CN105200075A - 用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法，本发明提供一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所述质粒中的目的基因序列经过了优化，在大肠杆菌中表达效率高，其中的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因表达出的γ-谷氨酰甲胺合成酶本身活性就很高，可解决现有的用于茶氨酸的酶活性低下的问题；而且其催化的底物为低成本的谷氨酸和乙胺，可解决现有技术底物成本较高的问题。本发明还提供了一种茶氨酸基因工程菌及其配套的培养方法，该基因工程菌由γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒转化得到，可用于生产茶氨酸，易于培养，可解决现有菌株不够稳定的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法。
背景技术
茶氨酸(L-Theanine)是茶叶中特有的游离氨基酸，属于酰胺类化合物，学名为N-乙基-γ-L-谷氨酰胺(5-N-ethyl-γ-L-glutamine)。茶氨酸在化学构造上与脑内活性物质谷酰胺、谷氨酸相似，是茶叶中生津润甜的主要成份。
茶氨酸主要应用于医药和食品领域。在医药方面，茶氨酸具有降血压的作用；与抗癌药物共同使用，可以增强抗肿瘤药物的疗效；具有松弛神经紧张和焦虑的作用；能引起脑内神经递质的变化，促进大脑的学习和记忆功能，并且能对帕金森症、传导神经功能紊乱等疾病起到预防效果；具有改善经期综合征和减肥的作用；另外，茶氨酸有抗疲劳、提高免疫力和防御病毒的作用。在食品方面，茶氨酸作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添加剂和功能食品的添加剂。另外，茶氨酸还应用于化妆品中作为保湿剂和皮肤保湿食品等。
目前，茶氨酸的合成方法主要有化学合成法和生物转化合成法。化学合成法反应过程复杂，副产物多，提取困难，收率较低，安全性差，能耗高且污染大，不适合工业化生产。生物转化合成法又可以分为茶树愈伤组织培养法、酶转化法合成和微生物转化法。其中，茶树愈伤组织培养法茶氨酸生产量低，产品分离纯化过程复杂及生产工艺的控制难度大，这种植物组织细胞培养法本身也还只在试验研究阶段。酶转化法合成是从微生物中提取酶，用酶提取液作为催化剂，催化底物一步转化生成茶氨酸，此法可以实现酶与底物充分接触，转化周期短，但酶极其不稳定，无法制成纯品再加入到合成反应器中，且无法回收利用。
微生物转化法是用完整的微生物细胞将底物一步转化为茶氨酸，此法的实质和酶转化法合成一样是利用微生物体内的裂和酶或转胺酶来进行转化底物，微生物发酵法生产的茶氨酸具有成本低、容易从反应液中提取获得产物、转化效率高、可大量生产的特点，因此，采用微生物发酵是实现茶氨酸规模化生产的必由之路。
近年来，有学者筛选高活性产茶氨酸的微生物菌株进行生产茶氨酸，但由于酶活较低，茶氨酸的产量很低。此外，很多用于构建基因工程菌的质粒还存在表达效率低、不够稳定的缺点。同时，也有学者利用基因工程技术构建表达关键酶的重组菌通过微生物转化法生产茶氨酸，但大多数克隆的是γ-谷氨酰基转肽酶，催化的底物是谷氨酰胺和乙胺，底物成本较高，不利于工业化生产。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所述的质粒在大肠杆菌中表达效率高，其中的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因表达出的γ-谷氨酰甲胺合成酶本身活性就很高，可解决现有的用于茶氨酸的酶活性低下的问题；而且其催化的底物为低成本的谷氨酸和乙胺，可解决现有技术底物成本较高的问题。
本发明的第二目的在于提供一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，该构建方法可对γ-谷氨酰甲胺合成酶的原始序列进行优化，可解决现有技术所用质粒表达效率低的问题。
本发明的第三目的在于提供茶氨酸基因工程菌，该基因工程菌由γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒转化得到，可用于生产茶氨酸，且该基因工程菌易于培养，可解决现有菌株不够稳定的缺点。
本发明的第四目的在于提供一种茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，该方法简单易行。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所述表达质粒上的所述γ-谷氨酰甲胺合成酶的碱基序列为SEQIDNO:1所示。
本申请所采用的γ-谷氨酰甲胺合成酶为对MethylovorusmaysNO.9来源的GenBankAccession号为AB333782.1的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因原始序列进行优化得来，该酶可将谷氨酸和乙胺催化生成L-茶氨酸，催化效率高，且底物性价比高，可有效降低成本。
一种如上所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，包括以下步骤：
1)、针对大肠杆菌表达系统对MethylovorusmaysNO.9来源的GenBankAccession号为AB333782.1的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因原始序列进行优化，将原始序列中的低频密码子转换为同义的大肠杆菌高频密码子，将原序列中的终止子替换成TAAT强终止子，在原序列两端添加上了限制性内切酶的酶切位点，得到优化的gmas基因序列；
2)、以优化的gmas基因序列为模板，合成碱基序列为SEQIDNO:1所示的gmas基因片段；
3)、将所述优化的gmas基因片段连接到原核表达载体上，得到γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。
密码子总计有64种，但实际最终对应翻译的目的氨基酸种类只有20种，这就意味着，存在某些多个密码子编码同一种氨基酸的现象，也称做密码子的简并性。正是由于该特性，每个氨基酸至少对应1种密码子，最多可以有一种氨基酸对应6种密码子。但这些编码相同氨基酸的不同密码子，在不同物种、不同生物体中使用的频率并非完全地平均分布，也即绝大多数生物倾向于只利用这些密码子中的一部分，该现象也称密码子的偏好性。其中那些被最频繁利用的密码子称为高频密码子，而那些不被经常利用的密码子称为低频密码子。为了能让MethylovorusmaysNO.9来源的基因在大肠杆菌表达系统中高效表达，本申请对其原始密码子进行了优化，将原始序列中的低频密码子转换为同义的大肠杆菌高频密码子。
针对原基因中终止子终止翻译效率不高的特点，本申请优选将其密码子替换为TAAT强终止子，使用强终止子可以使核糖体在翻译完成后更快更有效地从模板上脱离，一方面可进一步提高转录效率，另一方面也可以避免无功能的过长的蛋白的合成。
如上所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，步骤3)的具体步骤为：
将所述的gmas基因片段连接到克隆载体上，得到克隆载体-gmas；
对克隆载体-gmas进行扩增；
根据设计的酶切位点，将gmas基因片段从克隆载体-gmas上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体上，构建获得的重组载体即为γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。
本申请先将目的片段连接到克隆载体上，再酶切并与表达载体连接。此操作有主要两方面的原因：
进克隆载体比进表达载体容易很多，可以尽快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或者因为Taq酶的错配出现了碱基突变，会需要重复几次，样本即耗材都会大量消耗；
克隆载体的最大优点是它一般都有成熟的筛选系统，这样在一些连接效率较低、特异性不强的时候容易筛选。
如上所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法：
所述克隆载体为pUC57；
所述表达载体为pET-32a。
pET-32a便于原核表达，并且表达的蛋白具有tag，便于纯化。
一种茶氨酸基因工程菌，所述茶氨酸基因工程菌是由上述的质粒转化至大肠杆菌表达菌株中所得到。
优选的，所述大肠杆菌表达菌株为Transetta。
Transetta可补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
一种如上所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，包括如下步骤：
1)、将所述基因工程菌进行接种于含有所述工程菌所转入的所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB固体选择培养基上进行筛选培养，筛选出抗性菌株；
2)、将所述抗性菌株进行诱导培养，以诱导gmas基因表达；在所述培养过程中，用SDS-PAGE方法检测γ-谷氨酰甲胺合成酶的表达情况，检测合格后通过低温离心所述发酵培养基获得湿菌体；
3)、利用所述湿菌体在生物转化反应体系中进行催化底物生成L-茶氨酸。
优选的，在步骤1)中，所述筛选培养的培养条件为：
36～38℃恒温倒置培养12～16h。
优选的，在步骤2)中，所述诱导培养的具体培养过程为：
将步骤1)中筛选出的抗性菌株接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB液体培养基中，36～38℃，200～240rpm培养6～8h；随后将菌种接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的TB培养基中，当菌浓度培养至OD600为0.8～1.2时添加诱导剂，降温至22～30℃诱导15～20h。
IPTG是常用的外源基因诱导剂。用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候，需要诱导物进行诱导，但乳糖可以被细胞利用掉，所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动，但它不能被细胞利用掉，从而实现持续的表达。
优选的，如上所述茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，在所述的生物转化反应体系中：
催化底物反应液中包括：130～180mM谷氨酸钠、130～180mM乙胺盐酸盐、10～20mM六水氯化镁、3～8mM氯化锰、3～8mMATP；
培养温度为28～32℃，摇菌转速为100～300rpm，培养时间为35～45h。
其中，谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为反应的底物，ATP可为反应提供能量，而六水氯化镁及氯化锰一方面可调节渗透压，另一方面也可提供辅酶金属离子。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本申请所采用的γ-谷氨酰甲胺合成酶为通过对MethylovorusmaysNO.9来源的GenBankAccession号为AB333782.1的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因原始序列进行优化得来，该酶可将谷氨酸和乙胺催化生成L-茶氨酸，催化效率高，且底物性价比高，可有效降低成本。
2)、本申请将γ-谷氨酰甲胺合成酶的基因序列进行了改造，更适合大肠杆菌表达系统，表达效率更高。
3)、本申请所采用的基因工程菌易于培养，L-茶氨酸产量稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例5步骤3中重组质粒pET-32a-gmas酶切核酸电泳图；其中，M为Marker，1泳道为pET-32a质粒，2泳道为pET-32a-gmas质粒，3泳道为pET-32a-gmas质粒BamHI、HindIII双酶切；
图2为实施例5步骤3中重组质粒pET-32a-gmas的图谱；
图3为实施例5步骤4中重组蛋白GMAS的诱导表达SDS-PAGE检测图；其中M为蛋白Marker，D为阴性对照，T为总蛋白，S为可溶蛋白，P为不可溶蛋白。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，包括以下步骤：
1)、针对大肠杆菌表达系统对MethylovorusmaysNO.9来源的GenBankAccession号为AB333782.1的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因原始序列进行优化，将原始序列中的低频密码子转换为同义的大肠杆菌高频密码子，将原序列中的终止子替换成TAAT强终止子，在原序列两端添加上了限制性内切酶的酶切位点，得到优化的gmas基因序列；
2)、以优化的gmas基因序列为模板，合成碱基序列为SEQIDNO:1所示的gmas基因片段；
3)、将所述优化的gmas基因片段连接到原核表达载体上，得到γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。
实施例2
一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，包括以下步骤：
1)、针对大肠杆菌表达系统对MethylovorusmaysNO.9来源的GenBankAccession号为AB333782.1的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因原始序列进行优化，将原始序列中的低频密码子转换为同义的大肠杆菌高频密码子，将原序列中的终止子替换成TAAT强终止子，在原序列两端添加上了限制性内切酶的酶切位点，得到优化的gmas基因序列；
2)、以优化的gmas基因序列为模板，合成碱基序列为SEQIDNO:1所示的gmas基因片段；
3)、将所述的gmas基因片段连接到pUC57克隆载体上，得到pUC57-gmas；
对pUC57-gmas进行扩增；
将gmas基因片段从pUC57-gmas上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的pET-32a表达载体上，构建获得的重组载体即为γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。
实施例3
将实施例2中所述的质粒转化至大肠杆菌表达菌株Transetta中所得到茶氨酸基因工程菌。
一种上所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，包括如下步骤：
1)、将所述基因工程菌进行接种于含有所述工程菌所转入的所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB固体选择培养基上进行筛选培养，筛选出抗性菌株；
2)、将所述抗性菌株进行诱导培养，以诱导gmas基因表达；在所述培养过程中，用SDS-PAGE方法检测γ-谷氨酰甲胺合成酶的表达情况，检测合格后通过低温离心所述发酵培养基获得湿菌体；
3)、利用所述湿菌体在生物转化反应体系中进行催化底物生成L-茶氨酸。
催化底物反应液中包括：130mM谷氨酸钠、130mM乙胺盐酸盐、10mM六水氯化镁、3mM氯化锰、3mMATP；
培养温度为28～32℃，摇菌转速为100rpm，培养时间为35h。
实施例4
将实施例2中所述的质粒转化至大肠杆菌表达菌株Transetta中所得到茶氨酸基因工程菌。
一种上所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，包括如下步骤：
1)、将所述基因工程菌进行接种于含有所述工程菌所转入的所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB固体选择培养基上进行筛选培养，培养条件为36～38℃恒温倒置培养12～16h，筛选出抗性菌株；
2)、将步骤1)中筛选出的抗性菌株接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB液体培养基中，36～38℃，200～240rpm培养6～8h；随后将试管中的菌种接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的TB培养基中，当菌浓度培养至OD600为0.8～1.2时添加诱导剂，降温至22～30℃诱导15～20h，以诱导gmas基因表达；在所述培养过程中，用SDS-PAGE方法检测γ-谷氨酰甲胺合成酶的表达情况，检测合格后通过低温离心所述发酵培养基获得湿菌体；
3)、利用所述湿菌体在如下生物转化反应体系中进行催化底物生成L-茶氨酸：
催化底物反应液中包括：180mM谷氨酸钠、180mM乙胺盐酸盐、20mM六水氯化镁、8mM氯化锰、8mMATP；
培养温度为28～32℃，摇菌转速为300rpm，培养时间为45h。
实施例5
用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法
1、γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的密码子优化
根据嗜甲基菌属(MethylovorusmaysNO.9)的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因(GenBankAccession号AB333782.1)核苷酸序列，通过利用在线软件CodonJuggling(http://gladden.vbi.vt.edu/cgi-bin/gd/gdCodJug.cgi)优化γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的密码子，消除一些在大肠杆菌中低使用率的密码子，通过同义密码子间的转换保证所编码的蛋白质序列不变，来在大肠杆菌中更好的表达γ-谷氨酰甲胺合成酶。同时将原序列中的终止子替换成TAAT强终止子，并在序列两端添加上了限制性内切酶位点BamHΙ(GGATCC)和HindⅢ(AAGCTT)。
通过全基因合成(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，获得密码子优化后的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因核苷酸序列，合成的序列如SEQ1所示。
2、γ-谷氨酰甲胺合成酶基因表达载体的构建
先合成设计好的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因序列，γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的5’端序列带有BamHI(GGATCC)，而3’端带有HindⅢ(AAGCTT)。将合成的带有gmas基因的pUC57-gmas载体质粒和表达载体质粒pET-32a分别用BamHI和HindⅢ进行双酶切(限制性内切酶购自Takara公司)，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收gmas基因片段和pET-32a载体骨架，然后用T4DNA连接酶将gmas基因片段和pET-32a载体骨架连接起来。连接体系为10μL：
16℃连接过夜后。
3、重组大肠杆菌的构建
将10μL的连接产物转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中。
转化过程为：
取1管50μL的大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，置于冰上，待其融化后，向其中加入10μL的连接产物转，在冰上放置30min后，42℃热激90s，马上置于冰上2min后，在无菌环境下，涂布于Amp抗性LB固体平板上，37℃恒温培养箱倒置培养12h-16h，挑取单克隆菌落于5LB液体培养基(含Amp100μg/mL)，37℃，220rpm培养12h后，提取质粒进行酶切(如附图1所示)，将验证正确的单克隆菌液进一步进行测序验证，获得gmas基因序列完全正确的单克隆转化子，从而得到pET-32a-gmas重组质粒，重组质粒图谱如附图2。将pET-32a-gmas重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌Transetta(DE3)/pET-32a-gmas。
Amp抗性LB固体平板中含有：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，1.5％琼脂粉，氨苄青霉素100μg/mL。
4、重组大肠杆菌中gmas基因的诱导表达
用接种环挑一环重组大肠杆菌Transetta(DE3)/pET-32a-gmas甘油菌，在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上划线，37℃恒温倒置培养12～16h。挑取单菌落，接种于含5mLLB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)的试管中，37℃、220rpm培养6～8h。随后，将试管中的菌种接种(接种量为5％)于50mTB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中，当菌浓度培养至OD600为0.8～1.2时，开始添加适量的IPTG(异丙基-β-D-半乳糖苷)，降温至22～30℃诱导15～20h。SDS-PAGE检测GMAS蛋白的表达量及表达的形式，如附图3所示，GMAS蛋白大小为64.23kDa，主要以可溶蛋白和包涵体两种形式表达，其中可溶蛋白约占总蛋白的65％～70％。
LB液体培养基中含有(％)：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，pH7.0～7.2。
5、转化实验
将诱导培养的菌液在6000rpm，4℃离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。将收集的湿菌体投入到生物转化体系(转化体系：150mM谷氨酸钠，150mM乙胺盐酸盐，15mM六水氯化镁，5mM氯化锰和5mMATP)中，在30℃，200rpm条件下进行反应35～45h。然后取转化液经过沸水浴5～10min，使得酶蛋白变性失活，再经过高速离心去除酶蛋白，通过HPLC检测上清液中L-茶氨酸的浓度，结果显示重组大肠杆菌Transetta(DE3)/pET-32a-gmas经酶法转化L-茶氨酸的产量达到12.2g/L，转化率达到46.74％。
实验例
对实施例3、4、5的转化L-茶氨酸的产量、转化效率、生产周期、菌种使用时间进行统计：
由此可见，本申请所提供的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法，生产L-茶氨酸产量稳定，转化效率较高，且生产周期在本领域中相对较短，菌种效果稳定，可反复使用。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，其特征在于，所述表达质粒上的γ-谷氨酰甲胺合成酶的碱基序列为SEQIDNO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、针对大肠杆菌表达系统对MethylovorusmaysNO.9来源的GenBankAccession号为AB333782.1的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因原始序列进行优化，将原始序列中的低频密码子转换为同义的大肠杆菌高频密码子，将原序列中的终止子替换成TAAT强终止子，在原序列两端添加上了限制性内切酶的酶切位点，得到优化的gmas基因序列；
2)、以优化的gmas基因序列为模板，合成碱基序列为SEQIDNO:1所示的gmas基因片段；
3)、将所述优化的gmas基因片段连接到原核表达载体上，得到γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。
3.如权利要求2所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤3)的具体步骤为：
将所述的gmas基因片段连接到克隆载体上，得到克隆载体-gmas；
对克隆载体-gmas进行扩增；
将gmas基因片段从克隆载体-gmas上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体上，构建获得的重组载体即为γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。
4.如权利要求3所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，其特征在于：
所述克隆载体为pUC57；
所述表达载体为pET-32a。
5.一种茶氨酸基因工程菌，其特征在于，所述茶氨酸基因工程菌是由权利要求1所述的质粒转化至大肠杆菌表达菌株中所得到。
6.如权利要求5所述的茶氨酸基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌表达菌株为Transetta。
7.一种如权利要求5或6所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、将所述基因工程菌进行接种于含有所述工程菌所转入的所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB固体选择培养基上进行筛选培养，筛选出抗性菌株；
2)、将所述抗性菌株进行诱导培养，以诱导gmas基因表达；在所述培养过程中，用SDS-PAGE方法检测γ-谷氨酰甲胺合成酶的表达情况，检测合格后通过低温离心所述发酵培养基获得湿菌体；
3)、利用所述湿菌体在生物转化反应体系中进行催化底物生成L-茶氨酸。
8.如权利要求7所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述筛选培养的培养条件为：
36～38℃恒温倒置培养12～16h。
9.如权利要求7所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述诱导培养的具体培养过程为：
将步骤1)中筛选出的抗性菌株接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB液体培养基中，36～38℃，200～240rpm培养6～8h；随后将菌种接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的TB培养基中，当菌浓度培养至OD600为0.8～1.2时添加诱导剂，降温至22～30℃诱导15～20h。
10.如权利要求8所述茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，在所述的生物转化反应体系中：
催化底物反应液中包括：130～180mM谷氨酸钠、130～180mM乙胺盐酸盐、10～20mM六水氯化镁、3～8mM氯化锰、3～8mMATP；
培养温度为28～32℃，摇菌转速为100～300rpm，培养时间为35～45h。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109777763A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-05-21 | 天津科技大学 | 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用 |
| CN109777763B (zh) * | 2019-03-29 | 2020-06-30 | 天津科技大学 | 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用 |
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