JPH0823993A - ウリジン二リン酸ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法 - Google Patents
ウリジン二リン酸ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法Info
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- JPH0823993A JPH0823993A JP6120364A JP12036494A JPH0823993A JP H0823993 A JPH0823993 A JP H0823993A JP 6120364 A JP6120364 A JP 6120364A JP 12036494 A JP12036494 A JP 12036494A JP H0823993 A JPH0823993 A JP H0823993A
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- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
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- C12P19/305—Pyrimidine nucleotides
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Abstract
(57)【要約】
【構成】耐浸透圧性酵母を２〜８％の無機塩濃度の培地
にて好気的条件下で培養することを特徴とするウリジン
二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法。 【効果】ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを大量且つ
安価に製造できるようになった。
にて好気的条件下で培養することを特徴とするウリジン
二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法。 【効果】ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを大量且つ
安価に製造できるようになった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素法による生理活性
糖鎖合成の重要基質の一つであるウリジン二リン酸Ｎ−
アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミン）の高純度且つ安価な大量製造方法に関するもので
ある。
糖鎖合成の重要基質の一つであるウリジン二リン酸Ｎ−
アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミン）の高純度且つ安価な大量製造方法に関するもので
ある。
【０００２】なお、本明細書において、「％」は「％
（ｗ／ｖ）」を意味する。
（ｗ／ｖ）」を意味する。
【０００３】
【従来の技術及びその課題】最近、生理活性糖鎖の医薬
としての期待が高まり、世界的に糖鎖合成の研究競争が
熾烈になってきている。現在、一部の試薬用糖鎖が市販
されているが、それらは非常に高価であり、種類及び量
とも限定されている。糖鎖の製造には、天然物からの抽
出法、化学合成法及び酵素合成法又はこれらの併用法が
ある。このうち、医薬用として糖鎖を大量製造するため
には、酵素合成法が最も有望とみなされている。その理
由は、酵素法が他法に比べて非常に構造特異性の高い糖
鎖を効率よく合成できる利点を有しているからである。
としての期待が高まり、世界的に糖鎖合成の研究競争が
熾烈になってきている。現在、一部の試薬用糖鎖が市販
されているが、それらは非常に高価であり、種類及び量
とも限定されている。糖鎖の製造には、天然物からの抽
出法、化学合成法及び酵素合成法又はこれらの併用法が
ある。このうち、医薬用として糖鎖を大量製造するため
には、酵素合成法が最も有望とみなされている。その理
由は、酵素法が他法に比べて非常に構造特異性の高い糖
鎖を効率よく合成できる利点を有しているからである。
【０００４】酵素法により糖鎖を合成する場合、糖転移
酵素及び該酵素の基質である糖ヌクレオチドが必要とな
る。このうち、糖転移酵素は遺伝子組換え技術等のバイ
オテクノロジーの進展により量産化が可能になりつつあ
る。一方、基質である糖ヌクレオチドも発酵法と化学合
成法の併用により、以前よりも製造コストは低下しつつ
ある。しかしながら、多くの生理活性糖鎖の基幹となっ
ているＮ−アセチルグルコサミンの供与体であるＵＤＰ
−Ｎ−アセチルグルコサミンは、技術面及び採算面に問
題があり、現在のところ大量製造方法は確立されていな
い。
酵素及び該酵素の基質である糖ヌクレオチドが必要とな
る。このうち、糖転移酵素は遺伝子組換え技術等のバイ
オテクノロジーの進展により量産化が可能になりつつあ
る。一方、基質である糖ヌクレオチドも発酵法と化学合
成法の併用により、以前よりも製造コストは低下しつつ
ある。しかしながら、多くの生理活性糖鎖の基幹となっ
ているＮ−アセチルグルコサミンの供与体であるＵＤＰ
−Ｎ−アセチルグルコサミンは、技術面及び採算面に問
題があり、現在のところ大量製造方法は確立されていな
い。
【０００５】本発明者らは、以前に、味噌醸造に応用す
る目的で耐浸透圧性酵母の生理活性を詳細に検討した。
その中で、Zygosaccharomyces rouxiiが１ＭのＮａＣｌ
の存在下に培養すると、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミンを蓄積することを報告している（醸造協会誌、第８
３巻、第１１号、７７０−７７４頁、１９８８年）。し
かしながら、この方法では蓄積されるＵＤＰ−Ｎ−アセ
チルグルコサミン量は少ないため、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミンを大量且つ安価に製造することはできな
い。
る目的で耐浸透圧性酵母の生理活性を詳細に検討した。
その中で、Zygosaccharomyces rouxiiが１ＭのＮａＣｌ
の存在下に培養すると、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミンを蓄積することを報告している（醸造協会誌、第８
３巻、第１１号、７７０−７７４頁、１９８８年）。し
かしながら、この方法では蓄積されるＵＤＰ−Ｎ−アセ
チルグルコサミン量は少ないため、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミンを大量且つ安価に製造することはできな
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、最近の糖鎖
工学分野における急速な技術進歩により需要が世界的に
拡大しつつあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの大
量且つ安価な合成法を提供することを目的とする。
工学分野における急速な技術進歩により需要が世界的に
拡大しつつあるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの大
量且つ安価な合成法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Zygosacc
haromyces属の酵母が１Ｍという高い塩濃度でＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミンを蓄積する点に着目し、該酵
母のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの蓄積効率を更
に高めるために研究を重ねた結果、好気的条件下に該酵
母の培養を行うことにより、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグル
コサミンが大量に蓄積されることを見出し、本発明を完
成するに至った。
haromyces属の酵母が１Ｍという高い塩濃度でＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミンを蓄積する点に着目し、該酵
母のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの蓄積効率を更
に高めるために研究を重ねた結果、好気的条件下に該酵
母の培養を行うことにより、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグル
コサミンが大量に蓄積されることを見出し、本発明を完
成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、耐浸透圧性酵母を２
〜８％の無機塩濃度の培地にて好気的条件下で培養する
ことを特徴とするウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコ
サミンの製造方法を提供するものである。
〜８％の無機塩濃度の培地にて好気的条件下で培養する
ことを特徴とするウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコ
サミンの製造方法を提供するものである。
【０００９】耐浸透圧性酵母として、Zygosaccharomyce
s属、Pichia属, Debaryomycos属, Hansenula属及びCand
ida属に属する酵母が例示され、好ましくはZygosacchar
omyces属に属する酵母が挙げられる。
s属、Pichia属, Debaryomycos属, Hansenula属及びCand
ida属に属する酵母が例示され、好ましくはZygosacchar
omyces属に属する酵母が挙げられる。
【００１０】なお、本明細書で「耐浸透圧性酵母」と
は、２％以上の塩濃度培地で生育良好であるが、２％以
下でも生育する酵母を意味する。
は、２％以上の塩濃度培地で生育良好であるが、２％以
下でも生育する酵母を意味する。
【００１１】Zygosaccharomyces属などの耐浸透圧性酵
母（以下、本酵母と略す場合がある）は、我国では味噌
や醤油の製造に関連して研究されているが、欧米では蜂
蜜などの汚染を引き起こす有害菌として扱われてきてい
るもので、本酵母は物質生産を目的としてはほとんど省
みられなかったものである。本発明者らによる上記の耐
浸透圧性酵母に関する研究も、味噌醸造の微生物管理技
術の一貫として実施されたものである。
母（以下、本酵母と略す場合がある）は、我国では味噌
や醤油の製造に関連して研究されているが、欧米では蜂
蜜などの汚染を引き起こす有害菌として扱われてきてい
るもので、本酵母は物質生産を目的としてはほとんど省
みられなかったものである。本発明者らによる上記の耐
浸透圧性酵母に関する研究も、味噌醸造の微生物管理技
術の一貫として実施されたものである。
【００１２】本発明において、Zygosaccharomyces属に
属する耐浸透圧性酵母としては、特に限定されないが、
例えばZygosaccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces
bailiiが挙げられる。また、Pichia属に属する酵母とし
てPichia farinosa, Debaryomycos属に属する酵母とし
てDebaryomycos hansenii, Hansenula属に属する酵母と
してHansenula anomala及びCandida属に属する酵母とし
てCandida versatilisが挙げられる。
属する耐浸透圧性酵母としては、特に限定されないが、
例えばZygosaccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces
bailiiが挙げられる。また、Pichia属に属する酵母とし
てPichia farinosa, Debaryomycos属に属する酵母とし
てDebaryomycos hansenii, Hansenula属に属する酵母と
してHansenula anomala及びCandida属に属する酵母とし
てCandida versatilisが挙げられる。
【００１３】本酵母は、２〜８％の無機塩濃度の培地に
て培養する。この無機塩としては、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化
ナトリウム等のアルカリ金属ハロゲン化物ないしアルカ
リ土類金属ハロゲン化物、リン酸ナトリウム、リン酸二
水素一ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸
カリウム、リン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二カ
リウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウムなどの
アルカリ金属リン酸塩ないしアルカリ土類金属リン酸
塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸マグネシウ
ム、硝酸カルシウム等のアルカリ硝酸塩ないしアルカリ
土類金属硝酸塩、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸カルシウム等のアルカリ硫酸塩ない
しアルカリ土類金属硫酸塩等が挙げられ、これらを１種
又は２種以上用いる。好ましい無機塩としては、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリ
ウム等が挙げられ、より好ましくはこれらの無機塩の合
計の濃度が２〜８％の培地で培養される。
て培養する。この無機塩としては、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化
ナトリウム等のアルカリ金属ハロゲン化物ないしアルカ
リ土類金属ハロゲン化物、リン酸ナトリウム、リン酸二
水素一ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸
カリウム、リン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二カ
リウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウムなどの
アルカリ金属リン酸塩ないしアルカリ土類金属リン酸
塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸マグネシウ
ム、硝酸カルシウム等のアルカリ硝酸塩ないしアルカリ
土類金属硝酸塩、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸カルシウム等のアルカリ硫酸塩ない
しアルカリ土類金属硫酸塩等が挙げられ、これらを１種
又は２種以上用いる。好ましい無機塩としては、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリ
ウム等が挙げられ、より好ましくはこれらの無機塩の合
計の濃度が２〜８％の培地で培養される。
【００１４】本耐浸透圧性酵母の生産に利用できる培地
としては、上記濃度範囲の無機塩を含む高浸透圧培地で
ある限り、炭素源、窒素源、無機物などを適度に含有す
るものであれば、天然培地、人工培地のいずれであって
もよい。この炭素源、窒素源、無機物などについては特
に限定されず、当業者であれば公知のものから容易に選
択できる。上記培地のｐＨは、３〜８、好ましくは４〜
６である。
としては、上記濃度範囲の無機塩を含む高浸透圧培地で
ある限り、炭素源、窒素源、無機物などを適度に含有す
るものであれば、天然培地、人工培地のいずれであって
もよい。この炭素源、窒素源、無機物などについては特
に限定されず、当業者であれば公知のものから容易に選
択できる。上記培地のｐＨは、３〜８、好ましくは４〜
６である。
【００１５】本発明の方法では、耐浸透圧性酵母を好気
的条件下で培養する。好ましい好気的条件下とは、溶存
酸素濃度が１〜７ｐｐｍ、より好ましくは２〜７ｐｐｍ
になる状態で培養する。この溶存酸素濃度は、培養期間
中維持されているのが望ましいが、上記溶存酸素濃度を
維持している培養時間が所定時間あれば、上記溶存酸素
濃度を下回ることがあっても差し支えない。培養期間
は、上記溶存酸素条件を維持する期間は、培養条件によ
り変化するが、通常２〜４日程度である。培養は、撹拌
又は振盪させながら行うのが好ましい。本発明の方法に
より培養は、通気撹拌培養によるのが最も好ましい。本
発明の方法では、酸素供給効率が高いほど、本物質、す
なわち、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの生産に有
効である。
的条件下で培養する。好ましい好気的条件下とは、溶存
酸素濃度が１〜７ｐｐｍ、より好ましくは２〜７ｐｐｍ
になる状態で培養する。この溶存酸素濃度は、培養期間
中維持されているのが望ましいが、上記溶存酸素濃度を
維持している培養時間が所定時間あれば、上記溶存酸素
濃度を下回ることがあっても差し支えない。培養期間
は、上記溶存酸素条件を維持する期間は、培養条件によ
り変化するが、通常２〜４日程度である。培養は、撹拌
又は振盪させながら行うのが好ましい。本発明の方法に
より培養は、通気撹拌培養によるのが最も好ましい。本
発明の方法では、酸素供給効率が高いほど、本物質、す
なわち、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの生産に有
効である。
【００１６】本酵母を培養すると、菌体の増殖に伴っ
て、旺盛に酸素が消費され、その消費速度は、塩濃度や
植菌量により異なるが培養後３０時間〜７２時間でピー
クに達する。培養に適当な温度は、特に限定されない
が、通常２５〜３５℃であるが、３０℃近辺で行うのが
好ましい。
て、旺盛に酸素が消費され、その消費速度は、塩濃度や
植菌量により異なるが培養後３０時間〜７２時間でピー
クに達する。培養に適当な温度は、特に限定されない
が、通常２５〜３５℃であるが、３０℃近辺で行うのが
好ましい。
【００１７】本発明の方法によるＵＤＰ−Ｎ−アセチル
グルコサミンの生産収量は、菌体乾物１ｇ当たり２０〜
４０ｍｇであり、本発明の製造法は、工業的応用にも十
分な収量が得られる。
グルコサミンの生産収量は、菌体乾物１ｇ当たり２０〜
４０ｍｇであり、本発明の製造法は、工業的応用にも十
分な収量が得られる。
【００１８】
【発明の効果】本酵母は、前述したように、味噌及び醤
油醸造などの高濃度食塩下で静置発酵状態で利用されて
きた酵母であり、今までに通気撹拌培養のような好気的
条件による工業的発酵生産酵母としてはほとんど使用さ
れていなかった。本発明は、耐浸透圧性酵母を、高濃度
の無機塩の存在下に一定の溶存酸素条件下に培養するこ
とで、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、本物
質と略記する場合がある）の生産量が著しく高まること
を初めて見出したものであり、これにより、該物質を安
価且つ大量に生産することが可能になり、ひいては、種
々の構造を有する糖鎖の合成が可能になった。
油醸造などの高濃度食塩下で静置発酵状態で利用されて
きた酵母であり、今までに通気撹拌培養のような好気的
条件による工業的発酵生産酵母としてはほとんど使用さ
れていなかった。本発明は、耐浸透圧性酵母を、高濃度
の無機塩の存在下に一定の溶存酸素条件下に培養するこ
とで、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、本物
質と略記する場合がある）の生産量が著しく高まること
を初めて見出したものであり、これにより、該物質を安
価且つ大量に生産することが可能になり、ひいては、種
々の構造を有する糖鎖の合成が可能になった。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例及び比較例を用いてよ
り詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され
ない。
り詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され
ない。
【００２０】
【実施例１】本物質の生産に及ぼす培地食塩濃度の影響 〔方法〕チゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharo
myces rouxii）ＡＴＣＣ５２６９８株を、グルコース１
％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．１％及び塩化ナ
トリウム濃度を０、１、２、４、６、８、１０及び１２
％に各々調整した液体培地５Ｌを入れた８Ｌ容ジャーフ
ァーメンターを用い、３０℃、７２時間、通気量２．５
Ｌ／分、撹拌数３００ｒｐｍで好気的に培養した。な
お、種培養として、塩化ナトリウムを含有しない上記の
培地で３０℃、４８時間振盪培養した培養液５０ｍｌを
本培養液に接種した。培養終了後、各培養液１Ｌを遠心
分離して菌体を集めた。この菌体に、あらかじめよく冷
却した５％過塩素酸溶液３００ｍｌを加えてよく混合し
た後１時間保持した。次に、菌体懸濁液を１０％水酸化
カリウム溶液で中和した後濾過して澄明な抽出液を得
た。抽出液を蒸留水で１Ｌに定溶し、その１０μＬを高
速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析し、ＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミンを定量した。菌体量は、乾物
重量として測定した。すなわち、１Ｌの培養液から遠心
分離にて集められた菌体を蒸留水で２回洗浄した後、菌
体を１０５℃で４時間乾燥後秤量して測定した。
myces rouxii）ＡＴＣＣ５２６９８株を、グルコース１
％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．１％及び塩化ナ
トリウム濃度を０、１、２、４、６、８、１０及び１２
％に各々調整した液体培地５Ｌを入れた８Ｌ容ジャーフ
ァーメンターを用い、３０℃、７２時間、通気量２．５
Ｌ／分、撹拌数３００ｒｐｍで好気的に培養した。な
お、種培養として、塩化ナトリウムを含有しない上記の
培地で３０℃、４８時間振盪培養した培養液５０ｍｌを
本培養液に接種した。培養終了後、各培養液１Ｌを遠心
分離して菌体を集めた。この菌体に、あらかじめよく冷
却した５％過塩素酸溶液３００ｍｌを加えてよく混合し
た後１時間保持した。次に、菌体懸濁液を１０％水酸化
カリウム溶液で中和した後濾過して澄明な抽出液を得
た。抽出液を蒸留水で１Ｌに定溶し、その１０μＬを高
速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析し、ＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミンを定量した。菌体量は、乾物
重量として測定した。すなわち、１Ｌの培養液から遠心
分離にて集められた菌体を蒸留水で２回洗浄した後、菌
体を１０５℃で４時間乾燥後秤量して測定した。
【００２１】なお、比較のために、パン酵母サッカロミ
セス・セレビシエーを用いて塩化ナトリウム濃度を０及
び４％の条件で、同様の試験を行った。
セス・セレビシエーを用いて塩化ナトリウム濃度を０及
び４％の条件で、同様の試験を行った。
【００２２】〔結果〕表１に示すように、培地の塩化ナ
トリウム濃度が２％以上になると、単位菌体乾燥物当た
りの本物質の生産量が急激に増加する。しかしながら、
塩化ナトリウム濃度が高くなるほど、菌体収量が減少す
るので、単位培養液当たりの本物質の収量も減少する。
従って、塩化ナトリウム濃度は２〜８％の範囲が好まし
く、より好ましくは４％近辺の濃度である。
トリウム濃度が２％以上になると、単位菌体乾燥物当た
りの本物質の生産量が急激に増加する。しかしながら、
塩化ナトリウム濃度が高くなるほど、菌体収量が減少す
るので、単位培養液当たりの本物質の収量も減少する。
従って、塩化ナトリウム濃度は２〜８％の範囲が好まし
く、より好ましくは４％近辺の濃度である。
【００２３】比較に用いたパン酵母の場合、塩化ナトリ
ウムを含有しない培地では非常に旺盛に増殖するが、本
物質はほとんど生産されない。食塩濃度４％の培地では
増殖度が非常に小さく、いずれの培地でも本物質の生産
収量は非常に少なかった。
ウムを含有しない培地では非常に旺盛に増殖するが、本
物質はほとんど生産されない。食塩濃度４％の培地では
増殖度が非常に小さく、いずれの培地でも本物質の生産
収量は非常に少なかった。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【実施例２】本物質の生産に及ぼす通気撹拌条件の影響 〔方法〕培地の食塩濃度を４％とし、ジャーファーメン
ターの通気量と撹拌数を表２に示すように種々変えて試
験した。表２中、１分間に培養液と同容量の通気量（本
実験では１分間に５Ｌの通気条件）を１ｖｖｍとする。
溶存酸素濃度は、ＤＯメーターを用いて、培養期間を通
して連続的に測定した。
ターの通気量と撹拌数を表２に示すように種々変えて試
験した。表２中、１分間に培養液と同容量の通気量（本
実験では１分間に５Ｌの通気条件）を１ｖｖｍとする。
溶存酸素濃度は、ＤＯメーターを用いて、培養期間を通
して連続的に測定した。
【００２６】〔結果〕表２に示すように、より好気的な
通気撹拌条件ほど本物質の生産収量が高い。最小溶存酸
素濃度が１ｐｐｍ未満の条件でも本物質を生産すること
ができるが、効率よく生産するには同濃度を常時１ｐｐ
ｍ以上に維持しうる通気撹拌条件を用いることが好まし
い。
通気撹拌条件ほど本物質の生産収量が高い。最小溶存酸
素濃度が１ｐｐｍ未満の条件でも本物質を生産すること
ができるが、効率よく生産するには同濃度を常時１ｐｐ
ｍ以上に維持しうる通気撹拌条件を用いることが好まし
い。
【００２７】
【表２】
【００２８】
【実施例３】塩化ナトリウム添加培地を用いる発酵法に
よるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンナトリウム塩の
大量製造 種培地として、グルコース１％、ペプトン０．５％、酵
母エキス０．２％、リン酸第一カリウム０．１％、硫酸
マグネシウム０．０５％及び塩化ナトリウム４％を含有
する培地を用いた。
よるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンナトリウム塩の
大量製造 種培地として、グルコース１％、ペプトン０．５％、酵
母エキス０．２％、リン酸第一カリウム０．１％、硫酸
マグネシウム０．０５％及び塩化ナトリウム４％を含有
する培地を用いた。
【００２９】常法により好気的に３０℃、４８時間培養
した前培養液１０Ｌを、２トン型通気撹拌培養タンクに
入れた本培養液１ｋＬに接種し、これを通気量毎分５０
０Ｌ、撹拌数２００ｒｐｍの通気条件撹拌下に３０℃で
７２時間培養した。培養終了後、遠心分離機にて菌体を
分離し、湿重量で２０．２ｋｇの菌体を得た。
した前培養液１０Ｌを、２トン型通気撹拌培養タンクに
入れた本培養液１ｋＬに接種し、これを通気量毎分５０
０Ｌ、撹拌数２００ｒｐｍの通気条件撹拌下に３０℃で
７２時間培養した。培養終了後、遠心分離機にて菌体を
分離し、湿重量で２０．２ｋｇの菌体を得た。
【００３０】この菌体から、実施例１に示した方法によ
り３２０Ｌの抽出液を得た。この抽出液を常法により活
性炭カラム及びイオン交換カラムを用いて精製した。精
製濃縮液４．５Ｌに９９％エタノールを過剰に添加し、
生じた沈殿物をブッフナー濾過器上に集め、これを真空
乾燥して２１５ｇの白色粉末を得た。この白色粉末は高
純度のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン二ナトリウム
塩であった。
り３２０Ｌの抽出液を得た。この抽出液を常法により活
性炭カラム及びイオン交換カラムを用いて精製した。精
製濃縮液４．５Ｌに９９％エタノールを過剰に添加し、
生じた沈殿物をブッフナー濾過器上に集め、これを真空
乾燥して２１５ｇの白色粉末を得た。この白色粉末は高
純度のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン二ナトリウム
塩であった。
【００３１】以下に本実施例で製造した製品の純度試験
結果を示す。
結果を示す。
【００３２】ＨＰＬＣ分析：本製品３００ｍｇを精密秤
量して蒸留水に溶かして１００ｍｌに定容した。この溶
解液１０μＬを分析した。ＨＰＬＣは、日立アニオンゲ
ル３０１３Ｎを用いて行った。該ＨＰＬＣのクロマトグ
ラムを図１に示す。本図の下部の吸収は、２６０ｎｍ、
上部は２８０ｎｍであり、吸光度のフルスケールは２．
０であり、流速１ｍｌ／分、チャートスピード０．５ｃ
ｍ／分である。図１の単独のシャープなピークは、本品
が他のヌクレオチドの全く混在しない高純度のＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミン製品であることを示してい
る。
量して蒸留水に溶かして１００ｍｌに定容した。この溶
解液１０μＬを分析した。ＨＰＬＣは、日立アニオンゲ
ル３０１３Ｎを用いて行った。該ＨＰＬＣのクロマトグ
ラムを図１に示す。本図の下部の吸収は、２６０ｎｍ、
上部は２８０ｎｍであり、吸光度のフルスケールは２．
０であり、流速１ｍｌ／分、チャートスピード０．５ｃ
ｍ／分である。図１の単独のシャープなピークは、本品
が他のヌクレオチドの全く混在しない高純度のＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミン製品であることを示してい
る。
【００３３】ＵＶ吸収による純度：上記の本製品の３％
溶液を０．０１規定塩酸溶液で正確に１００倍希釈し、
この希釈液の２６２ｎｍの波長における吸光度を日立分
光光度計１００−３０型を用いて光幅１ｃｍで測定し
た。測定値は０．４４５であり、ウリジンヌクレオチド
の分子吸光係数（ε）＝９９００から計算した。
（［Ｍ］＝Ａ×１００／９９００、［Ｍ］×６５３＝原
液％、［Ｍ］は溶液のモル濃度、Ａは吸光度、１００は
希釈率、６５３はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン二
ナトリウム塩の分子量を示す） 上式により求められた原液の濃度は２．９３５％であ
り、本製品の純度は９７％以上である。
溶液を０．０１規定塩酸溶液で正確に１００倍希釈し、
この希釈液の２６２ｎｍの波長における吸光度を日立分
光光度計１００−３０型を用いて光幅１ｃｍで測定し
た。測定値は０．４４５であり、ウリジンヌクレオチド
の分子吸光係数（ε）＝９９００から計算した。
（［Ｍ］＝Ａ×１００／９９００、［Ｍ］×６５３＝原
液％、［Ｍ］は溶液のモル濃度、Ａは吸光度、１００は
希釈率、６５３はＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン二
ナトリウム塩の分子量を示す） 上式により求められた原液の濃度は２．９３５％であ
り、本製品の純度は９７％以上である。
【００３４】酵素分析：本製品が高純度のＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミン二ナトリウム塩であることをスタ
フィロコッカス属の細菌から調製した酵素ＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミンピロフォスフォリラーゼを用いた
反応により確認した。
アセチルグルコサミン二ナトリウム塩であることをスタ
フィロコッカス属の細菌から調製した酵素ＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミンピロフォスフォリラーゼを用いた
反応により確認した。
【００３５】
【実施例４】硫酸ナトリウム添加培地を用いる発酵法に
よるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造 本実施例は、培地の浸透圧を高める無機塩として塩化ナ
トリウムの代わりに硫酸ナトリウムを使用した実施例で
ある。
よるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造 本実施例は、培地の浸透圧を高める無機塩として塩化ナ
トリウムの代わりに硫酸ナトリウムを使用した実施例で
ある。
【００３６】種培地及び生産培地に、実施例３に記載し
た塩化ナトリウム４％の代わりに硫酸ナトリウム４％を
使用した以外は、実施例１と同様な製造条件で培養を行
い、湿重量で１８．５ｋｇの菌体を得た。この菌体を、
実施例３に記載と同様の方法で抽出、精製及び結晶化を
行い、１８２ｇの白色粉末を得た。得られた白色粉末
は、分析の結果、実施例３と同程度（９７％以上）の純
度のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン二ナトリウム塩
であった。
た塩化ナトリウム４％の代わりに硫酸ナトリウム４％を
使用した以外は、実施例１と同様な製造条件で培養を行
い、湿重量で１８．５ｋｇの菌体を得た。この菌体を、
実施例３に記載と同様の方法で抽出、精製及び結晶化を
行い、１８２ｇの白色粉末を得た。得られた白色粉末
は、分析の結果、実施例３と同程度（９７％以上）の純
度のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン二ナトリウム塩
であった。
【００３７】
【実施例５〜８】Zygosaccharomyces属以外の耐浸透圧
性酵母による生産 耐浸透圧性酵母としてZygosaccharomyces rouxiiの代わ
りにPichia farinosa、Debaryomycos hansenii、Hansen
ula anomala及びCandida versatilisをそれぞれ単独の
種菌として用い、培地中の塩化ナトリウム濃度を４％と
した以外は、実施例１と同様にして試験を行った。いず
れの酵母の場合もＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを
生産したが、その収量は、Zygosaccharomyces rouxiiを
使用した場合よりも低かった。
性酵母による生産 耐浸透圧性酵母としてZygosaccharomyces rouxiiの代わ
りにPichia farinosa、Debaryomycos hansenii、Hansen
ula anomala及びCandida versatilisをそれぞれ単独の
種菌として用い、培地中の塩化ナトリウム濃度を４％と
した以外は、実施例１と同様にして試験を行った。いず
れの酵母の場合もＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを
生産したが、その収量は、Zygosaccharomyces rouxiiを
使用した場合よりも低かった。
【００３８】
【発明の効果】本発明の実施により、糖鎖合成のスケー
ルアップにおける原料的隘路となっている、糖鎖関連医
薬品分野の研究開発及び基礎研究での応用に使用するＵ
ＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンが大量に供給される。
ルアップにおける原料的隘路となっている、糖鎖関連医
薬品分野の研究開発及び基礎研究での応用に使用するＵ
ＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンが大量に供給される。
【図１】実施例１で得られたＵＤＰ−Ｎ−アセチルグル
コサミンの、ＨＰＬＣ分析の結果を示すチャートであ
る。
コサミンの、ＨＰＬＣ分析の結果を示すチャートであ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年６月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】耐浸透圧性酵母として、Ｚｙｇｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｄｅｂａｒｙ
ｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属及びＣａｎｄｉ
ｄａ属に属する酵母が例示され、好ましくはＺｙｇｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母が挙げられ
る。
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｄｅｂａｒｙ
ｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属及びＣａｎｄｉ
ｄａ属に属する酵母が例示され、好ましくはＺｙｇｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母が挙げられ
る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】本発明において、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ属に属する耐浸透圧性酵母としては、特に
限定されないが、例えばＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｂａｉｌｉｉが挙げられる。また、Ｐｉｃｈｉ
ａ属に属する酵母としてＰｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓ
ａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母としてＤ
ｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ属に属する酵母としてＨａｎｓｅｎｕｌａ
ａｎｏｍａｌａ及びＣａｎｄｉｄａ属に属する酵母とし
てＣａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓが挙げられ
る。
ｏｍｙｃｅｓ属に属する耐浸透圧性酵母としては、特に
限定されないが、例えばＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｂａｉｌｉｉが挙げられる。また、Ｐｉｃｈｉ
ａ属に属する酵母としてＰｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓ
ａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母としてＤ
ｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ属に属する酵母としてＨａｎｓｅｎｕｌａ
ａｎｏｍａｌａ及びＣａｎｄｉｄａ属に属する酵母とし
てＣａｎｄｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓが挙げられ
る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】
【実施例５〜８】Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
属以外の耐浸透圧性酵母による生産 耐浸透圧性酵母としてＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｒｏｕｘｉｉの代わりにＰｉｃｈｉａ ｆａｒｉ
ｎｏｓａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉ
ｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ及びＣａｎｄ
ｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓをそれぞれ単独の種菌と
して用い、培地中の塩化ナトリウム濃度を４％とした以
外は、実施例１と同様にして試験を行った。いずれの酵
母の場合もＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを生産し
たが、その収量は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｒｏｕｘｉｉを使用した場合よりも低かった。
属以外の耐浸透圧性酵母による生産 耐浸透圧性酵母としてＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｒｏｕｘｉｉの代わりにＰｉｃｈｉａ ｆａｒｉ
ｎｏｓａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉ
ｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ及びＣａｎｄ
ｉｄａ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓをそれぞれ単独の種菌と
して用い、培地中の塩化ナトリウム濃度を４％とした以
外は、実施例１と同様にして試験を行った。いずれの酵
母の場合もＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを生産し
たが、その収量は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｒｏｕｘｉｉを使用した場合よりも低かった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 19/30 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｐ 19/30 Ｃ１２Ｒ 1:72）
Claims (3)
- 【請求項１】耐浸透圧性酵母を２〜８％の無機塩濃度の
培地にて好気的条件下で培養することを特徴とするウリ
ジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法。 - 【請求項２】耐浸透圧性酵母が、Zygosaccharomyces
属、Pichia属, Debaryomycos属, Hansenula属及びCandi
da属に属する酵母からなる群から選ばれる少なくとも１
種である請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項３】培養が、溶存酸素濃度が１ｐｐｍ以上に維
持された状態で行われることを特徴とする請求項１又は
２に記載のウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン
の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6120364A JP2767198B2 (ja) | 1994-05-12 | 1994-06-01 | ウリジン二リン酸ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法 |
| US08/435,152 US5674715A (en) | 1994-05-12 | 1995-05-05 | Method for producing uridine diphosphate N-acetylgluosamine |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9896194 | 1994-05-12 | ||
| JP6-98961 | 1994-05-12 | ||
| JP6120364A JP2767198B2 (ja) | 1994-05-12 | 1994-06-01 | ウリジン二リン酸ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0823993A true JPH0823993A (ja) | 1996-01-30 |
| JP2767198B2 JP2767198B2 (ja) | 1998-06-18 |
Family
ID=26440049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6120364A Expired - Lifetime JP2767198B2 (ja) | 1994-05-12 | 1994-06-01 | ウリジン二リン酸ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5674715A (ja) |
| JP (1) | JP2767198B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011810A1 (fr) * | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Yamasa Corporation | Procede de production d'uridine diphosphate-n-acetylglucosamine |
| JP2002335988A (ja) * | 2001-05-22 | 2002-11-26 | Yamasa Shoyu Co Ltd | オリゴ糖の製造法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1309837C (zh) * | 1996-09-13 | 2007-04-11 | 协和发酵工业株式会社 | 糖核苷酸类及复合糖类的制造方法 |
| ES2375357T3 (es) * | 2002-05-02 | 2012-02-29 | E-L Management Corp. | Procedimiento de mejora de la actividad biológica de extractos de origen vegetal. |
| US20030219456A1 (en) * | 2002-05-21 | 2003-11-27 | Taing Ok | Method of utilization of zygosaccharomyces rouxii |
| CN112592944B (zh) * | 2020-12-17 | 2023-09-29 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种氨基葡萄糖的生产方法 |
-
1994
- 1994-06-01 JP JP6120364A patent/JP2767198B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-05 US US08/435,152 patent/US5674715A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011810A1 (fr) * | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Yamasa Corporation | Procede de production d'uridine diphosphate-n-acetylglucosamine |
| US6287819B1 (en) | 1997-08-29 | 2001-09-11 | Yamasa Corporation | Process for producing uridine diphosphate-n-acetylglucosamine |
| JP2002335988A (ja) * | 2001-05-22 | 2002-11-26 | Yamasa Shoyu Co Ltd | オリゴ糖の製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5674715A (en) | 1997-10-07 |
| JP2767198B2 (ja) | 1998-06-18 |
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