CN109593812A - 一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法 - Google Patents
一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109593812A CN109593812A CN201811635369.4A CN201811635369A CN109593812A CN 109593812 A CN109593812 A CN 109593812A CN 201811635369 A CN201811635369 A CN 201811635369A CN 109593812 A CN109593812 A CN 109593812A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- ketone group
- deoxycholic acid
- solvent
- deoxycholic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种酶促法合成3‑酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于包括以下步骤：A、将鹅去氧胆酸和溶剂加入反应容器中，搅拌溶解，加入PBS缓冲液调节溶液pH值，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、乳酸脱氢酶、3α‑类固醇脱氢酶以及丙酮酸钠，控制反应温度，将鹅去氧胆酸氧化为3‑酮基脱氧胆酸，得转化液；B、将步骤A中的转化液升温，使3α‑类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶变性，采用高速离心机离心除去蛋白，溶液中加入氢氧化钠溶液，蒸馏除去溶剂，加水溶解蒸馏残留物，加酸结晶，得到3‑酮基脱氧胆酸。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种工艺简单，合成路线短，转化率高，后处理容易，环境友好的3‑酮基脱氧胆酸制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法。
背景技术
3-酮基脱氧胆酸化学名称为：3-酮基，7-α羟基-5β-胆烷酸，3-酮基脱氧胆酸是白色结晶粉末，无臭，味苦，易溶于乙醇、氯仿、乙酸乙酯、冰醋酸、稀碱液、略溶于乙醚，难溶于水和稀矿酸。3-酮基脱氧胆酸是熊胆汁高温水解后的游离胆酸类物质之一，是熊胆汁中的最重要组成成分之一。熊胆是一味珍贵的中药材，为熊科动物黑熊或棕熊的胆囊。中医等亚洲传统医学认为熊胆汁有清热解毒、平肝明目、杀虫止血的功效。因此，亚洲各国都有延续数千年的杀熊取胆的传统。目前在很多亚洲国家，人们把导管插入黑熊腹内，实施所谓的先进"活熊取胆“，该方法因为过于残忍，而遭到各个动物保护组织的反对。目前市场的的熊胆类产品，多为猪、牛、狗等大型的胆经加工而成。
为了维护消费者的权益，维持中药品种的完整性，有必要对熊胆进行人工合成。药物工作者对熊胆的成分进行分析，发现牛磺3-酮基脱氧胆酸为熊胆汁中的重要组成成分，如果对熊胆进行人工合成，就需要制3-酮基脱氧胆酸。目前国内外还没有合成3-酮基脱氧胆酸的报道。
本文将提供一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种工艺简单，合成路线短，转化率高，后处理容易，环境友好的3-酮基脱氧胆酸制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、将鹅去氧胆酸和溶剂加入反应容器中，搅拌溶解，加入PBS缓冲液调节溶液pH值，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、乳酸脱氢酶、3α-类固醇脱氢酶以及丙酮酸钠，控制反应温度，将鹅去氧胆酸氧化为3-酮基脱氧胆酸，得转化液；
B、将步骤A中的转化液升温，使3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶变性，采用高速离心机离心除去蛋白，溶液中加入氢氧化钠溶液，蒸馏除去溶剂，加水溶解蒸馏残留物，加酸结晶，得到3-酮基脱氧胆酸。
优先的，所述的溶剂为醇类溶剂、酯类溶剂或酮类溶剂中的一种。
优先的，所述溶剂的用量为鹅去氧胆酸质量用量的3-10倍。
优先的，所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的总用量为鹅去氧胆酸质量用量的0.1-0.5％。
优先的，所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的质量比为1-3:1-3:1。
优先的，步骤A中所述反应温度为20-30℃，pH值为6.5-7.5。
更优先的，所述反应温度优选为23±2℃，pH值为7.0-7.5。
优先的，步骤A中鹅去氧胆酸转化为3-酮基脱氧胆酸的反应时间为20-24小时。
步骤B中3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的变性温度为65-85℃。
更优先的，3α-类固醇脱氢酶(3α-HSDH)和乳酸脱氢酶(LDH)变性的温度为70-75℃。
优先的，步骤B中所述的酸为无机酸。
优先的，所述无机酸为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的一种。
综上所述，本发明相对于现有技术其有益效果是：
本发明利用酶的专属性反应，通过两种酶将鹅去氧胆酸3位α羟基氧化酮基，将鹅去氧胆酸氧化为3-酮基脱氧胆酸，原料转化率达到99％以上，提供了一种3-酮基脱氧胆酸的合成方法，为人工合成熊胆提供了原料来源。
本发明工艺简单，合成路线短，转化率高，后处理容易，环境友好。
本方法以鹅去氧胆酸为底物，在溶剂中溶解，加入PBS缓冲液调节溶液pH，加入NAD、LDH、丙酮酸钠，利用3-α类固醇脱氢酶氧化鹅去氧胆酸得到3-酮基脱氧胆酸。该方法使用溶剂单一，利于回收3-酮基脱氧胆酸；操作简单，反应条件温和易控，原料利用率高，转化率高达99％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述：
实施例1
在反应中加入10g鹅去氧胆酸，50ml仲丁醇，100mlpH7.4的PBS缓冲液搅拌溶解，并调节溶液pH7.0左右，加入10mg 3α-HSDH和10mgLDH冻干粉，10mgNAD，控制温度23℃，反应24小时。
反应液升温至70℃，搅拌2小时，降温至25℃，将反应液倒入高速离心机离心瓶中离心，上层清液倒入分液漏斗中静置分层，下层水相弃去，有机相加入1.1g氢氧化钠，真空蒸馏除去溶剂，蒸馏残留物中加入100ml水，1:1盐酸调节溶液酸性结晶，过滤。70℃真空干燥，得到纯度在99％以上3-酮基脱氧胆酸9.8g。
实施例2
在反应中加入10g鹅去氧胆酸，80ml乙酸乙酯，50mlpH7.4PBS缓冲液搅拌溶解，并调节溶液pH7.0左右，加入30mg 3-αHSDH和30mgLDH冻干粉，10mgNAD，控制温度25℃，反应20小时。
反应液升温至75℃，搅拌2小时，降温至30℃，将反应液倒入高速离心机离心瓶中离心，上层清液倒入分液漏斗中静置分层，下层水相弃去，有机相加入1.1g氢氧化钠，真空蒸馏除去溶剂，蒸馏残留物中加入100ml水，1:1盐酸调节溶液酸性结晶，过滤。75℃真空干燥，得到纯度在99％以上3-酮基脱氧胆酸9.7g。
实施例3
在反应中加入10g鹅去氧胆酸，50ml甲基异丁基酮，50mlpH7.4PBS缓冲液搅拌溶解，并调节溶液pH7.3左右，加入10mg3-αHSDH和10mgLDH冻干粉，10mgNAD，控制温度23℃，反应24小时。
反应液升温至72℃，搅拌2小时，降温至25-30℃，将反应液倒入高速离心机离心瓶中离心，上层清液倒入分液漏斗中静置分层，下层水相弃去，有机相加入1.1g氢氧化钠，真空蒸馏除去溶剂，蒸馏残留物中加入100ml水，1:1盐酸调节溶液酸性结晶，过滤。73℃真空干燥，得到纯度在99％以上3-酮基脱氧胆酸9.8g。
实施例4
一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，包括以下步骤：
A、将鹅去氧胆酸和溶剂加入反应容器中，搅拌溶解，加入PBS缓冲液调节溶液pH值，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、乳酸脱氢酶、3α-类固醇脱氢酶以及丙酮酸钠，控制反应温度，将鹅去氧胆酸氧化为3-酮基脱氧胆酸，得转化液；所述的溶剂为醇类溶剂、酯类溶剂或酮类溶剂中的一种。所述溶剂的用量为鹅去氧胆酸质量用量的3倍。所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的总用量为鹅去氧胆酸质量用量的0.1％。所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的质量比为1:1:1。所述反应温度为20℃，pH值为6.5。
B、将步骤A中的转化液升温，使3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶变性，采用高速离心机离心除去蛋白，溶液中加入氢氧化钠溶液，蒸馏除去溶剂，加水溶解蒸馏残留物，加酸结晶，得到3-酮基脱氧胆酸。3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的变性温度为65℃。所述酸为硫酸。
实施例5
一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，包括以下步骤：
A、将鹅去氧胆酸和溶剂加入反应容器中，搅拌溶解，加入PBS缓冲液调节溶液pH值，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、乳酸脱氢酶、3α-类固醇脱氢酶以及丙酮酸钠，控制反应温度，将鹅去氧胆酸氧化为3-酮基脱氧胆酸，得转化液；所述的溶剂为醇类溶剂、酯类溶剂或酮类溶剂中的一种。所述溶剂的用量为鹅去氧胆酸质量用量的10倍。所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的总用量为鹅去氧胆酸质量用量的0.5％。所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的质量比为3:3:1。所述反应温度为30℃，pH值为7.5。
B、将步骤A中的转化液升温，使3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶变性，采用高速离心机离心除去蛋白，溶液中加入氢氧化钠溶液，蒸馏除去溶剂，加水溶解蒸馏残留物，加酸结晶，得到3-酮基脱氧胆酸。3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的变性温度为85℃。所述酸为盐酸。
实施例6
一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，包括以下步骤：
A、将鹅去氧胆酸和溶剂加入反应容器中，搅拌溶解，加入PBS缓冲液调节溶液pH值，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、乳酸脱氢酶、3α-类固醇脱氢酶以及丙酮酸钠，控制反应温度，将鹅去氧胆酸氧化为3-酮基脱氧胆酸，得转化液；所述的溶剂为醇类溶剂、酯类溶剂或酮类溶剂中的一种。所述溶剂的用量为鹅去氧胆酸质量用量的5倍。所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的总用量为鹅去氧胆酸质量用量的0.3％。所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的质量比为1:3:1。所述反应温度为25℃，pH值为7。
B、将步骤A中的转化液升温，使3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶变性，采用高速离心机离心除去蛋白，溶液中加入氢氧化钠溶液，蒸馏除去溶剂，加水溶解蒸馏残留物，加酸结晶，得到3-酮基脱氧胆酸。3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的变性温度为75℃。所述酸为硝酸。
实施例7
一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，包括以下步骤：
A、将鹅去氧胆酸和溶剂加入反应容器中，搅拌溶解，加入PBS缓冲液调节溶液pH值，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、乳酸脱氢酶、3α-类固醇脱氢酶以及丙酮酸钠，控制反应温度，将鹅去氧胆酸氧化为3-酮基脱氧胆酸，得转化液；所述的溶剂为醇类溶剂、酯类溶剂或酮类溶剂中的一种。所述溶剂的用量为鹅去氧胆酸质量用量的8倍。所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的总用量为鹅去氧胆酸质量用量的0.4％。所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的质量比为3:1:1。所述反应温度为28℃，pH值为7.2。
B、将步骤A中的转化液升温，使3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶变性，采用高速离心机离心除去蛋白，溶液中加入氢氧化钠溶液，蒸馏除去溶剂，加水溶解蒸馏残留物，加酸结晶，得到3-酮基脱氧胆酸。3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的变性温度为80℃。所述酸为磷酸。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、将鹅去氧胆酸和溶剂加入反应容器中，搅拌溶解，加入PBS缓冲液调节溶液pH值，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、乳酸脱氢酶、3α-类固醇脱氢酶以及丙酮酸钠，控制反应温度，将鹅去氧胆酸氧化为3-酮基脱氧胆酸，得转化液；
B、将步骤A中的转化液升温，使3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶变性，采用高速离心机离心除去蛋白，溶液中加入氢氧化钠溶液，蒸馏除去溶剂，加水溶解蒸馏残留物，加酸结晶，得到3-酮基脱氧胆酸。
2.根据权利要求1所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于所述的溶剂为醇类溶剂、酯类溶剂或酮类溶剂中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于所述溶剂的用量为鹅去氧胆酸质量用量的3-10倍。
4.根据权利要求1所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的总用量为鹅去氧胆酸质量用量的0.1-0.5％。
5.根据权利要求1所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于所述3α-类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的质量比为1-3:1-3:1。
6.根据权利要求1所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于步骤A中所述反应温度为20-30℃，pH值为6.5-7.5。
7.据权利要求1所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于步骤A中鹅去氧胆酸转化为3-酮基脱氧胆酸的反应时间为20-24小时。
8.据权利要求1所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于步骤B中3α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的变性温度为65-85℃。
9.据权利要求1所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于步骤B中所述的酸为无机酸。
10.据权利要求9所述的一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法，其特征在于所述无机酸为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811635369.4A CN109593812A (zh) | 2018-12-29 | 2018-12-29 | 一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811635369.4A CN109593812A (zh) | 2018-12-29 | 2018-12-29 | 一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109593812A true CN109593812A (zh) | 2019-04-09 |
Family
ID=65964907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811635369.4A Pending CN109593812A (zh) | 2018-12-29 | 2018-12-29 | 一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109593812A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114276401A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-04-05 | 中山百灵生物技术股份有限公司 | 一种24-去甲熊去氧胆酸的合成方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861613A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-08-17 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种熊去氧胆酸制备方法 |
| CN107995928A (zh) * | 2017-01-09 | 2018-05-04 | 深圳市邦泰绿色生物合成研究院 | 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1 |
-
2018
- 2018-12-29 CN CN201811635369.4A patent/CN109593812A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861613A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-08-17 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种熊去氧胆酸制备方法 |
| CN107995928A (zh) * | 2017-01-09 | 2018-05-04 | 深圳市邦泰绿色生物合成研究院 | 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 柯叶芳等: "3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达", 《中国微生态学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114276401A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-04-05 | 中山百灵生物技术股份有限公司 | 一种24-去甲熊去氧胆酸的合成方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fieser et al. | Selective oxidation with N-bromosuccinimide. II. Cholestane-3β, 5α, 6β-triol | |
| Wilds et al. | The facile synthesis of 19-nortestosterone and 19-norandrostenedione from estrone | |
| CN105861613B (zh) | 一种熊去氧胆酸制备方法 | |
| TW201714891A (zh) | 膽酸及其衍生物之製備方法 | |
| CN101607977B (zh) | 油脂脱臭馏出物渣油中提取纯化天然植物甾醇的方法和工艺 | |
| IE53956B1 (en) | 3-beta, 7-beta, 15-alpha/trihydroxy-5-androsten-17-one, its 3,15-dipivalate, and its preparation | |
| CN106701882A (zh) | 化学‑酶法制备熊去氧胆酸 | |
| CN110256517B (zh) | 一种从猪胆汁或下脚料中生产高纯度鹅去氧胆酸的方法 | |
| PL80570B1 (zh) | ||
| Herzig et al. | Investigations on steroids. XIV. Studies in the series of the adrenal cortical hormones: dehydration of 6β, 21-diacetoxyallopregnane-5-ol-3, 20-dione | |
| CN110915987A (zh) | 一种综合利用茶叶生产饲料的方法 | |
| CN109593812A (zh) | 一种酶促法合成3-酮基脱氧胆酸的方法 | |
| CN109705127B (zh) | 一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法 | |
| CN101928746B (zh) | 雄甾-1,4,6-三烯-3,17-二酮的制备方法 | |
| CN106676156A (zh) | 石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法 | |
| CN105985233B (zh) | 一种制备阿魏酸的方法 | |
| US3803184A (en) | Method for preparing desmosterol | |
| CN105481927B (zh) | 一种从鸭胆汁中提取鸭胆酸和鹅去氧胆酸的方法 | |
| PL103989B1 (pl) | Sposob wytwarzania nowych 7 alfa-podstawionych estradioli | |
| Pearlman | The preparation of C-27 steroids from bile acids. I. Coprostanetetrol-3 (α), 7 (α), 12 (α), 25 | |
| CN101215309A (zh) | 用98%的牛羊胆酸生产鹅去氧胆酸的生产方法 | |
| CN110628860A (zh) | 植物甾醇转化分离9α-OH-AD和甲酯物的方法 | |
| Heintz et al. | Cyclisation de l'époxyde-2, 3 de squalène par des microsomes extraits de tissus de tabac cultivés in vitro | |
| CN109422794A (zh) | 一种从鸭胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法 | |
| CN112375118A (zh) | 以植物甾醇为原料制备胆固醇及其衍生物的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190409 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |