライマー（G) ： 5' -CCTGCTGATATAAAACCCCCCTGT-3'

プライマー（H) ： 5' -CCCGAAGCTTGTAGAGAGTGGGGT-3'

PCR反応は、 PCR反応は実施例 5と同じ反応組成、反応機器を用い、熱変性（ 9 4°C， 1分）、アニーリング（ 5 5°C, 2分）、伸長反応（ 72°C, 3分）のステップを 2 5回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後は実施例 5と同様の手法により、 1. 5 kbのDNA断片を精製した。回収した DNAは DNAブランティング ·キット（宝酒造より入手）により末端平滑化した。これを制限酵素 D r a Iで消化した後，制限酵素 Sma Iで消化したプラスミド pUC l 8と T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。このプラスミドを制限酵素 E c oR Iおよび H i n d IEで消化し、前述と同様に 1. 5 kbの DNA断片を精製し、同じく制限酵素 E c oR Iおよび H i n dffiで消化したプラスミド p T r c 9 9 A (Pharmacia Biotech.社より入手）と T 4 DNA リガ一ゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌 K 1 2株 JM 1 0 9菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド p T r c - g l mUを単離した。 pT r c— g l mUは、 p T r c 9 9 Aの t r cプロモーター下流の Sma I -H i n d IE認識部位に大腸菌 g 1 mUの構造遺伝子が挿入されたものである。得られた形質転換体を JM 1 0 9 [pT r c - g l mU] と名し、

(4) UD PAGピロホスホリラ一ゼの調製

JM 1 0 9 [pT r c— g l mU] をァンピシリンを 1 0 0〃 gZm£含む 2 x YT培地 2 5; ^で一夜 3 7°Cで培養した。これを、アンピシリンを 1 0 0 g/ 含む 2 X YT培地 5 0 0 に植菌した。 3 7°Cで 2時間培養後、 I PTGを終濃度 1 mMになるように添加し、引き続き 3 7°Cで一夜培養した。培養終了後、遠心分離（ 4°C， 9， 0 0 0 X g, 2 0分）により菌体を回収した。回収した菌体を 5 OmMトリス塩酸（pH 7. 5) に懸濁し、ブランソン社製超音波破砕機 (モデル 4 5 0 フニファー）を用いて破砕後（ 5 0W, 5分， 3回）、 4て、 1 5, 0 0 0 r pmの条件下で 3 0分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。

このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品における UDP AGピ口ホスホリラーゼ活性を測定した。その結果を対照菌（pT r c 9 9 Aを保持する大腸菌 JM 1 0 9菌）と共に下記表 3に示す。

表 3 菌 /プラスミド U D P A Gピロホスホリラーゼ活性

(Uni ts/mg protein)

JM109/pTrc99A 0.29

JM109/pTrc-glmU 16.52

なお、 UDPAGピロホスホリラーゼ活性は、以下に示す方法で UD PAGとピロリン酸から N—ァセチルグルコサミンー 1 リン酸と UTPへの分解活性を測定、算出したものである。

すなわち、 5 0 mMトリス塩酸緩衝液（p H 7. 5) 、 5mM塩化マグネシゥ厶、 3 mMピロリン酸ナトリウム、 I mM U D P A Gに U D P A Gピロホスホリラーゼ酵素標品を添加して（反応液当たり約 6 g相当量） 3 7°Cで 5分反応させる。また、ピロリン酸ナトリウム溶液の代わりに水を用い同様の反応を行い、これをコントロールとする。

反応液を 5分間の煮沸にて反応を停止し、これを 3 0倍に希釈した後 HP L C による分析を行う。分離には YMC社製の ODS— AQ 3 1 2カラムを用い、溶出液として 0. 5M リン酸一カリウム溶液を用いる。 HPLC分析結果から反応液中の U D P A Gの残量を算出し、 3 7でで 1 分間に 1 // m o £ eの UD PAGを分解する活性を 1単位（ュニット）とする。

(5) 組換え酵素を用いた UD P AGの合成

2 0 0 m Mグルコース、 5 0 m M N—ァセチルグルコサミン、 5 0 m M UMP、 2 0 0 mMリン酸カリウム（p H 8. 0) 、 1 0 mM 塩化マグネシゥ厶、 5 % (w/v) 乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）を含む溶液 5 に調製した組換え酵素（N—ァセチルグルコサミンキナーゼ； 0. 2ュニット， N ァセチルグルコサミン ' ホスフエ一トムターゼ； 0. 5ユニット， UDPAGピ口ホスホリラ一ゼ； 5ユニット）を添加し、 2 0でで 3 0 0 1- p mで撹拌しなから反応を行った。また，反応開始 1 6， 2 4， 4 0， 4 8, 6 4， 7 2時間目に 5 0 %グルコース溶液を反応液の 1 4分の 1量ずつ添加した。

経時的に反応液の分析を行った結果を図 5に示す。グルコース添加した場合、 5 %乾燥パン酵母と N—ァセチルグルコサミンキナ一ゼを組み合わせた反応液では、反応 8 8時間で UD P AGは 2 7 mM蓄積した。 N—ァセチルグルコサミンキナーゼの他に UD P AGピロホスホリラ一ゼを組み合わせた場合、 N—ァセチルグルコサミンホスフヱ一トム夕一ゼを組み合わせた場合、 UDPAGピロホスホリラ一ゼと N—ァセチルグルコサミンホスフヱ一トムターゼの両方を組み合わせた場合、 UDPAGの蓄積量はそれぞれ 3 3mM、 3 7mM、および 3 9mM に増加した。

実施例 7

実施例 6では、試験管での反応例を示したが、ここではジャーフアーメン夕一を用いて UD PAG合成反応のスケール ·アップを行った結果を示す。すなわち、 4 0 0 mMグルコース、 l O OmM N—ァセチルグルコサミン、 l O O mM UMP、 2 0 0 mM リン酸カリウム（pH 8. 0) 、 2 OmM 塩化マグネシゥム、 5 % (w/v) 乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）を含む 1. 5 L溶液に、実施例 5 (2) および実施例 6 (2) および（4) で調製した組換え酵素液（N—ァセチルグルコサミンキナ一ゼ； 1 2 0ユニット、 N—ァセチルグ儿コサミン ' ホスフエ一トム夕一ゼ； 7 5 0ュニット、 UD P AGピロホスフォリラ —ゼ； 7 5 0ュニット）を添加して、 2 3て、通気量 1. 5 LZ分、 7 0 0 r pmで攪拌しながら反応を行った。反応中消泡剤としてエイノールを適宜添加した。また、 1 2， 2 0， 3 6時間目にグルコースを 5 4 g反応液に添加した。経時的に反応液を分析した結果を図 6に示す。反応 4 5時間で UD P AGは 8 2mM蓄積した。

実施例 8

実施例 7までは乾燥パン酵母を用いた UD P AG合成について説明したが、乾燥パン酵母を使用する代わりに、一例として UMPキナ一ゼ、ポリリン酸キナーゼ、アデ二レートキナーゼから成る UTP生成を利用し、 i n v i t r oでも UD PAG合成が可能であることを以下に示す。なお、 110 からの11丁？の合成に通常ヌクレオシドニリン酸キナーゼが必要であるが、アデ二レートキナーゼも当該活性を有しているため、ヌクレオシドニリン酸キナーゼの添加は必要ない _c ( 1 ) 大腸菌由来 UMPキナーゼ遺伝子のクローニング

大腸菌 1 2株 JM 1 0 9菌（宝酒造（株）より入手）の染色体 DNAを斉藤と三浦の方法（Biochemica et Biophysica Acta., 72, 619 (1963)) で調製した _c この DNAをテンペレートとして、以下に示す 2種類のプライマー DN Aを常法に従って合成し、 P C R法により大腸菌 UMPキナーゼ（p y r H) 遺伝子 (GeneticsCLife Sci. Adv.), 11,59-65(1992)) を増幅した。

プライマー（ I ) ： 5' -TTCCATGGCTACCAATGCAAAAC-3' プライマ— （ J ) ： 5' -TTGGATCCTTATTCCGTGATTAAAGTCCC-3'

？じ尺にょる！^！！遺伝子の増幅は、実施例 5 と同じ反応組成、反応機器を用い、熱変性（ 9 4 °C， 1分）、ァニーリング（ 5 5 °C, 2分）、伸長反応 ( 7 2°C, 4分）のステップを 2 5回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後は実施例 5と同様の手法により、 0. 7 4 k b相当のDNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 N c 0 I及び B amH Iで切断し、同じく制限酵素 N c 0 I及び B amH Iで消化したプラスミド p T r c 9 9 A (Pharmacia Biotech.社より入手）と T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。この反応液を用いて大腸菌 JM 1 0 9菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド ρ TP 0 1を単離した。 p TP 0 1は、 p T r c 9 9 Aの t r cプ口モーター及びシャイン—ダルガノ配列下流の N c o I - B amH I切断部位に大腸菌 P y r H遺伝子の構造遺伝子を含有する N c o I — B amH I DNA断片が揷入されたものである。

( 2) 大腸菌由来 UMPキナーゼの調製

プラスミド pTP 0 1を保持する大腸菌 JM 1 0 9菌を、 5 0 g/ のアンピシリンを含有する L B培地 1 に植菌し、 3 0 °Cで振とう培養した。 4 x 1 0⁸ 個/ ^/ に達した時点で培養液に最終濃度 1 mMになるように I PTGを添加し、さらに 3 0°Cで 5時間振とう培養を続けた。

培養終了後、遠心分離（ 9, 0 0 0 x g, 1 0分）により菌体を回収し、 2 i の緩衝液（ 5 OmMトリス塩酸（pH 7. 5) 、 5 0mM塩化カリウム、 2mM 塩化マグネシウム）に懸濁した。懸濁液を超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離（ 2 0， 0 0 0 X g, 1 0分）により上清画分を除去した。このように得られた沈殿画分を酵素標品とした。

酵素標品における UMPキナーゼ活性を対照菌（p T r c 9 9 Aを保持する大腸菌 JM 1 0 9菌）と共に下記表 4に示す。なお、本発明における UMPキナーゼ活性の単位（ュニット）は、以下の方法で測定、算出したものである。すなわち、 5 0 mMトリス塩酸（p H 7. 5 ) 、 5 0 mM塩化カリウム、 2 mM塩化マグネシウム、 3mM UTP、 3mM A T Pの条件下で 3 0 °Cで保温することで反応を行い、 1分間煮沸することにより酵素を失活させる。

HP L Cにより反応液中の UDPを定量し、 3 0°Cで 1分間に 1 〃mo ^ eの UDPを生成する活性を 1単位（ユニット）とする。

表 4 菌 Zプラスミド UMPキナーゼ活性

(Units/mg protein)

JM109/pTrc99A 0.1以下

JM109/pTP01 4.9

( 3) 大腸菌由来ポリリン酸キナーゼ遺伝子のクローニング

大腸菌 K 1 2株 JM 1 0 9菌（宝酒造（株）より入手）の染色体 DNAを斉藤と三浦の方法（Biochemica et Biophysica Acta. , 72. 619 (1963)) で調製した。この DNAをテンペレートとして、以下に示す 2種類のプライマ一 DNAを常法に従って合成し、 P CR法により大腸菌ポリリン酸キナーゼ（p p k) 遺伝子 (J. Biol. Chem. , 267, 22556-22561(1992)) を増幅した。

プライマー（ Κ ) ： 5' -TACCATGGGTCAGGAAAAGCTATA-3'

プライマー（ L ) ： 5' -ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA-3'

P CRによる p p k遺伝子の増幅は、実施例 5と同じ反応組成、反応機器を用レ、、熱変性（ 9 4 °C, 1分）、ァニ一リング（ 5 5 °C， 1. 5分）、伸長反応 ( 7 2°C, 1. 5分）のステップを 2 5回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後は実施例 5 と同様の手法により、 1. O k b相当のDNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 N c 0 I及び B amH Iで切断し、同じく制限酵素 N c 0 I及び B amH Iで消化したプラスミド p T r c 9 9 A (Pharmacia Biotech.社より入手）と T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。この反応液を用いて大腸菌 JM 1 0 9菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド p T r c - P P Kを単離した。 p T r c— P PKは、 p T r c 9 9 Aの t r cプロモーター下流の N c o I - B a mH I切断部位に大腸菌 k遺伝子を含有する N c o I— B amH I DN A断片が挿入されたものである。

(4) 大腸菌由来ポリリン酸キナーゼの調製

プラスミド pT r c— P PKを保持する大腸菌 JM 1 0 9菌を、 1 0 0〃 gZ のアンピシリンを含有する 2 X YT培地 3 0 0 に植菌し、 3 7 °Cで振とう培養した。 4 X 1 0⁸ 菌 / に達した時点で、培養液に終濃度 1 mMになるように

I PTGを添加し、さらに 3 0°Cで 5時間振とう培養を続けた。

培養終了後、遠心分離（ 9， 0 0 0 X g, i 0分）により菌体を回収し、 6 0 の緩衝液（ 5 0 mMトリス塩酸（p H 7. 5) 、 5 mM EDTA、 0. 1 % トライトン X— 1 0 0、 0. 2 mgZ? ^リゾチーム）に懸濁した。 3 7てで 1時間保温した後、超音波処理を行い菌体を破砕し、さらに遠心分離（ 2 0, 0 0 0 x g、 1 0分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を

5 mM塩化マグネシウム及び 1 mM 2一メルカプトエタノールを含有する 5 0 mMトリス塩酸（pH 7. 8) に対して透析を行い、粗酵素液とした。

このように得られた粗酵素液におけるポリリン酸キナーゼ活性を測定した。その結果を対照菌（pT r c 9 9 Aを保持する大腸菌 JM 1 0 9菌）と共に下記表

5に示す。

表 5 菌 Zプラスミドポリリン酸キナーゼ活性

(Units/mg protein)

JM109/pTrc99A 0.00018

JM109/pTrc-PPK 0.19

なお、本発明におけるポリリン酸キナーゼ活性の単位（ュニット）は、以下の方法で測定、算出したものである。

すなわち、 5mM塩化マグネシウム、 1 0 0 mM硫酸アンモニゥム、 5mM ADP、ポリリン酸（無機リン酸として 1 5 OmM) を含有する 5mM トリス塩酸緩衝液（pH 7. 8 ) に酵素標品を添加して 3 7 °Cで保温することで反応を行い、 1分間煮沸することにより酵素を失活させる。 HPL Cにより反応液中の ATPを定量し、 3 7°Cで 1分間に 1 〃mo ^ eの A T Pを生成する活性を 1単位（ュニット）とする。

次に粗酵素液を DEAE トヨパール 6 5 0 M (トーツー（株））を用いて 0〜 0. 5 M N a C の濃度勾配にて分画し、ポリリン酸キナーゼ画分を得た。この画分をポリリン酸キナーゼ酵素標品とした。なお、この酵素標品におけるボリリン酸キナーゼの比活性は、 0. 6ユニット/ mg蛋白質であった。

( 5 ) 大腸菌由来アデ二レートキナーゼのクローニング

大腸菌 K 1 2株 JM 1 0 9菌（宝酒造（株）より入手）の染色体 DNAを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biopys. Acta. , 72, 619 (1963)) で調製した。この DNAをテンペレートとして、以下に示す 2種類のプライマー DNAを常法に従つて合成し、 P C R法により大腸菌アデ二レートキナーゼ（ a d k) 遺伝子 (Nucleic Acids Res.， 13(19), 7139-7151(1985 ) を増幅した。

プライマー (M) ： 5' -ATGGATCCCGTTTCAGCCCCAGGTGCC-3'

プライマー（ N ) ： 5' -ATAAGCTTGGCCTGAGATTGCTGATAAG-3'

P CRによる a d k遺伝子の増幅は、実施例 5 と同じ反応組成、反応機器を用い、熱変性（ 9 4 °C， 1分）、ァニーリング（ 5 6で， 1分）、伸長反応（ 7 2 °C， 3分）のステップを 2 5回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後は実施例 5 と同様の手法により、 1. 0 k b相当の DNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 B amH I及び H i n d HIで切断し、同じく制限酵素 B amH I及び H i n dlEで消化したプラスミド p UC 1 8 (宝酒造（株）より入手）と T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。この反応液を用いて大腸菌 JMl 0 9菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド P UC— ADKを単離した。 pUC— ADKは、 pUC 1 8の l a cプロモ一ター下流の B amH I -H i n d IE切断部位に大腸菌 a d k遺伝子を含有する BamH I -H i n dl DN A断片が挿入されたものである。

(6) 大腸菌由来アデニレ一トキナ一ゼの調製

プラスミド pUC— ADKを保持する大腸菌 JM 1 0 9菌を、 1 0 0 β g/i のアンピシリンを含有する 2 X YT培地 300 に植菌し、 37°Cで振とう培養した。 4 X 1 0⁸ 菌 Z に達した時点で、培養液に終濃度 1 mMになるように

I PTGを添加し、さらに 30°Cで 5時間振とう培養を続けた。

培養終了後、遠心分離（ 9, 000 X g, 1 0分）により菌体を回収し、 60 wの緩衝液（5 OmMトリス塩酸（pH7. 5) 、 5 mM EDTA、 0. 1 % トライトン X— 1 0 0、 0. 2mgZ リゾチ一厶）に懸濁した。 37°Cで 1時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離

( 2 0, 0 0 0 X , 1 0分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を 5 m M塩化マグネシゥ厶及び 1 m M 2—メルカプトエタノールを含有する 5 OmMトリス塩酸（pH7. 8) に対して透析を行い、粗酵素液とした。

このように得られた粗酵素液におけるアデ二レートキナーゼ活性を測定した。その結果を対照菌（pUC l 8を保持する大腸菌 JMl 0 9菌）と共に下記表 6 に示す。

表 6 菌 //プラスミドァデニレ一トキう -一ゼ活性

(Units/mg protein)

JM109/pUC18 1. 9

JM109/pUC-ADK 134

なお、本発明におけるアデ二レートキナーゼ活性の単位（ュニット）は、以下の方法で測定、算出したものである。

すなわち、 5 mM塩化マグネシウム、 5mM ATP、 5 mM AMPを含有する 5 OmM トリス塩酸緩衝液（pH 7. 8 ) に酵素標品を添加して 3 7でで保温することで反応を行い、 1分間煮沸することにより酵素を失活させる。 H P L Cにより反応液中の AD Pを定量し、 3 7てで 1分間に 2〃m o の AD Pを生成する活性を 1単位（ユニット）とする。

次に粗酵素液を DEAEトヨパール 6 5 0 M (ト一ソ一（株））を用いて 0〜 0. 5M N a C の濃度勾配にて分画し、アデ二レートキナーゼ活性のある画分を回収した。この画分をアデ二レートキナーゼ酵素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリリン酸キナーゼの比活性は、 3 4 4ュニット /mg蛋白質でめつた。

( 7) UMPキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、アデ二レートキナーゼからなる 11丁？生成系を用ぃた110?八0の合成

1 OmM塩化マグネシウム、 1 0 OmM硫安、ポリリン酸（無機リン酸として

7 5mM) 、 1 OmM UMP及び 3 mM AM Pを含有する 2 0 0 mMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 8) に 0. 1ユニットポリリン酸キナーゼ、 2. 5ュニット/ アデ二レートキナーゼ、 0. 5ユニット/ UM Pキナーゼ、

0. 0 5ユニット / N—ァセチルグルコサミンキナーゼ、 0. 5ユニット Z τηβ Ν—了セチルグルコサミン . ホスフェートム夕ーゼ、及び 1. 0ユニット Ζ ni UDPAGピロホスホリラ一ゼ酵素標品を添加し、 3 7でで 24時間保温したところ 3. 4mMの UDPAGの生成が確認された。産業上の利用可能性

本発明により、基質としての利用価値が低かった N—ァセチルグルコサミンを基質として用いた場合であっても UDPAGを効率的に製造することが初めて可能となったのである。

Claims

請求の範囲

1. 微生物菌体を用いてゥリジル酸（UMP) 及び N—ァセチルグルコサミンからゥリジン二リン酸一 N—ァセチルグルコサミン（UDPAG) を製造する方法において、 N—ァセチルグルコサミンキナーゼを共存せしめることを特徴とする UDPAGの製造法。

2. 微生物菌体が酵母菌体である請求項 1記載の UDPAGの製造法。

3. N—ァセチルグルコサミンキナ一ゼが細菌由来のものである請求項 1記載の UDPAGの製造法。

4. さらに N—ァセチルグルコサミン · ホスフエ一トムターゼ及び Zまたはゥリジンニリン酸— N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラ一ゼを作用せしめる請求項 1記載の UDPAGの製造法。

5. 酵素を用いてゥリジン三リン酸（UTP) 及び N—ァセチルグルコサミンから UDPAGを製造する方法において、酵素として N—ァセチルグルコサミンキナーゼ、 N—ァセチルグルコサミン . ホスフエ一ト厶夕ーゼ及びゥリジンニリン酸ー N—ァセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを併用することを特徴とする UDPAGの製造法。

6. UTPを用いる代わりに UT P生成系を共存させる請求項 5記載の UDPAGの製造法。

9. UTP生成系が微生物菌体を用し、る方法である請求項 6記載の U D P A G の製造法。

8. UTP生成系が酵素を用し、る方法である請求項 6記載の U D P A Gの製造法。

9. UT P生成系が U TP生成系とアデノシン三リン酸（AT P) 再生系とが共役したものである請求項 6記載の U D P A Gの製造法。

1 0. UTP生成系が、アデニル酸（AMP) にポリリン酸キナーゼ、アデ二レートキナ一ゼ及びポリリン酸を作用せしめて ATPを再生しながら UMPにゥリジル酸キナーゼを作用せしめて UT Pを生成するものである請求項 9記載の UDPAGの製造法。