JP7267441B2 - Ｌ－チロシンを生産する微生物及びこれを用いたｌ－チロシンの生産方法 - Google Patents

Ｌ－チロシンを生産する微生物及びこれを用いたｌ－チロシンの生産方法 Download PDF

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Description

KCCM KCCM12487P
本出願は、ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を含むＬ－チロシンを生産する微生物、及び前記微生物を用いたＬ－チロシンを生産する方法に関する。
Ｌ－チロシンは、アミノ酸の一つであり、薬品の原料や食品添加物、動物飼料、栄養剤などの重要素材として使用される。前記Ｌ－チロシン及びその他の有用物質を生産するために、高効率生産の微生物及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われている。
微生物のＬ－チロシン生産過程は、５炭糖回路の中間物質であるＥ４Ｐ（Erythrose-4-Phosphate）と解糖過程（glycolysis）の中間物質であるＰＥＰ（Phosphoenolpyruvate）が重合反応して生成されたＤＡＨＰ（3-Deoxy-D-arobino-heptulosonate-7-phosphate）から始まる。以後ＤＡＨＰは、芳香族共通の生合成経路を経てコリスミ酸（chorismate）からプレフェン酸（prephenate）を経て、Ｌ－チロシン生合成経路を介して、最終的にＬ－チロシンに転換される。この過程で、コリスミ酸はＬ－トリプトファンに、プレペン酸はＬ－チロシンまたはＬ－フェニルアラニンに分岐されうる。したがって、Ｌ－チロシン生産量を増やすために芳香族共通の生合成経路を強化する場合にＬ－トリプトファンとＬ－フェニルアラニンの生産も同時に増えると予想されうる。つまり、Ｌ－チロシンを生産しようとする場合、副産物としてフェニルアラニンとトリプトファンが一緒に生産されるため、遺伝子組み換え及び精製などの様々な研究が伴わなければならない。一方、Ｌ－トリプトファンは、微生物が生産するＬ－トリプトファンの濃度に応じてリプレッサー（repressor）とアッテネーター（attenuator）がこの生産を同時に調節することが知られている（特許文献１）。
韓国登録特許１０－０７９２０９５ Ｂ１ 韓国特許登録第１０－０９２４０６５号 韓国特許登録第１０－０６２００９２号
Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993) Methods Enzymol., 183, 63, 1990 Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008 DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007) Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-762 (1997) Appl Environ Microbiol 59 791, 1993 Nature biotechnol 14 620, 1996
本発明者らは、Ｌ－チロシンを高効率で生産することができる微生物を開発するために鋭意研究した結果、Ｌ－フェニルアラニンの生産遺伝子がＬ－トリプトファン生産オペロンのプロモーターにより調節される場合、Ｌ－チロシンの生産収率が高いレベルに増加するという事実を確認して、本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含む、Ｌ－チロシンを生産する微生物を提供することにある。
本出願の他の目的は、前記微生物を培地で培養する段階；及び培養された微生物または培地からＬ－チロシンを回収する段階を含むものである、Ｌ－チロシンの生産方法を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含む発現カセットを提供することにある。
本出願のまた他の目的は、ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を用いて、プレフェン酸デヒドラターゼの活性を調節する方法を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、Ｌ－チロシンを生産するための、前記Ｌ－チロシンを生産する微生物の用途を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、Ｌ－チロシンを生産するための、前記発現カセットの用途を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、Ｌ－チロシンを生産するための、組成物の用途を提供することにある。
本出願のプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びｔｒｐオペロンの調節領域を含むＬ－チロシンを生産する微生物は、菌体の成長に支障がなく、Ｌ－フェニルアラニン（L-phenylalanine）の蓄積を最小限に抑え、Ｌ－チロシンを高効率で生産することができる。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
前記のような目的を達成するために、本出願の一つの態様は、ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含む、Ｌ－チロシンを生産する微生物を提供する。
本出願の用語、「Ｌ－チロシン（L-Tyrosine）」は、２０個のα-アミノ酸中の一つであり、親水性アミノ酸または芳香族アミノ酸に分類される。チロシンは、医薬品やフラボノイド、アルカノイドなどの前駆体として使用される商業的に重要なアミノ酸である。
本出願の用語、「トリプトファンオペロン（tryptophan operon；Trp operon）」は、コリスミ酸（chorismic acid; chorismate）からトリプトファンを合成するのに関与する酵素を暗号化している遺伝子群であって、構造遺伝子（Structure Gene）及び発現調節領域（または調節領域、regulatory region）を含む。具体的には、トリプトファンオペロンはコリネバクテリウム属微生物由来のトリプトファンオペロン、またはエシェリキア属微生物由来のトリプトファンオペロンであってもよいが、本出願のｐｈｅＡ遺伝子を調節することができる限り、制限なく様々な由来のトリプトファンオペロンを含んでもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよく、エシェリキア属微生物は大腸菌であってもよいが、これに制限されない。また、前記トリプトファンオペロンは、公知のヌクレオチド配列を有してもよく、当業者は、ＮＣＢＩまたはＫｅｇｇなどのデータベースを介してトリプトファンオペロンのヌクレオチド配列を容易に得ることができる。通常のトリプトファンオペロンは、細胞が要求する十分な量のトリプトファンを生産できるように活発に転写するが、細胞内トリプトファンが十分に存在する場合に、抑制因子（repressor）がトリプトファンと結合してトリプトファンオペロンが不活性化されるため、転写が抑制される。本出願で、前記用語はトリプトファンオペロン、ｔｒｐオペロンなどと混在して用いられてもよい。
本出願において用語、「ｔｒｐオペロン調節領域」は、ｔｒｐオペロンを構成する構造遺伝子の上流に存在し、構造遺伝子の発現を調節することができる部位を意味する。コリネバクテリウム属微生物におけるｔｒｐオペロンを構成する構造遺伝子は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ遺伝子で構成されていてもよく、エシェリキア属微生物におけるｔｒｐオペロンを構成する構造遺伝子は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ遺伝子で構成されていてもよい。前記ｔｒｐオペロン調節領域は、ｔｒｐオペロン構造遺伝子の５’位置にあるｔｒｐＥの上流に存在するものであってもよい。具体的には、ｔｒｐオペロンを構成しうる構造遺伝子を除いたｔｒｐレギュレーター（trp regulator；ｔｒｐＲ）、プロモーター（trp promoter）、オペレーター（trp operator）、ｔｒｐリーダーペプチド（trp leader peptide；ｔｒｐＬ）及びｔｒｐ減衰因子（ｔｒｐ attenuator）を含むものであってもよい。より具体的には、プロモーター（trp promoter）、オペレーター（trp operator）、ｔｒｐリーダーペプチド（trp leader peptide；ｔｒｐＬ）及びｔｒｐ減衰因子（trp attenuator）を含むものであってもよい。本出願では、プレフェン酸デヒドラターゼをコードするｐｈｅＡ遺伝子の上流（Upstream）に位置して、ｐｈｅＡ遺伝子の発現を調節することができるｔｒｐオペロンに存在する調節領域であれば制限なく含まれる。本出願で、前記ｔｒｐオペロンの調節領域は、ｔｒｐオペロンの調節因子、ｔｒｐＥプロモーター、ｔｒｐオペロンプロモーター、ｔｒｐＥ調節領域、ｔｒｐＥ調節因子及びｔｒｐＥ調節配列と混用して使用されてもよい。
例えば、前記ｔｒｐオペロンの調節領域は、配列番号１の塩基配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。前記配列番号１の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋからその配列を確認することができる。
具体的には、前記調節領域は、配列番号１及び／または前記配列番号１と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性（homology）または同一性（identity）を有する塩基配列であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記制御領域に相応する機能を示す塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加された塩基配列を有する発現調節配列も、本出願の範囲内に含まれるのは自明である。
本出願において、用語、「相同性（homology）」及び「同一性（identity）」は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と互いに関連された程度を意味し、パーセンテージで示されてもよい。用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は標準配列アルゴリズムによって決定されるし、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）または同一な（identical）配列は、中間または高い厳しい条件（stringent conditions）で一般的に配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化は、ポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における相同性または同一性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：非特許文献１］、またはPearsonによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献２）を用いて決定できる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されていた (www.ncbi.nlm.nih.gov)。また、任意のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験により配列を比較することによって確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法により決定されてもよい（例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology）。
本出願の用語、「プレフェン酸デヒドラターゼ（prephenate dehydratase）」は、Ｌ－フェニルアラニンを生合成するのに必要なタンパク質の一つである。前記タンパク質をコードする遺伝子は、その例としてｐｈｅＡ遺伝子であってもよいが、これに制限されない。前記タンパク質は、二重作用性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（Bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase）でも命名されうる。前記プレフェン酸デヒドラターゼは、コリスミ酸（chorismate）またはプレフェン酸（prephenate）からＬ－フェニルアラニンを生産する経路の酵素であり、チロシン生合成経路と競合する段階にある酵素であるため、一般的には、チロシン生産菌株を製作するのにおいて不活性化させるための対象遺伝子として選定される。しかし、これを不活性化する場合、菌株の生長に影響を及ぼし、生産性が大幅に低下する問題がある。
本出願において、前記ｐｈｅＡ遺伝子がｔｒｐオペロン調節領域によって調節されるように遺伝的に変形した微生物は、具体的には、ｔｒｐオペロンの調節領域をｐｈｅＡの調節のためのプロモーター部位に適用した微生物は、菌体の成長に影響がなく、 フェニルアラニン（phenylalanine）の蓄積を最小限に抑え、チロシン生産を向上させるのに効果がある。
また、前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であるｐｈｅＡ遺伝子はｐｈｅＡ構造遺伝子の上流に存在する調節配列の一部または全体が欠失したものであってもよく、本出願の目的上ｐｈｅＡ構造遺伝子の上流の位置がｔｒｐオペロン調節領域に置換、またはｐｈｅＡ構造遺伝子の上流の位置にｔｒｐオペロンの調節領域が挿入されてｔｒｐオペロン調節領域によってｐｈｅＡによりコードされるタンパク質の発現により調節されうるｐｈｅＡ構造遺伝子を含むものであってもよい。本出願で「ｐｈｅＡ遺伝子」は、「プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子」及び「ｐｈｅＡ構造遺伝子」と混用して使用されてもよい。
本出願で使用される用語、「Ｌ－チロシンを生産する微生物」とは、自然にＬ－チロシンの生産能を有している微生物またはＬ－チロシンの生産能のない親菌株にＬ－チロシンの生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含む、Ｌ－チロシンを生産する微生物であってもよいが、これに制限されない。
具体的には、「Ｌ－チロシンを生産する微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含んでおり、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されているなどの原因で特定の機序が弱化されたり強化された微生物であって、目的とするＬ－チロシン生産のために遺伝的変異が起きたり、活性を強化させた微生物であってもよい。本出願の目的上、前記Ｌ－チロシンを生産する微生物は、前記ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含み、目的とするＬ－チロシン生産能が増加されたことを特徴とし、遺伝的に変形された微生物または組み換え微生物であってもよいが、これに制限されない。
より具体的には、本出願でＬ－チロシン生産能を有する微生物とは、本出願のｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含むか、または前記ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換され、向上されたＬ－チロシン生産能を有するようになった組み換え微生物を意味する。
本出願において、「遺伝子を含む微生物」は「遺伝的に変形された微生物」、「遺伝子を発現するように変形された微生物」、「遺伝子を発現する組み換え微生物」、または「遺伝子がコードするタンパク質の活性を有する組み換え微生物」を意味するが、これに制限されない。
その例として、ｉ）本出願のｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含むか、ｉｉ）ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を発現するように変形されるか、ｉｉｉ）ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を発現する組み換え微生物、ｉｖ）ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されて向上されたＬ－チロシン生産能を有するようになった組み換え微生物を意味してもよいが、これに制限されない。
前記「向上されたＬ－チロシン生産能を有するようになった微生物」は、形質変化前の親菌株または非変形微生物よりＬ－チロシン生産能が向上された微生物を意味する。前記「非変形微生物」は、天然型菌株それ自体であるか、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
本出願の目的上、前記微生物は前記ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含みＬ－チロシンを生産することができる微生物であればいずれも可能である。本出願において、前記「Ｌ－チロシンを生産することができる微生物」は、「Ｌ－チロシンを生産する微生物」、「Ｌ－チロシンの生産能を有する微生物」と混用して使用することができる。
前記微生物は、例えば、エンテロバクター（Enterbacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。
具体的には、前記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよい。本出願において、「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）などであるが、これに限定されるものではない。
本出願のもう一つの態様は、前記微生物を培地で培養する段階及び培養された微生物または培地からＬ－チロシンを回収する段階を含むものである、Ｌ－チロシンを生産する方法を提供する。
前記の方法において、前記微生物を培養する段階は特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的には、ｐＨ６～８、最も具体的には、ｐＨ７．０）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０～４５℃、具体的には、２５～４０℃を維持してもよく、約１０～１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたアミノ酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
本出願の前記培養段階で生産されたアミノ酸を回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集（collect）してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とするアミノ酸を回収してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行われてもよい。したがって、前記の回収されるアミノ酸は、精製された形態またはアミノ酸を含有した微生物発酵液であってもよい（非特許文献３）。また、前記培養段階の前後、前記回収段階の前後に当該分野で公知の適合な方法を追加して、目的アミノ酸の回収を効率的に行われることができる。
本出願の他の一つの態様は、前記ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含む発現カセットを提供する。
本発明において、用語、「発現カセット」は、個体の細胞内に存在する場合、導入された遺伝子が発現されるように、前記遺伝子に作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物の単位体であってもよい。前記発現カセットは、例えば発現ベクターの形態であってもよいが、これに制限されず、導入される目的の遺伝子が発現されるように機能することができる最小単位の遺伝子作製物はすべて含まれてもよい。
前記発現カセットは標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて製造及び精製されてもよい。前記発現カセットの種類は原核細胞及び真核細胞の各種宿主細胞から目的の遺伝子を発現し、目的のタンパク質を生産する機能をする限り、特に限定されない。発現カセットは、プロモーター、開始コドン、目的タンパク質をコードする遺伝子、または終結コドンを含んでもよく、その他にシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、目的遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域、または複製可能単位などを適宜含んでもよい。併せて、前記発現カセットは一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むモノシストロン（mono-cistronic）ベクター、２つ以上の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリシストロン（poly-cistronic）ベクターを含んでもよいが、これに制限されない。
本出願で用いられた用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的タンパク質を発現させるように適合した調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関に複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で発現可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組み換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
本出願で使用可能なベクターは特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。また、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドを挿入させてもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組み換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体内への挿入を確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーはベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的ポリヌクレオチドが挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存したり他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願において用語、「形質転換」は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含みうる。また、前記ポリヌクレオチドは標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記形質転換する方法は核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれており、宿主細胞に応じて当分野で公知のように適合した標準的な技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（CaPO4）沈殿、塩化カルシウム（CaCl2）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（PEG）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
また、前記において用語、「作動可能に連結された」というのは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列または調節領域と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能に連結は当業界の公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造してもよく、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
本出願の他の一つの態様は、前記ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含む、Ｌ－チロシン生産用組成物を提供する。
前記Ｌ－チロシン生産用組成物は、前記ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含み、さらに前記遺伝子またはオペロン調節領域を動作させうる構成を制限なく含みうる。前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びｔｒｐオペロン調節領域は、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させるように、ベクター内に含まれた形態であってもよい。前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であるｐｈｅＡ遺伝子の発現は、ｔｒｐオペロン発現調節領域により調節されるものであってもよい。
本出願の他の一つの態様は、前記ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を用いて、プレフェン酸デヒドラターゼの活性を調節する方法を提供する。
本出願のもう一つの様態として、Ｌ－チロシンを生産するための、前記Ｌ－チロシンを生産する微生物の用途を提供する。
本出願のもう一つの様態として、Ｌ－チロシンを生産するための、前記発現カセットの用途を提供する。
本出願のもう一つの様態として、Ｌ－チロシンを生産するための、組成物の用途を提供する。
以下、本出願の実施例に通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例１：Ｌ－チロシン生産菌株の製作
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムはＬ－チロシンを生産する能力はあるが、培養液に排出するほど過量生産してはいない。本出願の目的に応じてＬ－チロシン生産能を増加させる遺伝形質を確認するために、野生型菌株よりＬ－チロシン生産能が増加された菌株を活用した。したがって、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３８６９菌株にＬ－チロシンを生産するのに必要な遺伝子を強化してＬ－チロシン生産菌株を製作した。
まず、Ｌ－チロシンの前駆体としてＥ４Ｐ（Erythrose-4-Phosphate）の円滑な供給のためにｔｋｔ遺伝子の過発現を行った。これと同時にＬ－チロシンを細胞内に流入する芳香族アミノ酸の流入遺伝子であるａｒｏＰの欠損を行った。
前記遺伝子操作のために、まずｔｋｔ遺伝子を代替挿入するａｒｏＰ下流（Downstream）と上流（Upsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２と配列番号３のプライマーを用いてａｒｏＰ下流（Downstream）領域、配列番号４と配列番号５のプライマーを用いて上流（Upsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
また、ｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子を確保するためにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６と配列番号７のプライマーを用いてｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１５０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅されたａｒｏＰプロモーター上流と下流領域、ｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子断片、そしてＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺ（特許文献２）は、ギブソンアセンブリ（非特許文献４）方法を利用してクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得しており、ｐＤＺ－ΔａｒｏＰ：： Ｐｎ－ｔｋｔと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
前記それぞれのベクターを製作するために用いたプライマー配列は下記表１に示した通りである。

Figure 0007267441000001
製作されたｐＤＺ－ΔａｒｏＰ：： Ｐｎ－ｔｋｔベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株に電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程を経てａｒｏＰ遺伝子を欠損すると同時にｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子が挿入された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号８と配列番号９のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングを介して当該遺伝的操作を確認し、ＣＭ０６－０００１と命名した。

Figure 0007267441000002
Ｌ－チロシン経路を強化するために、既存のコリネバクテリウム・グルタミカムが有しているＬ－チロシンによるフィードバック調節を受けるｔｙｒＡ遺伝子を、強いプロモーターであるｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来のフィードバック調節を受けない変異型ｔｙｒＡに交替した。大腸菌由来ｔｙｒＡタンパク質は５３番のメチオニン（Methionine）がイソロイシン（Isoleucine）に、３５４番のアラニン（Alanine）がバリン（Valine）に変異するとフィードバックが解除されることが知られており、この形態（配列番号１０）を使用した（非特許文献５）。
前記遺伝子操作のために、まずｔｙｒＡ遺伝子を交替挿入するｔｙｒＡ上流（Upstream）と下流（Downsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いてｔｙｒＡ上流（Upstream）領域、配列番号１３と配列番号１４のプライマーを用いて下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
また、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ遺伝子を確保するためにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３８６９染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５と配列番号１６のプライマーを用いてｇａｐＡプロモーター断片をＰＣＲ実行を介して収得し、大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７と配列番号１８のプライマーを用いて大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。
重合酵素はＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅されたｔｙｒＡ上流と下流領域、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ遺伝子断片、そしてＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得しており、ｐＤＺ－ΔｔｙｒＡ：： ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
前記それぞれのベクターを製作するために使用したプライマー配列は表３に示した通りである。

Figure 0007267441000003
製作されたｐＤＺ－ΔｔｙｒＡ：： ＰｇａｐＡ－ｔｙｒＡｍベクターをＣＭ０６－０００１菌株に電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程を経てｔｙｒＡ遺伝子を欠損すると同時に、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来の変異ｔｙｒＡ遺伝子が挿入された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号１９と配列番号２０のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングを介して、当該遺伝的操作を確認し、ＣＭ０６－０００２と命名した。

Figure 0007267441000004
Ｌ－チロシン生産を増加させるために、芳香族共通の生合成経路の最初の段階であるａｒｏＧ遺伝子を大腸菌由来のフィードバック調節解除変異型ａｒｏＧに強いプロモーターを追加して強化した。大腸菌由来のａｒｏＧタンパク質は、１５０番のプロリン（Proline）がロイシン（Leucine）に置換される場合、フィードバックが解除されることが知られており、この形態（配列番号６８）を使用した（非特許文献６）
これらの遺伝子操作のために、まずａｒｏＧ遺伝子を追加挿入する上流（Upstream）と下流（Downsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１と配列番号２２のプライマーを用いてＢＢＤ２９＿１４４７０遺伝子の上流（Upstream）領域、配列番号２３と配列番号２４のプライマーを用いて下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅された変異型ａｒｏＧを追加挿入する上流と下流領域、ＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得しており、ｐＤＺ－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
また、ｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来の変異型ａｒｏＧ遺伝子を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５と配列番号２６のプライマーを用いてｇａｐＡプロモーター断片をＰＣＲ実行を介して収得し、大腸菌由来のフィードバック解除変異型ａｒｏＧ合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７と配列番号２８のプライマーを用いて変異型ａｒｏＧ遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅されたｇａｐＡプロモーターを含む変異型ａｒｏＧ遺伝子断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺ－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０はギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得しており、ｐＤＺ－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：： ＰｇａｐＡ- ａｒｏＧｍと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
前記それぞれのベクターを製作するために使用したプライマー配列は下記表５に示すとおりである。

Figure 0007267441000005
製作されたｐＤＺ－ΔＢＢＤ２９＿１４４７０：： ＰｇａｐＡ-ａｒｏＧｍベクターをＣＭ０６－０００２菌株に電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程を経てｇａｐＡプロモーターを含む大腸菌由来のフィードバック解除変異型ａｒｏＧ遺伝子が挿入された菌株を得た。該当遺伝子が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号２９と配列番号３０のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングを介して、当該遺伝的操作を確認し、ＣＭ０６－０００３と命名した。

Figure 0007267441000006
実施例２：Ｌ－チロシン生産菌株の生産能の評価
前記実施例１で製作した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために、次のような方法で培養して評価した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で２４時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、ＨＰＬＣによりＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファンの生産量を測定した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖 ２０ｇ、ペプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、尿素 １．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン １００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、パントテン酸カルシウム ２０００μｇ、ニコチンアミド ２０００μｇ（ 蒸留水１リットルあたり）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖 ３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、酵母エキス ５ｇ、ビオチン ９００μｇ、チアミン塩酸塩 ４５００μｇ、パントテン酸カルシウム ４５００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ ｇ（蒸留水１リットルあたり）

Figure 0007267441000007
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３８６９、ＣＭ０６－０００１、ＣＭ０６－０００２、ＣＭ０６－０００３における培養物中のＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン生産の結果は、前記表７の通りである。
野生型菌株に芳香族アミノ酸流入遺伝子欠損の前駆体であるＥ４Ｐ供給強化菌株であるＣＭ０６－０００１ではＬ－チロシンが生産されておらず、この菌株にさらにｔｙｒＡフィードバックの制限を解除したＣＭ０６－０００２でもＬ－チロシンが検出されなかった。
ＣＭ０６－０００２菌株にさらにａｒｏＧのフィードバック制限を解除して芳香族共通の生産経路を強化したＣＭ０６－０００３菌株では、Ｌ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニンの生産を確認した。Ｌ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニンは、以前菌株に比べて大幅に生産が増加したが、Ｌ－トリプトファンは大きく変化がなかった。
実施例３：Ｌ－チロシン生産菌株のｐｈｅＡ遺伝子の欠損
前記実施例２で芳香族共通の生産経路を強化したとき、Ｌ－フェニルアラニンが最も多い量が生産され、その次にＬ－チロシンが生産されて、Ｌ－トリプトファンは少量生産されることを確認した。したがって、Ｌ－フェニルアラニン生産経路を欠損するとＬ－チロシンとＬ－トリプトファン生産が増加すると予想することができる。
Ｌ－フェニルアラニン生産経路を欠損するために、プレフェン酸（Prephenic acid）から分岐される最初の段階の遺伝子であるｐｈｅＡを欠損した。これらの遺伝子欠損のために、まずｐｈｅＡ遺伝子の上流（Upstream）と下流（Downsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３１と配列番号３２のプライマーを用いてｐｈｅＡ上流（Upstream）領域、配列番号３３と配列番号３４のプライマーを用いて下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅されたｐｈｅＡ上流と下流領域、ＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得し、ｐＤＺ－ΔｐｈｅＡと命名した。クローニングはギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
前記それぞれのベクターを製作するために使用したプライマー配列は下記表８に示す通りである。

Figure 0007267441000008
製作されたｐＤＺ－ΔｐｈｅＡベクターをＣＭ０６－０００３菌株に電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程を経てｐｈｅＡが欠損した菌株を得た。当該遺伝子が欠損された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号３５と配列番号３６のプライマーを用いたＰＣＲ法ゲノムシーケンシングを介して、当該遺伝的操作を確認し、ＣＭ０６－０００４と命名した。

Figure 0007267441000009
実施例４：Ｌ－チロシン生産菌株のｐｈｅＡ遺伝子欠損菌株の生産能の評価
前記実施例３で作製した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために、実施例２で述べた方法及び培地組成を用いて菌株を培養した。

Figure 0007267441000010
Ｌ－チロシン生産菌株ＣＭ０６－０００３、ＣＭ０６－０００４における培養物中のＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン生産の結果は、前記表１０の通りである。ｐｈｅＡを欠損したＣＭ０６－０００４菌株はＬ－フェニルアラニンの生産が大幅に減り、Ｌ－チロシンが主要産物として生産された。実施例２と同様にＬ－トリプトファン生産量は大きく変わらなかった。
しかし、ＣＭ０６－０００４菌株はＬ－フェニルアラニンを生産することができないため、培地の酵母エキスに含まれるＬ－フェニルアラニンに依存してのみ生長することができ、非欠損株に比べて糖消耗を１／３の水準しかできなかった。つまり、微生物からｐｈｅＡ遺伝子を欠損する場合、菌株の生長に大きな影響を与えるため、目的産物の生産のための目的で前記菌株を活用することはできないことを確認した。
実施例５：Ｌ－チロシン生産菌株のｐｈｅＡ遺伝子プロモーター交替菌株の製作
前記実施例２と４の結果により、Ｌ－トリプトファンは培養時に常に低濃度に維持されながらも菌体の成長には支障がないように精巧に調節されることが予測できる。公知の文献でもＬ－トリプトファンの生産は、Ｌ－トリプトファン濃度による抑制剤と促進剤の同時調節を受けることが知られている（ 非特許文献７）。
したがって、Ｌ－トリプトファンの調節機序をＬ－フェニルアラニン生産遺伝子ｐｈｅＡに適用し、Ｌ－トリプトファン濃度によってｐｈｅＡ遺伝子が調節を受けるようにした。
このとき、対照群としてｐｈｅＡをＬ－トリプトファン濃度によって調節されるようにするｔｒｐＥの調節領域の他に、Ｌ－イソロイシン（Isoleucine）の濃度によって調節されるようにするｉｌｖＢのプロモーター、Ｌ－ロイシン（Leucine）の濃度によって調節されるようにするｌｅｕＡのプロモーター、ｌｅｕＣのプロモーターを挿入した菌株も製作して比較した。
ｐｈｅＡ遺伝子がｔｒｐＥの調節領域により調節されるようにするために、挿入する領域の上流（Upstream）、ｔｒｐＥの調節領域及び挿入する領域の下流（Downsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７と配列番号３８のプライマーを用いて挿入しようとする領域の上流（Upstream）領域、配列番号３９と配列番号４０のプライマーを用いてｔｒｐＥの調節領域、そして配列番号４１と配列番号４２のプライマーを用いて挿入しようとする領域の下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅された挿入しようとする領域の上流と下流領域、ｔｒｐＥ調節領域、ＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得しており、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｔｒｐＥと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
ｐｈｅＡ遺伝子がｉｌｖＢのプロモーターによって調節されるようにするために挿入する上流（Upstream）領域、ｉｌｖＢのプロモーター領域及び挿入する下流（Downsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７と配列番号４３のプライマーを用いて挿入しようとする上流（Upstream）領域、配列番号４４と配列番号４５のプライマーを用いてｉｌｖＢのプロモーター領域、そして配列番号４６と配列番号４２のプライマーを用いて挿入しようとする下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅された挿入しようとする上流及び下流領域、ｉｌｖＢプロモーター領域、及びＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得しており、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｉｌｖＢと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
ｐｈｅＡ遺伝子がｌｅｕＡのプロモーターによって調節されるようにするために、挿入する上流（Upstream）領域、ｌｅｕＡのプロモーター領域、及び挿入する下流（Downsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７と配列番号４７のプライマーを用いて挿入しようとする上流（Upstream）領域、配列番号４８と配列番号４９のプライマーを用いてｌｅｕＡのプロモーター領域 、そして配列番号５０と配列番号４２のプライマーを用いて挿入しようとする下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅された挿入しようとする上流と下流領域、ｌｅｕＡプロモーター領域、そしてＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得しており、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｌｅｕＡと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
ｐｈｅＡ遺伝子がｌｅｕＣのプロモーターによって調節されるようにするために、挿入する上流（Upstream）領域、ｌｅｕＣのプロモーター領域、及び挿入する下流（Downsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７と配列番号５１のプライマーを用いて挿入しようとする上流（Upstream）領域、配列番号５２と配列番号５３のプライマーを用いてｌｅｕＣのプロモーター領域、配列番号５４と配列番号４２のプライマーを用いて挿入しようとする下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅された挿入しようとする上流と下流領域、ｌｅｕＣプロモーター領域、そしてＳｍａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得しており、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｌｅｕＣと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
製作されたｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｔｒｐＥ、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｉｌｖＢ、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｌｅｕＡ、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｌｅｕＣベクターをＣＭ０６－０００３菌株にそれぞれ電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程クロスプロセスを経て、ｐｈｅＡ遺伝子がｔｒｐＥ調節領域、ｉｌｖＢ、ｌｅｕＡまたはｌｅｕＣのプロモーターにより調節されるように作られた菌株を収得した。当該調節領域またはプロモーターが挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号５５と配列番号５６のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングを介して、当該遺伝的操作を確認した。ｐｈｅＡ遺伝子の前にｔｒｐＥの調節領域を挿入した菌株はＣＭ０６－０００５と、ｉｌｖＢのプロモーターを挿入した菌株はＣＭ０６－０００６と、ｌｅｕＡのプロモーターを挿入した菌株はＣＭ０６－０００７と、ｌｅｕＣのプロモーターを挿入した菌株はＣＭ０６－０００８と命名した。
前記それぞれのベクターを製作するために使用したプライマー配列は下記表１１に示す通りである。

Figure 0007267441000011
実施例６：Ｌ－チロシン生産菌株のｐｈｅＡ遺伝子プロモーター交替菌株の生産能の評価
前記実施例５で製作した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために実施例２で述べた方法及び培地組成を用いて菌株を培養した。

Figure 0007267441000012
Ｌ－チロシン生産菌株であるＣＭ０６－０００３、ＣＭ０６－０００４、ＣＭ０６－０００５、ＣＭ０６－０００６、ＣＭ０６－０００７、ＣＭ０６－０００８における培養物中のＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン生産の結果は、前記表１２の通りである。
ｐｈｅＡを欠損したＣＭ０６－０００４菌株の場合、Ｌ－チロシンを５．０８％の収率で生産した。したがって、Ｌ－フェニルアラニン経路をＬ－トリプトファン濃度によって調節されるようにしたＣＭ０６－０００５菌株の場合、Ｌ－フェニルアラニンを少量生産してＬ－チロシンを生産するため、Ｌ－フェニルアラニン経路を自然のままのＣＭ０６－０００３菌株よりは高い収率が期待できるが、Ｌ－フェニルアラニン経路を欠損したＣＭ０６－０００４菌株よりは低い収量が予測できる。しかし、予想とは違ってＣＭ０６－０００５菌株はＣＭ０６－０００４菌株より生産能が向上されて５．３７％の収率でＬ－チロシンを生産した。ＣＭ０６－０００５のＬ－チロシン生産量は親菌株であるＣＭ０６－０００３に比べて２８３％増加し、ＣＭ０６－０００４に比べて１４４％向上した。
前記結果からｐｈｅＡをＬ－トリプトファン濃度によって調節されるようにした場合、Ｌ－チロシン生産が予期しないレベルに大幅に増加することが確認できた。また、Ｌ－トリプトファン調節機序をｐｈｅＡに導入するものと同様の対照群として、ｐｈｅＡをＬ－イソロイシン濃度によって調節されるようにしたＣＭ０６－０００６菌株やＬ－ロイシン濃度によって調節されるようにしたＣＭ０６－０００７、ＣＭ０６－０００８菌株に比べても優れていることを確認した。したがって、Ｌ－トリプトファン調節機序をｐｈｅＡに導入することがｐｈｅＡを欠損したり他の調節機序を導入することに比べて、Ｌ－チロシン生産に相乗効果が大きいことを確認した。
実施例７：ｎｏｎ－ＰＴＳのＬ－チロシン生産菌株のｐｈｅＡ遺伝子欠損及びプロモーター交替菌株の製作
Ｌ－チロシンの生産は、ＰＥＰとＥ４Ｐを前駆物質として始まるため、ｎｏｎ－ＰＴＳ（Phosphotransferase system）を使用した場合、ＰＥＰ供給をより円滑にして高い生産が期待できる（非特許文献８）。したがって、菌株のＰＴＳ遺伝子であるｐｔｓＧを除去して、ｎｏｎ－ＰＴＳ遺伝子であるＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ １０９８８由来のｇｌｆを導入した。
ｐｔｓＧを欠損してｇｌｆを挿入するために、まずＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のｇｌｆ遺伝子を挿入する上流（Upstream）と下流（Downsteam）領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７と配列番号５８のプライマーを用いてｐｔｓＧ上流（Upstream）領域、配列番号５９と配列番号６０のプライマーを用いて下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
また、既公知のｃｊ７プロモーター（配列番号６１、特許文献３）を含むｇｌｆ遺伝子を確保するために、合成ｃｊ７プロモーターＤＮＡを鋳型とし、配列番号６２と配列番号６３のプライマーを用いてｃｊ７プロモーター断片をＰＣＲ実行を通じて収得し、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ１０９８８の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６４と配列番号６５のプライマーを用いてｇｌｆ遺伝子断片をＰＣＲ実行を介して収得した。重合酵素はＳｏｌｇＴＭＰｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行った。
増幅されたｐｔｓＧ上流と下流の遺伝子断片、ｃｊ７プロモーターを含むｇｌｆ遺伝子断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターｐＤＺはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得し、ｐＤＺ－ΔＰＴＳＧ ：： pｃｊ７-ｇｌｆと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することによって行われた。
本実施例で使用したプライマーの配列は、表１３に示す通りである。

Figure 0007267441000013
製作されたｐＤＺ－ΔＰＴＳＧ：： pｃｊ７-ｇｌｆベクターをＣＭ０６－０００３菌株に電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程を経てｃｊ７プロモーターを含むＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ由来のｇｌｆ遺伝子が挿入された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号６６と配列番号６７のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングを介して、その遺伝的操作を確認し、ＣＭ０６－０００９と命名した。

Figure 0007267441000014
前記作製したＣＭ０６－０００９菌株に、実施例３で製作したｐＤＺ－ΔｐｈｅＡベクターを電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程を経てｐｈｅＡ遺伝子が欠損した菌株を得た。当該遺伝子が欠損した相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号３５と配列番号３６のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングを介して、その遺伝的操作を確認し、ＣＭ０６－００１１と命名した。
前記製作したＣＭ０６－０００９菌株に、実施例５で製作したｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｔｒｐＥ、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｉｌｖＢ、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｌｅｕＡ、ｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｌｅｕＣベクターをそれぞれ電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程を経てｐｈｅＡ遺伝子の前に、それぞれの調節領域またはプロモーターが挿入された菌株を得た。当該調節領域またはプロモーターが挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号５５と配列番号５６のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングを介して、その遺伝的操作を確認した。ｐｈｅＡ遺伝子の前にｔｒｐＥの調節領域を挿入した菌株はＣＭ０６－００１０と、ｉｌｖＢのプロモーターを挿入した菌株はＣＭ０６－００１２と、ｌｅｕＡのプロモーターを挿入した菌株はＣＭ０６－００１３と、そしてｌｅｕＣのプロモーターを挿入した菌株はＣＭ０６－００１４と命名した。
実施例８：ｎｏｎ－ＰＴＳのＬ－チロシン生産菌株のｐｈｅＡ遺伝子欠損及びプロモーター交替菌株の生産能の評価
前記実施例７で製作した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために実施例２で述べた方法及び培地組成を用いて菌株を培養した。

Figure 0007267441000015
Ｌ－チロシン生産菌株であるＣＭ０６－０００３、ＣＭ０６－０００９、ＣＭ０６－００１１、ＣＭ０６－００１０、ＣＭ０６－００１２、ＣＭ０６－００１３、ＣＭ０６－００１４における培養物中のＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン生産の結果は、前記表１５の通りである。
予想通り、ＰＴＳ菌株であるＣＭ０６－０００３に比べてＰＥＰ供給を円滑にすることができるｎｏｎ－ＰＴＳ菌株であるＣＭ０６－０００９でＬ－チロシン及びＬ－フェニルアラニン生産が増加することを確認した。同様に、この場合もＬ－トリプトファン生産の増加は大きくなかった。
ｎｏｎ－ＰＴＳ菌株を基盤にｐｈｅＡを欠損したＣＭ０６－００１１菌株の場合、Ｌ－チロシンを５．８５％の収率で生産して親菌株に比べて増加したが、Ｌ－チロシンの最終生産量が親菌株に比べて少なく、また糖消耗の速度が著しく低くて生産性が低下したことを確認した。実施例６と同様にＣＭ０６－００１０菌株は、これより低い収率でＬ－チロシンを生産することが予想できる。しかし、実際はＣＭ０６－００１１菌株の収率より何と２０．７％向上された７．０６％の収率でＬ－チロシンを生産した。ＣＭ０６－００１０菌株のＬ－チロシン生産量は親菌株であるＣＭ０６－０００９に比べて４５％増加し、ＣＭ０６－００１１に比べて９１％も増加した。また、ｐｈｅＡをＬ－イソロイシン濃度によって調節されるようにしたＣＭ０６－００１２菌株やＬ－ロイシン濃度によって調節されるようにしたＣＭ０６－００１３、ＣＭ０６－００１４菌株に比べても優れていることを確認することによって、Ｌ－トリプトファン調節機序をｐｈｅＡに導入することがｐｈｅＡを欠損したり、他の調節機序を導入することに比べてＬ－チロシン生産に相乗効果が大きいことを確認した。
実施例９．Ｌ－チロシン類似体に対して耐性を有する微生物のスクリーニング
本実施例では、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３８６９を親菌株にして、Ｌ－チロシンによるフィードバック抑制を解除するために人工変異法を用いてＬ－チロシン類似体であるＬ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅに対する耐性を有する菌株を選別する実験を実施した。
具体的には、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine：以下、ＮＴＧ）を用いた人工変異法で変異を誘導した。 ＡＴＣＣ １３８６９菌株を種培地で１８時間培養して種培地４ｍｌに接種した後、ＯＤ６６０が約１．０になるまで培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ｍａｌａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ６．５）で２回洗浄し、最終的に４ｍｌの同一の緩衝溶液で懸濁した。菌体懸濁液に最終濃度１５０ｍｇ／ｌになるようにＮＴＧ溶液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ｍａｌａｔｅ緩衝溶液（pH6.5）中２ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で２０分間静置した後、遠心分離を介して菌体を回収した。ＮＴＧ除去のために、同一の緩衝液で２回洗浄した。最終的に洗浄した菌体を２０％グリセロール溶液４ｍｌに懸濁した後、使用するまで－７０℃で保管した。ＮＴＧ処理菌株を０．５ｇ／ｌのＬ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅを含む最小培地に塗抹し、前記過程を介してＬ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅに耐性を有する１００株の菌株を獲得した。
実施例１０．Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅに耐性を有する菌株のＬ－チロシン生産能の評価
実施例９で得られた１００株のＬ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ耐性菌株についてＬ－チロシン生産能を確認した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、実施例９で獲得した１００株の菌株を接種した後、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いて生産されたアミノ酸の生産量を測定した。実験した１００株の菌株中、Ｌ－チロシン生産能が優れたことが示された上位１０株に対するアミノ酸の培養液内濃度を表１６に示した。前記過程を介して確認された１０株の候補をそれぞれＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－１～ＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－１０と命名した。
その中で、Ｌ－チロシン生産能が最も優れたＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－６及びＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－８菌株を選別した。

Figure 0007267441000016
実施例１１．Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅに耐性を有する菌株のｐｈｅＡ遺伝子プロモーターの交替
実施例１０で選別したＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－６、ＹＡＲ－８菌株のｐｈｅＡ遺伝子がｔｒｐオペロンの調節領域によって調節されるようにした。このため、実施例５で製作したｐＤＺ－ΔＰｐｈｅＡ：： ＰｔｒｐＥをＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－６、ＹＡＲ－８菌株にそれぞれ電気穿孔法で形質転換した後、２次交差過程を経てｐｈｅＡの遺伝子がｔｒｐＥの調節領域によって調節されるように作った菌株を得た。前記調節領域が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号５５と配列番号５６のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングを介して、その遺伝的操作を確認した。ｐｈｅＡ遺伝子の前にｔｒｐＥの調節領域を挿入したＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－６、ＹＡＲ－８菌株は、それぞれＹＡＲ－６Ｐ、ＹＡＲ－８Ｐと命名した。
実施例１２．Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ耐性ＡＴＣＣ １３８６９菌株のｐｈｅＡ遺伝子プロモーター交替菌株の生産能の評価
実施例１１で製作した菌株のＬ－チロシン生産能を確認するために実施例２で述べた方法及び培地組成を用いて菌株を培養した。

Figure 0007267441000017
Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ耐性ＡＴＣＣ １３８６９菌株及びｐｈｅＡ遺伝子プロモーターの交替菌株における培養物中のＬ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン生産の結果は、前記表１７の通りである。
実施例６及び実施例８のようにｐｈｅＡ遺伝子がｔｒｐＥ調節領域によって調節されるようにした場合、Ｌ－フェニルアラニン生産の減少及びＬ－チロシン生産の増加を期待することができる。実際の実験結果で、ＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－６Ｐ及びＡＴＣＣ １３８６９ ＹＡＲ－８Ｐ菌株は副産物であるＬ－フェニルアラニン生産が大幅に減少し、その減少分よりも高い水準の目的産物であるＬ－チロシン生産の増加を確認した。これにより、Ｌ－トリプトファン調節機序をｐｈｅＡに導入する場合、糖消耗の速度の低下なしにＬ－チロシンの生産量が予測できない水準に著しく増加することがあり、ｔｒｐオペロンの調節領域及びｐｈｅＡ遺伝子の組み合わせがＬ－チロシン生産に相乗効果が大きいことを確認した。
前記結果からｐｈｅＡをＬ－トリプトファン濃度によって調節されるようにした場合、Ｌ－チロシン生産が予期できない水準に大幅に増加することを確認できた。具体的な例として、Ｌ－チロシン生産能が増加するように変形された菌株だけではなく、ランダム突然変異菌株でもＬ－チロシン生産が予想できない水準に大幅に増加することを確認できた。
前記菌株、ＣＭ０６－００１０は２０１９年４月１５日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託し、ＫＣＣＭ １２４８７Ｐで寄託番号を付与された。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (12)

  1. ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含み、
    前記ｔｒｐオペロン調節領域が、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐオペレーター、ｔｒｐリーダーペプチド及びｔｒｐ減衰因子を含む、Ｌ－チロシンを生産する微生物。
  2. 前記ｔｒｐオペロン調節領域が、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の上流（Upstream）に位置するものである、請求項１に記載のＬ－チロシンを生産する微生物。
  3. 前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子が、ｐｈｅＡ遺伝子である、請求項１に記載のＬ－チロシンを生産する微生物。
  4. 前記ｔｒｐオペロンの調節領域が、配列番号１の塩基配列からなる、請求項１に記載のＬ－チロシンを生産する微生物。
  5. Ｌ－チロシンを生産する微生物を培地で培養する段階；及び培養された微生物または培地からＬ－チロシンを回収する段階を含むものである、Ｌ－チロシンの製造方法であって、
    前記微生物はｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含む、Ｌ－チロシンの製造方法。
  6. ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を含む発現カセットであって、
    前記ｔｒｐオペロン調節領域が、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐオペレーター、ｔｒｐリーダーペプチド及びｔｒｐ減衰因子を含む、発現カセット。
  7. ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子、これを含む発現カセット、これを含む微生物またはこれらの組み合わせを含む、Ｌ－チロシン生産用組成物。
  8. ｔｒｐオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ（Prephenate dehydratase）をコードする遺伝子を用いて、プレフェン酸デヒドラターゼの活性を調節する方法であって、
    前記ｔｒｐオペロン調節領域が、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐオペレーター、ｔｒｐリーダーペプチド及びｔｒｐ減衰因子を含む、方法。
  9. 前記ｔｒｐオペロン調節領域が前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の上流に位置する、請求項５に記載の方法。
  10. 前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子がｐｈｅＡ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
  11. 前記ｔｒｐオペロン調節領域が、ｔｒｐレギュレーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐオペレーター、ｔｒｐリーダーペプチド及びｔｒｐ減衰因子からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  12. 前記ｔｒｐオペロン調節領域が、配列番号１の塩基配列からなる、請求項５に記載の方法。
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