CN109161536B - 制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法，该制备方法采用含尿苷的料液为底物，加入具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的大肠杆菌细胞破碎液、六偏磷酸钠、硫酸镁和少量ATP，在pH 8.0，温度30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸。在上述偶联催化反应体系中，尿苷激酶负责催化尿苷和ATP生成尿苷酸，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP。聚磷酸激酶负责催化六偏磷酸钠和ADP形成ATP，从而实现反应中ATP的再生。本发明提供的尿苷酸生产方法具有原料价格低廉，周期短，操作简便，绿色环保，产率高的优点，具有良好的工业应用价值。

Description

制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法

技术领域

本发明涉及化合物生物技术生产领域，具体涉及一种制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法。

背景技术

尿苷酸是一种重要的核苷酸产品，可作为食品添加剂、药品以及药物前体应用于不同领域。作为母乳中含量第二大的核苷酸，它是婴幼儿食品中常用的添加剂；能参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸苷的合成，也可作为膜磷脂的前体提高脑部胞苷二磷酸胆碱和乙酰胆碱水平；以其为前体的碘苷也已广泛应用于临床。

现有的尿苷酸的生产方法主要为化学合成法和酶解法。

化学合成法包括磷酸化法和脱氨法，其中是磷酸化法(201410334268.9)是以尿苷为原料，将2，3位的羟基保护后，再使用有毒的POCl₃试剂作为磷酸化试剂合成尿苷酸，整个过程收率较高但是生产安全性差，容易造成污染且杂质较多。脱氨法(ZL201110116164.7，ZL201310442551.9)是以胞苷酸为原料，在酸性条件下经过脱氨反应，将胞苷酸直接转变为尿苷酸，整个过程简单高效，但由于原料胞苷酸价格昂贵，生产成本较高。

酶解法(Bioresource Technology,2003,88(3):245-250)是利用核酸酶水解核糖核酸(RNA)得到四中单核苷酸(腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸)混合物后，再经过离子交换法分离精制得到尿苷酸。与化学法相比，酶解法具有原料成本低、反应安全、反应条件温和等有点，但是存在生产周期长，分离精制工序复杂，加工成本高等缺陷。

除了化学合成法和酶解法之外，也有研究者使用来自大肠杆菌或保加利亚乳杆菌的尿苷激酶以尿苷为底物催化合成尿苷酸(Journal of Biotechnology,2014,188:81–87)。该方法转化周期较短，尿苷酸收率较高，但是使用的尿苷激酶高度依赖GTP作为磷酸供体，而GTP价格昂贵且再生成本较高。鉴于现有技术存在的不足，特提出本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法，两种工程菌发酵获得酶可直接催化尿苷溶液或尿苷发酵液得到产品，原料成本低廉，产物单一易于分离纯化，尿苷酸产量和摩尔转化率具有显著优势。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种制备尿苷酸用转化制剂，包括尿苷激酶和聚磷酸激酶，所述尿苷激酶的氨基酸序列见序列1，所述聚磷酸激酶的基因序列见序列3；或所述聚磷酸激酶的基因序列见序列4。

一种尿苷酸制备的方法，具体操作如下

(1)将工程菌进行破碎获得粗酶液，获得具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的粗酶液；(2)获得的粗酶液与50-150mM的尿苷溶液或尿苷发酵液、50-150mM的六偏磷酸钠、50-150mM的硫酸镁、3-9mM的ATP混合，在pH 8.0，30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸，工程菌分别表达权利要求1所述尿苷激酶和聚磷酸激酶；

所述工程菌以pET-his质粒为载体在E.coli BL21中过表达权利要求1所述尿苷激酶；所述工程菌以pET-28a质粒为载体在E.coli BL21中过表达利要求1所述聚磷酸激酶；

所述工程菌的培养方法为：

将工程菌株从甘油保菌管中以1％v/v的接种量接种至5mL含有100μg/mL相应质粒抗性抗生素的LB液体培养基摇管中，37℃，200r/min活化培养12h，以1％v/v接种量接种至100mL含有100μg/mL相应质粒抗性抗生素的LB液体培养基的500mL三角瓶中，于37℃200rpm培养12h，再按1％v/v接种量转接400mL含有100μg/mL相应质粒抗性抗生素的LB液体培养基的1000mL三角瓶中，于37℃200rpm继续培养；待菌株浓度OD_600nm达到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG，25℃诱导培养8-12h表达蛋白。

而且，所述尿苷溶液或尿苷发酵液、六偏磷酸钠和硫酸镁的浓度均为100mM，ATP的浓度为5mM。而且，所述尿苷溶液或尿苷发酵液、六偏磷酸钠和硫酸镁的浓度均为100mM，ATP的浓度为5mM。

本发明的有益效果为：

1、本发明筛选得到的两种尿苷激酶均可以利用ATP作为磷酸供体，与现有报道使用GTP作为磷酸供体的尿苷激酶相比，ATP来源更为广泛且易于再生。

2、本发明将尿苷激酶和聚磷酸激酶进行偶联，使用聚磷酸激酶催化的反应实现ATP的循环再生，从而减少反应中ATP的添加量，有效的降低了生产成本。

3、本发明所得的基因工程菌易于培养，可直接催化尿苷发酵液得到产品，原料成本低廉，产物单一易于分离纯化，尿苷酸产量和摩尔转化率具有显著优势。

4、本发明首次分离出脱氮假单胞菌来源的聚磷酸激酶编码基因，发明人经过比较多种微生物来源的聚磷酸激酶的活性和与尿苷激酶的协同性，证实很多种来源的聚磷酸激酶均不能获得较高的转化率。本发明通过发明人多年的研究、分析、对比，首先得出较高转化率和催化活性的脱氮假单胞菌来源的聚磷酸激酶编码基因，其次找到了与其能够进行匹配协作的尿苷激酶，首次采用全细胞催化合成尿苷酸。

附图说明

图1为酶催化反应示意图。

图2为尿苷和尿苷酸标准品液相色谱图(尿苷出峰时间为8.9min，尿苷酸出峰时间为13.3min)。

图3为以尿苷溶液为原料催化合成尿苷酸的液相色谱图。

图4为尿苷发酵液的液相色谱图。

图5为以尿苷发酵液为原料催化合成尿苷酸的液相色谱图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

一种尿苷酸制备的方法，利用含尿苷的料液为底物，加入具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的大肠杆菌细胞破碎液、六偏磷酸钠、硫酸镁和少量ATP，在pH 8.0，30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸。

优选的，上述尿苷酸的制备方法，具体步骤如下：

(1)在大肠杆菌E.coli BL21(ACCC11171)中异源表达尿苷激酶编码基因，构建出具有尿苷激酶活性的菌株E.coli UDK；

(2)在大肠杆菌E.coli BL21(ACCC11171)中异源表达聚磷酸激酶编码基因，构建出具有聚磷酸激酶活性的菌株E.coli PPK；

(3)将上述构建的重组菌株E.coli UDK和E.coli PPK分别在培养基中培养，产生高酶活性的尿苷激酶和聚磷酸激酶；

(4)将步骤(3)中培养获得的具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的大肠杆菌细胞(E.coli UDK和E.coli PPK细胞)进行破碎获得粗酶液；

(5)将步骤(4)中获得的粗酶液与50-150mM的尿苷溶液或尿苷发酵液、50-150mM的六偏磷酸钠、50-150mM的硫酸镁、3-9mM的ATP混合，在pH 8.0，30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸。

优选的，上述尿苷酸的制备方法，所述步骤(2)中是以pET-28a质粒为载体在E.coliBL21中过表达聚磷酸激酶基因，构建出具有聚磷酸激酶活性的菌株E.coliUDK。其中，所述聚磷酸激酶编码基因分别来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides，ATCC17023)和脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans，ATCC13867)，其核苷酸序列分别为序列表<3>、<4>所示序列；质粒pET-28a的核苷酸序列为序列表<6>所示序列；

优选的，上述尿苷酸的制备方法，所述步骤(3)中重组菌株的培养方法为：将重组菌株从甘油保菌管中以1％(v/v)的接种量接种至5mL含有相应质粒抗性抗生素(100μg/mL)的LB液体培养基摇管中，37℃，200r/min活化培养12h，以1％(v/v)接种量接种至100mL含有相应质粒抗性抗生素(100μg/mL)的LB液体培养基的500mL三角瓶中，于37℃200rpm培养12h，再按1％(v/v)接种量转接400mL含有相应质粒抗性抗生素(100μg/mL)的LB液体培养基的1000mL三角瓶中，于37℃200rpm继续培养；待菌株浓度OD_600nm达到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG，25℃诱导培养8-12h表达蛋白。

优选的，上述尿苷酸的制备方法，所述步骤(3)中培养基为LB液体培养基：每10gNaCl、5g酵母粉、10g蛋白胨用去离子水定容到1L。

优选的，上述尿苷酸的制备方法，所述步骤(4)中细胞破碎的方法可以为超声破碎、冻融破碎或者液氮研磨破碎。

优选的，上述尿苷酸的制备方法，所述步骤(5)中尿苷溶液或尿苷发酵液、六偏磷酸钠和硫酸镁的浓度均为100mM，ATP的浓度为5mM。

上述尿苷酸的制备方法，所得反应液中尿苷酸的检测方法为：取适量体积的反应液于沸水浴5min，再于13000rpm离心10min后，取上清用去离子水稀释至1g/L，用0.22um的无菌膜过滤至液相瓶待分析。使用高效液相色谱测定尿苷酸的含量，进样量为80uL，色谱柱为Sepax C18(4.6mm×250mm)色谱柱，流动相为0.6％磷酸缓冲液(三乙胺调pH 6.6)，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长280nm，尿苷保留时间约为8.9min，尿苷酸保留时间约为13.3min。

实施例1

具有尿苷激酶活性的菌株E.coli UDK的构建

①根据Genbank上嗜热栖热菌(Thermus thermophiles,ATCC27634)的尿苷激酶编码基因udk 1的核苷酸序列，在其氨基酸序列第93上设计点突变，使酪氨酸残基突变为组氨酸残基，并用大肠杆菌中常见的密码子优化手段对其进行密码子优化，将优化后序列加上酶切位点BamH I和EcoR I送到金唯智公司进行合成。

②根据Genbank上芽孢杆菌(Bacillus sp.,NCBI:txid1960589)的尿苷激酶序列编码基因udk2的核苷酸序列，用大肠杆菌中常见的密码子优化手段对其进行密码子优化，将优化后序列加上酶切位点BamH I和EcoR I(见附录〈2〉)送到金唯智公司进行合成。

③使用Takara限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切步骤①、②中的目的基因片段及pET-His载体质粒(见附录〈5〉)，获得带有相同粘性末端的目的基因和线性化质粒片段。

④使用Takara T4DNA连接酶分别连接步骤③中的基因片段，得到两种重组表达载体pET-His-udk 1和pET-His-udk 2。

⑤将步骤④中的两种重组表达载体分别转化入E.coli BL21(ACCC11171)中，获得两株具有尿苷激酶活性的菌株E.coli UDK 1和E.coli UDK 2。

实施例2

具有聚磷酸激酶活性的菌株E.coli PPK的构建

①采用PCR技术以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides，ATCC17023)基因组为模板，根据聚磷酸激酶编码基因ppk 1的核苷酸序列(见附录〈3〉)，设计一对基因扩增引物(见附录〈7〉)，扩增获取目的基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点EcoR I和HindIII。

②采用PCR技术以脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans，ATCC13867)基因组为模板，根据聚磷酸激酶编码基因ppk 2的核苷酸序列(见附录〈4〉)，设计一对基因扩增引物(见附录〈8〉)，扩增获取目的基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点EcoR I和HindIII。

③使用Takara限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切步骤①、②中获得目的片段及pET-28a载体质粒(见附录〈6〉)，获得带有相同粘性末端的目的基因和线性化质粒片段。

④使用Takara T4DNA连接酶分别连接步骤③中获得的基因片段，得到两种重组表达载体pET-28a-ppk 1和pET-28a-ppk 2。

⑤将步骤④的两种重组表达载体分别转化入E.coli BL21(ACCC11171)中，获得具有聚磷酸激酶活性的菌株E.coli PPK 1和E.coli PPK 2。

实施例3

尿苷激酶和聚磷酸激酶粗酶液的制备

①将实施例1和2中的重组菌株从甘油保菌管中以1％(v/v)的接种量接种至5mL含有相应质粒抗性抗生素(100μg/mL)的LB液体培养基摇管中，37℃，200r/min活化培养12h，以1％(v/v)接种量接种至100mL含有相应质粒抗性抗生素(100μg/mL)的LB液体培养基的500mL三角瓶中，于37℃200rpm培养12h，再按1％(v/v)接种量转接400mL含有相应质粒抗性抗生素(100μg/mL)的LB液体培养基的1000mL三角瓶中，于37℃200rpm继续培养；待菌株浓度OD_600nm达到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG，25℃诱导培养8-12h表达蛋白。

②培养结束后，将发酵液于4℃，80000rpm离心收集菌体。使用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤三次后，再用50mM pH 8.0的Tris-HCL缓冲液重悬，超声破碎30min，即得到尿苷激酶和聚磷酸激酶粗酶液。

实施例4

双酶偶联催化尿苷溶液合成尿苷酸

①配制反应体系，其中尿苷溶液、六偏磷酸钠和硫酸镁的浓度均为100mM，ATP的浓度为5mM，反应过程中使用氢氧化钠控制pH值为8.0。

②将不同来源的尿苷激酶与不同来源的聚磷酸激酶两两组合进行催化反应。

组合1：E.coli UDK 1与E.coli PPK 1

组合2：E.coli UDK 2与E.coli PPK 1

组合3：E.coli UDK 1与E.coli PPK 2

组合4：E.coli UDK 2与E.coli PPK 2

③向步骤①中的反应体系内加入不同组合混合粗酶液(反应体系中蛋白浓度为30g/L)，在pH 8.0，30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸，反应时间6h。

④反应结束后，取适量体积的反应液于沸水浴5min，再于13000rpm离心10min后，取上清用去离子水稀释至1g/L，用0.22um的无菌膜过滤至液相瓶待分析。使用高效液相色谱测定尿苷酸的含量，进样量为80uL，色谱柱为Sepax C18(4.6mm×250mm)色谱柱，流动相为0.6％磷酸缓冲液(三乙胺调pH 6.6)，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长280nm。经高效液相色谱检测，测的各个组合反应催化情况如表1所示。

表1以尿苷溶液为原料的催化反应结果

实施例5

双酶偶联催化尿苷发酵液合成尿苷酸

①配制反应体系，其中尿苷发酵液、六偏磷酸钠和硫酸镁的浓度均为100mM，ATP的浓度为5mM，反应过程中使用氢氧化钠控制pH值为8.0。

②将不同来源的尿苷激酶与不同来源的聚磷酸激酶两两组合进行催化反应。

组合1：E.coli UDK 1与E.coli PPK 1

组合2：E.coli UDK 2与E.coli PPK 1

组合3：E.coli UDK 1与E.coli PPK 2

组合4：E.coli UDK 2与E.coli PPK 2

③加入不同组合混合粗酶液(反应体系中蛋白浓度为30g/L)，在pH 8.0，30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸，反应时间6h。

④反应结束后，取适量体积的反应液于沸水浴5min，再于13000rpm离心10min后，取上清用去离子水稀释至0.1-2g/L，用0.22um的无菌膜过滤至液相瓶待分析。使用高效液相色谱测定尿苷酸的含量，进样量为80uL，色谱柱为Sepax C18(4.6mm×250mm)色谱柱，流动相为0.6％磷酸缓冲液(三乙胺调pH 6.6)，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长280nm。经高效液相色谱检测，测的各个组合反应催化情况如表2所示。

表2以尿苷发酵液为原料的催化反应结果

实施例6

不同来源聚磷酸激酶酶活的比较

聚磷酸激酶催化反应如下：ADP+(Pi)n→ATP+(Pi)n-1，由此，通过测定ATP的生成量可以计算聚磷酸激酶的酶活。反应体系为1mL反应液，50μL的纯酶液，5mM的ADP，10mM的六偏磷酸钠，30mM的硫酸镁，50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液，30℃下反应20min，沸水浴加热5min终止反应，反应后将反应液稀释100倍，使用高效液相色谱检测ATP的生成量。酶活力单位定义为：一个酶活单位(U)即一定温度和pH条件下每分钟催化产生1μmol ATP所需的酶量。经计算，来自于类球红细菌的聚磷酸激酶PPK1的比酶活为187U/mg,而来自于脱氮假单胞菌的聚磷酸激酶PPK2的比酶活为229U/mg。

本发明涉及的基因序列附录如下：

〈1〉嗜热栖热菌的尿苷激酶

VSAPKPFVIGIAGGTASGKTTLAQALARTLGERVALLPMDHYYKDLGHLPLEERLRVNYDHPDAFDLALYLEHAQALLRGLPVEMPVYDFRAHTRSPRRTPVRPAPVVILEGILVLYPKELRDLMDLKVFVDADADERFIRRLKRDVLERGRSLEGVVAQYLEQVKPMHLHFVEPTKRYADVIVPRGGQNPVALEMLAAKALARLARMGAA

〈2〉芽孢杆菌的尿苷激酶基因

CGGGATCCGAATTCATGGCAAGAAAACCGGTAATAATCGGTGTTGCTGGAGGTACGGCCTCTGGTAAGACGACTGTTGCAAAAGAAATCTTTGAGGAATTTAGTGAGCAATCCATTGTACTTATTGAACAGGATGCCTATTATAAAGATCAAAGTCACCTGAGCTTTGAAGAACGGTTACAAACGAATTATGATCATCCACTGGCTTTTGATAGTGAATTATTGCTAGAACATTTGCAAATGCTCGCAAATCGTCGCGGAATTGACAAGCCTGTTTATGATTATAAAGAACATACACGATCAAACGAGGTCGTTCGGATTGAACCGAAGGATGTTATCATCTTAGAAGGGATTCTTATTTTGGAAGATGAGCGTCTCCGTGATCTAATGGACATTAAACTCTTTGTAGATACCGATGCGGACATTCGCATTATTCGTAGACTTTCCCGTGACATAAGTGAGAGAGGGCGTTCTATTGAATCGGTCATCGAGCAGTATACGGATGTTGTACGTCCGATGCATCTTCAATTTATTGAACCAACTAAGCGATACGCAGATGTAATTATCCCAGAAGGTGGTAAAAATCGTGTCGCAATTGATTTAATGGTGACAAAAATTCGTACAATTATTGAAGAGAACGCGATTTTGTAACGAATTC

〈3〉类球红细菌的聚磷酸激酶编码基因

CGGAATTCATGGCCGAAGATCGTGCTATGCCGGTTATGCCGCCGGCTGCTGACGCTGCTGAAGCCGTCCCGGCCGCTCCGACCGCCCTGCCGGAAGAAGGTCCGGCAGGTCCGGAAGCACCGCTGCAAACCCTGCATGGTCCGCGTCACTTTCCGGCAGTTGATGCGAACGCCATTCGCCAGGCTTTCGAAGGCGGTCATTATCCGTACCCGCGTCGCCTGGGCCGTGTGGTTTATGAAGCGGAAAAAGCCCGCCTGCAGGCAGAACTGCTGAAGGTCCAGATTTGGGCGCAAGAAACCGGTCAGAAATTTGTGATCCTGATGGAAGGCCGTGATGCGGCCGGTAAAGGCGGTACGATCAAGCGCTTCATGGAACATCTGAACCCGCGTTATGCACGCGTCGTGGCTCTGACCAAACCGGGCGAACGTGAACGCGGTCAATGGTTTTTCCAGCGTTACATTGAACACCTGCCGACGGCCGGCGAAATCGTGTTTTTCGATCGCAGCTGGTATAATCGTGCAGGCGTGGAACGCGTTATGGGTTTTTGCACCCCGTCTGAATACCTGGAATTTATGCGTCAAGCGCCGGAACTGGAACGTATGCTGGTTCGCTCAGGTATTCGTCTGTATAAATACTGGTTTTCGGTCACCCGCGATGAACAGCGTGCACGCTTCCTGGCCCGTGAAACGGACCCGCTGAAACGCTGGAAGCTGAGTCCGATTGATAAAGCGTCCCTGGACAAGTGGGATGACTATACCGAAGCAAAAGAAGCTATGTTTTTCTACACCGATACGGCAGACGCTCCGTGGACGATCGTGAAGTCCAACGATAAAAAGCGTGCCCGCCTGAATTGTATGCGTCACTTTCTGAGCTCTCTGGATTATCCGGGCAAAGACCCGGAAGTTGTCGGTGTCCCGGACCCGCTGATTGTGGGTCGTGCAGCTCAGGTTATCGGTACCGCTGCCGACATTCTGGACTCCGCCACCCCGCCGGCCCTGCGTAAACCGCGTCAAGGTTGACCCAAGCTT

〈4〉脱氮假单胞菌的聚磷酸激酶编码基因

CGGAATTCATGCCGCAGCCCGACTCCAACAAGCCCGCTCCCGCCAGCGCACCCACCGTGGGTGGCGAGGAAATCCGCGCGCAAAGCCACGGCCCGGTGGCGCTGACCGTCGCCCTGGCCCCGCGCGGCAGCAACGAGGACTCCACCTCCGCCGAGTTGCCCGCCGGCTATCCCTACCGCCGCCGCCTGCAACGCAAGGAGTACGAGGCACAGAAGGCGCAACTGCAGGTCGAGCTGCTGAAGGTGCAGAGCTGGGTGAAGGAAACCGGCCAGCGCATCGTCGTGCTCTTCGAGGGCCGCGACGCCGCCGGCAAGGGTGGGACCATCAAGCGCTTCATGGAGCACCTCAACCCGCGCGGCGCCCGCGTTGTGGCGCTGGAGAAGCCCAGCGACGCCGAGCGCGGGCAGTGGTATTTCCAGCGCTACATCCAGCACCTGCCCACCGCCGGCGAGATCGTCTTCTTCGACCGCTCCTGGTACAACCGCGCCGGGGTCGAGCGGGTCATGGGCTTCTGCTCGCCGCGCCAGTACCTGGAGTTCATGCAGCAGACCCCGGAGCTGGAGCGGATGCTGGTGCGCAACGGCATCCACCTGCTCAAGTACTGGTTCTCGGTGAGCCGGGAAGAGCAGCTGCGCCGCTTCGTCTCGCGCCGCGACGACCCGCTCAAGCACTGGAAGCTGTCGCCCATCGACATCCAGTCGCTGGACCGCTGGGACGAGTACACCCAGGCCAAGGAGGCGATGTTCTTCCACACCGACACCGCCGATGCGCCCTGGGTGGTGATCAAGTCCGACGACAAGAAGCGCGCGCGGCTGAACTGCCTGCGCCACTTCCTGCACGTGCTGGACTACCCCGGCAAGGACCTGAGGATCGCCCGCGCCCCGGACGACCGGCTGGTGGGCCGGGCCGCCGAACTGGACCGCGACGAGCTGGAGCGCCCGATACCGGCTCCGGTGGCGGAGCCGATACCGGCCTGACCCAAGCTT

〈5〉pET-His质粒

AGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGCATCATCACCATCACCATCTGCTGCCGCGCGGATCCGCAGAATTCAGCGCTAGCTAACATATCATCATCATTAAGCTT

〈6〉pET-28a质粒

TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT

〈7〉类球红细菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物

5'CG GAATTC ATGGGTAAGAATCCAGTAGTCATTG 3' EcoR I

5'CCC AAGCTT TGCTATGGTATTACAAAATCGCG 3' Hind III

〈8〉脱氮假单胞菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物

5'CG GAATTCATGCCGCAGCCCGACT 3' EcoR I

5'CCC AAGCTT TCAGGCCGGTATCGGCT 3' Hind III

上述参照具体实施方式对该一种尿苷酸的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 制备尿苷酸用酶制剂以及酶催化制备尿苷酸的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 211

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌的尿苷激酶(Unknown)

<400> 1

Val Ser Ala Pro Lys Pro Phe Val Ile Gly Ile Ala Gly Gly Thr Ala

1 5 10 15

Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Ala Leu Ala Arg Thr Leu Gly Glu

20 25 30

Arg Val Ala Leu Leu Pro Met Asp His Tyr Tyr Lys Asp Leu Gly His

35 40 45

Leu Pro Leu Glu Glu Arg Leu Arg Val Asn Tyr Asp His Pro Asp Ala

50 55 60

Phe Asp Leu Ala Leu Tyr Leu Glu His Ala Gln Ala Leu Leu Arg Gly

65 70 75 80

Leu Pro Val Glu Met Pro Val Tyr Asp Phe Arg Ala His Thr Arg Ser

85 90 95

Pro Arg Arg Thr Pro Val Arg Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Glu Gly

100 105 110

Ile Leu Val Leu Tyr Pro Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Asp Leu Lys

115 120 125

Val Phe Val Asp Ala Asp Ala Asp Glu Arg Phe Ile Arg Arg Leu Lys

130 135 140

Arg Asp Val Leu Glu Arg Gly Arg Ser Leu Glu Gly Val Val Ala Gln

145 150 155 160

Tyr Leu Glu Gln Val Lys Pro Met His Leu His Phe Val Glu Pro Thr

165 170 175

Lys Arg Tyr Ala Asp Val Ile Val Pro Arg Gly Gly Gln Asn Pro Val

180 185 190

Ala Leu Glu Met Leu Ala Ala Lys Ala Leu Ala Arg Leu Ala Arg Met

195 200 205

Gly Ala Ala

210

<210> 2

<211> 657

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌的尿苷激酶基因(Unknown)

<400> 2

cgggatccga attcatggca agaaaaccgg taataatcgg tgttgctgga ggtacggcct 60

ctggtaagac gactgttgca aaagaaatct ttgaggaatt tagtgagcaa tccattgtac 120

ttattgaaca ggatgcctat tataaagatc aaagtcacct gagctttgaa gaacggttac 180

aaacgaatta tgatcatcca ctggcttttg atagtgaatt attgctagaa catttgcaaa 240

tgctcgcaaa tcgtcgcgga attgacaagc ctgtttatga ttataaagaa catacacgat 300

caaacgaggt cgttcggatt gaaccgaagg atgttatcat cttagaaggg attcttattt 360

tggaagatga gcgtctccgt gatctaatgg acattaaact ctttgtagat accgatgcgg 420

acattcgcat tattcgtaga ctttcccgtg acataagtga gagagggcgt tctattgaat 480

cggtcatcga gcagtatacg gatgttgtac gtccgatgca tcttcaattt attgaaccaa 540

ctaagcgata cgcagatgta attatcccag aaggtggtaa aaatcgtgtc gcaattgatt 600

taatggtgac aaaaattcgt acaattattg aagagaacgc gattttgtaa cgaattc 657

<210> 3

<211> 1028

<212> DNA

<213> 类球红细菌的聚磷酸激酶编码基因(Unknown)

<400> 3

cggaattcat ggccgaagat cgtgctatgc cggttatgcc gccggctgct gacgctgctg 60

aagccgtccc ggccgctccg accgccctgc cggaagaagg tccggcaggt ccggaagcac 120

cgctgcaaac cctgcatggt ccgcgtcact ttccggcagt tgatgcgaac gccattcgcc 180

aggctttcga aggcggtcat tatccgtacc cgcgtcgcct gggccgtgtg gtttatgaag 240

cggaaaaagc ccgcctgcag gcagaactgc tgaaggtcca gatttgggcg caagaaaccg 300

gtcagaaatt tgtgatcctg atggaaggcc gtgatgcggc cggtaaaggc ggtacgatca 360

agcgcttcat ggaacatctg aacccgcgtt atgcacgcgt cgtggctctg accaaaccgg 420

gcgaacgtga acgcggtcaa tggtttttcc agcgttacat tgaacacctg ccgacggccg 480

gcgaaatcgt gtttttcgat cgcagctggt ataatcgtgc aggcgtggaa cgcgttatgg 540

gtttttgcac cccgtctgaa tacctggaat ttatgcgtca agcgccggaa ctggaacgta 600

tgctggttcg ctcaggtatt cgtctgtata aatactggtt ttcggtcacc cgcgatgaac 660

agcgtgcacg cttcctggcc cgtgaaacgg acccgctgaa acgctggaag ctgagtccga 720

ttgataaagc gtccctggac aagtgggatg actataccga agcaaaagaa gctatgtttt 780

tctacaccga tacggcagac gctccgtgga cgatcgtgaa gtccaacgat aaaaagcgtg 840

cccgcctgaa ttgtatgcgt cactttctga gctctctgga ttatccgggc aaagacccgg 900

aagttgtcgg tgtcccggac ccgctgattg tgggtcgtgc agctcaggtt atcggtaccg 960

ctgccgacat tctggactcc gccaccccgc cggccctgcg taaaccgcgt caaggttgac 1020

ccaagctt 1028

<210> 4

<211> 986

<212> DNA

<213> 脱氮假单胞菌的聚磷酸激酶编码基因(Unknown)

<400> 4

cggaattcat gccgcagccc gactccaaca agcccgctcc cgccagcgca cccaccgtgg 60

gtggcgagga aatccgcgcg caaagccacg gcccggtggc gctgaccgtc gccctggccc 120

cgcgcggcag caacgaggac tccacctccg ccgagttgcc cgccggctat ccctaccgcc 180

gccgcctgca acgcaaggag tacgaggcac agaaggcgca actgcaggtc gagctgctga 240

aggtgcagag ctgggtgaag gaaaccggcc agcgcatcgt cgtgctcttc gagggccgcg 300

acgccgccgg caagggtggg accatcaagc gcttcatgga gcacctcaac ccgcgcggcg 360

cccgcgttgt ggcgctggag aagcccagcg acgccgagcg cgggcagtgg tatttccagc 420

gctacatcca gcacctgccc accgccggcg agatcgtctt cttcgaccgc tcctggtaca 480

accgcgccgg ggtcgagcgg gtcatgggct tctgctcgcc gcgccagtac ctggagttca 540

tgcagcagac cccggagctg gagcggatgc tggtgcgcaa cggcatccac ctgctcaagt 600

actggttctc ggtgagccgg gaagagcagc tgcgccgctt cgtctcgcgc cgcgacgacc 660

cgctcaagca ctggaagctg tcgcccatcg acatccagtc gctggaccgc tgggacgagt 720

acacccaggc caaggaggcg atgttcttcc acaccgacac cgccgatgcg ccctgggtgg 780

tgatcaagtc cgacgacaag aagcgcgcgc ggctgaactg cctgcgccac ttcctgcacg 840

tgctggacta ccccggcaag gacctgagga tcgcccgcgc cccggacgac cggctggtgg 900

gccgggccgc cgaactggac cgcgacgagc tggagcgccc gataccggct ccggtggcgg 960

agccgatacc ggcctgaccc aagctt 986

<210> 5

<211> 2799

<212> DNA

<213> pEt-His质粒(Unknown)

<400> 5

agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 60

acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggatctg gcgtaatagc 120

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgggac 180

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 240

acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 300

ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 360

gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca 420

tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 480

ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 540

gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 600

gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 660

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 720

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 780

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 840

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 900

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 960

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 1020

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 1080

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 1140

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 1200

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 1260

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 1320

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 1380

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 1440

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 1500

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 1560

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 1620

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 1680

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 1740

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 1800

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 1860

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 1920

gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 1980

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 2040

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 2100

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 2160

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 2220

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 2280

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 2340

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 2400

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 2460

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 2520

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 2580

aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag gatctcgatc ccgcgaaatt 2640

aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct agaaataatt ttgtttaact 2700

ttaagaagga gatataccat gcatcatcac catcaccatc tgctgccgcg cggatccgca 2760

gaattcagcg ctagctaaca tatcatcatc attaagctt 2799

<210> 6

<211> 5369

<212> DNA

<213> pEt-28a质粒(Unknown)

<400> 6

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160

ggtcgcggat ccgaattcga gctccgtcga caagcttgcg gccgcactcg agcaccacca 5220

ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc 5280

caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt 5340

tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 5369

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 类球红细菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物(Unknown)

<400> 7

cggaattcat gggtaagaat ccagtagtca ttg 33

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 类球红细菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物(Unknown)

<400> 8

cccaagcttt gctatggtat tacaaaatcg cg 32

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 脱氮假单胞菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物(Unknown)

<400> 9

cggaattcat gccgcagccc gact 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 脱氮假单胞菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物(Unknown)

<400> 10

cccaagcttt caggccggta tcggct 26

Claims (3)

1.一种制备尿苷酸用转化制剂，其特征在于：包括尿苷激酶和聚磷酸激酶，所述尿苷激酶的氨基酸序列见序列1，所述聚磷酸激酶的基因序列见序列3或序列4。

2.一种尿苷酸制备的方法，其特征在于：具体操作如下

（1）将工程菌进行破碎获得粗酶液，获得具有尿苷激酶和聚磷酸激酶活性的粗酶液；（2）获得的粗酶液与50-150 mM的尿苷溶液、50-150 mM的六偏磷酸钠、50-150 mM的硫酸镁、3-9 mM的ATP混合，在pH 8.0，30℃的反应条件下进行酶促反应合成尿苷酸，工程菌分别表达权利要求1所述尿苷激酶和聚磷酸激酶；

所述工程菌以pET-his质粒为载体在E. coli BL21中过表达权利要求1所述尿苷激酶；所述工程菌以 pET-28a 质粒为载体在E. coli BL21中过表达权利要求1所述聚磷酸激酶；

所述工程菌的培养方法为：

将工程菌株从甘油保菌管中以1%v/v的接种量接种至5 mL 含有100 μg/mL相应质粒抗性抗生素的LB 液体培养基摇管中，37℃，200r /min活化培养12 h，以1%v/v接种量接种至100 mL含有100 μg/mL相应质粒抗性抗生素的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，于37℃200 rpm培养12 h，再按1%v/v接种量转接400 mL含有100 μg/mL相应质粒抗性抗生素的LB液体培养基的1000 mL三角瓶中，于37℃ 200 rpm继续培养；待菌株浓度OD_600nm 达到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3 mmol/L的IPTG，25 ℃诱导培养8-12h表达蛋白。

3.根据权利要求2所述的尿苷酸制备的方法，其特征在于：所述尿苷溶液、六偏磷酸钠和硫酸镁的浓度均为100 mM，ATP的浓度为5 mM。

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