CN110004122A - 一种过氧化物酶、其编码基因及其表达和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种过氧化物酶、其编码基因及其表达和用途，包括如下氨基酸序列:(1)如SEQ ID NO.1‑2任一所示的氨基酸序列；(2)与(1)中所述的SEQ ID NO.1‑2任一所示的氨基酸序列具有85％以上的同源性的氨基酸序列；上述过氧化物酶是申请人从自然界中寻找和筛选的具有高稳定和高活性的过氧化物酶的氨基酸序列，克服现有技术中的过氧化物酶热稳定性、pH稳定性、H₂O₂和有机试剂浓度耐受方面较差的缺陷。

Description

一种过氧化物酶、其编码基因及其表达和用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种过氧化物酶、其编码基因及其表达和用途。

背景技术

过氧化物酶(Peroxidase，简称POD)，广泛地存在于动物、植物和微生物中，并在其中扮演着重要角色。它利用过氧化氢来催化氧化多种有机和无机底物。大多数过氧化物酶是分子量在28-500kDa之间的含血红素的酶。过氧化物酶的分类如下：第一大类是将POD划分为两个超级家族，一个超级家族是由植物、真菌和细菌来源组成的POD，另一个超级家族则是由来源于动物形成的POD。对第一个超级家族中的植物POD的研究做了细分，具体的分类已达到几十种，大致的分类可归为三大类：第一类是胞内型POD；第二类是从高等植物里分泌的POD，它的活性决定了植物是否有良好的生理功能；第三类是存在于真菌的胞外POD。除了第一大类的分类外，还可以根据其他的标准对POD进行分类，以下的两大类分类的依据分别是从POD的来源和POD等电点(PI)的高低来进行分类的。第二大类的分类根据植物来源的不同将POD分为大麦过氧化物酶(BP)、大米过氧化物酶(RP)、棉花过氧化物酶(CP)、大豆过氧化物酶(SBP，拉丁文名Glycine max)、花生过氧化物酶(PP)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，简称HRP，拉丁文名Armoracia rusticana)和番茄过氧化物酶(TP)等。第三大分类则是按照等电点高低将POD分为中性(pI＝7.0)POD、酸性(pI<7.0)POD和碱性POD(pI>7.0)。

POD作为一类重要的氧化还原酶，能有效催化一系列化学反应。其作为显色体系的关键组分广泛地应用在一些常规生化检测项目，如酶联免疫检测，临床领域比色检测；在环保领域，对于含酚类和芳香胺类化合物的去除有潜在的应用价值；在生物催化有机合成领域，可被用来催化合成导电高分子材料聚苯胺。过氧化物酶在电化学领域也有应用，它可以固定在电极上用于测定H₂O₂和有机氢过氧化物的分析系统。

HRP是目前研究最深入和应用最多的过氧化物酶。据估算，全球每年对HRP的需求大约100kg以上，约2亿美元的市场价值。然而，由于HRP具有相对较低的热稳定性和较差的pH稳定性，限制了其应用范围，如将HRP应用于电化学领域领域，由于HRP在H₂O₂浓度较大时会失活，只能与生物传感器结合测定低H₂O₂浓度的样品。许多研究试图通过化学修饰和基因工程改造等方法提高辣根过氧化物酶稳定性，但效果都不理想。

因此，从自然中寻找更稳定的尤其在热稳定性、pH稳定性、H₂O₂和有机试剂浓度耐受方面要远优于HRP的POD具有非常重要的意义，这些性质决定了POD在存储稳定性和化学催化稳定性等方面具有优势，使其在生物化工和环保等对酶的稳定性要求极高的应用领域具有潜在的利用价值。另外，由于POD在动植物中的含量极低，从动植物中大量提取POD不仅成本高，而且会破坏生态环境。基因工程表达是一种潜在的解决POD来源问题的途径之一，提供一种能够高效表达POD的方法，不仅可以减少破坏生态环境的活动发生，而且可以实现大规模发酵生产。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的过氧化物酶热稳定性、pH稳定性、H₂O₂和有机试剂浓度耐受方面较差的缺陷，从而提供一种过氧化物酶，所述过氧化物酶热稳定性高、pH稳定性强、H₂O₂和有机试剂浓度耐受方面强。

本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种高效表达过氧化物酶的方法，不仅可以减少破坏生态环境的活动发生，而且可以实现大规模发酵生产。

为此，本发明提供了如下技术方案：

一种过氧化物酶，包括如下氨基酸序列:

(1)如SEQ ID NO.1-2任一所示的氨基酸序列；

(2)与(1)中所述的SEQ ID NO.1-2任一所示的氨基酸序列具有85％以上的同源性的氨基酸序列。

一种过氧化物酶基因，编码所述的过氧化物酶的基因。

所述的过氧化物酶基因，包括如下核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.3-4任一所示的核苷酸序列；

(2)与(1)中所述的SEQ ID NO.3-4任一所示的核苷酸序列具有85％以上的同源性的核苷酸序列。

包含所述的过氧化物酶基因的重组载体。

所述的重组载体，所述载体为大肠杆菌表达载体。优选的，所述载体为pET30a。

包含所述的过氧化物酶基因的重组菌株。

所述的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌。

一种表达过氧化物酶的方法，包括如下步骤：

S1、将所述的过氧化物酶基因的重组载体转化至菌株中，得到重组菌株；

S2、将所述重组菌株进行发酵，诱导过氧化物酶的表达；

S3、回收并纯化表达的过氧化物酶。

所述的方法，在S2步骤中，诱导过氧化物酶表达的诱导温度为15-37℃，诱导时间为14-18小时；优选的，诱导剂为IPTG，浓度为0.1-5mM。

所述的过氧化物酶在降解过氧化物中的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种过氧化物酶，包括如下氨基酸序列:(1)如SEQ ID NO.1-2任一所示的氨基酸序列；(2)与(1)中所述的SEQ ID NO.1-2任一所示的氨基酸序列具有85％以上的同源性的氨基酸序列；上述过氧化物酶是申请人从自然界中寻找和筛选的具有高稳定和高活性的过氧化物酶的氨基酸序列，其中，海南岛是我国的第一大热带岛屿，拥有非常丰富和独特的热带植物资源，棕榈科植物有上百种，这为我国提供了难得的棕榈基因资源宝库，而SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列便是申请人在我国海南上百种的棕榈科植物中寻找和筛选得到的具有高稳定和高活性的过氧化物酶的氨基酸序列，又在众多种类的非洲棕榈树中寻找和筛选到与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列同源性较高的SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，经测定，发现SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的过氧化物酶同样具有高稳定和高活性。

2.本发明提供的包含所述的过氧化物酶基因的重组载体，所述载体为pET30a，通过筛选发现，选择pET30a作为所述的过氧化物酶基因的出发载体构建得到的重组载体表达量高，显著高于其他载体。

3.本发明提供的包含所述的过氧化物酶基因的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌，通过筛选发现，选择大肠杆菌作为过氧化物酶基因的重组菌株，可以高效表达过氧化物酶，显著高于其他菌株如酵母。

4.本发明提供的一种表达过氧化物酶的方法，包括如下步骤：S1、将所述的过氧化物酶基因的重组载体转化至菌株中，得到重组菌株；S2、将所述重组菌株进行发酵，诱导过氧化物酶的表达；S3、回收并纯化表达的过氧化物酶；采用上述方法可以高效表达过氧化物酶，可以实现大规模发酵生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中扩增后的DT2678-2基因凝胶电泳图；

图2是本发明实施例1中酶切后的DT2678-2基因凝胶电泳图；

图3是本发明实施例1中酶切前后的表达载体pET30a凝胶电泳图；

图4是本发明实施例1中酶切后的重组载体pET30a-DT2678-2的凝胶电泳图；

图5是本发明实施例1中上清液中DT2678-2蛋白的SDS-PAGE图；

图6是本发明实施例1中包涵体中DT2678-2蛋白的SDS-PAGE图；

图7是本发明实施例2中包涵体中DT2413蛋白的SDS-PAGE图；

图8是本发明对比例1中上清液中DT2413蛋白的SDS-PAGE图；

图9是本发明实验例1中不同诱导温度下的pET30a-DT2678-2表达DT2678-2蛋白的SDS-PAGE图；

图10是本发明实验例1中不同浓度诱导剂下的pET30a-DT2678-2表达DT2678-2蛋白的SDS-PAGE图；

图11是本发明实验例2中不同温度下的DT2678-2蛋白和HRP蛋白的酶活性测定结果曲线图；

图12是本发明实验例2中B-R缓冲液中的DT2678-2蛋白和HRP蛋白的pH稳定性测定结果曲线图；

图13是本发明实验例2中柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的DT2678-2蛋白和HRP蛋白的pH稳定性测定结果曲线图；

图14是本发明实验例2中不同有机试剂中的DT2678-2蛋白酶活性测定结果曲线图；

图15是本发明实验例2中不同有机试剂中的HRP蛋白的酶活性测定结果曲线图；

图16是本发明实验例3中不同诱导温度下的pET30a-DT2413表达DT2413蛋白的SDS-PAGE图；

图17是本发明实验例4中不同复性时间下的DT2413蛋白的酶活性曲线图；

图18是本发明实验例4中不同温度下的DT2413蛋白和HRP蛋白的酶活性测定结果曲线图；

图19是本发明实验例4中柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的DT2413蛋白和HRP蛋白的pH稳定性测定结果曲线图；

图20是本发明实验例4中DT2413蛋白以TMB为底物和H₂O₂的双倒数图；

图21是本发明实验例4中不同有机试剂中的DT2413蛋白酶活性测定结果曲线图；

图22是本发明实验例4中不同有机试剂中的HRP蛋白酶活性测定结果曲线图；

图23是本发明实施例1中的构建的重组载体pET30a-DT2678-2的结构图；

图24是本发明实施例2中的构建的重组载体pET30a-DT2413的结构图。

具体实施方式

下述实施例中涉及的材料和仪器均为市售产品，不同厂家的材料和仪器并不会产生较大差别，具体如下：

表1主要药品及生化试剂

表2主要仪器

引物：

HC-NdeⅠ：GAATGCTGATCTGCAGATCGGTTTCTACAAC；

HC-HindⅢ：GAATTCTTAGCTCGCGCTGTTAACAACGCT；

HC-BsmI：GAATGCTGATCTGCAGATCGGTTTCTACAAC；

HC-EcoRI：GAATTCTTAGCTCGCGCTGTTAACAACGCT；

上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

菌种与载体：

大肠杆菌BL21(DE3)，由北京全式金生物技术有限公司提供；

表达载体pET30a(+)、pTYB12由New England Biolabs(NEB)公司提供。培养基：

LB培养基(1000mL)：称取10g胰蛋白胨、5g酵母抽提物、5g NaCl于烧杯中加入1000mL去离子水，调pH至7.0后121℃高压灭菌20min。

含氨苄的LB固体培养基：加15g琼脂粉到上述1L的LB液体培养基中。高压灭菌后待温度降至40～50℃，加入氨苄至终浓度100μg/mL。

含卡那霉素抗性的LB平板：按照含卡那霉素培养基的程序再加入IPTG和X-gal至终浓度为0.5mM的IPTG和80μg/mL的X-gal。

缓冲液配制：

B-R缓冲液：向100mL浓度均为40mM的磷酸、硼酸和醋酸三种酸混合液中加入不同体积的200mM的氢氧化钠可以组成pH为2～12的缓冲液。

底物缓冲液：18.43g十二水合磷酸氢二钠、5.1g一水合柠檬酸、1mL吐温加到1L蒸馏水中pH调至5。

Column Buffer：含20mM的Tris-HCl(pH8.5)、500mM的NaCl、1mM的EDTA。

Cleavage Buffer：含20mM的Tris-HCl(pH8.5)、500mM的NaCl、1mM的EDTA、50mM的β-巯基乙醇。

密码子优化获得人工合成基因

遗传密码共有64种，因为密码子使用偏好性，大部分生物倾向于其中一部分密码子，一个生物的最佳密码子即为被最频繁利用的密码子，不被经常利用的称为稀有密码子。

有学者发现，大肠杆菌的稀有密码子主要是因为其基因组没有可以识别这些密码子的tRNA，而且外源蛋白含较多的大肠杆菌稀有密码子会导致表达量较低，因此，依据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子使用偏好性将测序成功的质粒DNA的基因序列进行密码子优化，人工合成易于大肠杆菌表达的本发明的过氧化物酶的基因序列。密码子优化的过氧化物酶基因如SEQ ID NO.3-4任一所示的核苷酸序列。

下述实施例中如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的基因的命名为DT2678-2。如SEQID NO.4所示的核苷酸序列的基因的命名为DT2413。

DT2678-2基因和DT2413基因由上海生工生物工程股份有限公司合成。

实施例1重组载体pET30a-DT2678-2的构建和诱导表达

1、重组载体pET30a-DT2678-2的构建，包括如下步骤：

(1)基因DT2678-2和载体pET30a的双酶切

用引物HC-NdeⅠ和HC-HindⅢ对DT2678-2基因进行PCR扩增，扩增后的DT2678-2基因进行凝胶电泳，电泳图如1所示，图中M代表Marker，1代表扩增的DT2678-2基因。将扩增后的DT2678-2基因用NEB公司的限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，由于两者酶切后都是产生粘性末端，具有较高的连接效率，DT2678-2基因双酶切后只去掉几个碱基，其凝胶电泳图如2所示，图中2代表酶切后的DT2678-2基因，DT2678-2基因酶切前后变化很小，在1000bp左右。表达载体pET30a同样用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，双酶切后的表达载体，其凝胶电泳图如3所示，图中3代表酶切后的表达载体pET30a，4代表未酶切的表达载体pET30a，由图中可以看到，经过双酶切后的表达载体pET30a只显示出一条带，其片段长度约为5400bp，另外一条只有20bp左右，所以电泳不显示，从图中也可看出，未经双酶切的环状pET30a跑得比双酶切后的线性pET30a慢。反应体系如下表3：

表3双酶切反应体系

(2)目的基因与经双酶切的表达载体相连接

利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒将酶切后的DT2678-2基因和载体进行纯化，用NEB公司的T4DNA连接酶进行连接反应。连接体系见下表4：

表4连接体系

目的基因和载体所加入的量根据公式：(目的基因(ng)×载体片段长度(bp))/(载体(ng)×目的基因片段长度(bp))＝3:1-10:1计算确定。

将上述反应组分轻轻振荡，短暂离心，于4℃过夜连接。

2、重组载体pET30a-DT2678-2转入大肠杆菌BL21(DE3)

(1)离心使反应连接物汇集到管底，取2μL连接反应产物于置于冰上的1.5mL离心管中。将冻存的感受态细胞BL21(DE3)从-80℃冰箱中取出并冻融(约5min)，轻轻振动离心管使之混匀。

(2)向(1)中每个反应体系中加入50μL感受态细胞大肠杆BL21(DE3)。将上述混合体系冰浴30min。在精确的42℃水浴中热击45s后迅速冷却2min。

(3)在上述反应体系中加入950μL卡那霉素(100μg/mL)LB液体培养基中。

(4)在37℃振荡培养(150rpm)1.5h。振荡培养结束后1000rcf离心10min，弃掉500μL上清液，然后重悬菌液。每个样品进行两次涂板(含卡那霉素/IPTG/X-Gal的LB培养基平板)重复，每次150mL。

(5)将平板用封口膜封，于37℃倒置过夜培养(14h～15h)。从转化的平板中挑取中等大小的单克隆菌落接含卡那霉素的液体培养基中培养，按照生工的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒并进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组载体，结果如图4所示，从图中可以看出，酶切出两条带，分别约为5000bp和1000bp，说明重组载体pET30a-DT2678-2构建成功。构建的重组载体pET30a-DT2678-2的结构图如图23所示，重组载体pET30a-DT2678-2经测定的序列如SEQ ID NO.5所示。

3、重组载体pET30a-DT2678-2的诱导表达

将上述验证成功的重组大肠杆菌接种到含卡纳霉素的LB培养基后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5～0.8，向试管培养液中加入IPTG至终浓度为1mM，之后置于37℃、180rpm条件下振荡培养16h。然后进行SDS-PAGE验证，具体为将上述获得的培养液在4℃、12000rpm条件下离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，而后以样品体积:上样缓冲液体积＝4:1的比例加入上样缓冲液并煮沸10min，瞬离后电泳。样品在浓缩胶处，采用80V稳压电泳，待其进入分离胶后，则改为120V稳压电泳，当溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm左右，取出用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。

4、DT2678-2蛋白纯化和复性

(1)上清液亲和层析纯化DT2678-2蛋白

将步骤3中培养液(菌液)采用含50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，20mMImidazole，1％Triton X-100，1mM DTT和1mM PMSF的裂解液进行超声裂解(V菌液：V细胞裂解液＝10:1)，功率60％，超声3s，间歇3s，总超声时间30min，工作时间15min，破碎后于4℃、9500rpm条件下离心40min，取上清液，同时以Column Buffer(50mM Tris(pH8.0)、300mMNaCl、20mM Imidazole)缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，具体步骤如下：

①平衡。沿壁慢慢加入30mL Column Buffer，因吸附层是胶体状态，流速过快会导致其上浮影响吸附柱稳定性。

②上样。取出蛋白样品，沿壁轻轻加入柱中，液面保持在柱的二分之一以上，保证不会因流速过快而使吸附层暴露在空气中破坏其结构和功能。

③冲洗。加入体积大于60mL Column Buffer洗涤柱子，去除其他杂质。

④切割。待Column Buffer将要流尽时立即沿壁轻轻加入9mL～12mL咪唑溶液，估计柱中的Column Buffer流尽后堵住吸附柱下面的出口，盖上盖子，于23℃条件下切割36～40h。

⑤接收目的蛋白。用1.5mL的离心管收集700μL～1mL液体直至吸附柱中的咪唑溶液流尽，目的是为了不让目的蛋白被稀释。将离心管中的样品进行SDS-PAGE验证，验证结果如图5所示，图中M为marker，1为全菌破菌离心后的上清液，2为上清同Ni-IDA孵育后流出液，3-4为50mM咪唑的洗脱组分，5-7为100mM咪唑的洗脱组分，8-12为500mM咪唑的洗脱组分。从图中可以清晰地看到在5～7处的30kDa～40kDa之间无明显的蛋白条带，即从上清液中未诱导表达出目的蛋白，而在60kDa～80kDa之间却有两条明显的蛋白带，由目的蛋白的质量为33kDa可知，这两条蛋白带是杂蛋白带，即上清液经Ni-IDA亲和层析纯化分析并未得到DT2678-2蛋白，DT2678-2蛋白应当表达在包涵体中。

(2)包涵体通过亲和层析纯化DT2678-2蛋白

包涵体采用含50mM Tris(pH 8.0)，300mM NaCl，1％Triton X-100，2mM EDTA和5mM DTT的缓冲液洗涤后，以含50mM Tris(pH 8.0)，300mM NaCl，8M Urea和20mMImidazole的缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，具体咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白的步骤参照上述(1)上清液亲和层析纯化DT2678-2蛋白中的步骤，同样地收集每个洗脱组分通过SDS-PAGE电泳鉴定其纯化，鉴定结果见图6，图中M为marker，1为包涵体溶解离心后上清，2为上清同Ni-IDA孵育后流出液，3-6为50mM咪唑洗脱组分，7-11为100mM咪唑的洗脱组分，12-13为300mM的洗脱组分，从图中可以清楚地看到在3～9处的30kDa～40kDa之间有非常明显的蛋白条带，在10～13处，虽然蛋白条带浅但仍能看清楚有少量表达的蛋白。由目的蛋白的质量为33kDa可知，从包涵体中已成功地诱导表达出本发明所需要的目标蛋白，即目的蛋白于包涵体中成功纯化。纯化的DT2678-2蛋白经测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5、蛋白的复性

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane3～9，采用TAKARA的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定DT2678-2蛋白的浓度，后将其加入到经高温煮沸处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到1L的缓冲液[1xPBS(pH 7.4)、4mM还原型谷胱甘肽(GSH)、0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.4M L-Arginine、1M Urea、5％甘油(Glycerol)]中复性，复性48h后DT2678-2蛋白(目的蛋白)最终透析于储存液1x PBS(pH7.4)、10％Glycerol溶液约6～8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。将8μg目的蛋白加入到20μL含有1mM DTT、6M尿素的变性剂中反应10min，后将经尿素处理过的目的蛋白加到180μL蛋白复性折叠培养基中。活性最大的折叠培养基组成如下：50μL含有6M尿素的Buffer A(20mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 8.0)、50μL的0.1M的CaCl₂、5μL含有0.2mM牛血红素的Buffer B(20mM Tris-HCl、pH8.0)、110μL Buffer A和5μL的28mM的GSSG。

蛋白得率的计算

上述经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane3～9，采用TAKARA的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白的浓度为255μg/mL，共计约80mL，加上流出液中尚未结合Ni柱的蛋白，预计总蛋白量为25～30mg。

将纯化后的DT2678-2蛋白进行透析复性，同样地用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测得DT2678-2蛋白的浓度约为159μg/mL。DT2678-2蛋白的得率：

①培养1L的表达菌可得到蛋白25～30mg，取约10mg未复性的蛋白进行复性后得到约6.24mg目标蛋白。复性得率约为：6.24mg/10mg＝0.624；

②培养1L的表达菌所得到的复性后蛋白可得到：

(25～30)mg*0.624＝(15.6～18.7)mg。

实施例2重组载体pET30a-DT2413的构建和诱导表达

1、重组载体pET30a-DT2413的构建，包括如下步骤：

(1)基因DT2413和载体pET30a的双酶切

用引物HC-NdeⅠ和HC-HindⅢ对DT2413基因进行PCR扩增，将扩增后的DT2413基因用NEB公司的限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切。表达载体pET30a同样用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切。反应体系如下表5：

表5双酶切反应体系

(2)目的基因与经双酶切的表达载体相连接

利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒将酶切后的DT2413基因和载体进行纯化，用NEB公司的T4DNA连接酶进行连接反应，连接体系见下表6：

表6连接体系

目的基因和载体所加入的量根据公式：(目的基因(ng)×载体片段长度(bp))/(载体(ng)×目的基因片段长度(bp))＝3:1-10:1计算确定。

将上述反应组分轻轻振荡，短暂离心，于4℃过夜连接。

2、重组载体pET30a-DT2413转入大肠杆菌BL21(DE3)

(1)离心使反应连接物汇集到管底，取2μL连接反应产物于置于冰上的1.5mL离心管中。将冻存的感受态细胞BL21(DE3)从-80℃冰箱中取出并冻融(约5min)，轻轻振动离心管使之混匀。

(2)向(1)中每个反应体系中加入50μL感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)。将上述混合体系冰浴30min。在精确的42℃水浴中热击45s后迅速冷却2min。

(3)在上述反应体系中加入950μL卡那霉素(100μg/mL)LB液体培养基中。

(4)在37℃振荡培养(150rpm)1.5h。振荡培养结束后1000rcf离心10min，弃掉500μL上清液，然后重悬菌液。每个样品进行两次涂板(含卡那霉素/IPTG/X-Gal的LB培养基平板)重复，每次150mL。

(5)将平板用封口膜封，于37℃倒置过夜培养(14h～15h)。从转化的平板中挑取中等大小的单克隆菌落接含卡那霉素的液体培养基中培养，按照生工的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒并进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组载体。构建成功的重组载体pET30a-DT2413的结构如图24所示，重组载体pET30a-DT2413经测定的序列如SEQ IDNO.6所示。

3、重组载体pET30a-DT2413的诱导表达

将上述鉴定成功的重组大肠杆菌接种到含卡纳霉素的LB培养基后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5～0.8，向试管培养液中加入IPTG至终浓度为0.1mM，之后置于15℃、180rpm条件下振荡培养16h。然后进行SDS-PAGE验证，具体为将上述获得的培养液在4℃、12000rpm条件下离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，而后以样品体积:上样缓冲液体积＝4:1的比例加入上样缓冲液并于100℃下煮沸10min，瞬离后电泳。样品在浓缩胶处，采用80V稳压电泳，待其进入分离胶后，则改为120V稳压电泳，当溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm左右，取出用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。

扩大培养：扩大培养量至2L，将上述验证成功的重组大肠杆菌接种到含卡纳霉素的LB培养基后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到2L的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)培养至OD600为0.8，加IPTG终浓度为0.1mM，15℃诱导表达16h。

4、DT2413蛋白纯化

(1)上清液亲和层析纯化DT2413蛋白

将步骤3中培养液(菌液)采用含50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，20mMImidazole，1％Triton X-100，1mM DTT和1mM PMSF的裂解液进行超声裂解(V菌液：V细胞裂解液＝10:1)，功率60％，超声3s，间歇3s，总超声时间30min，工作时间15min，破碎后于4℃、9500rpm条件下离心40min，取上清液，同时以Column Buffer(50mM Tris(pH8.0)、300mMNaCl、20mM Imidazole)缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，具体步骤如下：

①平衡。沿壁慢慢加入30mL Column Buffer，因吸附层是胶体状态，流速过快会导致其上浮影响吸附柱稳定性。

②上样。取出蛋白样品，沿壁轻轻加入柱中，液面保持在柱的二分之一以上，保证不会因流速过快而使吸附层暴露在空气中破坏其结构和功能。

③冲洗。加入体积大于60mL Column Buffer洗涤柱子，去除其他杂质。

④切割。待Column Buffer将要流尽时立即沿壁轻轻加入9mL～12mL咪唑溶液，估计柱中的Column Buffer流尽后堵住吸附柱下面的出口，盖上盖子，于23℃条件下切割36～40h。

⑤接收目的蛋白。用1.5mL的离心管收集700μL～1mL液体直至吸附柱中的咪唑溶液流尽，目的是为了不让目的蛋白被稀释。将离心管中的样品进行SDS-PAGE验证，验证得到即上清液经Ni-IDA亲和层析纯化分析并未得到DT2413蛋白，DT2413蛋白应当表达在包涵体中。

(2)包涵体通过亲和层析纯化DT2413蛋白

包涵体采用含50mM Tris(pH 8.0)，300mM NaCl，0.5M Urea,1％Triton X-100和2mM DTT的缓冲液洗涤后，以含2mM DTT，50mM Tris(pH 8.0)，300mM NaCl，8M Urea和20mMImidazole的缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白的步骤参照上述(1)上清液亲和层析纯化DT2413蛋白中的步骤，同样地收集每个洗脱组分通过SDS-PAGE电泳鉴定其纯化，鉴定结果见图7，图中M为marker，1为包涵体溶解离心后上清，2为上清同Ni-IDA孵育后流出液，3-6为50mM咪唑洗脱组分，7-10为100mM咪唑的洗脱组分，11-13为300mM的洗脱组分，14为500mM的洗脱组分，从图中可以清楚地看到在3～14处的30kDa-40kDa之间有非常明显的蛋白条带，与目的蛋白的质量理论值相当，由此可知，从包涵体中已成功地诱导表达出本发明所需要的目标蛋白，即目的蛋白于包涵体中成功纯化。纯化的DT2413蛋白经测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

经纯化分析，收集纯度较高的洗脱组分，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH 7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，2mM DTT，0.4M L-Arginine，1MUrea，5％甘油]中，然后透析于储存液1×PBS(pH7.4)，10％Glycerol溶液约6-8h。透析结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

蛋白浓度的测定

上述经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的洗脱组分，采用TAKARA的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白的浓度为0.311mg/mL，用BSA做标准品。

对比例1重组载体pTYB12-DT2413的构建和诱导表达

1、重组载体pTYB12-DT2413的构建，包括如下步骤：

(1)基因DT2413和载体pET30a的双酶切

用引物HC-BsmI和HC-EcoRI对DT2413基因进行PCR扩增，扩增后的DT2413基因用NEB公司的限制性内切酶BsmI和EcoRI进行双酶切。表达载体pTYB12同样用BsmI和EcoRI进行双酶切。反应体系如下表7：

表7双酶切反应体系

(2)目的基因与经双酶切的表达载体相连接

琼脂糖凝胶电泳验证酶切片段后，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒将酶切后的DT2413基因和载体进行纯化，用NEB公司的T4DNA连接酶进行连接反应，连接体系见下表8：

表8连接体系

目的基因和载体所加入的量根据公式：(目的基因(ng)×载体片段长度(bp))/(载体(ng)×目的基因片段长度(bp))＝3:1-10:1计算确定。

将上述反应组分轻轻振荡，短暂离心，于4℃过夜连接。

2、重组载体pTYB12-DT2413转入大肠杆菌BL21(DE3)

(1)离心使反应连接物汇集到管底，取2μL连接反应产物于置于冰上的1.5mL离心管中。将冻存的感受态细胞BL21(DE3)从-80℃冰箱中取出并冻融(约5min)，轻轻振动离心管使之混匀。

(2)向(1)中每个反应体系中加入50μL感受态细胞大肠杆BL21(DE3)。将上述混合体系冰浴30min。在精确的42℃水浴中热击45s后迅速冷却2min。

(3)在上述反应体系中加入950μL卡那霉素(100μg/mL)LB液体培养基中。

(4)在37℃振荡培养(150rpm)1.5h。振荡培养结束后1000rcf离心10min，弃掉500μL上清液，然后重悬菌液。每个样品进行两次涂板(含卡那霉素/IPTG/X-Gal的LB培养基平板)重复，每次150mL。

(5)将平板用封口膜封，于37℃倒置过夜培养(14h～15h)。从转化的平板中挑取中等大小的单克隆菌落接含卡那霉素的液体培养基中培养，按照生工的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒并进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组载体。上述鉴定成功的重组大肠杆菌的菌液于-80℃保存。

3、重组载体pTYB12-DT2413的诱导表达

a)取500μL的-80℃保存的菌液和500μL LB培养基1.5mL离心管中，在37℃、150rpm条件下振荡培养2h。

b)向350mL AMP+LB培养基中加1mL复苏好的菌液，培养至OD600值为0.8-1.0。

c)取50mL上述OD600值为0.8-1.0的溶液作为对照组，不加IPTG，剩余的300mL三等分，分别加入对应量IPTG使各锥形瓶中IPTG终浓度分别为0.5mM、1mM和5mM。在16℃、180rpm条件下振荡培养24h。

d)在4℃、9500rpm条件下离心25min，收集菌体，加10mL细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂、V菌液：V细胞裂解液＝10:1)重悬菌体沉淀，涡旋混匀，菌液进行冰浴超声波破碎。破碎后于4℃、9500rpm条件下离心40min，取上清液，即为所需的重组蛋白，然后进行SDS-PAGE验证，结果见图8，图中1是未加IPTG诱导的表达情况，2-4分别是IPTG浓度为5mM、1mM和0.5mM，图中5-8依次是纯化后的第1-4管蛋白,从图中可以看出5mM的IPTG诱导表达量最高。

4、DT2413蛋白纯化

(1)上清液亲和层析纯化DT2413蛋白

取步骤3中获得的上清液，同时以Column Buffer(50mM Tris(pH8.0)、300mMNaCl、20mM Imidazole)缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，洗脱步骤具体如下：

①平衡。沿壁慢慢加入30mL Column Buffer，因吸附层是胶体状态，流速过快会导致其上浮影响吸附柱稳定性。

②上样。取出蛋白样品，沿壁轻轻加入柱中，液面保持在柱的二分之一以上，保证不会因流速过快而使吸附层暴露在空气中破坏其结构和功能。

③冲洗。加入体积大于60mL Column Buffer洗涤柱子，去除其他杂质。

④切割。待Column Buffer将要流尽时立即沿壁轻轻加入9mL～12mL的CleavageBuffer，估计柱中的Column Buffer流尽后堵住吸附柱下面的出口，盖上盖子，于23℃条件下切割36～40h。

⑤接收目的蛋白。用1.5mL的离心管收集700μL～1mL液体直至吸附柱中的Cleavage Buffer流尽，目的是为了不让目的蛋白被稀释。将离心管中的样品进行SDS-PAGE鉴定，鉴定结果见图8，图中M为marker，图中1是未加IPTG诱导的表达情况，2-4分别是IPTG浓度为5mM、1mM和0.5mM，图中5-8依次是纯化后的第1-4管蛋白，两个箭头分别是纯化前后的目的蛋白，纯化前包含标签蛋白chitin，分子量约为58KDa，纯化前的目的条带在90KDa左右，纯化后的目的条带在32KDa左右，与理论值相当。

蛋白浓度的测定

上述经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的洗脱组分，采用TAKARA的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白的浓度为1mg/L，用BSA做标准品。

实验例1不同诱导温度和不同浓度诱导剂对pET30a-DT2678-2表达的影响

(1)不同诱导温度对pET30a-DT2678-2表达的影响

按照本发明实施例1实施，在步骤3中，向试管培养液中加入IPTG至终浓度为0.1mM，之后分别置于15℃、25℃、37℃、180rpm条件下振荡培养16h。然后进行SDS-PAGE验证，SDS-PAGE验证得到图9，图中M表示marker，0表示15℃诱导，1表示25℃诱导，2表示37℃诱导，从图9的SDS-PAGE验证结果可以很明显的看出，在诱导温度为15℃、25℃和37℃时得到的含重组质粒的大肠杆菌在30kDa～40kDa之间有一条明显的蛋白条带，这与DT2678-2蛋白的质量33kDa相符合，而在15℃、25℃和37℃这三种温度下表达可看出在温度为37℃条件下的蛋白表达量略高于25℃时的蛋白表达量。

(2)不同浓度诱导剂对pET30a-DT2678-2表达的影响

按照本发明实施例1实施，在步骤3中，向试管培养液中加入IPTG至终浓度分别为0.1mM、0.5mM、1mM和5mM，之后置于37℃、180rpm条件下振荡培养16h。然后进行SDS-PAGE验证，SDS-PAGE验证得到图10，图中M表示marker，0表示对照，1表示0.1mM IPTG，2表示0.5mMIPTG，3表示1mM IPTG，4表示5mM IPTG，从图中可以看出，随着IPTG浓度的增大DT2678-2蛋白的表达量也随之增大，但当增大到5mM时，DT2678-2蛋白的表达量反而有所减小。这可能是因为高浓度的IPTG起到了反作用，抑制了重组蛋白的表达。由图中可知，在IPTG浓度为1mM时，重组蛋白RPP-pET30a表达量最高。

实验例2DT2678-2蛋白和HRP蛋白的酶活性测定

(1)热稳定测定

分别于25℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下测定实施例1中复性后的DT2678-2蛋白和商业购买的HRP蛋白的酶活性，考察温度对DT2678-2蛋白和HRP活力的影响。由图11可以看出，50℃、60℃几乎不影响DT2678-2蛋白的酶活性，在70℃时DT2678-2蛋白酶活性在60％以上，在75℃时的酶活性保持在20％以上。而商业化的HRP在温度为50℃时酶活性已降低到20％，在60℃时即失活。可见，相较于HRP而言，DT2678-2蛋白具有耐高温的特性。

(2)pH稳定性的测定

将实施例1中复性后的DT2678-2蛋白和HRP分别与B-R缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制成pH为2～7的溶液于4℃条件下反应1h后测定其酶活性，探究pH对DT2678-2蛋白和HRP酶活力的影响，将pH为7时的酶活性规定为100％，将pH为2～6时的酶活性相应地转化为相对于pH等于7而言的酶活性。从图12中可知，在B-R缓冲液中，随着pH值的降低，DT2678-2蛋白和HRP的酶活性相应地降低，但是HRP酶活性降低的速度远远大于DT2678-2蛋白，特别是在pH为2～4时，HRP的酶活性急速降低直至为零；从图13中可知，在柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，DT2678-2蛋白和HRP在pH为6～7时酶活性均未发生变化，pH2～5时酶活性均低于100％，在pH5～7时DT2678-2蛋白和HRP的酶活性都降低地十分平缓，而在pH为2～4时两者的酶活性都迅速降低，但显然地，DT2678-2蛋白酶活性降低地较为缓慢。从B-R缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液两种缓冲液对应的不同pH对DT2678-2蛋白和HRP的影响来看，DT2678-2蛋白的pH稳定性均明显高于HRP。

(3)有机试剂对酶活性的影响

将实施例1中复性后的DT2678-2蛋白和HRP分别与0、10％、20％、30％、40％、50％、60％(体积浓度)不同浓度的DMSO、1,4-二氧六环、乙醇于室温下反应15min，考察不同浓度的有机试剂对DT2678-2和HRP酶活性的影响。从图14-15可以看出，DT2678-2蛋白和HRP的酶活性均随有机试剂浓度的增大而减小，在0～20％之间酶活性极速降低，而在浓度为30％～60％之间酶活性降低趋于平缓。在浓度为10％的1,4-二氧六环和乙醇条件下，DT2678-2蛋白的酶活性约为85％，而HRP已降低到50％左右，而在DMSO浓度为10％时，DT2678-2蛋白的酶活性约为65％，而HRP已降低到不足20％。在相同浓度的同种有机试剂条件下，DT2678-2蛋白的酶活性明显高于商业化的HRP，且与1,4-二氧六环和乙醇这两种有机试剂相比，DMSO更容易导致DT2678-2蛋白和HRP的失活，而1,4-二氧六环和乙醇对DT2678-2蛋白和HRP的影响差别不大。

实验例3不同诱导温度对pET30a-DT2413表达的影响

按照本发明实施例2实施，在步骤3中，向试管培养液中加入IPTG至终浓度为0.1mM，之后分别置于15℃、37℃、180rpm条件下振荡培养16h。然后进行SDS-PAGE验证，SDS-PAGE验证得到图16，图中M表示marker，0表示对照，1表示15℃诱导，2表示37℃诱导，由图中可以看出，15℃诱导比37℃诱导表达情况稍好。

实验例4DT2413蛋白的酶活性测定

由于DT2413蛋白需经受翻译后的加工修饰才能有活性，而大肠杆菌缺乏蛋白质加工系统，因此在DT2413蛋白的酶活性测定之前，需对实施例2中纯化得到的DT2413蛋白进行变复性处理。

(1)变性

取四组8μg实施例2中得到的DT2413蛋白加入到20μL含有1mM DTT的6M尿素中作变性处理，处理时间依次为5min，10min，15min，30min。

(2)复性

向上述变性过的酶溶液中，加入110μL buffer A(20mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH8.0)，50μL含6M尿素的buffer A，10μL的0.1M的CaCL₂溶液，5μL含0.2mM hemin的buffer B(20mM Tris-HCL，pH 8.0)，5μL的28mM氧化型谷胱甘肽，测定室温复性1h，6h，8h，10h，12h，24h，28h，30h，32h后的酶活性。

通过对不同复性时间酶活性的测定，各个复性时间点酶活性如图17所示，从图中可看出，(1)变性15min，室温复性至第24h时酶活性达到最大；(2)室温下复性的酶在24h达到其最大活性后，在之后的第28h、30h、32h逐渐趋于稳定，且有轻微波动下降趋势，可能是因为在室温下，酶被缓慢降解的速率大于它的复性速率；故DT2413蛋白最佳变性时间为15min，最佳复性时间为24h，然后置于4℃保持酶活性稳定，不被降解。

(3)温度对DT2413稳定性的影响

将复性好的20μL的DT2413酶溶液([E]＝1.11×10^-7M)及HRP酶溶液([E]＝4.19×10^-10M)加入到0.2ml离心管中，分别在25℃、37℃、50℃、60℃、65℃、70℃、80℃加热1h，然后室温放置复性1h，分别取5μL处理好的溶液加入到100μL含18.5mM OPD、4mM H₂O₂的100mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)，三个重复，反应15min后，加2M硫酸终止反应，490nm测定其吸光度值。

不同温度处理后的DT2413、HRP活性如图18所示，在65℃时，DT2413蛋白仍保持98％活性；80℃时，活性降为20％左右；同条件下，HRP在37℃酶活性就降为58％；50℃时，活性仅为10％左右；60℃时，活性仅有8％，基本失活。

(4)pH对DT2413稳定性的影响

将复性好的2μL DT2413酶溶液([E]＝1.11×10^-6M)加入到pH值为2-7的48μL的10mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液中(用HCL调柠檬酸-磷酸盐缓冲液pH值为2)，在室温中放置1h。同时，HRP做阳性对照。同上述“(3)温度对DT2413稳定性的影响”测定方法测定。

pH对DT2413、HRP活性的影响如图19所示，以pH7条件下的酶活100％，DT2413蛋白在强酸条件下酶活性更高可能是因为变性时酶变性不彻底，空间结构未完全打开，强酸导致酶再次更大程度的打开空间结构，又重新复性，故比弱酸及中性条件下酶活性更高。总体来看DT2413蛋白在酸性条件下的稳定性都优于HRP。

(5)底物专一性

将不同浓度OPD(邻苯二胺)、愈创木酚、TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶于10mmol/L的pH7.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)溶于10mmol/L的pH3.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，向其加入H₂O₂，与DT2413反应，分别在450nm、470nm、405nm、405nm测定其产物吸光度值。(TMB、愈创木酚加DMSO溶解。)

双底物酶系统中，底物与酶相互作用的机制一般为序列机制或乒乓机制，DT2413与底物作用机制为乒乓机制，其反应式如下：

E+H₂O₂→EI+H₂O

EI+AH₂→EII+AH

EII+AH₂→E+H₂O+AH

其中E为原生酶，即DT2413蛋白。EI和EII为中间产物酶，AH₂是电子供体底物，AH是AH₂的单电子氧化产物。

图20为DT2413蛋白以TMB为底物和H₂O₂的双倒数图，在固定的TMB浓度(0.5mM，1mM和2mM)下TMB氧化的初始速率的倒数对1/[H₂O₂]的初始作图。插图为初始双倒数图纵截距对1/[TMB]的二次作图。由此可计算出Vmax、Km。OPD、ABTS、愈创木酚同理算其Km，Vmax和Kcat(＝Vmax/[E])，计算结果见表9，其中米氏常数Km近似地表明酶与底物的亲和力；Vmax表示酶促反应最大反应速率；Kcat催化常数，其值越大，说明酶的催化效率越高；Kcat/Km用来衡量酶的催化效率，又被称为专一性常数或表观二级速率常数，其包含了催化反应中所有步骤的反应常数，同时反映了酶对底物的亲和力和催化能力，因此可以用于比较不同酶对于特定底物的催化效率及同一种酶对于不同底物的催化效率。

表9

表9续表

(6)有机试剂对DT2413活性的影响

分别用含0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％(体积浓度)的DMSO、1,4–二氧六环、乙醇底物缓冲液(18.5mM OPD、4mM H₂O₂的100mM pH5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液)处理复性好的DT2413酶15min。同时，HRP做阳性对照。分别三个重复，反应15min后，加2M硫酸终止反应，490nm处测定其吸光度值。

有机试剂DMSO、1，4-二氧六环、乙醇对DT2413蛋白、HRP的影响如图21-22所示：有机试剂浓度为10％时，DT2413仍保持70％左右的活性，同条件下，HRP活性就降至60％以下，其中DMSO的降至20％左右；有机试剂浓度为20％时，DT2413保持60％左右的活性，同条件下，HRP活性就降至40％左右，其中DMSO的降至20％左右。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南大学

<120> 一种过氧化物酶、其编码基因及其表达和用途

<130> HA201801626

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Asp Leu Gln Ile Gly Phe Tyr Asn Thr Ser Cys Pro Thr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Leu Val Gln Gln Ala Val Ala Ala Ala Phe Ala Asn Asn Ser Gly Ile

20 25 30

Ala Pro Gly Leu Ile Arg Met His Phe His Asp Cys Phe Val Arg Gly

35 40 45

Cys Asp Ala Ser Val Leu Leu Asp Ser Thr Ala Asn Asn Thr Ala Glu

50 55 60

Lys Asp Ala Ile Pro Asn Asn Pro Ser Leu Arg Gly Phe Glu Val Ile

65 70 75 80

Thr Ala Ala Lys Ser Ala Val Glu Ala Ala Cys Pro Gln Thr Val Ser

85 90 95

Cys Ala Asp Ile Leu Ala Phe Ala Ala Arg Asp Ser Ala Asn Leu Ala

100 105 110

Gly Asn Ile Thr Tyr Gln Val Pro Ser Gly Arg Arg Asp Gly Thr Val

115 120 125

Ser Leu Ala Ser Glu Ala Asn Ala Gln Ile Pro Ser Pro Leu Phe Asn

130 135 140

Ala Thr Gln Leu Ile Asn Ser Phe Ala Asn Lys Thr Leu Thr Ala Asp

145 150 155 160

Glu Met Val Thr Leu Ser Gly Ala His Ser Ile Gly Val Ala His Cys

165 170 175

Ser Ser Phe Thr Asn Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Ser Thr Ser Gly Ile

180 185 190

Asp Pro Thr Leu Ser Pro Ala Tyr Ala Ala Leu Leu Arg Asn Thr Cys

195 200 205

Pro Ala Asn Ser Thr Arg Phe Thr Pro Ile Thr Val Ser Leu Asp Ile

210 215 220

Ile Thr Pro Ser Val Leu Asp Asn Met Tyr Tyr Thr Gly Val Gln Leu

225 230 235 240

Thr Leu Gly Leu Leu Thr Ser Asp Gln Ala Leu Val Thr Glu Ala Asn

245 250 255

Leu Ser Ala Ala Val Lys Ala Asn Ala Met Asn Leu Thr Ala Trp Ala

260 265 270

Ser Lys Phe Ala Gln Ala Met Val Lys Met Gly Gln Ile Glu Val Leu

275 280 285

Thr Gly Thr Gln Gly Glu Ile Arg Thr Asn Cys Ser Val Val Asn Ser

290 295 300

Gly

305

<210> 2

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Asp Leu Gln Ile Gly Phe Tyr Asn Thr Ser Cys Pro Thr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Leu Val Gln Gln Ala Val Ala Ala Ala Phe Ala Asn Asn Ser Gly Ile

20 25 30

Ala Ala Gly Leu Ile Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Arg Gly

35 40 45

Cys Asp Ala Ser Val Leu Leu Asp Ser Thr Ala Asn Asn Thr Ala Glu

50 55 60

Lys Asp Ala Pro Pro Asn Asn Pro Ser Leu Arg Gly Phe Glu Val Ile

65 70 75 80

Ala Ala Ala Lys Ser Ala Val Glu Ala Ala Cys Pro Lys Thr Val Ser

85 90 95

Cys Ala Asp Ile Val Ala Phe Ala Ala Arg Asp Ser Ala Thr Leu Ala

100 105 110

Gly Asn Ile Ser Tyr Gln Val Pro Ser Gly Arg Arg Asp Gly Asn Val

115 120 125

Ser Leu Ala Ser Glu Ala Asn Ala Asn Ile Pro Ser Pro Leu Phe Asn

130 135 140

Ala Thr Gln Leu Ile Asn Ser Phe Ala Gly Lys Asn Leu Thr Thr Asp

145 150 155 160

Glu Met Val Thr Leu Ser Gly Ala His Ser Ile Gly Val Ala His Cys

165 170 175

Ser Ser Phe Leu Asn Arg Ile Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Ser Asp Val

180 185 190

Asp Pro Thr Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Asp Leu Leu Lys Asn Lys Cys

195 200 205

Pro Ser Asn Ser Thr Arg Phe Thr Pro Ile Thr Val Ser Leu Asp Ile

210 215 220

Ile Thr Pro Thr Val Leu Asp Asn Arg Tyr Tyr Thr Gly Val Glu Leu

225 230 235 240

Thr Leu Gly Leu Leu Thr Ser Asp Gln Ala Leu Val Thr Glu Ala Asn

245 250 255

Leu Ser Ala Ala Val Gln Asp Asn Ala Asn Asn Ser Ala Thr Trp Ala

260 265 270

Ser Lys Phe Ala Gln Ala Met Val Lys Met Gly Leu Ile Glu Val Leu

275 280 285

Thr Gly Thr Gln Gly Glu Ile Arg Thr Asn Cys Ser Val Val Asn Ser

290 295 300

Ala Ser

305

<210> 3

<211> 947

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

catatgcatc atcatcacca ccacgactgc agatcggttt ttataacacc agctgtccga 60

ccgcagaaag tctggttcaa caagcagttg cggcagcgtt tgcgaataat agcggtattg 120

caccgggtct gattcgtatg cacttccacg attgctttgt tcgcggttgc gacgcgagcg 180

tgctgctgga tagtaccgca aatacaccgc ggaaaaagac gcgattccga ataatccgag 240

cctgcgcggt tttgaagtta ttaccgcggc gaaatctgca gttgaagcag cttgtccgca 300

aaccgttagc tgcgcagata ttctggcttt gcggcacgtg attcagcaaa tctggcgggt 360

aatattacct atcaagttcc gtctggtcgt cgcgatggta ccgttagtct ggcatctgaa 420

gcaaacgcac agattccgag tccgctgttt aacgcaacca gctgattaac agctttgcga 480

acaaaaccct gaccgctgac gaaatggtta ccctgtctgg cgcacatagt attggcgttg 540

cacattgcag cagctttacc aaccgtctgt acaacttcaa cagcccagcg gtattgatcc 600

gaccctgagt ccggcatacg ctgcactgct gcgtaatacc tgtccggcaa atagtacccg 660

ttttaccccg atcaccgtta gcctggatat cattaccccg tctgtcctgg aaacatgtac 720

tataccggcg ttcaactgac cctgggtctg ctgacctctg atcaagcact ggttaccgaa 780

gcgaatctgt ctgcggcagt taaagcgaat gcgatgaatc tgaccgcttg ggctagtaat 840

ttgcccaggc catggtcaaa atgggccaaa tcgaagttct gaccggtacc caaggcgaaa 900

ttcgtaccaa ctgcagcgtt gtcaacagcg gtagttaatg aaagctt 947

<210> 4

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

catatgcatc atcatcacca ccacgatctg cagatcggtt tttataacac cagctgtccg 60

accgcagaaa gtctggttca acaagcagtt gcggcagcgt ttgcgaataa tagcggtatt 120

gcggcaggtc tgattcgtct gcatttccac gattgctttg ttcgcggttg cgacgcgagc 180

gtgctgctgg atagtaccgc gaataacacc gcagaaaaag acgcaccgcc gaataatccg 240

agtctgcgcg gttttgaagt tattgcggcg gcaaaaagcg cagttgaagc agcttgtccg 300

aaaaccgtta gctgcgcgga tattgttgcc tttgcagcac gtgattctgc aaccctggca 360

ggtaatatta gttatcaggt tccgtctggt cgtcgcgatg gtaacgttag tctggcaagc 420

gaagcaaacg cgaacattcc gagtccgctg tttaacgcaa cccagctgat taacagcttt 480

gcaggtaaaa acctgaccac cgacgaaatg gttaccctgt ctggcgcaca tagtattggc 540

gttgcacatt gcagcagctt tctgaaccgc atctacaact tcagcaatac cagcgacgtt 600

gatccgaccc tgagttctgc atacgcagat ctgctgaaaa acaaatgccc gagcaacagc 660

acccgtttta ccccgattac cgttagcctg gacatcatta ccccgaccgt tctggataac 720

cgctattata ccggcgttga actgaccctg ggtctgctga cctctgatca agcactggtt 780

accgaagcga atctgtctgc ggctgttcag gataatgcga ataatagcgc gacctgggca 840

agtaaattcg ctcaggccat ggtcaaaatg ggtctgatcg aagttctgac cggtacccaa 900

ggcgaaattc gtaccaactg cagcgttgtc aacagcgcaa gctaatgaaa gctt 954

<210> 5

<211> 4865

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctccca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 180

ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 240

cgtagtgggc catcccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct 300

ttaatagtgt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 360

ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 420

cttcccttcc tttctcccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc 480

cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt 540

gatggttcac gtagtgggcc atcccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 600

ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 660

tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 720

tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttaa caaaatatta acgtttacaa tttcaggtgg 780

cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa 840

tatgtatccg ctcatgaatt aattcttaga aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa 900

tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg 960

agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatct ggtatcggtc tgcgattccg 1020

actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt 1080

gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaattta tgcatttctt 1140

tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca 1200

aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgtaaaagg 1260

acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 1320

attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc 1380

gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc 1440

ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta 1500

cctttgcatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1560

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1620

tgttggaatt taatgcggcc tagagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc 1680

ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt catgaccaaa atcccttaac 1740

gtgagttttc gttccactga ggtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 1800

tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 1860

ggtttgtttg ccggatcaag agctaccact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 1920

gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 1980

tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatctgtt accagtggct gctgccagtg 2040

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 2100

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt gggcgaacga cctacaccga 2160

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 2220

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 2280

tgcgtattgg gcgccagggt ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg 2340

cccttcaccg cctggccctg agagagttgc agcaagcgtc cacgctggtt tgccccagca 2400

ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat 2460

cgtcgtatcc cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag cccgactcgg taatggcgcg 2520

cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc 2580

attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc ctcccgttcc 2640

gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc 2700

gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgaca 2760

gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 2820

tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 2880

tggcacctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag 2940

attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac 3000

gctggcaccc agtgatcggc gcgagattta atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc 3060

agggccagac tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt 3120

gccacgcggt tgggaatgta ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 3180

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 3240

catactctgc gacatcgtat aacgttctgg tttcacattc accaccctga attgactctc 3300

ttccgggcgc tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat 3360

ctcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttagaagcag cccagtagta ggttgaggcc 3420

gttgagcacc gccgccgcaa ggaatggtgc atgcaaggag atggcgccca acagtccccc 3480

ggccacgggg cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg tcatgagccc gaagtggcga 3540

gcccgatctt ccccatcggt gatgtcggcg atataggcgc cagcaaccgc acctgtggcg 3600

ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg tagaggatcg agatcgactc gatcccgcga 3660

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 3720

ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcatcat catcaccacc acgactgcag 3780

atcggttttt ataacaccag ctgtccgacc gcagaaagtc tggttcaaca agcagttgcg 3840

gcagcgtttg cgaataatag cggtattgca ccgggtctga ttcgtatgca cttccacgat 3900

tgctttgttc gcggttgcga cgcgagcgtg ctgctggata gtaccgcaaa tacaccgcgg 3960

aaaaagacgc gattccgaat aatccgagcc tgcgcggttt tgaagttatt accgcggcga 4020

aatctgcagt tgaagcagct tgtccgcaaa ccgttagctg cgcagatatt ctggctttgc 4080

ggcacgtgat tcagcaaatc tggcgggtaa tattacctat caagttccgt ctggtcgtcg 4140

cgatggtacc gttagtctgg catctgaagc aaacgcacag attccgagtc cgctgtttaa 4200

cgcaaccagc tgattaacag ctttgcgaac aaaaccctga ccgctgacga aatggttacc 4260

ctgtctggcg cacatagtat tggcgttgca cattgcagca gctttaccaa ccgtctgtac 4320

aacttcaaca gcccagcggt attgatccga ccctgagtcc ggcatacgct gcactgctgc 4380

gtaatacctg tccggcaaat agtacccgtt ttaccccgat caccgttagc ctggatatca 4440

ttaccccgtc tgtcctggaa acatgtacta taccggcgtt caactgaccc tgggtctgct 4500

gacctctgat caagcactgg ttaccgaagc gaatctgtct gcggcagtta aagcgaatgc 4560

gatgaatctg accgcttggg ctagtaattt gcccaggcca tggtcaaaat gggccaaatc 4620

gaagttctga ccggtaccca aggcgaaatt cgtaccaact gcagcgttgt caacagcggt 4680

agttaatgaa agcttgcggc cgcactcgag cacaccacca ccaccactga gatccggctg 4740

ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat 4800

aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt ctgaaaggag gaactatatc 4860

cggat 4865

<210> 6

<211> 6198

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980

gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 5040

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgca tcatcatcac caccacgatc 5100

tgcagatcgg tttttataac accagctgtc cgaccgcaga aagtctggtt caacaagcag 5160

ttgcggcagc gtttgcgaat aatagcggta ttgcggcagg tctgattcgt ctgcatttcc 5220

acgattgctt tgttcgcggt tgcgacgcga gcgtgctgct ggatagtacc gcgaataaca 5280

ccgcagaaaa agacgcaccg ccgaataatc cgagtctgcg cggttttgaa gttattgcgg 5340

cggcaaaaag cgcagttgaa gcagcttgtc cgaaaaccgt tagctgcgcg gatattgttg 5400

cctttgcagc acgtgattct gcaaccctgg caggtaatat tagttatcag gttccgtctg 5460

gtcgtcgcga tggtaacgtt agtctggcaa gcgaagcaaa cgcgaacatt ccgagtccgc 5520

tgtttaacgc aacccagctg attaacagct ttgcaggtaa aaacctgacc accgacgaaa 5580

tggttaccct gtctggcgca catagtattg gcgttgcaca ttgcagcagc tttctgaacc 5640

gcatctacaa cttcagcaat accagcgacg ttgatccgac cctgagttct gcatacgcag 5700

atctgctgaa aaacaaatgc ccgagcaaca gcacccgttt taccccgatt accgttagcc 5760

tggacatcat taccccgacc gttctggata accgctatta taccggcgtt gaactgaccc 5820

tgggtctgct gacctctgat caagcactgg ttaccgaagc gaatctgtct gcggctgttc 5880

aggataatgc gaataatagc gcgacctggg caagtaaatt cgctcaggcc atggtcaaaa 5940

tgggtctgat cgaagttctg accggtaccc aaggcgaaat tcgtaccaac tgcagcgttg 6000

tcaacagcgc aagctaatga aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact 6060

gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc 6120

aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag 6180

gaggaactat atccggat 6198

Claims (10)

1.一种过氧化物酶，其特征在于，包括如下氨基酸序列:

(1)如SEQ ID NO.1-2任一所示的氨基酸序列；

(2)与(1)中所述的SEQ ID NO.1-2任一所示的氨基酸序列具有85％以上的同源性的氨基酸序列。

2.一种过氧化物酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的过氧化物酶的基因。

3.根据权利要求2所述的过氧化物酶基因，其特征在于，包括如下核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.3-4任一所示的核苷酸序列；

(2)与(1)中所述的SEQ ID NO.3-4任一所示的核苷酸序列具有85％以上的同源性的核苷酸序列。

4.包含权利要求2或3所述的过氧化物酶基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体为大肠杆菌表达载体。优选的，所述载体为pET30a。

6.包含权利要求2或3所述的过氧化物酶基因的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。

8.一种表达过氧化物酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将权利要求4或5所述的过氧化物酶基因的重组载体转化至菌株中，得到重组菌株；

S2、将所述重组菌株进行发酵，诱导过氧化物酶的表达；

S3、回收并纯化表达的过氧化物酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在S2步骤中，诱导过氧化物酶表达的诱导温度为15-37℃，诱导时间为14-18小时；优选的，诱导剂为IPTG，浓度为0.1-5mM。

10.权利要求1所述的过氧化物酶在降解过氧化物中的用途。