CN106520724B - 重组人脱氧核糖核酸酶i的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法。本发明提供了质粒载体、工程菌、由工程菌发酵产生重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的方法，由该方法制备的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ及其应用与药物。本发明实现了rHuDNase I在毕赤酵母中的分泌表达，保证了与人体rHuDNase I结构的相似性，所得产物活性高达2677IU/mg，表达量高达87mg/L，纯度近乎为100％。

Description

重组人脱氧核糖核酸酶I的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法。

背景技术

随着气候环境的变化及和生活方式的改变，现代人患呼吸道疾病的机率越来越大，人群分布也越来越多。呼吸系统疾病近年来成为一种常见病、多发病，世界范围内其发病率都较高，并有增加的趋势，它是我国人口死亡的第二大因素，而且，65岁以上老人因呼吸系统疾病死亡占相当大的比例。以慢性支气管炎为例，据统计，我国50岁以上中老年人发病率为15％～30％左右。喘、咳、痰、炎四症是呼吸系统疾病常见症状，同时互为因果。痰是呼吸道炎症的产物，可刺激呼吸道粘膜，引起咳嗽及哮喘，并可加重感染。急慢性支气管炎或慢性肺病患者呼吸衰竭时，如病人痰液粘稠度过高或形成痰栓，可阻塞呼吸道而导致窒息。

目前对该病的治疗原则是抗炎，化痰，止咳，其中化痰药主要包括恶心性和刺激性祛痰药，痰液溶解剂和黏液调节剂，10年市场总销售额约为31亿，其中排名前五位的氨溴索约占市场份额的80％多，乙酰半胱氨酸、复方可待因、复方右美沙芬、愈创木酚甘油醚各占3％左右。这些祛痰药的基理是对胃黏膜及呼吸道黏膜进行刺激而增加呼吸道的分泌物，使痰液变稀，或者作用于气管和支气管的黏液产生细胞，使分泌物黏滞性降低。但这些药物的药理或临床上存在一些缺陷，这主要是由于其分子结构中游离的巯基会吸附胃肠道粘蛋白，口服后会产生胃肠道局部损伤，副作用较大，患者使用多有不良反应，会伴有恶心、呕吐、胃肠道出血等症状。并且，这些祛痰药会减弱青霉素、头孢类抗生素、红霉素、四环素等的抗菌活性，不宜联合用药，对某些呼吸参数如痰粘度等的改善效力不高等，故限制了患者对该类药的长期口服治疗。市场迫切需求一种新的安全有效的痰液降解剂问世。

重组人脱氧核糖核酸酶I(rHuDNase I)可直接作用于痰液中的主要粘性成分DNA，改变分泌物的组成和流变学性质，降低痰液粘度，改善受抑制的呼吸功能。对囊性纤维化病人形成的顽固呼吸道分泌物的临床治疗显示，rHuDNase I对病人粘液的降解及肺功能的改善效果显著，并可长期安全使用。尽管该药物上市的定位是针对囊性纤维化病人，但调查结果显示，其它呼吸道疾病患者对该药的需求呈快速上升趋势，rHuDNase I在未来祛痰药市场上将具有广阔的市场发展空间，它不但会为临床祛痰药物带来新的选择，而且随着其市场推进发展，也必将会改变目前祛痰药市场的格局。2010年，该药在全球的销售总额达到25.2亿，预计2015年将达到37.3亿。

但是目前，该药价格非常昂贵。究其原因，是由于rHuDNase I的生产效率十分的低。目前，对rHuDNase I的制备方法主要通过细菌或哺乳动物细胞表达。哺乳动物细胞对重组蛋白的表达效率较低。细菌表达虽然能够提高重组蛋白的产量，但氨基酸链在折叠过程中却容易出现问题，导致制备的重组蛋白活性较低或彻底失活。因此，进一步开发表达量大、蛋白活性高的rHuDNase I的制备方法，具有重大的经济和社会意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法。该方法所得蛋白量较大，蛋白活性较高。

本发明提供了表达载体，其以pPIC9载体为骨架其中包括rHuDNase I基因。

pPIC9载体的质粒图谱如图1；pPIC9载体为毕赤酵母的蛋白表达载体，其为融合表达载体，表达水平为高拷贝，启动子为AOX1；抗性标记为氨苄霉素，营养标记为HIS4；可选用的酶切位点为Xho I，SnaB I，EcoR I，Avr II，Not I。

本发明将rHuDNase I基因的5’端链接有6×His标签。

本发明选择的rHuDNase I基因的插入位点为Xho I与Not I酶切位点之间。

所述rHuDNase I基因的来源为人肝cDNA文库。基因片段的长度为0.85kb。

本发明构建的载体能够将rHuDNase I基因插入毕赤酵母GS115的his4区，从而使rHuDNase I基因能够顺利的表达。所述表达载体在转化入酵母菌前，转化入大肠杆菌DH5α进行扩增和保存。

本发明还提供了一种工程菌，其为转化本发明所述表达载体的酵母菌。

本发明采用的酵母菌为毕赤酵母GS115。

所述转化采用电转化，转化条件为1500V，5ms。

所述转化前，表达载体经线性化，所述线性化的酶Sal I。

所述转化后，采用MD固体培养基筛选阳性转化子；每升MD固体培养基中包括葡萄糖20g，YNB 13.4g，生物素0.4mg；琼脂20g；筛选培养的温度为28℃。倒置培养。

经培养，MD固体培养基上生长的转化子经DNA测序，PCR检测，验证成功插入rHuDNase I基因。

本发明还提供了重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法，其为发酵本发明提供的工程菌。

本发明中，发酵前还包括种子活化的步骤。所述活化采用BMGY培养基。

发酵的培养基为BMDY培养基。

每升BMGY培养基中含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB 13.4g，甘油10g，生物素0.4mg。

每升BMDY培养基中含酵母提取物15g，蛋白胨30g，YNB 13.4g，葡萄糖40g，生物素0.4mg，硫酸铵2g。

本发明中，发酵包括培养和诱导的步骤；所述发酵在发酵罐中进行。

所述培养的温度为30℃，搅拌速度为150rpm～300rpm；培养至菌体体积为10％。菌体体积是指为离心以后菌体所占培养液的体积。

所述诱导的诱导剂为甲醇，温度为25℃～30℃，搅拌速度为200rpm～450rpm。

具体的，开始诱导后2h温度为30℃；搅拌转速为250rpm；诱导后2～4h，温度由30℃降至25℃，转速由250rpm升至450rpm；诱导后4h至诱导结束，温度为25℃；转速为450rpm。

所述诱导剂的加入采用流加方式，其占培养基体积的1％。

所述发酵过程pH值为6.0。

所述发酵步骤中，溶氧呈现先下降再升高后又下降的趋势；其波动范围为20％～90％；具体的，在培养的过程中，溶氧由80％下降至20％，后又升高至90％；诱导过程中，溶氧由90％下降至35％。

本发明所述溶氧量为：即时溶氧量所占初始溶氧量的百分比，定义充分通气时的溶氧量为100％。

本发明中，发酵步骤持续108h，其中，转速、溶氧、温度、菌体密度、pH值参数如图4所示。

经过发酵，所得重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ存在于培养液中。

发酵后进行纯化，所述纯化采用镍柱层析。

所述纯化包括：

步骤1：收集发酵上清液经稀释后、调整pH值为7.2，离心后取上清液上样镍层析柱；

步骤2：平衡镍层析柱后，以洗脱液洗脱，收集rHuDNase I。

所述平衡的缓冲液中，包括50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、20mM imidazole，其pH值为8.0。所述平衡缓冲液的体积为层析介质体积的10倍。

所述洗脱液中，包括50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、500mM imidazole，其pH值为8.0。所述洗脱液的体积为层析介质体积的5倍。

将分离纯化的rHuDNase I重组蛋白以SDS-PAGE检测，其分子量约为37kDa；以程序Gel-Pro Analyzer图像扫描分析，纯度近乎100％；分别测定纯化后的rHuDNase I重组蛋白活性浓度，计算出其比活性为2677IU/mg。

本发明所述制备方法制备的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ。

本发明所述制备方法制备的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ在制备治疗呼吸道疾病的药物中的应用。

实验表明，本发明提供的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ在Ca2+和Mg2+存在条件下，能够降解DNA。

本发明还提供了一种治疗呼吸道疾病的药物，其中包括本发明制备方法制备的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ。

所述治疗呼吸道疾病的药物中包括1mg/mL rHuDNase I，0.15mg/mLCaCl₂·2H₂O，8.77mg/mL NaCl，pH值为7.2。

所述治疗呼吸道疾病的药物中还可以包括糖类，所述糖类选自蔗糖，海藻糖或菊粉。

本发明提供了质粒载体、工程菌、由工程菌发酵产生重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的方法，由该方法制备的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ及其应用与药物。本发明实现了rHuDNase I在毕赤酵母中的分泌表达，保证了与人体rHuDNase I结构的相似性，所得产物活性高达2677IU/mg，表达量高达87mg/L，纯度近乎为100％。

附图说明

图1示rHuDNase I(6×His)基因PCR扩增产物；

图2示质粒pPIC9图谱；

图3示各个转化子分泌表达rHuDNase I(6×His)的比较；

图4示小试各个转化子分泌表达rHuDNase I(6×His)的比较；

图5示中试发酵工艺条件；

图6示甲醇诱导过程中发酵液中总蛋白浓度的变化；

图7示甲醇诱导过程中发酵液中DNase I酶活性的变化；

图8示纯化后的rHuDNase I重组蛋白的检测，其中图8-a示SDS-PAGE电泳检测结果，图8-b示Gel-Pro Analyzer图像扫描分析；

图9示rHuDNase I(6XHis)降解DNA pUC18；

图10示rHuDNase I降解DNA的特性；

图11示rHuDNase I的稳定性；其中，图11-a示rHuDNase I在4℃保存6个月的稳定性；图11-b示rHuDNase I在25℃保存6个月的稳定性；图11-c示rHuDNase I在60℃保存6个周的稳定性。

具体实施方式

本发明提供了重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1rHuDNase I分泌表达质粒的构建

本发明所用rHuDNase I基因片段经高保真Pfu酶PCR扩增获得(模板为人肝cDNA文库，序列的genbank登录号为AAA63170.1，引物序列为ATCTCGAGAAAAGACATCATCATCATCATCATCTGAAGATCGCAGCC和ATGCGGCCGCTCACTTCAGCATCACCTC)，片段长约为0.85kb(图1-a)；同时以PCR扩增了带有6×His标记的rHuDNase I基因片段(图1-b)，平行构建对应的表达质粒。

PCR产物经酶切(酶切位点为Xho I/Not I)后，插入表达质粒pPIC9(图2)。两个片段经T4DNA连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞；得到的转化子以PCR检测是否能扩增出0.85kb的条带；对能够扩增出目的条带的菌落，扩大培养然后提取质粒DNA，酶切验证质粒是否含有0.85kb片段插入；最后，选取3个克隆的质粒DNA进行序列测定，结果显示我们所选取的克隆中rHuDNase I基因的DNA序列完全正确。至此，我们得到了含有rHuDNase I表达单元的质粒pP/DNase(6×His)。

在我们所构建的质粒的表达单元中，rHuDNase I结构基因的上游分别是由AOX1启动子、分泌信号肽顺序和信号肽切割顺序。AOX1启动子受甲醇的调控，因此，rHuDNase I基因的表达可以用甲醇作为诱导物进行诱导。

实施例2rHuDNase I毕赤酵母表达菌株的构建和筛选

将实施例1中构建的含有rHuDNase I表达单元的质粒pP/DNase(6×His)，经Sal I酶线性化后，电转化(1500V，5ms)毕赤酵母感受态细胞，后涂布于MD平板(每升含葡萄糖20g，YNB 13.4g，生物素0.4mg)，28℃培养至长出转化子。

选取4个转化子(依次记为1～4)，提取其基因组DNA，然后进行PCR检测，观察能否扩增出特征性的0.85kb条带。每个转化子在5mL BMGY，28℃培养48小时，然后连续加入1％的甲醇诱导，取上清液，SDS-PAGE电泳观察，比较空白对照，可以看到一条分子量接近人DNase I的条带(图3)。说明这些转化子皆能够成功表达rHuDNase I，且表达量较为接近。

检测各转化子的发酵液中的总蛋白浓度(生工生物公司的改良型BCA法蛋白质浓度测定试剂盒)和DNase I酶活性(参考Benzonase endonuclease标准活性测定法)，进行测定，酶活力的计算公式为：

结果如表1：

表1各转化子发酵液中蛋白浓度及DNase活性

	转化子1	转化子2	转化子3	转化子4
					蛋白质浓度(mg/mL)	0.54	0.53	0.53	0.52
DNase活性(IU/μL)	0.317	0.330	0.322	0.308

从上表的数据结果可以看出，4个转化子的表达能力相近，无显著差异，对各菌种予以-80℃保存。

实施例3rHuDNase I在酵母中的小试诱导表达

实施例2制得的4个转化子，分别接种于4mL YPD(每升含酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g)，28℃，培养过夜。

2mL种子液接入500mL BMMY(每升含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB 13.4g，甲醇10g，生物素0.4mg)，28℃，培养过夜。

500mL培养液离心，菌体悬浮于250mL BMMY，1％甲醇开始诱导表达。

表达情况如图4，结合图3～4和表1可知，各转化子的表达量皆较高，不同的转化子之间表达量不存在显著性差异。

实施例4rHuDNase I诱导表达的中试生产工艺研究

挑取实施例2制得的转化子，接种于500mL BMGY(每升含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB 13.4g，甘油10g，生物素0.4mg)，30℃，培养1天为种子液。

转接于30升BMDY(每升含酵母提取物15g，蛋白胨30g，YNB 13.4g，葡萄糖40g，生物素0.4mg，硫酸铵2g)(接种量为500mL)，30℃培养，24小时后，菌体达到约10％，至此开始流加甲醇诱导。在整个发酵过程中，控制pH于6.0，溶氧于40～50。整个发酵过程的参数变化请参见图5。

其中，转化子2以甲醇诱导开始以后发酵罐中发酵液的总蛋白浓度(图6，生工生物公司的改良型BCA法蛋白质浓度测定试剂盒)和DNase I酶活性(图7，参考Benzonaseendonuclease标准活性测定法)，酶活力的计算公式为：

由图可以看到两者在整个诱导过程中一直在不断地上升，经甲醇诱导至82h时，总蛋白的浓度为2.7mg/mL；DNase I酶活性为1.2U/μL。转化子1和转化子3～4的蛋白表达量与酶活性与此相似，无显著差异。

实施例5酵母中rHuDNase I的分离纯化

以实施例2的转化子为种子，发酵诱导至108h终止发酵，测定总蛋白浓度为2.7mg/mL，DNase I酶活性为1.2U/μL。

将各菌株的培养液上清以50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,pH 8.0缓冲液稀释5倍，以0.5N NaOH调整至pH 7.2，离心后上样Ni²⁺层析柱，以10倍层析介质体积的50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,20mM imidazole,pH 8.0缓冲液平衡，然后以5倍层析介质体积的50mMNaH₂PO₄,300mM NaCl,500mM imidazole,pH 8.0缓冲液洗脱，收集获得rHuDNase I重组蛋白。

将表达子2表达的rHuDNase I重组蛋白经分离纯化后的以SDS-PAGE检测，其分子量约为37kDa(图8-a)。以程序Gel-Pro Analyzer图像扫描分析，蛋白的纯度高于95％(程序结果显示为几乎100％)(图8-b)，比活性可高达2677IU/mg。转化子1和转化子3～4的蛋白纯度与比活性与此相似，无显著差异。

实施例6酵母分泌的rHuDNase I降解DNA的特性

用实施例4纯化的表达子2表达的rHuDNase I重组蛋白和质粒pUC18DNA一起37℃保温，如图9所示，很少量的重组蛋白即可以将DNA完全降解。

为了进一步验证本发明中的rHuDNase I的体外活性，我们用以下一组实验检测了该重组蛋白的特征，如图10所示，在仅有DNA存在的情况下，DNA并不会发生降解；在加入2μl重组蛋白后，DNA则全部被降解；重组蛋白在经过100℃高温处理被灭活后，DNA则不发生降解；众所周知，DNase I的作用必须有Mg²⁺和Ca²⁺的参与，当体系中有缺乏Mg²⁺和Ca²⁺时，rHuDNase I几乎没有活性，反之，当Mg²⁺或Ca²⁺存在时，DNA就基本被rHuDNase I降解。

实施例7rHuDNase I蛋白的稳定性测试

我们测定了实施例4中纯化的rHuDNase I保存于4℃、25℃和60℃条件下的热稳定性。

各菌种表达的rHuDNase I分别配制成为制剂，其中包括1mg/ml rHuDNase I,0.375mg/ml CaCl₂,11.0mg/ml NaCl,22.5mg/ml碳水化合物(蔗糖、海藻糖或者菊粉)，使用0.2N的盐酸调节pH至6.3。

将1ml样品溶液冷冻干燥，干粉样品放入真空干燥器中干燥一天。冰冻干燥这一步骤大概要损失活性20％，这个现象也曾见报道。

然后，在相对湿度为0％、避光条件下分别保温于4℃和25℃，测定储存0、2、4、6月后样品的DNase I活性；同时为了检验rHuDNase I在较高温度下的稳定性，我们将样品也保温于60℃，测定储存0、2、4、6周后样品的DNase I活性。

对表达子2表达的rHuDNase I重组蛋白的检测结果显示，在4℃和25℃两种温度环境中，rHuDNase I无论在是否添加糖类辅料的情况下均很稳定，保存6个月，依然保持着起始时90％以上的活性(图11-a、图11-b)；在高温60℃环境中，所有添加的糖类辅料均对保持样品rHuDNase I活性具有重要作用。无糖类添加时60℃保存6周，rHuDNase I活性降低至起始时的一半左右；而在样品中添加蔗糖、海藻糖或者菊粉时，在60℃保存6周，rHuDNase I活性依然能够保持在起始时的90％左右(图11-c)。转化子1和转化子3～4的表达蛋白的稳定性与此相似，无显著差异。

实施例8雾化过程对rHuDNase I活性的影响

以1mg/mL rHuDNase I(实施例4纯化的表达子2表达的蛋白)，0.15mg/mL CaCl₂·2H₂O，8.77mg/mL NaCl，pH 7.2为雾化配方配制rHuDNase I溶液，装入小型药用喷雾器。喷雾过程中，以一玻璃板挡在前方，收集喷雾后的溶液，比较喷雾前后的rHuDNase I活性浓度。经测定，喷雾后的rHuDNase I活性浓度和喷雾前的几乎相同，证明喷雾过程可能对rHuDNase I活性没有影响。转化子1和转化子3～4的表达蛋白的稳定性与此相似，无显著差异。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种工程菌，其特征在于，其为转化表达载体的GS115酵母菌，所述表达载体以pPIC9载体为骨架，其中包括rHuDNase I基因；所述rHuDNase I基因的genbank 登录号为AAA63170.1，所述rHuDNase I基因的插入位点为Xho I与Not I酶切位点之间；所述rHuDNase I基因连接有6×His标签。

2.重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的制备方法，其特征在于，发酵权利要求1所述的工程菌；所述发酵包括培养和诱导的步骤；所述发酵的培养基为BMGY培养基；所述诱导的培养基为BMDY培养基；

所述培养的温度为30℃，发酵罐搅拌速度为150rpm~300rpm；培养至菌体为10%；

所述诱导的诱导剂为甲醇，温度为30℃，搅拌速度为200rpm~450rpm；所述诱导剂的加入采用流加方式，其占培养基体积的1%；所述发酵过程pH值为6.0。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵后进行纯化，所述纯化采用镍柱层析。

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