CN104531652B

CN104531652B - 一种添加维生素b6提高谷氨酸脱羧酶产量的方法及应用

Info

Publication number: CN104531652B
Application number: CN201410733876.7A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 宿玲恰; 黄燕
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-12-04
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2034-12-04
Also published as: CN104531652A

Abstract

本发明公开了一种添加维生素B₆提高谷氨酸脱羧酶产量的方法及应用，属于酶工程和发酵工程技术领域。本发明采用导入了L‑谷氨酸脱羧酶GAD基因的重组大肠杆菌，以半合成培养基、分批补料的发酵方式控制一定的比生长速率，在OD₆₀₀值为20‑80时进行流加一定浓度乳糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加2‑25mM维生素B6，诱导24h胞内谷氨酸脱羧酶酶活由对照(发酵过程中未添加维生素B₆)1293U/mL提高到3300U/mL；本发明还公布了一种利用该发酵工艺的重组酶进行无需添加辅酶生产γ‑氨基丁酸的合成工艺，GABA积累量由对照的190g/L增加到374g/L。

Description

一种添加维生素B6提高谷氨酸脱羧酶产量的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种添加维生素B₆提高谷氨酸脱羧酶产量的方法及应用，属于酶工程和发酵工程技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)，一种非蛋白质氨基酸，分子式为C4H9NO2、极易溶于水。GABA以自由态形式广泛存在于自然界中，是哺乳动物中枢神经系统的抑制性传递物质。GABA具有多种生理功能，如镇静神经、抗焦虑、降血氨、降血压、抑制脂肪肝及肥胖症、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、改善脑细胞、促进激素分泌和保肝利肾等。GABA 正被广泛应用于医药、食品保健、化工及农业等行业。目前GABA在临床上常用于降低人体的血氨，治疗各种类型的肝昏迷，同时又被广泛用于治疗各种脑疾病，还可以作为儿童智力的营养补充剂和促进剂，老年人的营养剂。

GABA天然存在量很低，因此很难从天然组织中大量分离。目前，GABA的生产方法有化学合成法、植物富集法和微生物合成法。化学合成法受到苛刻的反应条件及昂贵的天然原料的限制，成本高、安全性差。植物富集法含量低，尚无法用作医药、医药中间体和食品添加剂。与化学法相比，微生物合成法的主要优点是条件温和、不需要昂贵的原料，能耗低。其原理是利用菌体内的谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD；EC4.1.1.15，吡哆醛类裂解酶，能专一地催化L-谷氨酸裂解为GABA和CO₂)的作用，将L-谷氨酸脱羧转化为GABA。微生物合成法主要有直接发酵法和酶催化法。早期微生物法生产GABA主要采用直接发酵法，以大肠杆菌、乳酸菌、植物乳杆菌等为生产菌，利用菌体内的谷氨酸脱羧酶的作用，将发酵液中的L-谷氨酸转化为GABA，再从发酵液中分离纯化制得GABA。传统的直接发酵法得到的发酵液是一个复杂的多相体系，除了目的产物GABA，还含有大量菌体、蛋白质、残糖、色素及无机盐等杂质，使得GABA生产的下游分离纯化复杂化，成为GABA工业化生产的瓶颈问题。酶催化法是以发酵培养的全细胞或酶液作为催化剂转化生产GABA，所需设备简单，条件容易控制，反应步骤少，副反应少，收率高，环境友好，得到的转化液相对于直接发酵的发酵液而言，成分简单，杂质含量少，使得主要产品的分离纯化工艺简化，成本降低。所以筛选具有相对高活力的L-谷氨酸脱羧酶的微生物并通过分子生物学技术外源高效表达L- 谷氨酸脱羧酶并优化酶制备工艺得到该领域学者、专家的关注。

目前已经有一些关于采用谷氨酸脱羧酶工程菌生产GABA的报道，已有研究将大肠杆菌基因来源的谷氨酸脱羧酶在E.coli BL21(DE3)中表达，在150g/L谷氨酸、0.15mM磷酸吡哆醛(PLP)、0.6mM Ca²⁺酶转化体系中添加360U粗酶液，反应结束后，产物浓度达到94g/L，摩尔转化率达到90％。但是根据已报道的一些专利和文献，谷氨酸脱羧酶的辅酶为5’-磷酸吡哆醛(PLP)，胞内的含量并不能满足重组谷氨酸脱羧酶的需要，所以常在谷氨酸脱羧酶发酵制备和GABA生产工艺中添加一定量辅酶促进生产，但是辅酶存在稳定性差、价格高、来源少等诸多缺点。为解决上述问题，本发明提供一种添加维生素B₆提高重组菌谷氨酸脱羧酶产量的方法，并研究了该方法得到的谷氨酸脱酸酶的应用性能，为γ-氨基丁酸的工业化生产降低成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在重组菌发酵过程中添加维生素B₆以提高谷氨酸脱羧酶产量的方法，并提供一种不需要添加辅酶生产GABA的工艺，降低了GABA的生产成本。

本发明的第一个目的是提供一种提高谷氨酸脱羧酶产量的方法，是在表达谷氨酸脱羧酶基因的基因工程菌的发酵过程中添加维生素B₆。

所述维生素B₆的添加方式为一次性添加、分批添加或恒速流加。

所述维生素B₆在发酵液中的浓度控制在2-30mM。

所述基因工程菌的发酵方法，在本发明的一种实施方式中，是在30-37℃培养，控制溶氧水平在15～30％、pH 6.5～7.5，当OD₆₀₀达到20～80时，以25～30℃下流加乳糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加维生素B₆，诱导18-24h。

所述基因工程菌的发酵方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：采用温度两阶段控制策略和恒溶氧分批补料技术高密度培养基因工程菌生产重组谷氨酸脱羧酶的发酵工艺；在发酵过程中，以30-37℃恒温培养，控制溶氧水平在15～30％，流加氨水控制pH 6.5～7.5，当 OD₆₀₀达到20～80时，以25～30℃恒温、恒速流加乳糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加一定量的维生素B₆，诱导18-24h。

本发明的第二个目的是提供所述方法在γ-氨基丁酸合成中的应用。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是指基因工程菌发酵所得细胞或重组酶在γ-氨基丁酸合成中的应用。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将发酵得到的基因工程菌细胞用缓冲液洗涤并悬浮，将L-谷氨酸或谷氨酸钠加入到细胞悬浮液中至终浓度为10-200g/L，维持反应温度 30-40℃，调节控制pH 4.5-5.5，每隔2-6h补加L-谷氨酸或谷氨酸钠至终浓度为0-100g/L，反应12-32h。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将发酵得到的基因工程菌进行细胞破碎得到酶液，将酶液加入到L-谷氨酸或谷氨酸钠的终浓度为10-200g/L的反应体系中，维持反应温度30-40℃、pH 4.5-5.5，每隔2-6h补L-谷氨酸或谷氨酸钠至终浓度0-100g/L，反应12-32h。

本发明的第三个目的是一种用于权利要求1所述方法的基因工程菌。

所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是表达来源于大肠杆菌的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的重组大肠杆菌。

所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是将Genebank号为NC_000913.3的基因序列(即SEQ ID NO.1所示的序列)连接到pET-24a(+)载体后转化到E.coli BL21(DE3)中得到的重组菌。

本发明的优势：(1)在发酵过程中添加维生素B₆使酶产量达到3300U/mL，是对照的2.5 倍；(2)该酶的酶比活由对照(不添加维生素B6发酵处理)的130U/mg提高为197.2U/mg，提高了51.7％；(3)酶在反应温度37-40℃热稳定性显著提高，GAD的半衰期由对照的38h 提高到107h，半衰期提高到了3倍以上；(4)酶催化过程不需要添加辅酶，维生素B6价格便宜且易获得，稳定性较辅酶磷酸吡哆醛、辅酶前体物质盐酸吡哆醛等稳定，易储藏，为γ- 氨基丁酸的工业化生产提供方便、降低生产成本。

附图说明

图1重组大肠杆菌摇瓶发酵生产谷氨酸脱羧酶的过程曲线图；其中■，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生素B₆；

图2重组大肠杆菌发酵罐发酵生产谷氨酸脱羧酶的过程曲线图；其中■，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生素B₆；

图3谷氨酸脱羧酶的SDS-PAGE分析；其中M，蛋白质分子量标准；1，谷氨酸脱羧酶粗酶液；2，GAD-对照纯酶；2，GAD-VB₆纯酶；

图4谷氨酸脱羧酶最适pH；其中■，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生素B₆；

图5谷氨酸脱羧酶最适温度；其中■，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生素B₆；

图6谷氨酸脱羧酶pH稳定性；其中■，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生素B₆；

图7谷氨酸脱羧酶37℃热稳定性；其中■，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生素B₆。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上按照常规的分子克隆手册所述的条件进行操作。

菌株和质粒：质粒pET-24a(+)，菌株E.coli-K12、E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)。

材料和方法：所用的限制性内切酶，T4连接酶,pMD18-T simple载体，PCR试剂，DNAmarker等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109，引物，质粒抽提试剂盒等均购于上海生工生物工程公司。

实施例1：基因工程菌的构建

根据NCBI数据库中的gadB的基因序列(Genebank：NC000913.3)，分别设计含Nde I和 Xho I酶切位点的两端引物P1(序列如SEQ ID NO.2所示)、P2(序列如SEQ ID NO.3所示)，如下：

上游引物P1:5’-CGCCATATGGACCAGAAGCTGTTAACGGAT-3’

下游引物P2:5’-CCGCTCGAGTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTCT-3’

以本实验室的E.coli-K12总DNA为模版或者以化学合成法得到的序列如Genebank：NC 000913.3所示的片段为模板，扩增谷氨酸脱羧酶gadB基因。将gadB基因与pMD18-T simple 载体(商业化工具载体)连接并转化宿主E.coli JM109,并将转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取单菌落，接入LB液体培养基，8～10h提取质粒，命名为gadB/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定。结果表明插入片段为1401bp的DNA 片段，与基因库NC000913.3的基因序列(即SEQ ID NO.1所示的序列)完全相同。

1、用于构建大肠杆菌的质粒是pET-24a(+)。将pET-24a(+)质粒和gadB/pMD18-Tsimple 分别进行Nde I和Xho I双酶切，酶切验证产物回收后再用T₄连接酶连接，连接产物转化至E. coli JM109感受态细胞，经37℃培养8h挑取转化子在含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中震荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒gadB/pET-24a(+)。

2、将质粒gadB/pET-24a(+)转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌，并将转化产物gadB/pET-24a(+)/E.coli BL21(DE3)涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养8h。挑取单菌落至液体LB中，37℃培养过夜，保存甘油管。

实施例2：大肠杆菌gadB/pET-24a(+)/E.coli BL21(DE3)摇瓶发酵

1、菌株gadB/pET-24a(+)/E.coli BL21(DE3)

2、种子培养基：将-80℃保藏的菌种接入种子培养基，初始pH7.0-7.2，回转恒温摇床37 ℃、200rpm培养7-8h。种子培养基的组成为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L。

3、发酵产酶：发酵接种量5％；发酵培养基组成为：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄12.54g/L,KH₂PO₄2.31g/L；37℃培养2h后加入终浓度0.4mM IPTG诱导；在诱导0h时加入0.05mM维生素B₆(对照不加维生素B₆)，降温至25℃培养24h。离心菌体，用pH5.550mM Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液悬浮菌体，超声破碎，离心后测上清液中谷氨酸脱羧酶酶活，重组谷氨酸脱羧酶发酵活力达到156U/mL，是对照的1.8倍(对照87.5U/mL)；产酶曲线见图1。

4、酶活测定方法：取上述40ul酶液加入360ul底物(底物在50mM pH 4.8磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液体系含0.15mM PLP 0.1M谷氨酸)37℃反应4min，然后用600ul 0.2M pH＝10 硼酸缓冲液终止反应。采用HPLC-OPA衍生法测量γ-氨基丁酸生成量。酶活定义单位为在酶活测量体系下，在1分钟内能转化生成1微摩尔产物的酶量。

实施例3：大肠杆菌gadB/pET-24a(+)/E.coli BL21(DE3)发酵工艺

1、菌株gadB/pET-24a(+)/E.coli BL21(DE3)。

3、发酵接种量4％-8％。

4、发酵培养基组成：蛋白胨1g/L、酵母粉1g/L、(NH₄)₂HPO₄4g/L、KH₂PO₄13.5g/L、MgSO₄·7H₂O 4.1g/L、柠檬酸0.85g/L、甘油8g/L、微量元素5mL/L，氨苄青霉素100mg/L；微量元素液组成:HCl 5M/L、FeSO₄·7H₂O 10g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L、CuSO₄·5H₂O 1.0g/L、MnSO₄·4H₂O 0.5g/L、Na₂B₄O₇·10H₂O 0.23g/L、CaCl₂·2H₂O 2.0g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.1g/L。

具体发酵工艺如下：

1)分批发酵阶段：将种子培养液按5-10％的接种量接入发酵培养基中，通过调节搅拌转速或者通入富氧空气将溶氧维持在20-30％，温度控制在33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，培养5-6h；

2)补料培养阶段：分批发酵阶段结束后待溶氧上升至80-100％。以指数流加的方式补加补料液控制菌体以0.2h^-1的比生长速率生长，通过提高搅拌转速或者通入富氧空气维持溶氧在20-30％，温度控制在33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5；所述补料液为：甘油600g/L，MgSO₄·7H₂O 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L；

3)诱导阶段：当菌体达到45-60时，将温度降为27-30℃，诱导阶段以16-20g.L^-1.h^-1为起始速率流加补料液，每3-5h降低10-20％的补料液流速，同时补加乳糖，乳糖流速控制在 0.2-0.4g.L^-1.h^-1，通过提高搅拌转速或者通入氧气维持溶氧在20-30％，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5；在诱导0h、12h补加2mM维生素B₆(对照不添加)，诱导24h；产酶曲线见图2。

发酵结束后离心菌体，用pH5.550mM Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液悬浮菌体，超声破碎，离心后测上清液中谷氨酸脱羧酶酶活，重组菌(添加维生素B₆)的谷氨酸脱羧酶发酵活力达到 3300-3400U/mL，是对照(不添加维生素B₆)的2.5倍(对照1200-1300U/mL)。

实施例4：谷氨酸脱羧酶纯化和酶学性质

分别将发酵过程中添加、未添加的维生素B₆的重组酶菌体进行超声破碎，离心10min，取上清液于4℃，8000rpm离心20min，除去细胞碎片。向上清液中加入60％固体硫酸铵盐盐析过夜，4℃，8000rpm离心20min，取沉淀物用适量pH 5.5，20mMNa₂HPO₄-柠檬酸缓冲液溶解，采用透析膜透析除去残余硫酸铵，透析样品通过0.4um膜过滤后制成上样样品。经过DEAE-Sepharose阴离子交换树脂。纯化过程中蛋白SDS-PAGE电泳图见图3(为方便区分，之后用GAD-VB₆指发酵过程中添加维生素B₆的重组酶，GAD-对照指发酵过程中未添加维生素B₆的重组酶)。

1、比酶活比较：

GAD-VB₆(发酵过程中添加维生素B₆)的比酶活为197U/mg，比GAD-对照(发酵未添加维生素B₆)的比酶活130.2U/mg提高了51.3％。

2、酶学性质包括了GAD-VB₆与GAD-对照的最适pH、最适温度、pH稳定性、37℃热稳定性的比较研究。

最适pH及pH稳定性：配制不同pH值(3.0～7.0)的缓冲液，在37℃条件下分别测定酶活，以酶活最高为100％，计算相对活性，考察酶的最适pH；将重组酶在不同pH值(3.0～7.0)的缓冲液中4℃保温24h，再分别测定残留活性，考察酶的pH稳定性。所用的缓冲体系分别为：柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系(3.0～7.0)。

最适温度及热稳定性：在30～60℃范围内，每隔5℃，pH 4.8条件下分别测定酶活，以酶活最高为100％，计算相对酶活，以确定酶的最适温度；为研究重组酶的热稳定性，将重组酶分别在37℃下保温，定期取样测定残留酶活。

GAD-VB₆与GAD-对照最适pH、最适温度均为pH5.0(图4)、50℃(图5)，但在pH4 的条件下GAD-VB₆还能保持83％的酶活而对照只有37％。此外，两者的pH稳定性没有很大差异(图6)。如图7所示，酶在反应温度37-40℃热稳定性显著提高，GAD的半衰期由对照的38h提高到107h，半衰期提高到了3倍以上。

实施例5：以表达谷氨酸脱羧酶的工程菌制备GABA

本实施例进行的酶催化或者全细胞转化底物均采用50mM pH5.0Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液溶解L-谷氨酸或L-谷氨酸钠，未添加5’-磷酸吡哆醛(PLP)，即不需要添加辅酶。

最适加酶量：用50mM pH5.0Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制终浓度200g/L L-谷氨酸，分别加入5、10、15、20、25g/L实施例3中得到的GAD-VB₆、GAD-对照的工程菌细胞湿菌体，维持反应温度35-40℃，调节控制pH 5.0-5.2。结果发现GAD-VB₆、GAD-对照的最适加菌量分别为10g/L、15g/L。

用50mM pH5.0Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液洗涤并悬浮实施例3中得到的GAD-VB₆、GAD-对照的工程菌细胞(分别在最适加菌量的条件下GAD-VB₆10g/L，GAD-对照15g/L)，将L- 谷氨酸钠(添加量为254g/L，对应L-谷氨酸初始反应浓度为200g/L)加入到细胞悬浮液中，反应开始，维持反应温度35-40℃，调节控制pH 5.0-5.2，反应4-6h后每隔2h补加L-谷氨酸至终浓度为50g/L。反应24h，GAD-VB₆反应液中产物浓度达到385g/L、摩尔转化率为 99.3％；GAD-空白中产物浓度为340g/L，摩尔转化率为89.2％。

实施例6：以谷氨酸脱羧酶制备GABA

最适加酶量：分别将实施例3中超声破碎得到的酶液以10、20、30、40、50U/(g·L)的加酶量加入采用50mM pH5.0Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液溶解的200g/L L-谷氨酸反应体系中，维持反应温度35-40℃，调节控制pH 5.0-5.2。可以得到GAD-VB₆、GAD-对照的最适加酶量分别为30U/(g·L)、40U/(g·L)。

将实施例3中超声破碎得到的酶液{GAD-VB₆30U/(g·L)，GAD-对照40U/(g·L)}加入采用50mM pH5.0Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液溶解的200g/L L-谷氨酸反应体系中，反应开始，维持反应温度35-40℃、pH 5.0-5.2，反应4-6h后每隔2h补加L-谷氨酸至浓度为50g/L。反应24 h，GAD-VB₆反应液中产物浓度达到374g/L、摩尔转化率为89.1％；GAD-空白产物浓度为190g/L，摩尔转化率为45.2％。

实施例7：重组菌的发酵培养与GABA的制备

将表达谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌活化后，接种于发酵罐，在30-37℃培养，控制溶氧水平在15～30％、pH 6.5～7.5，当OD₆₀₀达到20～80时，以25～30℃下流加乳糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加终浓度为2-30mM的维生素B₆，诱导18-24h。以不添加维生素B₆发酵的同一菌株为对照。培养结束后，测定谷氨酸脱羧酶酶活，结果发现添加了维生素B₆的重组菌的谷氨酸脱酸酶酶活是对照的2倍以上。

将上述发酵得到的细胞或者细胞破碎后得到的酶液，加入到L-谷氨酸或谷氨酸钠的终浓度为10-200g/L的反应体系中，维持反应温度30-40℃、pH 4.5-5.5，直接反应12-32h或者每隔2-6h补0-100g/L的L-谷氨酸或谷氨酸钠反应12-32h。结果表明，添加维生素B₆发酵得到的细胞或酶液，其反应液中的产物浓度和摩尔转化率都显著高于对照。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种提高谷氨酸脱羧酶产量的方法，其特征在于，是在表达谷氨酸脱羧酶基因的基因工程菌的发酵过程中添加维生素B₆；所述基因工程菌是将Genebank号为NC_000913.3的基因序列连接到pET-24a(+)载体后转化到E.coli BL21(DE3)中得到的重组菌；所述基因工程菌的发酵方法如下：在30-37℃培养，控制溶氧水平在15～30％、pH 6.5～7.5，当OD₆₀₀达到20～80时，在25～30℃流加乳糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加维生素B₆，诱导18-24h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素B₆的添加方式为一次性添加、分批添加或恒速流加。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素B₆在发酵液中的浓度控制在2-30mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的发酵方法如下：采用温度两阶段控制策略和恒溶氧分批补料技术高密度培养基因工程菌生产重组谷氨酸脱羧酶的发酵工艺；在发酵过程中，以30-37℃恒温培养，控制溶氧水平在15～30％，流加氨水控制pH6.5～7.5，当OD₆₀₀达到20～80时，以25～30℃恒温、恒速流加乳糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加一定量的维生素B₆，诱导18-24h。

5.权利要求1-4任一所述方法在γ-氨基丁酸合成中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是将发酵得到的基因工程菌细胞用缓冲液洗涤并悬浮，添加终浓度为10-200g/L的L-谷氨酸或谷氨酸钠到细胞悬浮液中，维持反应温度30-40℃，调节控制pH 4.5-5.5，每隔2-6h补加L-谷氨酸或谷氨酸钠至终浓度为0-100g/L，反应12-32h。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是将发酵得到的基因工程菌进行细胞破碎得到酶液，将酶液加入到L-谷氨酸或谷氨酸钠终浓度为10-200g/L的反应体系中，维持反应温度30-40℃、pH 4.5-5.5，每隔2-6h补L-谷氨酸或谷氨酸钠至终浓度为0-100g/L，反应12-32h。