CN113564220B - 一种利用废弃肠道内容物进行生物转化获得熊去氧胆酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用废弃肠道内容物进行生物转化获得熊去氧胆酸的方法，是以鹅去氧胆酸为底物，利用废弃的动物肠道内容物进行生物转化，从而获得熊去氧胆酸。本发明利用废弃肠道内容物成功催化转化得到了熊去氧胆酸，使废弃肠道内容物得到有效利用，为熊去氧胆酸的生物转化提供了一条新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种废弃肠道内容物生物转化再利用的方法，属于生物催化转化领域。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高以及科学技术的进步，我国的畜禽养殖业发展迅速，畜禽在屠宰过程中，会产生大量的废弃肠道内容物，带来严重的环境负荷。此外，据统计，我国每年用于科学实验的小鼠及大鼠数量多达上亿只，宰杀后的废弃物会造成一系列的环境污染问题。为达到资源利用最大化，践行绿色可持续发展理念，寻找一种废弃肠道内容物的再利用技术尤为重要。
胆汁酸在生物体的代谢循环中起着十分重要的作用，初级胆汁酸在肝脏中由胆固醇合成，小部分进入肠道经肠道微生物菌群转化，形成各种次级胆汁酸。其中，熊去氧胆酸(UDCA)为一种次级胆汁酸，是熊胆中主要成分，具有降压、利胆、溶解胆结石等功能，在临床上应用于治疗肝胆方面的疾病，具有良好的疗效，市场需求旺盛。然而，熊是国家一级保护动物，不能通过杀熊取胆获取UDCA，因而寻求新的UDCA来源意义重大。
为解决UDCA来源受限问题，可将胆酸通过一定途径转化为UDCA，目前获得UDCA的方法主要包括化学转化法和生物转化法，由于化学法在转化过程中污染严重、环境负荷大，因而开发一种新的生物转化途径，符合绿色发展理念。生物转化获得UDCA主要是利用微生物产生的酶进行催化转化。其中，初级胆汁酸的羟基氧化是肠道微生物的一种常见转化为次级胆汁酸的方式。现有技术中应用较多的是利用纯菌种在体外将胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)转化为UDCA。但是，该方法需要对菌种进行分离、鉴定等，过程复杂。
发明内容
针对上述现状所存在的问题，本发明提供一种利用废弃肠道内容物进行生物转化获得熊去氧胆酸的方法，旨在简化现有生物转化法获得UDCA的工艺过程。
本发明为实现目的，采用如下技术方案：
一种利用废弃肠道内容物进行生物转化获得熊去氧胆酸的方法，其特点在于：以鹅去氧胆酸CDCA为底物，利用废弃的动物肠道内容物进行生物转化，从而获得熊去氧胆酸UDCA。具体包括如下步骤：
(1)在0-4℃的低温条件下，收集废弃的动物肠道内容物；
(2)将CDCA溶解于磷酸盐缓冲液中；
(3)将步骤(1)中所收集的肠道内容物置于带盖Eppendorf管中，加入适量溶有CDCA的磷酸盐缓冲液并充分混匀，得到生物转化体系；
(4)将步骤(3)所得的生物转化体系放入摇床中进行生物转化，摇床转速为160-240r/min、温度为25-35℃、转化时间为72-120h；
(5)转化完成后，将生物转化体系进行离心、取上清液，然后过滤，即得到含UDCA的粗产物水溶液。
进一步地，所述动物肠道内容物为鸡、鸭、鹅、小鼠或大鼠的直肠、盲肠或结肠中的内容物。
进一步地，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为8.0-10.0、浓度为0.1mol/L。
进一步地，步骤(2)中，CDCA溶解在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.5-2.0mg/mL。
进一步地，步骤(3)中，肠道内容物与溶有CDCA的磷酸盐缓冲液的体积比为1：2-6。
进一步地，步骤(5)中，所述离心的转速为8000-12000rpm、时间为20-30min。
进一步地，步骤(5)中，所述过滤是用0.45μm微孔滤膜进行过滤。
本发明的有益效果体现在：
1、本发明利用废弃肠道内容物，通过肠道内容物中的微生物菌群及其产生的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶，以CDCA为底物，生物转化产生中间产物7-酮石胆酸，并进一步转化为终产物UDCA，经高效液相测定终产物UDCA的得率可达19.3％。
2、本发明有效利用了废弃的动物肠道内容物，成本低、符合绿色发展的要求，且获得了高附加值的UDCA，为UDCA的生物转化提供了一种新的途径。
3、本发明的转化方法操作简便、反应条件温和。
附图说明
图1为鹅去氧胆酸、7-酮石胆酸、熊去氧胆酸三个标准品的高效液相色谱图，可以看出：熊去氧胆酸标准品出峰时间为12.8min，7-酮石胆酸标准品出峰时间为18.0min，鹅去氧胆酸标准品出峰时间为29.1min。
图2为实施例4中利用废弃肠道内容物进行生物转化所得产物的高效液相色谱图，从图中可以看出，转化产物在保留时间为12.5min和18.9min有出峰，可判断转化产物为熊去氧胆酸以及中间产物7-酮石胆酸。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。以下内容仅仅是对本发明的构思所做的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施案例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式代替，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例以废弃鸡直肠内容物转化CDCA生成UDCA，具体步骤如下：
(1)在0℃的低温条件下，收集宰杀后废弃的鸡直肠内容物。
(2)配制pH＝8.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，将CDCA溶解于磷酸盐缓冲液中(终浓度为0.8mg/mL)。
(3)将10mL步骤(1)中所收集的鸡直肠内容物置于50mL带盖Eppendorf管中，加入20mL溶有CDCA的磷酸盐缓冲液并充分混匀，得到生物转化体系。
(4)将步骤(3)所得的生物转化体系放入摇床中进行生物转化，摇床转速为170r/min、温度为28℃、转化时间为72h。
(5)转化完成后，将生物转化体系进行离心(离心转速为10000rpm、时间为30min)、取上清液，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，即得到含UDCA的粗产物水溶液。
利用高效液相色谱法(HPLC)对粗产物水溶液进行浓度测定：流动相为：乙腈/0.05％磷酸盐水溶液(V/V)＝50/50，检测波长为192nm，流速为0.5-1.0mL/min。
经计算，所得终产物UDCA的得率为13.8％，CDCA的转化率为83.4％。
实施例2
本实施例以废弃鸭结肠内容物转化CDCA生成UDCA，具体步骤如下：
(1)在0℃的低温条件下，收集宰杀后废弃的鸭结肠内容物。
(2)配制pH＝8.5、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，将CDCA溶解于磷酸盐缓冲液中(终浓度为1mg/mL)。
(3)将6mL步骤(1)中所收集的鸭结肠内容物置于50mL带盖Eppendorf管中，加入30mL溶有CDCA的磷酸盐缓冲液并充分混匀，得到生物转化体系。
(4)将步骤(3)所得的生物转化体系放入摇床中进行生物转化，摇床转速为200r/min、温度为30℃、转化时间为72h。
(5)转化完成后，将生物转化体系进行离心(离心转速为10000rpm、时间为30min)、取上清液，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，即得到含UDCA的粗产物水溶液。
按照实施例1相同的方法进行高效液相色谱检测，本实施例所得终产物UDCA的得率为14.7％，CDCA的转化率为89.5％。
实施例3
本实施例以废弃鹅盲肠内容物转化CDCA生成UDCA，具体步骤如下：
(1)在0℃的低温条件下，收集宰杀后废弃的鹅盲肠内容物。
(2)配制pH＝9.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，将CDCA溶解于磷酸盐缓冲液中(终浓度为1.5mg/mL)。
(3)将5mL步骤(1)中所收集的鹅盲肠内容物置于50mL带盖Eppendorf管中，加入20mL溶有CDCA的磷酸盐缓冲液并充分混匀，得到生物转化体系。
(4)将步骤(3)所得的生物转化体系放入摇床中进行生物转化，摇床转速为180r/min、温度为35℃、转化时间为96h。
(5)转化完成后，将生物转化体系进行离心(离心转速为12000rpm、时间为20min)、取上清液，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，即得到含UDCA的粗产物水溶液。
按照实施例1相同的方法进行高效液相色谱检测，本实施例所得终产物UDCA的得率为16.2％，CDCA的转化率为90.8％。
实施例4
本实施例以废弃小鼠盲肠内容物转化CDCA生成UDCA，具体步骤如下：
(1)在4℃的低温条件下，收集宰杀后废弃的小鼠盲肠内容物。
(2)配制pH＝8.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，将CDCA溶解于磷酸盐缓冲液中(终浓度为1.0mg/mL)。
(3)将5mL步骤(1)中所收集的小鼠盲肠内容物置于50mL带盖Eppendorf管中，加入25mL溶有CDCA的磷酸盐缓冲液并充分混匀，得到生物转化体系。
(4)将步骤(3)所得的生物转化体系放入摇床中进行生物转化，摇床转速为240r/min、温度为35℃、转化时间为180h。
(5)转化完成后，将生物转化体系进行离心(离心转速为9000rpm、时间为30min)、取上清液，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，即得到含UDCA的粗产物水溶液。
按照实施例1相同的方法进行高效液相色谱检测，本实施例所得终产物UDCA的得率为18.5％，CDCA的转化率为93.6％。
实施例5
本实施例以废弃小鼠结肠内容物转化CDCA生成UDCA，具体步骤如下：
(1)在0℃的低温条件下，收集宰杀后废弃的小鼠结肠内容物。
(2)配制pH＝10.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，将CDCA溶解于磷酸盐缓冲液中(终浓度为1.7mg/mL)。
(3)将8mL步骤(1)中所收集的小鼠结肠内容物置于50mL带盖Eppendorf管中，加入30mL溶有CDCA的磷酸盐缓冲液并充分混匀，得到生物转化体系。
(4)将步骤(3)所得的生物转化体系放入摇床中进行生物转化，摇床转速为160r/min、温度为28℃、转化时间为96h。
(5)转化完成后，将生物转化体系进行离心(离心转速为10000rpm、时间为30min)、取上清液，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，即得到含UDCA的粗产物水溶液。
按照实施例1相同的方法进行高效液相色谱检测，本实施例终产物UDCA的得率为14.1％，CDCA的转化率为82.8％。
实施例6
本实施例以废弃大鼠盲肠内容物转化CDCA生成UDCA，具体步骤如下：
(1)在0℃的低温条件下，收集宰杀后废弃的大鼠盲肠内容物。
(2)配制pH＝10.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，将CDCA溶解于磷酸盐缓冲液中(终浓度为1.5mg/mL)。
(3)将10mL步骤(1)中所收集的大鼠盲肠内容物置于50mL带盖Eppendorf管中，加入30mL溶有CDCA的磷酸盐缓冲液并充分混匀，得到生物转化体系。
(4)将步骤(3)所得的生物转化体系放入摇床中进行生物转化，摇床转速为180r/min、温度为35℃、转化时间为120h。
(5)转化完成后，将生物转化体系进行离心(离心转速为12000rpm、时间为20min)、取上清液，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，即得到含UDCA的粗产物水溶液。
按照实施例1相同的方法进行高效液相色谱检测，本实施例所得终产物UDCA的得率为19.3％，CDCA的转化率为95.5％。
以上仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种利用废弃肠道内容物进行生物转化获得熊去氧胆酸的方法，其特征在于：以鹅去氧胆酸CDCA为底物，利用废弃的动物肠道内容物进行生物转化，从而获得熊去氧胆酸UDCA；所述动物肠道内容物为鸡、鸭、鹅、小鼠或大鼠的直肠、盲肠或结肠中的内容物；所述方法包括如下步骤：
(1)在0-4℃的低温条件下，收集废弃的动物肠道内容物；
(2)将CDCA溶解于pH值为8.0-10.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中；CDCA溶解在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.5-2.0mg/mL；
(3)将步骤(1)中所收集的肠道内容物置于带盖Eppendorf管中，加入适量溶有CDCA的磷酸盐缓冲液并充分混匀，得到生物转化体系；肠道内容物与溶有CDCA的磷酸盐缓冲液的体积比为1：2-6；
(4)将步骤(3)所得的生物转化体系放入摇床中进行生物转化，摇床转速为160-240r/min、温度为25-35℃、转化时间为72-120h；
(5)转化完成后，将生物转化体系进行离心、取上清液，然后过滤，即得到含UDCA的粗产物水溶液；所述离心的转速为8000-12000rpm、时间为20-30min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述过滤是用0.45μm微孔滤膜进行过滤。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 周德庆.能转化鹅去氧胆酸为熊去氧胆酸的厌氧菌的筛选.《复旦学报》.1990, * |
| 能转化鹅去氧胆酸为熊去氧胆酸的厌氧菌的筛选;周德庆;《复旦学报》;19900630;第175-177页 * |
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