CN111411114B - 一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，包括：以嗜热链球菌Benshit的基因组为模板，构建argR基因外源表达质粒pPH12、pPH13和pPH14和argR基因过表达质粒pPH15和弱化表达质粒pPH16；将质粒pET30α、pPH12、pPH13和pPH14进行诱导优化，可溶性蛋白ArgR；将过表达质粒pPH15和弱化表达质粒pPH16转入嗜热链球菌Benshit，得到重组菌株Benshit/pPH15和Benshit/pPH16；将重组菌株Benshit/pPH15和重组菌株Benshit/pPH16置于发酵培养基中进行过夜培养、离心发酵、透析，得到嗜热链球菌胞外多糖EPS。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调控嗜热链球菌胞外多 糖含量的方法。
背景技术
乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)分为同聚多糖和杂聚 多糖，作为食品稳定剂和增稠剂能显著增加粘度防止乳清沉淀。EPS 不但有利于益生菌肠内定植，还具有增强机体免疫、抗肿瘤、抗氧化 和降血脂等活性功能。嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)是一 种产酸性能优良的乳酸菌,其代谢合成EPS能显著改善食品质地和风味，广泛应用于乳制品发酵。嗜热链球菌EPS主要由不同比例的半 乳糖和葡萄糖组成，伴有少量乙酰半乳糖、乙酰半乳糖胺、鼠李糖和 岩藻糖等单糖。嗜热链球菌EPS生物合成由基因组中大小为15-36kb 的eps基因簇控制，其中epsA和epsB编码EPS合成调控蛋白，epsC 和epsD决定EPS链长，epsE、epsF、epsG、epsH和epsI是功能性 重复糖单元，epsJ、epsK、epsL和epsM是聚合和输出单元。功能性 重复糖单元中，epsE编码半乳糖基转移酶，受epsD调控；epsF、epsG 和epsI编码不同的糖基转移酶，epsH编码乙酰转移酶。
革兰氏阳性菌胞内精氨酸生物合成受argCJBDFRGH基因簇控 制，其中argR编码精氨酸合成代谢的主要调控蛋白ArgR；结合L- 精氨酸的ArgR能和启动子区域18bp回文结构序列(ARG boxes) 结合，强烈抑制操纵子上游启动子活性，负调控整个精氨酸合成通路。ArgR蛋白N端由Ser-57和Arg-58构成的“SR”序列，用于DNA结合； C端保守区域是与L-精氨酸和部分DNA结合的结构域，6个精氨酸 分子结合在2个ArgR三聚体的C端结构域界面，起到协同调控因子 的作用。ArgR与ARG boxes序列结合引起基因结构的拓扑形变，诱 发调控作用。除调控精氨酸合成，ArgR在天蓝色链霉菌中直接或间 接控制452个基因，涉及氮代谢、嘌呤和嘧啶生物合成、细胞形态和 抗生素基因等众多代谢通路；在谷氨酸棒状杆菌中ArgR已证明调控 谷氨酸合成代谢，而在嗜热栖热菌中还调控赖氨酸合成代谢。这些研 究表明ArgR可能是一个全局性调控因子，对非精氨酸代谢也存在广 泛调控，但目前尚未见对EPS合成调控的报道。
嗜热链球菌Benshit是本实验室筛选的一株具有良好产粘性和口 感辅助效果的益生乳酸菌。对嗜热链球菌Benshit中EPS结构解析， 发现其单糖组成为N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和葡萄糖，摩尔比为 1:2:1，并通过全基因组测序和生物信息学分析完成eps基因簇功能注 释。目前国内外对EPS生物合成的转录调控研究比较欠缺，而本发 明首次发现ArgR对嗜热链球菌EPS合成的调控作用。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种调控嗜 热链球菌胞外多糖含量的方法。
本发明提供了一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，通过嗜 热链球菌(Streptococcus thermophilus)Benshit获得编码精氨酸代谢 调控蛋白ArgR，而后采用编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR对嗜热链球 菌胞外多糖含量进行进行调控，嗜热链球菌Benshit已保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 12098，具有这样的特征，包括：将编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR 的argR基因进行过表达或弱化，从而使热链球菌胞外多糖含量降低 或升高，包括如下步骤：步骤1，以嗜热链球菌Benshit的基因组为 模板，构建argR基因外源表达质粒pPH12、argR基因外源表达质粒pPH13和argR基因外源表达质粒pPH14；步骤2，以嗜热链球菌 Benshit的基因组为模板，构建argR基因过表达质粒pPH15和argR 基因弱化表达质粒pPH16步骤3，将质粒pET30α、argR基因外源表 达质粒pPH12、argR基因外源表达质粒pPH13和argR基因外源表达 质粒pPH14进行诱导优化，得到可溶性的含有His-tag标签的精氨酸 代谢调控蛋白ArgR；步骤4，将过表达质粒pPH15和弱化表达质粒 pPH16转入嗜热链球菌Benshit，得到重组菌株Benshit/pPH15和重组 菌株Benshit/pPH16；步骤5，分别将重组菌株Benshit/pPH15和重组 菌株Benshit/pPH16置于种子液中进行过夜培养、离心发酵、透析， 得到嗜热链球菌胞外多糖EPS，其中，argR基因的序列如SEQ ID No： 1所示。
在本发明提供的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法中，还可以 具有这样的特征：其中，argR基因外源表达质粒pPH12的序列如SEQ ID No：2所示，argR基因外源表达质粒pPH13的序列如SEQ ID No： 3所示，argR基因外源表达质粒pPH14的序列如SEQ ID No：4所示。
在本发明提供的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法中，还可以 具有这样的特征：其中，过表达质粒pPH15的序列如SEQ ID No：5 所示，弱化表达质粒pPH16的序列如SEQID No：6所示。
在本发明提供的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法中，还可以 具有这样的特征：其中，质粒pET30α的序列如SEQ ID No：7所示。
在本发明提供的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法中，还可以 具有这样的特征：其中，含有His-tag标签的精氨酸代谢调控蛋白ArgR 的序列如SEQ ID No：8所示。
本发明还提供了一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的过表达质 粒，用于降低所述嗜热链球菌胞外多糖含量，具有这样的特征：过表 达质粒含有如权利要求3中的序列，该序列如SEQ ID No：5所示。
本发明还提供了一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的过表达质 粒，用于提高所述嗜热链球菌胞外多糖含量，具有这样的特征：弱化 表达质粒含有如权利要求3中的序列，该序列如SEQ ID No：6所示。
发明的作用与效果
本发明所涉及的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，通过尿素 变性复性的方法纯化大肠杆菌外源表达ArgR包涵体，并将纯化蛋白 和启动子结合互作以鉴定调控作用，同时通过过表达和弱化argR基 因后测定胞外多糖产量的方案确定了调控蛋白ArgR对嗜热链球菌胞 外多糖合成的应用基础，即利用大肠杆菌异源表达嗜热链球菌含 His-tag标签的ArgR蛋白，通过尿素变性-复性和Ni2+亲和层析纯化， 并利用凝胶电泳迁移(EMSA)和生物膜层干涉(BLI)证明ArgR和 eps基因簇中PepsA启动子有特异性结合，并且过表达argR基因显著 降低了EPS合成，而弱化argR基因则提高了EPS合成。此外，本发 明首次发现ArgR这类蛋白能特异性结合嗜热链球菌eps基因簇启动 子，调控EPS的合成。
附图说明
图1是本发明的实施例1中质粒构建示意图；
图2是本发明的实施例2中ArgR异源表达和纯化情况图；
图3是本发明的实施例3中同诱导条件的蛋白表达情况图；
图4是本发明的实施例3中尿素变性纯化包涵体ArgR示意图；
图5是本发明的实施例4中凝胶电泳迁移实验检测ArgR和PepsA的相 互作用图；
图6是本发明的实施例4中生物膜层干涉实验检测ArgR和PepsA的相 互作用图；
图7是本发明的实施例5中eps基因簇ArgR结合位点分析示意图；
图8是本发明的实施例6中过表达和弱化argR对生长影响示意图；
图9是本发明的实施例6中过表达和弱化argR对EPS合成量影响示 意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实 施例及附图对本发明作具体阐述。
本发明中的所有实施例中采用的引物的具体DNA序列信息见表 1。所有实施例中所涉及的主要试剂如
Max DNA聚合 酶，DNA连接酶(Soltution I)，限制性内切酶NdeI、XhoI，DNAMarker， Protein Marker均购自TaKaRa公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试 剂盒、PCR产物回收试剂盒、红霉素、卡那霉素、Taq DNA聚合酶、 无缝克隆试剂盒购自上海杰李生物技术有限公司；Ni-NTA琼脂糖树 脂购自QIAGEN公司；EMSA化学发光试剂盒购自上海碧云天生物 技术有限公司；电泳仪设备及超灵敏凝胶成像仪购自Bio-Rad公司； 分子互作仪及链霉亲和素传感器购自Fortebio公司。SDS-PAGE Gel Kit、蛋白快速染色试剂ProteinShow-G250 Protein Stain Reagent、 SDS-PAGE Loading Buffer购自康为世纪生物科技有限公司。
以下结合实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体 方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据 已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记 载。
表1 本研究中使用的引物
下述实施例中的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，已在 2016年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12098，以下内容中均简称为：嗜热链球菌S-3，且所使用的实验 方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特 殊说明均可从商业途径得到。
实施例1：实验用质粒构建
图1是本发明的实施例1中质粒构建示意图。
以S-3基因组为模板，使用引物ArgR-1-F/R、ArgR-2-F/R和 ArgR-3-F/R扩增三种argR基因片段，经NdeI和XhoI酶切后通过T4 连接酶插入质粒pET30α，转化至E.coliTop10，在抗性平板筛选阳性 转化子，测序正确的重组质粒分别命名为pPH12、pPH13和pPH14。 使用引物ArgR-pIB-F/R，antiArgR-pIB-F/R扩增得到目标基因，质粒 pIB184经EcoRI和BamHI酶切，酶切产物和目标基因连接后转化， 测序正确的质粒分别命名为pPH15和pPH16。argR基因为432bp， 其蛋白为16.1kDa，采用TMHMN在线分析(http://www.cbs.dtu.dk) 显示其无跨膜结构，含不同位置His标签的ArgR表达质粒pPH12、 pPH13和pPH14结构如图1所示。
实施例2：ArgR异源表达和纯化情况
图2是本发明的实施例2中ArgR异源表达和纯化情况图，图中， 泳道1、2、3来自质粒pPH12的菌液上清，破碎后上清和破碎后沉 淀，泳道4、5来自质粒pPH13的破碎后上清和破碎后沉淀，泳道6、 7:来自质粒pPH14的破碎后上清和破碎后沉淀，M为Protein Marker。
将质粒pET30α、pPH12、pPH13和pPH14分别转化至E.coli BL21(DE3)，将种子液接种至新鲜培养基，37℃培养至OD550＝0.6， 加入终浓度0.4mmol/L IPTG后20℃诱导8h。使用磷酸盐缓冲液 (PBS)离心洗涤菌体，加入1％(V/V)蛋白酶抑制剂，低温超声破碎 (800W功率，5min)，经离心获得上清液和沉淀。使用SDS-PAGE 凝胶电泳检测菌液、上清液和沉淀悬浮液。将含不同位置His标签的 ArgR表达质粒的大肠杆菌诱导后发现，3种工程菌表达的可溶性 ArgR蛋白含量较低，主要形成包涵体，如图2所示。
实施例3：不同诱导条件的蛋白表达情况
图3是本发明的实施例3中同诱导条件的蛋白表达情况图，图3 (a)是低速诱导ArgR的SDS-PAGE图像，图中，IPTG浓度为0.2 mmol/L、0.4mmol/L和0.6mmol/L，诱导时间2h、4h、6h、8h、10h、12h及24h，图3(b)是BCA法测定不同诱导条件下的总可 溶性蛋白质含量。
E.coli BL21(DE3)/pPH13种子液接种至新鲜培养基，分别加入终 浓度为0.2mmol/L、0.4mmol/L和0.6mmol/L的IPTG，20℃培养； 分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h收集菌液，SDS-PAGE 检测蛋白表达，二喹啉甲酸法测定总蛋白。
为增加可溶性蛋白表达，我们采用低温诱导降低ArgR蛋白合成 速度，减少包涵体形成。在20℃使用不同IPTG浓度和诱导时间表达 ArgR，分析条带灰度值的结果表明与其它两种IPTG浓度相比，在0.4 mmol/L IPTG浓度下ArgR可溶性表达量最高，在12h时ArgR占比总蛋白达到82％，如图3(a)所示，在此条件下，可溶性蛋白浓度 达到0.15mg/mL，如图3(b)所示。
图4是本发明的实施例3中尿素变性纯化包涵体ArgR示意图， 图中，泳道1为细菌发酵液上清，泳道2、3为破碎离心后的上清液 和沉淀，泳道4为尿素纯化的蛋白质，M为Protein Marker。
低温诱导获得更多的可溶性ArgR，但对于蛋白纯化而言，其浓 度仍然过低，而包涵体含量较高。因此，我们选择Ni2+柱结合效率最 高的E.coli BL21(DE3)/pPH13包涵体，在尿素溶解后纯化获得可溶 性ArgR，如图4所示，具体方法为：按照前述方法培养和诱导菌体， 破碎离心后获得包涵体，使用包涵体溶解液(8M Urea,50mmol/L NaH2PO4,300mmol/LNaCl；pH 8.0)将其低温溶解，经0.45μm滤膜 过滤；用2个柱体积洗涤液(5mmol/LImidazole,50mmol/LNaH2PO4, 300mmol/LNaCl；pH 8.0)平衡Ni-NTA琼脂糖树脂后，包涵体溶解 液以0.5mL/min的流速流过柱体；用5个柱体积平衡液(10mmol/L Imidazole,8MUrea,50mmol/L NaH2PO4,300mmol/L NaCl；pH 8.0) 以1mL/min的流速洗去杂蛋白；用2个柱体积洗脱液(250mmol/L Imidazole,8M Urea,50mmol/L NaH2PO4,300mmol/L NaCl；pH 8.0)洗脱出目的蛋白。使用3kDa超滤管低温脱盐浓缩，测定蛋白质浓度 达到2.95mg/mL，满足后续实验要求。
实施例4：凝胶迁移以及生物膜层干涉检测ArgR与PepsA启动子结合
使用引物PepsA-link-F/R以及Biotin-F-R扩增得到两端含有生物素 标记的PepsA片段，同时获得未标记片段。凝胶阻滞实验(EMSA， electrophoresis mobility shiftassays)如下：10μL反应体系包含25ng 标记探针，不同浓度ArgR(0-10μmol/L)和2μL结合缓冲液，对照 组需额外加入1.25μg未标记探针；25℃孵育20min后上样至4％(W/V) 非变性聚丙烯酰胺胶，使用Tris-硼酸缓冲液(TBE)电泳；经电泳迁 移的凝胶条带随后转移至尼龙膜,在紫外交联、封闭后结合 Streptavidin-HRP，使用化学发光成像。
图5是本发明的实施例4中凝胶电泳迁移实验检测ArgR和 PepsA的相互作用图。
采用凝胶迁移实验检测ArgR对eps基因簇PepsA启动子的结合特 异性，如图5所示，PepsA启动子DNA结合ArgR蛋白后发生阻滞迁 移，在8μmol/L浓度时达到饱和；加入竞争探针后标记探针的阻滞 迁移基本消失，说明结合具有特异性。
图6是本发明的实施例4中生物膜层干涉实验检测ArgR和PepsA的相互作用图。
生物素标记的PepsA片段使用DNA缓冲液(10mmol/L HEPES,2 mmol/L MgCl2,0.1mmol/L EDTA,200mmol/L KCl；pH 8.0)溶解,ArgR 溶液中加入终浓度1‰(W/V)BSA和2‰(V/V)Tween-20作为母液, 使用蛋白质缓冲液(1‰BSA,2‰Tween-20,PBS)稀释至62.5mg/L、 125mg/L、250mg/L、500mg/L和1000mg/L。溶液处理后加样至检 测孔板，使用生物膜层干涉仪(BIL)测定：传感器在DNA缓冲液 中平衡10min，在生物素标记DNA溶液中饱和10min，蛋白质缓冲 液中平衡8min，蛋白样品中饱和10min，蛋白质缓冲液解离15min。
生物膜层干涉实验分别和结合亲和力(图6)，ArgR与PepsA启动 子的BIL分析表明，结合系数(Ka)为1.45*103±1.10*101M-1S-1，解 离系数(Kd)为2.57*10-5±4.83*10-6S-1，亲和力系数(KD)为 1.78*10-8±3.60*10-10M，数据拟合度0.978，说明ArgR与PepsA的解离 水平低，分子间结合稳定。上述两种检测结果都显示ArgR可稳定结 合PepsA，说明ArgR可以调控eps基因簇。
实施例5：ArgR与PepsA启动子结合位点分析
图7是本发明的实施例5中eps基因簇ArgR结合位点分析示意 图，图7(a)是基于嗜热链球菌CNRZ1066产生的ArgR结合位点 motif，图7(b)基于报道的motif寻找ArgR在PepsA上的结合位点，PepsA上的16471-16488和16568-16585位点与ArgR结合拥有高可信 度。
为寻找ArgR结合启动子的DNA序列，基于公布在Regprecise网 站(http://regprecise.lbl.gov)上嗜热链球菌CNRZ1066的ArgR结合 序列，使用WebLogo在线服务器(http://weblogo.berkeley.edu)生成 motif信息：5’-WwTdWATAAWwATAvAdW-3’，如图7所示；同时综 合嗜热栖热菌已报道的ARG-box：5’-nkTGyATAnTtTTnCnnG-3’，大 肠杆菌的ARG-box：5’-WnTGnATWWWWATnCAnW-3’和乳酸乳球 菌的ARG-box：5’-AwwGwATAAWWATrCWnw-3’，通过MEME网站 (http://meme-suite.org/)对eps基因簇中PepsA启动子中ARG-box位 点进行预测，分析结果表明PepsA上可能存在两个ArgR结合位点。
实施例6：过表达和弱化argR基因对EPS合成影响
图8是本发明的实施例6中过表达和弱化argR对生长影响示意 图，图中pPH15为过表达质粒，pPH16为弱化表达质粒，pIB184为 对照组质粒；测定OD600取样间隔为0.5h。
重组菌株S-3/pPH15、S-3/pPH16和S-3/pIB184过夜培养的种子 液分别以3％接种量接种于LM17培养基，培养至6h、12h和24h 离心收集发酵液，经三氯乙酸处理后透析3天，使用苯酚硫酸法测定 多糖，每组6个平行，数据应用SPSS软件进行独立样本t检验分析。 与含空质粒pIB184菌株(对照)相比，argR基因过表达或弱化菌株 生长延迟期和倍增时间并无显著性差异，如图8所示，说明细菌初级 代谢可能未受较大影响。
图9是本发明的实施例6中过表达和弱化argR对EPS合成量影 响示意图，图中pPH15为过表达质粒，pPH16为弱化表达质粒，pIB184 为对照组质粒，*表示0.01<p≤0.05。
培养到6h时这3种菌株的EPS产量均无显著差别，但培养12h 时过表达argR菌株EPS产量仅为0.075g/L，24h时0.103g/L，与对 照相比均显著降低；而采用反义RNA弱化argR菌株，EPS产量在 12h与对照组无显著性差异，而在24h时与对照相比显著上升，达 到0.134g/L，如图9所示，上述结果表明EPS合成受AgrR负调控。
实施例的作用与效果
根据实施例1至实施例6可知，将过表达质粒pPH15转入嗜热 链球菌S-3后，置于种子液中进行过夜培养、离心发酵、透析，当培 养12h时的EPS产量仅为0.075g/L，当培养24h时的EPS产量为0.103 g/L，与对照相比均显著降低；将弱化表达质粒pPH16转入嗜热链球菌S-3后，置于种子液中进行过夜培养、离心发酵、透析，当培养24 h时的EPS产量为0.134g/L，与对照相比均显著上升。
因此，本发明所涉及的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，通 过尿素变性复性的方法纯化大肠杆菌外源表达ArgR包涵体，并将纯 化蛋白和启动子结合互作以鉴定调控作用，同时通过过表达和弱化 argR基因后测定胞外多糖产量的方案确定了调控蛋白ArgR对嗜热链 球菌胞外多糖合成的应用基础，即利用大肠杆菌异源表达嗜热链球菌 含His-tag标签的ArgR蛋白，通过尿素变性-复性和Ni2+亲和层析纯 化，并利用凝胶电泳迁移(EMSA)和生物膜层干涉(BLI)证明ArgR 和eps基因簇中PepsA启动子有特异性结合，并且过表达argR基因显 著降低了EPS合成，而弱化argR基因则提高了EPS合成。此外，本 发明首次发现ArgR这类蛋白能特异性结合嗜热链球菌eps基因簇启 动子，调控EPS的合成。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护 范围。
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gtttcgattg aatagcctga actaaagtag gctaaagaga gggtaaacat gacgttatta 4860
cgccctatta aacccttttc tcctgaaaat ttcgtttcgt gcaataagag attaaaccag 4920
ggttcatcta cttgtttttt gccttctgta ccgcttaaaa ccgttagact tgaacgagta 4980
aagcccttat tatctgtttg tttgaaagac caatcttgcc attctttgaa agaataacgg 5040
taattaggat caaaaaattc tacattgtcc gttcttggta tgcgagcaat accaaaatga 5100
ttacacgtta gatcaactgg caaagacttt ccaaaatatt ctcggatatt ttgcgaaatt 5160
attttggctg ctttgacaga tttaaattct gattttgaag tcacatagac tggcgtttct 5220
aaaacaaaat atgcttgata acctttatca gatttgataa tcatagtagg cataaaacct 5280
aaatcaatag cggttgttaa aatatcgctt gctgaaatag tttcttttgc cgtgtgaata 5340
tcaaaatcaa taaagaaggt attgatttgt cttaaattgt tttcagaatg tcctttcgtg 5400
tatgaacggt tttcgtctgc atacgttcca taacgataaa cgttgggtgt ccaatgtgta 5460
aatgtatctt gattttcttg aatcgcttcc tcggaagtca gaacaacacc acgaccgcca 5520
atcatgcttg attttgagcg atacgcaaaa atagcccctt tgcttttacc tggcttggta 5580
gtgattgagc gaattttact atttttaaat ttgtacttta acaagccgtc atgaagcaca 5640
gtttctacaa caaaagggat attcattcag ctgttctcct ttcctataaa tcctataaaa 5700
taggttgttt aattaacttg gtttgctttt tcattcaact gtttcaatat tgcatgtttt 5760
gaaaaagatt tttttccttt ataagtcaat ttttttccac taatcgaata aattattttg 5820
ttattttcta ttaacttata tatataatct tccccctccg aagaaaaata cttatctgat 5880
tttgtttcta agtagatatt tctcttttct aactctttct taaacgtttc tagtgtatag 5940
atatttgcta attttcttat ctccaataaa ctatttttta tataagtttt acattcatca 6000
tgattcatac aaactccacc ttctataaat gaatacaaaa aaagcaatca aacgatttcc 6060
gattgattgc ttaacaattc ttaaattcag tagcttagat acttgaaaac tctctgattt 6120
ccctatataa tgatagtacg gttatatacc gtcttcaaac aaagttaatt aaataacttc 6180
ttacgaggga agagttcatc tgactaactg ataagcgttg gtttggcaat cttatcgggc 6240
tatgcattta taaaatgtcg tcaaacattt tataaatgtg tcatggctct tttttcgttt 6300
ctattcagtt cgttgtttcg ttatatctag tataccgctt ttaaaaaaaa ataagcaacg 6360
atttcgtgca ttattcacac gaagtcattg cttttttctt cttccatttc taaatccaat 6420
gttacttgtt ctgattctgt ttctggctct ggttctgttg gctcatttgg gattaaatcc 6480
actactagcg ttgagttagt t 6501
<210> 7
<211> 5421
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 1620
gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 1680
actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 1740
gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 1800
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ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 1920
aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 1980
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gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 2100
cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 2160
cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 2220
gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt 2280
attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atatggtgca ctctcagtac 2340
aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg 2400
gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 2460
ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 2520
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tgaagcgatt cacagatgtc tgcctgttca tccgcgtcca gctcgttgag tttctccaga 2640
agcgttaatg tctggcttct gataaagcgg gccatgttaa gggcggtttt ttcctgtttg 2700
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aaggaggaac tatatccgga t 5421
<210> 8
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
hhhhhhleli rkivqenkit tqgelvrllq aeglkatqat vsrdineigi tkvptedgsy 60
iyglstaprr vgkssvacrr llridrqhaf mnilvqpgts rlikkillde ykhlifslia 120
dddtlflvaq selaaielhg qivkwveehh hhhh 154
Claims (7)
1.一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，通过嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）Benshit获得编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR的基因，而后采用所述编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR的基因对所述嗜热链球菌胞外多糖含量进行调控，所述嗜热链球菌Benshit已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12098，其特征在于，将所述编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR的argR基因进行过表达或弱化，从而使所述热链球菌胞外多糖含量降低或升高，包括如下步骤：
步骤1，以所述嗜热链球菌Benshit的基因组为模板，构建argR基因外源表达质粒；
步骤2，以所述嗜热链球菌Benshit的所述基因组为模板，构建argR基因过表达质粒和argR基因弱化表达质粒；
步骤3，将质粒pET30α、所述argR基因外源表达质粒进行诱导，得到可溶性的含有His-tag标签的精氨酸代谢调控蛋白ArgR；
步骤4，分别将所述过表达质粒和弱化表达质粒转入所述嗜热链球菌Benshit，得到过表达重组菌株和弱化表达重组菌株；
步骤5，分别将所述过表达重组菌株和所述弱化表达重组菌株置于发酵培养基中进行过夜培养、离心发酵、透析，得到嗜热链球菌胞外多糖EPS，
其中，所述argR基因的序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，其特征在于：
所述argR基因外源表达质粒序列如SEQ ID No：2或SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所示。
3.根据权利要求1所述的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，其特征在于：
所述过表达质粒的序列如SEQ ID No：5所示，
所述弱化表达质粒的序列如SEQ ID No：6所示。
4.根据权利要求1所述的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，其特征在于：
所述质粒pET30α的序列如SEQ ID No：7所示。
5.根据权利要求1所述的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，其特征在于：
含有His-tag标签的精氨酸代谢调控蛋白ArgR的序列如SEQ ID No：8所示。
6.一种过表达质粒在降低嗜热链球菌胞外多糖含量中的应用，其特征在于：
所述过表达质粒含有如权利要求3所述的序列，该序列如SEQ ID No：5所示。
7.一种弱化表达质粒在提高嗜热链球菌胞外多糖含量中的应用，其特征在于：
所述弱化表达质粒含有如权利要求3所述的序列，该序列如SEQ ID No：6所示。
Priority Applications (1)
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| 嗜热链球菌S-3对发酵乳品质的影响;徐致远等;《工业微生物》;20180822(第04期);摘要 * |
| 念珠藻Nostoc punctiforme胞外多醣生合成調控之預測;曾志彧等;《生物學報》;20141231;第49卷;第29-38页 * |
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