CN100558882C - 一种利用木糖和葡萄糖生产乙醇的重组酿酒酵母 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCC No.2255。此酿酒酵母能够很好的利用木糖，还能同时转运木糖和葡萄糖生产乙醇，利用率都高达80%以上。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能够利用木糖并能同时利用木糖和葡萄糖生产乙醇的重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-3。
背景技术
木质纤维素是世界上最为丰富的生物质资源，量最大、价最廉，每年的总产量约占所有生物质资源的50％，目前大多数此类的物质没有得到很好的利用。利用木质纤维素为主的可再生生物质资源，生产可再生能源具有重要的经济与社会意义。以生物质为原料制取的工业乙醇，作为一种清洁的可再生能源，是替代石油等化石燃料的必然趋势。传统的生物乙醇生产主要以粮食发酵为主，世界粮食紧缺现象严重限制了原料来源，原料成本居高不下，低成本的新原料路线是降低生物乙醇生产成本的关键。在传统的生物乙醇生产中，以葡萄糖为主的六碳糖易于被微生物发酵生成乙醇，然而占总糖量约40％的木糖却不易于被其利用。充分利用木质纤维素生产乙醇原料中的木糖发酵生产乙醇，能使乙醇的产量在原有基础上增加25％。木糖的有效利用是提高乙醇经济指标的重要内容，是生物质资源成功工业化转化的关键因素。
酿酒酵母(S.cerevisiae)是真核微生物，细胞壁厚、固醇含量高，对乙醇及木质纤维素水解物中毒性因子的耐受性较高；能在低pH、严格厌氧条件下快速发酵葡萄糖生产乙醇，副产物少；不易被细菌和病毒污染，且相关工业技术成熟，一直是乙醇发酵的研究重点和首选目标微生物。但缺乏有效利用木糖的能力。以木质纤维素为原料生产乙醇，其关键之一就是产生乙醇的微生物能有效利用各种糖作为碳源。在国外，早在上世纪八十年代初期，国际上许多实验室就已经开始从事其高效生产乙醇的研究。但是天然的酿酒酵母菌只能非常缓慢的代谢木糖，却不能有效发酵木糖。由于天然微生物的木糖发酵性能难以达到工业生产的要求，所以人们利用传统的菌种筛选方法通常经过大量的微生物培养、酶活测定及菌种驯化培养来选育所需菌种，由于工作量大、耗时长、效率低，近年来已转向利用代谢工程原理，通过分子遗传改造相关代谢途径来获得能在厌氧条件下高效代谢发酵葡萄糖、木糖及其他各种戊糖的工程菌。但以前的研究大部分没有得到十分理想的目标表型。我们认为这些单基因或几个基因的改造，某种的基因缺失或者扩增，只是改变了细胞的局部元件，或是重新设计调节了细胞网络代谢产物的平衡系统，并没有解决木糖代谢途径中的复杂问题。
基因表达调控是也成为生物学目前应用手段热点。全局转录机制调控工程(globetranscriptional mechanism engineering，gTME)是用分子生物学方法，如易错PCR、DNA改组等方法，建立通用转录因子的突变库，针对目的产品或目标表型，通过定向筛选，获得目的代谢流增强或特定表型增强的菌种，是按人们的设计获得目标表型的一种方法。
酿酒酵母具有木糖代谢的完整途径，但是却不能有效的发酵木糖产乙醇。我们解决这些问题模拟微生物适应外界环境的改变，在酵母菌木糖代谢途径的基因组层面上定向进化或同时改变多个相关基因群，使细胞在整体水平上适应木糖的代谢或利用，我们利用gTME技术通过基因工程方法改造全局转录调控因子使整个转录调控过程发生变化从而改变或提高基因组的转录及表达。从而获得了能够高效利用木糖并能够同时转运木糖和葡萄糖产乙醇的酿酒酵母。
利用全局调控技术对酿酒酵母菌进行转录机制工程改造，筛选得到利用木糖高的菌株。并配合目标菌株具体分析，深入研究利用木糖的代谢调控网络及机制，找出全局调控对酿酒酵母木糖代谢的影响，希望通过全局调控的手段优化酿酒酵母木糖代谢网络，以实现最大效率的木糖利用，并为酿酒酵母高效利用木糖产乙醇奠定基础。为普适性强的分子育种及代谢工程改造提供坚实而富有新意的工程理论基础，从而使细胞分子遗传进化，实现由繁而慢到简而快的根本性转变，从根本上降低生物乙醇的原料成本，这将对基因工程和代谢工程技术理论的发展带来重大的革新，实现重组菌株的工业应用也将有着不可估量的巨大推动作用和更广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了避免上述不足之处提供一种利用木糖并能够同时转运木糖和葡萄糖生产乙醇的重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-3。
本发明的目的通过下列措施来达到：
本发明人实验室选育并保藏一种重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-3，目前该酿酒酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，登记入册的编号是CGMCC No.2255，保藏日期是：2007年11月13日。
该酿酒酵母CGMCC No.2255的选育方法，其特征是利用全局转录机制工程(globalTransciption Machinery Engineering gTME)方法，尿嘧啶缺陷型木糖培养基筛选。
1)出发菌株
出发菌株为酿酒酵母YPH499(Saccharomyces cerevisiae YPH499购自美国Stratagene公司，ura3-52lys2-801amberade2-101ochretrp1-Δ63his3-Δ200leu2-Δ1)为亮氨酸、组氨酸、尿嘧啶缺陷型。
2)培养基
基本培养基(YPD)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，去离子水定容至1L。
筛选培养基：不含氨基酸酵母氮源(YNB)6.7g，必需氨基酸混合物(缺尿嘧啶)1.3g，木糖20g，琼脂粉20g，去离子水定容至1L。
种子培养基：同基本培养基。
发酵培养基A(含5％木糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖50g，去离子水定容至1L。
发酵培养基B(含10％木糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖100g，去离子水定容至1L。
发酵培养基C(含15％木糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖150g，去离子水定容至1L。
发酵培养基D(含5％葡萄糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖50g，去离子水定容至1L。
发酵培养基E(含10％葡萄糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖100g，去离子水定容至1L。
发酵培养基F(含15％葡萄糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖150g，去离子水定容至1L。
发酵培养基G(含5％混合糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖25g，葡萄糖25g，去离子水定容至1L。
发酵培养基H(含10％混合糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖50g，葡萄糖50g，去离子水定容至1L。
发酵培养基I(含15％混合糖)：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖75g，葡萄糖75g，去离子水定容至1L。
配制固体平板培养基时添加2％的琼脂。
3)突变株的诱变和筛选
接一环酿酒酵母YPH499入基本培养基，30℃、200r/min培养14h，离心收集菌体，利用酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取得到YPH499基因组，以获得YPH499基因组为模板，引物SPT15_Sense：TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG(SEQ ID No.2)和SPT15_Anti：CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACA(SEQ ID No.3)，克隆得到spt15基因(SEQ ID No.1)；以获得的spt15基因为模板进行易错PCR[GenemorphII RandomMutagenesis kit(购于美国Stratagene公司)]，所得易错PCR产物直接连接到PYX212(氨苄青霉素抗性带尿嘧啶筛选标记)表达载体上，醋酸锂法转化入酿酒酵母YPH499在筛选培养基上表达。
通过特定筛选培养基条件，得到能够在以木糖为唯一碳源的筛选培养基上生长的重组酿酒酵母YPH499-3CGMCC No.2255，通过镜检可见酿酒酵母YPH499-3CGMCC No.2255(见图1)。将酿酒酵母YPH499-3CGMCC No.2255在上述不同发酵培养基中进行摇瓶发酵，在发酵四天时测得糖的利用率为：94.0％(5％木糖)，90.0％(10％木糖)，82.0％(15％木糖)，98.9％(5％葡萄糖)，97.1％(10％葡萄糖)，95.9％(15％葡萄糖)，91.7％(5％混合糖中的木糖)，85.9％(5％混合糖中的葡萄糖)，80.8％(15％混合糖中的木糖)，90.3％(10％混合糖中的木糖)，92.0％(10％混合糖中的葡萄糖)，92.1％(15％混合糖中的葡萄糖)，其木糖和葡萄糖利用率均达到80％以上(结果见图2-4)。木糖醇产量很少(发酵109个小时：10％木糖、15％木糖的木糖醇含量分别为：2.81g/L、2.45g/L.)。
重组酿酒酵母YPH499-3CGMCC No.2255具有下述性质：
(1)菌落形态学特征：单细胞，呈卵圆形、圆形或卵形。大小约1-5×5-30微米，无鞭毛，不能游动。在固体培养基上菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色。液体培养均匀生长。
(2)生理与生化特性：具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。兼性厌氧，无性繁殖以芽殖为主。能发酵葡萄糖、木糖。
(3)营养特征：异养。
分析方法：
将含有1.5ml发酵液的离心管置于高速离心机中，于12000rpm下离心5min，取上清备用。
木糖、木糖醇、葡萄糖浓度用高效液相色谱测定。DIONEX(Ultimate3000)高效液相色谱仪，检测器Shodex RI-101，ChromeleonVersion6.80工作站，色谱柱为Kromasil5-NH2柱(江苏汉邦科技有限公司)色谱条件：柱温30℃，流动相为乙腈∶水＝80∶20(V/V)，流速为1.0mL/min。
乙醇检测：血乙醇试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)，采用两点速率法。
菌体浓度用OD600测定，10D600＝0.367g干菌体/L(木糖)，0.410g干菌体/L(葡萄糖)，0.355g干菌体/L(混合糖)。
本发明的有益效果：
重组酿酒酵母YPH499-3CGMCC No.2255最佳生长温度为30℃，能很好的利用木糖，并同时转运木糖和葡萄糖。同时利用木糖和葡萄糖，利用率都高达80％以上。单纯以木糖为唯一碳源发酵乙醇产率为5％，木糖和葡萄糖以1∶1混合发酵时乙醇产率为10％。
与其他菌株进行的的效果比较：
酿酒酵母YPH499在纯木糖培养基上不长，当葡萄糖和木糖同时存在时利用葡萄糖；重组酿酒酵母YPH499-3CGMCC No.2255在纯木糖、葡萄糖和木糖二者等质量的混合糖中糖利用率都达到80％以上。
附图说明：
图1是重组酿酒酵母YPH499-3CGMCC No.2255镜检结果。
图2是重组酿酒酵母YPH499-3CGMCC No.2255在发酵培养基上的生长曲线图。
图3是木糖、葡萄糖的利用曲线图。
图4是混合糖的利用曲线图。
保藏信息说明：
一种重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-3，目前该酿酒酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，登记入册的编号是CGMCC No.2255，保藏日期是：2007年11月13日。
具体实施方式：
以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1
出发菌株：
出发菌株为酿酒酵母YPH499(购自美国Stratagene公司)，为亮氨酸、组氨酸、尿嘧啶缺陷型。
培养基：
基本培养基(YPD)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，去离子水定容至1L。
筛选培养基：不含氨基酸酵母氮源(YNB)6.7g，必需氨基酸混合物(缺尿嘧啶)1.3g，木糖20g，琼脂粉20g，去离子水定容至1L。
配制固体平板培养基时添加2％的琼脂
突变株的诱变和筛选：
从新鲜斜面接一环酿酒酵母YPH499入基本培养基，30℃、200r/min培养14h，离心收集菌体，利用酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取得到YPH499基因组，以获得YPH499基因组为模板，引物SPT15_Sense：TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG(SEQ IDNo.2)和SPT15_Anti：CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACA(SEQ ID No.3)，克隆得到spt15基因(SEQID No.1)；以获得的spt15基因为模板进行易错PCR[GenemorphIIRandom Mutagenesis kit(购于美国Stratagene公司)]，所得易错PCR产物直接连接到PYX212(氨苄青霉素抗性带尿嘧啶筛选标记)表达载体上，醋酸锂法转化入酿酒酵母YPH499在筛选培养基上表达，得到重组酿酒酵母菌株YPH499-3CGMCC No.2255。
实施例2
种子培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，去离子水定容至1L。
发酵培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖50g，去离子水定容至1L。
从新鲜斜面上接一环实施例1得到的酿酒酵母YPH499-3，CGMCC No.2255接入装有种子培养基的50ml锥形瓶中，在30℃，200rpm的摇床(太仓市实验设备厂)中培养24h后，以1％接种量(v/v)接入装有发酵培养基的锥形瓶中，在30℃，200rpm的摇床中培养，发酵72h，所得木糖的利用率为94％，乙醇产率为5％。
实施例3
种子培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，去离子水定容至1L。
发酵培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖25g，葡萄糖25g，去离子水定容至1L。
从新鲜斜面上接一环由实施例1得到的酿酒酵母YPH499-3，CGMCC No.2255接入装有种子培养基的锥形瓶中，在30℃，200rpm的摇床(太仓市实验设备厂)中培养24h后，以1％接种量(v/v)接入装有发酵培养基的锥形瓶中，在30℃，200rpm的摇床中培养，发酵72h，所得木糖的利用率为91％，葡萄糖的利用率为85％，乙醇产率为10％。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种利用木糖和葡萄糖生产乙醇的重组酿酒酵母
<160>3
<210>1
<211>723
<212>DNA
<213>spt15基因
<220>
<223>酿酒酵母YPH499基因组为模板克隆得到
<400>1
atggccgatg aggaacgttt aaaggagttt aaagaggcaa acaagatagt gtttgatcca 60
aataccagac aagtatggga aaaccagaat cgagatggta caaaaccagc aactactttc 120
cagagtgaag aggacataaa aagagctgcc ccagaatctg aaaaagacac ctccgccaca 180
tcaggtattg ttccaacact acaaaacatt gtggcaactg tgactttggg gtgcaggtta 240
gatctgaaaa cagttgcgct acatgcccgt aatgcagaat ataaccccaa gcgttttgct 300
gctgtcatca tgcgtattag agagccaaaa actacagctt taatttttgc ctcagggaaa 360
atggttgtta ccggtgcaaa aagtgaggat gactcaaagc tggccagtag aaaatatgca 420
agaattatcc aaaaaatcgg gtttgctgct aaattcacag acttcaaaat acaaaatatt 480
gtcggttcgt gtgacgttaa attccctata cgtctagaag ggttagcatt cagtcatggt 540
actttctcct cctatgagcc agaattgttt cctggtttga tctatagaat ggtgaagccg 600
aaaattgtgt tgttaatttt tgtttcagga aagattgttc ttactggtgc aaagcaaagg 660
gaagaaattt accaagcttt tgaagctata taccctgtgc taagtgaatt tagaaaaatg 720
tga 723
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工引物
<220>
<223>SPT15_Sense
<400>2
tcgagtgcta gcaaaatggc cgatgaggaa cgtttaaagg 40
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工引物
<220>
<223>SPT15_Anti
<400>3
ctagcggtcg actcacattt ttctaaattc acttagcaca 40
Claims (2)
1.一种重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCC No.2255。
2.权利要求1所述的重组酿酒酵母在利用木糖或同时利用木糖和葡萄糖发酵生产乙醇中的应用。
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