CN116904454A - 一种启动子及其在上调目的基因的转录表达上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种启动子及其在上调目的基因的转录表达上的应用。本发明的启动子具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。该启动子与已知的强启动子相比，具有更高的表达活性。可通过将其可操作地连接到目的基因的上游区域，实现对目的基因的转录表达上调，表达水平优于其天然启动子的作用，从而可提升相应功能。将该启动子应用于调控赖氨酸的代谢路径，具有明显的改善效果。

Description

一种启动子及其在上调目的基因的转录表达上的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种启动子及其在上调目的基因的转录表达上的应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及其他有机酸。
谷氨酸棒杆菌用于生产氨基酸的历史可追溯到20世纪60年代，谷氨酸棒杆菌可以在自然环境下生产谷氨酸，诱变的谷氨酸棒杆菌还可以生产赖氨酸、缬氨酸等多种氨基酸。随着代谢工程技术和基因组测序技术的快速发展，对谷氨酸棒杆菌的代谢路径研究越来越清晰，研究者们陆续鉴定到很多遗传学上的高产机理，并实现了多种代谢产物的高效生产。
对于氨基酸的高效生产，可通过很多途径来实现，比如解除产物的反馈抑制，强化末端合成途径的关键酶，强化辅因子供应，优化中央代谢的碳流分配，及阻断竞争支路等。对于基因的强化表达，传统的策略有引入基因的多个拷贝，或用已知的强启动子替换目的基因的天然启动子。通用的谷棒内源强启动子有编码超氧化物歧化酶基因的启动子，和编码延伸因子的启动子。然而，这些通用启动子由于数量有限，表达强度固定，远远不能满足基因工程技术研发人员对启动子的需求。此外，启动子的表达强度，除了与核心区的碱基序列有关，其上下游的碱基序列及长度，对基因的表达也有显著的影响，这与基因的复杂调控机理有关。因此，不断开发新的启动子，应用于特定代谢路径的特定基因的表达调控是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型启动子，该启动子核酸序列通过可操作地连接到目标基因上，进而上调目标基因的转录表达，从而提升相应功能。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种启动子，其具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种新型启动子，其能上调目标基因的转录表达，当将其可操作地连接到赖氨酸合成相关基因上，可促进赖氨酸的高效生产。
本发明所述的启动子是指位于编码区上游的非翻译核酸序列，该序列至少包含RNA聚合酶结合位点，并且具有启动下游基因转录成mRNA的活性。该序列中还常常包括一段5’非翻译区，该区域是某些转录因子或调控因子的结合区域。
第二方面，本发明提供一种表达载体，其包括上述启动子。
第三方面，本发明提供一种DNA分子，其包括编码赖氨酸外运蛋白的基因和连接于所述基因的上游区域的启动子，和/或，编码丙酮酸羧化酶的基因和连接于所述基因的上游区域的启动子；所述启动子如上所述。
第四方面，本发明提供上述启动子或表达载体或DNA分子在以下一个或多个方面上的应用：
(1)上调目的基因的转录表达，优选所述目的基因为赖氨酸合成相关基因；
(2)提高微生物的氨基酸产量，优选所述氨基酸为赖氨酸；
(3)提高微生物的糖酸转化率。
第五方面，本发明提供一种重组微生物，其包括上述启动子或表达载体或DNA分子。
本发明的重组微生物，其出发菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
第六方面，本发明提供一种制备上述重组微生物的方法，其包括：将上述启动子或表达载体引入宿主细胞中的步骤，优选，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
第七方面，本发明提供上述重组微生物在生产氨基酸中的应用，优选所述氨基酸为赖氨酸。
第八方面，本发明提供一种提高微生物赖氨酸产量和/或糖酸转化率的方法，具体将编码赖氨酸外运蛋白的基因和/或丙酮酸羧化酶的基因处于上述启动子的控制之下。
第九方面，本发明提供一种生产赖氨酸的方法，其包括对上述重组微生物进行发酵培养的步骤。
本发明具体以一株赖氨酸生产菌CGMCC No.11942为实施对象，用该新型启动子替换赖氨酸外运蛋白编码基因的天然启动子，改造后的菌株具有更高效的赖氨酸外运能力。为了进一步验证该启动子的效果，本发明继续以另外一株赖氨酸生产菌CGMCC No.13407为实施对象，用该新型启动子异位表达丙酮酸羧化酶，后者是赖氨酸合成相关的重要基因，改造后的菌株具有显著的转化率提升效果。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种新型的人工合成启动子。该启动子与已知的强启动子相比，具有更高的表达活性。可通过将上述新型启动子核酸序列可操作地连接到目的基因的上游区域，实现对目的基因的转录表达上调，表达水平优于其天然启动子的作用，从而可提升相应功能。将该启动子应用于调控赖氨酸的代谢路径，具有明显的改善效果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明的新型启动子为人工合成启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。人工启动子序列可通过基因合成公司进行全序列合成。对于人工启动子的PCR扩增和测序鉴定可通过引物Psp1-f和Psp1-r来实现。
本发明中以2株产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌作为出发菌株，利用基因工程技术引入人工启动子序列，用于目的基因的上调表达。以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示：
表1引物序列信息
本发明实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
本发明中lysE：赖氨酸外运蛋白编码基因，pyc：丙酮酸羧化酶编码基因，sod：超氧化物歧化酶基因，tuf：延伸因子。
实施例1绿色荧光蛋白作为报告基因表征启动子活性
1、构建含有绿色荧光蛋白报告基因的表达质粒
以pEF-GFP质粒(上海科雷生物科技有限公司，中国)为模板，以GFP-f/GFP-r引物对进行PCR扩增，该PCR产物包含GFP基因的开放阅读框(ORF)。将人工启动子Psp1的序列SEQID NO：17通过融合PCR技术，可操作地连接至GFP基因的前面。将融合的含有人工启动子序列和GFP基因的PCR产物用限制性内切酶SacI、EcoRI进行双酶切。并用同样的限制性内切酶双酶切表达载体pEKEx2(GenBank:AY585307.1；中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)。两种双酶切产物分别进行纯化，并以T4 DNA连接酶进行连接，获得重组质粒pEKEx2-Psp1-GFP。
用同样的方法构建其他2种强启动子表达GFP报告基因的表达质粒，2种强启动子分别是超氧化物歧化酶基因的启动子Psod(sod基因编码超氧化物歧化酶，其在GenBank的编号为NCg12826)，和延伸因子的启动子Ptuf(tuf基因编码延伸因子，其在GenBank的编号为NCgl0480)。
本实施例中超氧化物歧化酶基因的启动子的序列通过引物Psod-f和Psod-r进行PCR扩增获得，扩增模板为ATCC 13032基因组。延伸因子的启动子的序列通过引物Ptuf-f和Ptuf-r进行PCR扩增获得，扩增模板为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组(NCBI ReferenceSequence:NC_003450.3)。以上2个启动子的序列也可通过基因合成公司进行全序列合成。获得的重组质粒分别命名为pEKEx2-Psod-GFP和pEKEx2-Ptuf-GFP。
2、构建含有绿色荧光蛋白报告基因的表达菌株
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032的感受态细胞。并分别将3种表达质粒pEKEx2-Psp1-GFP、pEKEx2-Psod-GFP和pEKEx2-Ptuf-GFP以电穿孔的方法转化至上述谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞中，并在含有15-25mg/L卡那霉素抗性的BHI选择培养基上筛选目的转化子。
通过PCR扩增目标序列和核苷酸测序分析，确认获得3种目标重组菌株，即ATCC13032/Psp1-GFP、ATCC 13032/Psod-GFP和ATCC 13032/Ptuf-GFP。
3种目标重组菌株的PCR扩增和核酸测序的引物分别为Psp1-f和GFP-r、Psod-f和GFP-r、Ptuf-f和GFP-r。
3、绿色荧光蛋白表征启动子活性
在BHI固体培养基上划线培养3种重组菌ATCC 13032/Psp1-GFP、ATCC 13032/Psod-GFP和ATCC 13032/Ptuf-GFP，33℃培养18-20h。之后分别挑取1环培养物接种至装有10mL BHI液体培养基的50mL三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养15h。将获得的种子液取1mL接种至装有30mL BHI液体培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min培养至对数生长期(约4-6h)。离心收集菌体，用PBS缓冲液清洗三次，并稀释到合适的梯度，维持菌体悬浮液OD562稀释到1。取200ul菌体悬浮液至96孔板，使用多功能酶标仪检测荧光强度(激发波长484nm，发射波长507nm),荧光强度值(RFU/OD562)为样品荧光强度/细胞密度，测定的荧光强度值如表2所示。
表2 GFP荧光强度检测
菌株 荧光强度值(RFU/OD562)
ATCC 13032/Psp1-GFP 6200
ATCC 13032/Psod-GFP 3900
ATCC 13032/Ptuf-GFP 2800
如上表2所示，在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，利用Psp1人工启动子表达的荧光强度高于标准强启动子表达的荧光强度，说明启动子Psp1比已知的强启动子Psod、Ptuf具有更高的表达活性。因此，初步判断人工启动子Psp1可以作为可选择的强启动子使用。后续实施例用该启动子表达谷氨酸棒杆菌中的特定基因。
实施例2新型启动子用于强化表达赖氨酸外运蛋白
1、构建pK18mobsacB-Psp1-lysE工程质粒
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以lysE-1f/lysE-1r和lysE-2f/lysE-2r引物对进行PCR扩增，分别得到上、下游同源臂片段lysE-up和lysE-dn；将上、下游同源臂片段和Psp1进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。片段用BamHI、SphI进行双酶切，载体pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒，命名为pK18mobsacB-Psp1-lysE。
2、构建Psp1-lysE工程菌株
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)的方法制备CGMCC No.11942的感受态细胞及进行基因重组。以电穿孔的方法将重组质粒pK18mobsacB-Psp1-lysE转化至CGMCC No.11942感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列(以Psp1-f、Psp1-r为引物进行扩增，PCR扩增以普通DNA聚合酶Taq进行扩增，PCR条件按说明书提示进行即可)和核苷酸测序分析，获得3株在lysE基因前引入人工启动子Psp1的菌株，分别命名为11942-Psp1-lysE-1、11942-Psp1-lysE-2、11942-Psp1-lysE-3。
保藏编号为CGMCC No.11942的材料已在中国专利公布号CN105734004中公开，具体信息为：生物材料MHZ-0912-6，分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11942。
实施例3新型启动子用于强化表达丙酮酸羧化酶
为了进一步验证该启动子的效果，本实施例继续以另外一株赖氨酸生产菌CGMCCNo.13407为实施对象，用该新型启动子异位表达丙酮酸羧化酶，后者是赖氨酸合成相关的重要基因，改造后的菌株具有显著的转化率提升效果。
保藏编号为CGMCC No.13407的材料已在中国专利号CN106635944中公开，具体信息为：生物材料MHZ-0913-3，分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13407。
1、构建pK18mobsacB-Psp1-pyc工程质粒
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以pyc-1f/pyc-1r和pyc-2f/pyc-2r引物对进行PCR扩增，分别得到上、下游同源臂片段pyc-up和pyc-dn；将上、下游同源臂片段和Psp1进行融合PCR，获得3片段融合的全长片段。片段用BamHI、SphI进行双酶切，载体pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒，命名为pK18mobsacB-Psp1-pyc。
2、构建Psp1-pyc工程菌株
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)的方法制备CGMCC No.13407的感受态细胞及进行基因重组。以电穿孔的方法将重组质粒pK18mobsacB-Psp1-pyc转化至CGMCC No.13407感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列(以Psp1-f、Psp1-r为引物进行扩增，PCR扩增以普通DNA聚合酶Taq进行扩增，PCR条件按说明书提示进行即可)和核苷酸测序分析，获得3株在pyc基因前引入人工启动子Psp1的菌株，分别命名为13407-Psp1-pyc-1、13407-Psp1-pyc-2、13407-Psp1-pyc-3。
实施例4摇瓶测试工程菌的赖氨酸发酵能力
赖氨酸发酵实验使用的培养基如下：
平板活化培养基：BHI 37g/L，18g/L琼脂粉。
种子培养基：蔗糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，尿素5g/L，七水硫酸镁0.4g/L，调节pH至7.0。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，硫酸铵25g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，七水硫酸镁1.0g/L，豆粕水解液10g/L，碳酸钙30g/L，调节pH至7.0。
发酵方法：
1、种子活化：从冻存管中取待验证菌株，在种子活化培养基上划线培养，33℃培养24h；
2、种子培养：挑取平板活化种子1环接至装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养6h；
3、发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养14-15h，每株菌做三个平行。
4、OD562测定：将发酵液用0.01M稀盐酸稀释100倍，使用分光光度计在波长562nm处检测吸光值。每株菌做三个平行，计算平均值，表格中的数据为3个平行检测的平均值。
5、赖氨酸浓度测定：取2mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测重组菌与对照菌发酵液中的L-赖氨酸含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的赖氨酸浓度如表3所示。
表3重组菌株的赖氨酸产量和糖酸转化率检测
本发明测试2种改造菌的各3株菌株，改造菌的指标均显著高于对照组，且同一种改造菌的不同株的表型一致。
综上所述，本发明人工启动子序列无论是用于改造外运蛋白还是用于改造丙酮酸羧化酶，相应重组菌株的产酸和转化率都有显著提升。该结果表明，本发明的人工启动子具有比较高的表达活性，能够提高基因的表达水平，具有一定的普适性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 冯波
<120> 一种启动子及其在上调目的基因的转录表达上的应用
<130> KHP211121311.3
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagctcatg gtgagcaagg gcgagga 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaattctta cttgtacagc tcgtcca 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgcagtag ctgccaatta ttccggg 27
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgtcgacgg gtaaaaaatc ctttcgta 28
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tagatatctt gaaatcggct ttcaac 26
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtatgtcct cctggacttc gtgg 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gattagcttc acgggttacc gctcct 26
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccccccagga tctaaccccg ccccagtcgt gacctatgga agtacttaag taaaatg 57
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttggcggtc tcttgttgaa aggaataatt actctaatgg tgatcatgga aatcttcat 59
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccgaaaccc accagcggga accagatcag 30
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actggggcgg ggttagatcc tgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tagagtaatt attcctttca aca 23
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgtgtacgc agcaggtgac tgtactgacc 30
<210> 14
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccacctgcag acatcttacc tcttaaaata tttctaaact ttgcaaactt tgcac 55
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttgttgaaa ggaataatta ctctagtgtc gactcacaca tcttcaacgc ttccagc 57
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcataccgc gtccgccacc accggc 26
<210> 17
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
actggggcgg ggttagatcc tggggggttt atttcattca ctttggcttg aagtcgtgca 60
ggtcagggga gtgttgcccg aaaacattga gaggaaaaca aaaaccgatg tttgattggg 120
ggaatcgtgt ggtatgatgg taggacgcaa cagctgctac tgtccttggc ggtctcttgt 180
tgaaaggaat aattactcta 200

Claims (10)

1.一种启动子，其特征在于，具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
2.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的启动子。
3.一种DNA分子，其特征在于，包括编码赖氨酸外运蛋白的基因和连接于所述基因的上游区域的启动子，和/或，编码丙酮酸羧化酶的基因和连接于所述基因的上游区域的启动子；所述启动子如权利要求1所述。
4.权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达载体或权利要求3所述的DNA分子在以下一个或多个方面上的应用：
(1)上调目的基因的转录表达，优选所述目的基因为赖氨酸合成相关基因；
(2)提高微生物的氨基酸产量，优选所述氨基酸为赖氨酸；
(3)提高微生物的糖酸转化率。
5.一种重组微生物，其特征在于，包括权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达载体或权利要求3所述的DNA分子。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
7.一种制备权利要求5或6所述的重组微生物的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的表达载体引入宿主细胞中的步骤，优选，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
8.权利要求5或6所述的重组微生物在生产氨基酸中的应用，优选所述氨基酸为赖氨酸。
9.一种提高微生物赖氨酸产量和/或糖酸转化率的方法，其特征在于，将编码赖氨酸外运蛋白的基因和/或丙酮酸羧化酶的基因处于权利要求1所述的启动子的控制之下。
10.一种生产赖氨酸的方法，其特征在于，包括对权利要求5或6所述的重组微生物进行发酵培养的步骤。
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